CN109136117A - 一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂及其制备方法 - Google Patents
一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂及其制备方法，属于生防菌剂制备技术领域；本发明所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，该生防菌剂配方内容为：1×106~1×109CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）、2.5~7.5wt藻糖、0.01~0.03wt胱甘肽、0.01~0.03wt坏血酸、0.02~0.05mol/L pH6.5磷酸缓冲液；本发明还对此液体生防菌剂的果实生防效果进行了验证，结果显示Y35‑1酵母菌液体菌剂处理的油桃果实发病率与果实病斑直径均比对照组中的明显减少，且与之存在显著性差异，结果显示本发明配制的液体制剂能有效抑制油桃、枇杷果实中的炭疽病病害的发生与发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）液体生防菌剂及其制备方法，属于生防菌剂制备技术领域。
背景技术
油桃、枇杷作为源于我国且栽培较广的水果之一，口味酸甜适度，且具有很高的营养价值。但是由于油桃、枇杷果实皮薄，成熟和采摘在高温高湿的初夏季节，在采摘、运销、贮藏过程中极易受到机械损伤和微生物侵害而发生腐烂，从而造成巨大的经济损失。
炭疽病是多种果实采后运销和贮藏过程中常发生的主要病害之一，其病原微生物主要是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）两种。一直以来，控制果实病害主要依赖于化学杀菌剂，目前由于消费者对食品质量要求的提高，以及对农药环境污染问题的关注，而使化学杀菌剂的应用受到部分限制，故亟待找到一种有效的果蔬病害防治的替代方法。
近年来，生物防治已经成为各国关于果蔬采后病害防治的研究热点。其中拮抗酵母菌因为具有营养要求简单、易定植、繁殖快、环境抗逆性强等多种优点，而使其更适合作为生防制剂用于水果的采后病害防治方面，从而被认为可作为一种有效的代替化学合成杀菌剂的方法。但是目前对枇杷及油桃等炭疽病害具有显著防治作用的拮抗菌，报道不多，防治效果不明显。
发明内容
本发明的目的在于提供一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂配方及其制备方法，以期应用于有效控制油桃、枇杷等果实运销、贮藏过程中发生的炭疽病害及腐烂问题。
本发明首先提供一种季也蒙毕赤酵母Y35-1（Pichia guilliermondii Y35-1），已于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M2016719。
本发明还提供一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，该生防菌剂配方包括：1×106 ~1×109CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）、2.5~7.5wt% 海藻糖、0.01~0.03 wt % 谷胱甘肽、0.01~0.03 wt % 抗坏血酸、0.02~0.05mol/L pH6.5磷酸缓冲液。
不同浓度间单因素实验结果若效果相似，则选用低浓度试剂。
季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂优选的配方为：1×108CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）、5% wt海藻糖、0.02 wt %谷胱甘肽、0.01 wt %抗坏血酸，以0.05mol/L pH6.5磷酸缓冲液配置。
本发明同时也提供了一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的制备方法，制备步骤如下：
将季也蒙毕赤酵母菌活化后，取两环接种于NYDB种子培养基中（50mL/250mL），28℃、200r/min培养24h，取100μL种子培养液接入NYTB发酵培养基中（50mL/250mL），28℃、200r/min培养48 h；
将酵母菌发酵液置于离心杯中，3000r/min下离心10min，倒掉上清液，用无菌水清洗两次，所得沉淀用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）洗下并制成酵母菌悬液，用血球计数板计数，调整浓度后备用。
用0.02~0.05mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）配制季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，使液体生防菌剂中含有1×106 ~1×109CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）、2.5~7.5%海藻糖、0.01~0.03%谷胱甘肽、0.01~0.03%抗坏血酸；充分混匀后，分装到已灭菌的离心管中，所分装的菌剂均分为3组，并分别保存在-20℃，5℃，25℃的条件下。
按照本发明中的配方和制备方法配制的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，在5℃下存放，存活率较高，能较好保持菌剂的效力，具有较好的果实生防效果，为以后应用在油桃等果实贮藏方面提供了依据。
本发明的有益效果描述如下：
本发明提供了一种季也蒙毕赤酵母菌株Y35-1的液体生防菌剂极其制备方法；本发明筛选了多种保护添加剂，其中包括糖类（海藻糖）、抗逆及还原剂类（谷胱甘肽和抗坏血酸）。海藻糖因其在生物抗逆反应中的作用而被作为天然的保护剂，谷胱甘肽可以作为抗逆保护剂，抗坏血酸作为还原剂而具有抗逆保护作用，本发明选择选择的各保护添加剂和相应的用量下，拮抗酵母液体制剂的酵母菌存活率最高。
按照本发明提供的制备方法制备的液体生防菌剂，虽然随着贮藏天数的增加，其存活率有所下降，但下降很缓慢，且相比较于对照组（25℃，10d，为70.5%；90d，<5.0%），其效果下降不明显，酵母菌存活率较高（25℃，10d，为88.2%；90d，为68.5%）。表明在制备液体生防菌剂时添加的海藻糖、谷胱甘肽等物质，对Y35-1酵母菌存活率的保持具有很好的保护作用。
本发明所述的液体生防菌剂的适宜贮存条件为5℃，在相同贮藏天数时，存放的Y35-1液体生防菌剂的存活率在5℃（90d，66.5%）下要明显高于25℃对照组（90d，<5.0%），也高于-20℃低温（90d，35.5%）下存放的液体生防菌剂；本发明还对此液体生防菌剂的果实生防效果进行了验证，结果显示Y35-1酵母菌液体菌剂处理的油桃果实21d发病率（16.0%）与果实病斑直径（0.50cm）均比对照组（100%，3.50cm）中的明显减少，且与之存在显著性差异。Y35-1酵母菌液体菌剂处理的枇杷果实21d发病率（15.6%）与果实病斑直径（0.35cm）也比对照组（100%，3.10cm）中的明显减少。结果显示本发明配制的液体制剂能有效抑制油桃、枇杷果实中的炭疽病病害的发生与发展。
附图说明
图1本发明的季也蒙毕赤酵母菌Y35-1菌株的细胞及菌落形态学特征。
图2本发明的季也蒙毕赤酵母菌Y35-1菌株的PCR结果（a）及系统发育树（b）；图中，M为DL2000 Plus DNA Marker，1为菌株Y35-1的PCR产物。
图3是本发明提供的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂在25℃、5℃、-20℃下存放的酵母菌细胞存活率统计结果。
具体实施方式
通过借助以下实施实例将更加详细地说明本发明。此处所描述的具体实施实例仅具有说明性，本发明并不受这些实施实例的限制。
实施例1：菌株的分离及鉴定
季也蒙毕赤酵母菌Y35-1（Pichia guilliermondii Y35-1）是本实验室筛选得到的，经验证，其抑菌效果非常好。已于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCC NO: M2016719）。
菌种筛选及鉴定过程主要步骤如下：
拮抗酵母菌的分离：从镇江市高桥镇农业生态果园采集成熟健康枇杷果实，在完整果实表面分离筛选菌株，挑选培养特征各异的酵母单菌落在NYDA平板上进行分离纯化，挑取各个单菌落进行低温保藏。
拮抗酵母菌悬液制备：将培养的酵母菌重悬浮成为菌悬液，用血球计数板计算酵母菌悬液的浓度，用无菌蒸馏水调整菌悬液至所需浓度，备用。
通过体内和体外的多次筛选，最终得到一株具有抑菌作用且活性强的拮抗酵母菌株，并对该菌株进行种属的鉴定。
拮抗酵母菌的体外筛选：挑选培养板中挑选抑菌效果良好，即具有生防潜力的酵母菌株做体内筛选。
拮抗酵母菌的体内筛选：根据果实的腐烂情况，挑选出具有抑菌作用的酵母菌株，并将抑菌效果最好的酵母菌株进行种属鉴定。
拮抗酵母菌株的形态学及生理生化指标的鉴定方法包括：细胞形态学鉴定、群体形态培养特征鉴定、子囊孢子的鉴定、假菌丝的形成及鉴定、掷孢子的形成及鉴定以及糖发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验。结果显示：Y35-1菌株在麦芽汁液体培养基中培养后镜检观察细胞形态呈椭圆形到圆形，细胞无性繁殖：一端或两端芽殖，如图1所示。在28℃NYDA培养基培养3d，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，微隆起，不透明乳黄色，易挑起，有芳香味，如图1所示。发酵供试糖类结果为Y35-1菌株可以发酵葡萄糖、蔗糖、棉籽糖和海藻糖，不能够发酵麦芽糖和乳糖。对供试碳源和氮源的同化结果为：Y35-1菌株可以同化D-葡萄糖、D-半乳糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、纤维二塘、棉籽糖、麦芽糖、海藻糖、D-山梨醇、蜜二糖、D-木糖、丙三醇、松三糖、D-甘露糖，不能同化赤藻糖醇和乳糖；Y35-1菌株可以同化(NH4)2SO4，不能同化KNO3和KNO2。
拮抗酵母菌株的分子特征鉴定包括：模板为采用反复冻融法提取的酵母菌DNA，采用通用引物为ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），对DNA模板进行PCR扩增。反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s变性，55℃30s退火，72℃1min延伸，35个循环；72℃10min延伸；4℃保温。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增出长度约560bp的rDNA-ITS序列。
PCR扩增产物经切胶回收后，送生物公司测序，测定的序列结果如SEQ.ID.NO.1所示，将所得的序列采用Neighbor-Joining法进行分析系统学分析，构建系统发育树。图2显示，PCR扩增出大约长度为560bp的rDNA-ITS序列，系统发育树亲缘关系分析确定菌株Y35-1与Pichia guilliermondii strain W1171处于同一分支。
根据以上鉴定结果进行种属归类鉴定，酵母菌株Y35-1被鉴定为季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）。
SEQ.ID.NO.1:
CCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAaAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
实施例2：季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的制备
首先对酵母菌进行富集培养：先将深冻季也蒙毕赤酵母菌水浴解冻，接入NYDB液体培养基中，28℃，200r/min摇瓶培养24-48h，重复培养一次，进行酵母菌活化。然后，将活化后的季也蒙毕赤酵母菌挑取两环接种于NYDB种子培养基中（50mL/250mL），28℃、200r/min条件下培养24 h；然后取100μL得到的种子培养液接入NYTB发酵培养基中（50mL/250mL），在28℃、200r/min条件下培养48 h；其中NYDB培养基包括牛肉浸膏8g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g、蒸馏水1000mL，自然pH；NYTB培养基包括牛肉浸膏8g、酵母浸膏5g、海藻糖10g、蒸馏水1000mL，自然pH。
将富集培养好的季也蒙毕赤酵母菌发酵液置于离心杯中，3000r/min下离心10min，倒掉上清液，用无菌水清洗两次，所得沉淀用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）洗下并制成季也蒙毕赤酵母菌悬液，用血球计数板计数，调整浓度后备用。
用0.02~0.05mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）配制季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，使液体生防菌剂中含有1×106 ~1×109CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）、2.5~7.5%海藻糖、0.01~0.03%谷胱甘肽、0.01~0.03%抗坏血酸；充分混匀后，分装到已灭菌的离心管中，所分装的菌剂均分为3组，并分别保存在-20℃，5℃，25℃的条件下。
实施例3：季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂各添加成分对效果的影响
本实施例对各成分不同添加量的效果进行了验证，具体的方法如下：
液体制剂添加保护剂单因素筛选：各添加保护剂的保护结果如表1所示，当海藻糖浓度为5 wt %时，Y35-1酵母细胞存活达到最高值，为75.6%；浓度为2.5 wt %和10 wt %时，存活率分别为66.5%和62.0%，因此选择5 wt %海藻糖为最优添加量。
谷胱甘肽起到还原抗逆的保护作用，其在0.01 wt %、0.02 wt %、0.03 wt %浓度时的酵母菌存活率分别为63.6%、78.5%、65.5%，因此选择0.02 wt %谷胱甘肽为最优添加量。
抗坏血酸具有抗氧化而起到抗逆的作用，其在0.01 wt %、0.02 wt %、0.03 wt %浓度时的酵母菌存活率分别为81.3%、76.5%、75.5%，因此选择0.01 wt %抗坏血酸为最优添加量。
表1 不同浓度的添加剂对酵母菌液体制剂细胞存活率的影响（25℃,10d）
选取保护效果好的以上三种添加剂的最优添加量进行复配，进一步验证酵母菌的液体制剂细胞存活率。
分别用2.5 wt %（记为A1，下同）、5 wt %（A2）、10 wt %（A3）海藻糖和0.01 wt %（B1）、0.02 wt %（B2）、0.03 wt %（B3）谷胱甘肽及0.01 wt %（C1）、0.02 wt %（C2）、0.03 wt%（C3）抗坏血酸各一份组合进行试验验证。试验结果显示，最佳组合为A2B2C1，10d后酵母菌存活率为88.2%，高于单一添加剂和其它复配添加剂的酵母菌存活率。因此，选定添加剂复配的最佳组合为5 wt %海藻糖、0.02 wt %谷胱甘肽和0.01 wt %抗坏血酸。
最后，测定液体生防菌剂中的活菌数：季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂制备完成后，采用梯度稀释涂平板的方法确定初始活菌数；在25℃条件下保存的制剂每10天取样进行活菌数的测定；5℃和-20℃保存的制剂每30天取样进行活菌数的测定；然后统计各制剂中酵母菌的存活率。
从图3可以看出，在25℃、5℃、-20℃下存放的Y35-1液体剂型随着贮藏天数的增加，酵母菌细胞存活率下降，但是当添加有海藻糖等物质时，相比较于无添加剂保护的对照酵母菌液（25℃,10d，为70.5%），添加剂对存活率的保持（25℃,10d，为88.2%）起到了积极的作用；而且结果显示，相比较于25℃对照存放的菌剂存活率（90d，<5.0%），在5℃下存放的菌剂的存活率（90d，66.5%）更高，表明此种液体剂型更适宜存放在5℃的条件下。
按照本发明中的配方和制备方法配制的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，在5℃下存放，存活率较高，能较好保持菌剂的效力。
实施例4：季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂应用于采后油桃的生防效果测定
首先，用灭菌打孔器在经过0.1%NaClO消毒并经水清洗的油桃果实（室温晾干后）赤道上打深度为3mm、直径5mm的小孔。吸取实施例2制备的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂10μL接种于油桃伤口处，2h后接入5×104spores/mL的胶孢炭疽菌孢子悬浮液10μL于果实伤口处，（胶孢炭疽菌孢子悬液的制备：将4℃ PDA试管斜面上保藏的胶孢炭疽菌在PDA平板上进行活化。用接种环在培养七天的病原真菌平板上刮去适量孢子并接入无菌蒸馏水中，悬浮均匀后用血球计数板计数，用无菌蒸馏水调至所需浓度后备用），同时以无菌水处理为空白对照，并且设置季也蒙毕赤酵母菌悬液组、未添加谷胱甘肽的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂组作为对比。
然后，将油桃果实放于保鲜膜密封的塑料筐中，于 25℃、RH95%的恒温培养箱中贮藏。每隔7天观察油桃果实的炭疽病发病率并测定病斑直径。每处理组至少30个果实样品，试验重复两次。
由表2可以看出，Y35-1酵母菌液体菌剂处理的油桃果实发病率（16.0%）与果实病斑直径（0.50cm）均比对照组中的（果实发病率100%，病斑直径3.5cm）明显减少，且与之存在显著性差异。
表2 季也蒙毕赤酵母菌液体制剂对油桃果实炭疽病病原菌的生防效力 （21天）
注：结果以平均值±标准误的形式列出；根据邓肯氏新复极差法，不同字母表示各处理间存在显著性差异（p<0.05）
同时相比较于酵母菌悬液组，21d后，液体生防菌剂处理组中的效果优于酵母菌悬液直接处理组中的效果（果实发病率15.0 %，病斑直径0.85 cm）。且液体菌剂中酵母菌细胞的稳定性高于酵母菌悬液的细胞稳定性，其生防活力保存期更长。另外，对比于没有添加谷胱甘肽、其它成分相同的酵母菌液体制剂的同期效果（果实发病率19.0 %，病斑直径0.65 cm），本发明的液体制剂生防效果更佳。
按照本发明中的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的生防效果显示，配制的液体制剂能够有效保留Y35-1酵母菌的细胞活力及生防效力，能有效抑制油桃果实中的炭疽病害的发生与发展。
实施例5：季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂应用于采后枇杷的生防效果测定
测定方法同实施例3的方法。
由表3可见，Y35-1酵母菌液体菌剂处理的枇杷果实炭疽病发病率（15.6%）与果实病斑直径（0.35cm）均比对照组中（果实发病率100%，病斑直径3.10cm）的明显减少，且与之存在显著性差异。
表3季也蒙毕赤酵母菌液体制剂对枇杷果实炭疽病病原菌的生防效力 （21天）
注：结果以平均值±标准误的形式列出；不同字母表示各处理间存在显著性差异（p<0.05）
相比较于酵母菌悬液组，21d时，液体生防菌剂处理组中的果实发病率与果实病斑直径低于酵母菌悬液直接处理组中的效果（果实发病率16.0%，病斑直径0.90cm）。另外，对比于没有添加谷胱甘肽、其它成分相同的酵母菌液体制剂的效果（果实发病率18.5 %，病斑直径0.55 cm），本发明的液体制剂对枇杷果实的生防效果更佳。
按照本发明中的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的生防效果显示，配制的液体制剂能够有效保留Y35-1酵母菌的细胞活力及生防效力，且能有效抑制油桃、枇杷果实中的炭疽病害的发生与发展。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 564
<212> DNA
<213> 季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)
<400> 1
ccagcgctta actgcgcggc gaaaacctta cacacagtgt ctttttgata cagaactctt 60
gctttggttt ggcctagaga taggttgggc cagaggttta acaaaacaca atttaattat 120
ttttacagtt agtcaaattt tgaattaatc ttcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt 180
tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tatgaattgc agattttcgt 240
gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccctctggta ttccagaggg catgcctgtt 300
tgagcgtcat ttctctctca aacccccggg tttggtattg agtgatactc ttagtcggac 360
taggcgtttg cttgaaaagt attggcatgg gtagtactag atagtgctgt cgacctctca 420
atgtattagg tttatccaac tcgttgaatg gtgtggcggg atatttctgg tattgttggc 480
ccggccttac aacaaccaaa caagtttgac ctcaaatcag gtaggaatac ccgctgaact 540
taagcatatc aataagcgga ggaa 564
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (10)
1.一种防治果实炭疽病的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1，于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2016719。
2.一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂包括权利要求1所述的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1，所述季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1的浓度为1×106 ~1×109CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1的浓度为1×108CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂还包括质量浓度为2.5~7.5%的海藻糖、质量浓度为0.01~0.03%谷胱甘肽、质量浓度为0.01~0.03%抗坏血酸、0.02~0.05mol/L pH6.5磷酸缓冲液。
5.根据权利要求4所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂还包括质量浓度为5%的海藻糖、质量浓度为0.02%的谷胱甘肽、质量浓度为0.01%的抗坏血酸、0.05mol/L pH6.5磷酸缓冲液。
6.权利要求1-5任一项所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法操作如下：
将季也蒙毕赤酵母菌活化后，接种于NYDB种子培养基中，培养后得到的种子培养液，将得到的种子培养液接入NYTB发酵培养基中培养后得到酵母菌发酵液；
将得到的酵母菌发酵液置于离心杯中，离心，倒掉上清液，用无菌水清洗，所得沉淀用0.05mol/L磷酸缓冲液洗下并制成酵母菌悬液，用血球计数板计数，调整浓度后备用；
用0.02~0.05mol/L磷酸缓冲液配制季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，使液体生防菌剂中含有1×106 ~1×109CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）Y35-1、2.5~7.5wt %海藻糖、0.01~0.03 wt %谷胱甘肽、0.01~0.03 wt %抗坏血酸；充分混匀后，分装到已灭菌的离心管中，保存。
7.根据权利要求6所述的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述用0.05mol/L磷酸缓冲液配制季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，使液体生防菌剂中含有1×108CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichia guilliermondii）Y35-1、5 wt %海藻糖、0.02 wt%谷胱甘肽、0.01 wt %抗坏血酸。
8.权利要求2所述的生防菌剂在防治果实病害中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述果实包括但不限于油桃、枇杷。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病害为炭疽病。
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| CN109055248A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-21 | 江苏大学 | 一种生防酵母菌活性冻干粉及其制备方法 |
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