CN109452088A - 金针菇x18及其栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食用菌领域，特别涉及金针菇X18及其栽培方法。本发明提供的金针菇新品种“雪榕金针菇X18”，长速快，将生产周期缩短了2天，生育期间芽出量大，产量较原始品种提高了20g/瓶左右，有效节约了工厂成本，提高工厂化栽培出菇的效益。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌领域，特别涉及金针菇X18及其栽培方法。
背景技术
金针菇学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等。英文为：“EnokiMushroom”，植物学名为Flammulina velutiper(Fr.)Sing。因其菌柄细长，似金针菜，故称金针菇，属伞菌目白蘑科针金菇属，是一种菌藻地衣类，具有很高的药用食疗作用。
金针菇在自然界广为分布，中国、日本、俄罗斯、欧洲、北美洲、澳大利亚等地均有分布。在中国北起黑龙江，南至云南，东起江苏，西至新疆均适合金针菇的生长。金针菇不含叶绿素，不具有光合作用，不能制造碳水化合物，但完全可在黑暗环境中生长，必须从培养基中吸收现成的有机物质，如碳水化合物、蛋白质和脂肪的降解物，为腐生营养型，是一种异养生物，属担子菌类。金针菇是一种木材腐生菌，易生长在柳、榆、白杨树等阔叶树的枯树干及树桩上。
金针菇是秋冬与早春栽培的食用菌，以其菌盖滑嫩、柄脆、营养丰富、味美适口而著称于世，特别是凉拌菜和火锅的上好食材，其营养丰富，清香扑鼻而且味道鲜美，深受大众的喜爱。据测定，金针菇氨基酸的含量非常丰富，高于一般菇类，尤其是赖氨酸的含量特别高，赖氨酸具有促进儿童智力发育的功能。金针菇干品中含蛋白质8.87％，碳水化合物60.2％，粗纤维达7.4％，经常食用可防治溃疡病。有研究又表明，金针菇内所含的一种物质具有很好的抗癌作用。金针菇既是一种美味食品，又是较好的保健食品，金针菇的国内外市场日益广阔。金针菇人工栽培技术并不复杂，只要能控制好环境条件，就容易获得稳定可靠的产量。
金针菇由营养器官(菌丝体)和繁殖器官(子实体)两大部分组成。⑴菌丝体由孢子萌发而成，在人工培养条件下，菌丝通常呈白色绒毛状，有横隔和分枝，很多菌丝聚集在一起便成菌丝体。和其它食用菌不同的是，菌丝长到一定阶段会形成大量的单细胞粉孢子(也叫分生孢子)，在适宜的条件下可萌发成单核菌。金针菇丝或双核菌丝。有人在试验中发现，金针菇菌丝阶段的粉孢子多少与金针菇的质量有关，粉孢子多的菌株质量都差，菌柄基部颜色较深。⑵子实体主要功能是产生孢子，繁殖后代。金针菇的子实体由菌盖、菌褶、菌柄三部分组成，多数成束生长，肉质柔软有弹性。菌盖呈球形或呈扁半球形，直径1.5～7厘米，幼时球形，逐渐平展，过分成熟时边缘皱折向上翻卷。菌盖表面有胶质薄层，湿时有粘性，色黄白到黄褐，菌肉白色，中央厚，边缘薄，菌褶白色或象牙色，较稀疏，长短不一，与菌柄离生或弯生。菌柄中央生，中空圆柱状，稍弯曲，长3.5～15厘米，直径0.3～1.5厘米，菌柄基部相连，上部呈肉质(亦有书说菌柄为纤维质、胶质)，下部为革质，表面密生黑褐色短绒毛，担孢子生于菌褶子实层上，孢子圆柱形，无色。
金针菇氨基酸的含量非常丰富，高于一般菇类，尤其是赖氨酸的含量特别高，赖氨酸具有促进儿童智力发育的功能。
金针菇不仅可以预防和治疗肝脏病，而且也适合高血压患者、肥胖者和中老年人食用，这主要是因为它是一种高钾低钠食品。
金针菇可抑制血脂升高，降低胆固醇，防治心脑血管疾病。食用金针菇具有抵抗疲劳、抗菌消炎、消除重金属盐类物质、抗肿瘤的作用。
金针菇可抑制血脂升高，降低胆固醇，防治心脑血管疾病。
食用金针菇具有抵抗疲劳，抗菌消炎。
经常食用金针菇，不仅可以预防和治疗肝脏病及胃、肠道溃疡，而且也适合高血压患者、肥胖者和中老年人食用，这主要是因为它是一种高钾低钠食品。
金针菇营养成分十分丰富，如蛋白质、维生素B1、B2等，具有利湿热、宽胸、利尿、止血、下乳的功效，并且治产后乳汁不下，用金针菇炖瘦猪肉食用，极有功效。
综上所述，金针菇具有降低胆固醇、缓解疲劳、抑制癌细胞、提高免疫力的功效。
市场在售的金针菇，有的菇盖白度一般，经常会有凹陷甚至是畸形菇盖，整把菇高度参差不齐，摸上去不紧实，切根后容易散开。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种金针菇X18及其栽培方法。本发明提供的金针菇新品种“雪榕金针菇X18”，长速快，将生产周期缩短了2天，生育期间芽出量大，产量较原始品种提高了20g/瓶左右，有效节约了工厂成本，提高工厂化栽培出菇的效益。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了新品种金针菇，其保藏编号为CGMCC No.14986。
在上述技术方案的基础上，本发明还提供了所述的金针菇在制备降低胆固醇、缓解疲劳、抑制癌细胞和/或提高免疫力的药物中的应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还提供了所述的金针菇的液体培养基，以质量份计，所述培养基包括：
在上述技术方案的基础上，本发明还提供了所述的金针菇的栽培培养基，以质量份计，包括如下组分：
在上述技术方案的基础上，本发明还提供了所述金针菇的系统选育方法，取原始菌株经菌丝翻接、培养、搔菌、子实体生长，选择菇形好的子实体组织分离接入PDA培养基中，选择产量高、菇体健壮、菇型好的菌株，获得所述金针菇。
在上述技术方案的基础上，本发明还提供了所述金针菇的培养方法，取本发明所述的金针菇接种至培养基培养。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养包括菌丝翻接、摇瓶培养、发酵罐培养和栽培瓶培养。
在本发明的一些具体实施方案中，所述菌丝翻接采用PDA培养基，所述金针菇的接种量为1块菌块，菌块大小为5*5*3mm，活菌数约为1200cfu/g。
在本发明的一些具体实施方案中，所述摇瓶培养采用如权利要求3所述的液体培养基，所述金针菇的接种量为4块菌块，每块菌块大小为5*5*3mm，活菌数约为1200cfu/g。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵罐培养采用如权利要求3所述的液体培养基，所述金针菇的接种量为600mL菌液，活菌数约为1700cfu/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述栽培瓶培养采用如权利要求4所述的栽培培养基，所述金针菇的接种量为35-37mL菌液，活菌数约为1700cfu/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述摇瓶培养的培养温度为22℃，培养转速为150rpm/min；培养时间为7天。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵罐培养的培养温度为22～23℃，培养时间为7天。
在本发明的一些具体实施方案中，所述栽培瓶培养为于温度21～23℃、湿度65％～70％、CO2浓度2000～3000ppm的条件下培养20天。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养期的菌丝恢复至芽出需要7-8天，这期间的生长条件为：温度控制为14℃～16℃，湿度为95～100％，CO2浓度为2000ppm以下，无光照；出芽后调节温度4℃～15℃，相对湿度为85％～95％，CO2浓度为2000～8000ppm，光照强度5～20LUX，生长时间为20～21天。
优质金针菇外观应该是菇盖洁白圆小，呈半球形隆起，没有畸形或凹陷，整把菇的高度整齐一致，菌柄根部紧实，切根后不易松散。本发明通过系统选育得到的金针菇新品种“雪榕金针菇X18”，解决了市场上金针菇的白度不够、菇盖畸形、整把菇不整齐等问题，并且本发明提供的金针菇新品种“雪榕金针菇X18”，长速快，将生产周期缩短了2天，生育期间芽出量大，产量较原始品种提高了20g/瓶左右，有效节约了工厂成本，提高工厂化栽培出菇的效益。
和市场上的金针菇比较，本发明提供的金针菇品种“雪榕金针菇X18”具有以下优点：
1、本发明提供的金针菇品种“雪榕金针菇X18”总栽培周期比传统工艺缩
短了2天；
2、发明提供的金针菇品种“雪榕金针菇X18”生育期间的芽出量较多，单产较高，超出原始金针菇品种“X3”20g/瓶，平均单产为413.47g/瓶；
3、发明提供的金针菇品种“雪榕金针菇X18”的菇盖形状比品种“X3”略小，白度更好，菇盖不易凹陷，畸形菇盖较少；
4、发明提供的金针菇品种“雪榕金针菇X18”整把菇的高度相近，整齐度较好；菇柄的紧实度较好，切根后不容易松散。
生物保藏说明
生物材料：X18；分类命名：金针菇(Flammulina velutipes)；于2017年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.14986。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明提供的金针菇“雪榕金针菇X18”的系统选育流程；
图2示本发明提供的金针菇“雪榕金针菇X18”的生产工艺流程；
图3示本发明提供的金针菇菌株营养生长阶段菌丝生长特征；其中，左边三支试管种为本次申请专利品种的雪榕金针菇“雪榕金针菇X18”，右边三支试管为雪榕自有金针菇“X3”；雪榕金针菇X18比X3菌丝浓白，气生菌丝旺盛，雪榕金针菇X18菌种块已经看不清了，试管壁气生菌丝旺盛；但是X3的菌种块比较明显，试管壁气生菌丝也相对稀薄；
图4示不同金针菇菌株之间的菌丝拮抗反应；
图5示不同金针菇的性状比较；其中，图5(A)为整把菇的整齐度、高度和白度对比；图5(B)示切根后整把菇的白度和紧实度对比；
图6示本发明提供的金针菇“雪榕金针菇X18”的基因组DNA电泳图谱；其中，泳道从左至右依次为：Marker，金针菇“雪榕金针菇X18”；
图7示本发明提供的金针菇“雪榕金针菇X18”的ITS系统发育树。
具体实施方式
本发明公开了一种金针菇X18及其栽培方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
食用菌的系统选育，即在现有的品种群体中选择优良的自然变异，通过比较鉴定而培育出新品种，其实质是优中选优。具体流程为：原始菌株-菌丝翻接-摇瓶培养-发酵罐培养-出菇比较-子实体组织分离-确立优选菌株。
材料
试验菌种
X3：雪榕自有金针菇品种，已获得上海市品种认定；
雪榕金针菇X18：由X3经系统选育而成。
培养基
PDA培养基：4％日本寒天培养基，自然pH。
液体培养基：白砂糖2％、豆粕粉0.3％、磷酸二氢钾0.06％、硫酸镁0.06％、自来水定容至所需含量，PH自然。
栽培培养基：玉米芯38.2％、米糠29.2％、麸皮10.6％、棉籽壳5.3％、大豆皮5.3％、啤酒糟4.8％、甜菜渣2.1％、豆腐渣2.1％、贝化石1.6％、轻质碳酸钙0.7％，装瓶重量975-1100克、含水量67.5％-69.5％。
原料要求：金针菇工厂化栽培原料主要有玉米芯、米糠、棉子壳、麸皮、大豆皮等。原料必须保持新鲜、干燥，无虫蛀和霉变现象，颗粒度符合设备和工艺要求。原料保存过程中应通风换气，保持储藏环境干燥。
原料混合：按配方要求准确定量，使物料充分搅拌均匀，加水至含水量达到67.5％-69.5％，pH6.5-7.0。根据季节变化调整搅拌时间，防止混合料酸败，搅拌至装瓶结束。
装瓶：使用1100ml耐高温塑料瓶在装瓶机上完成装瓶过程。要求装瓶上紧下松，瓶间装料差异小于40g，装料高度距瓶肩1-1.5cm，中间打孔至瓶底，装瓶后应立即盖上瓶盖。
灭菌：装瓶结束后立即进行高压高温灭菌，100℃保持60min，升温至121℃保持60min，必须彻底杀灭培养料中的所有微生物及孢子。
冷却：灭菌后瓶筐推入冷却室进行冷却至22℃以下，冷却室、接种室安装净化装置和制冷设备。
专业术语：
搔菌：就是用搔菌机(或手工)去除老菌种块和菌皮，这是促使菌丝发生原基的重要措施，通过搔菌可使子实体从培养基表面整齐发生
子实体：是高等真菌的产孢构造，即果实体，由已组织化了的菌丝体组成。在担子菌中又叫担子果，在子囊菌中又叫子囊果。无论是有性生殖还是无性生殖，无论结构简单或复杂，都称其产孢结构为子实体。
原基：食用菌出菇之前，由菌丝缠绕扭结形成的一个一个小颗粒，长大后即为一个一个蘑菇。
菌丝：单条管状细丝，为大多数真菌的结构单位，一些原核生物也有菌丝，如放线菌。
菌丝体：很多菌丝聚集在一起组成真菌的营养体，即菌丝体。
诱变育种：利用物理或化学等因素，使基因载体DNA分子产生变异，从中加以选择和利用的一种育种方法。物理因素如紫外线、x－射线、r—射线、同位素Co60和激光等。化学诱变剂都是直接作用于DNA分子，根据其化学性质或作用方式，一般可分为三大类：(1)碱基类似物，如5—溴尿嘧啶及a—氨基嘌呤等；(2)改变DNA碱基结构的诱变剂，如亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍等；(3)移码诱变剂，如吖啶类、吡啶类、多环烃、含氮杂环致癌物、真菌毒素、抗菌素，研究较多的有吖啶类化合物。
原生质体融合技术:指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
本发明提供的金针菇X18及其栽培方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1栽培种的制备
接种操作人员必须符合无菌操作的要求，接种时瓶内温度控制在25℃以下，并使用显微镜检，确保液体菌种无污染且活力旺盛方可用于接种栽培。每个品种制作20筐，共960瓶，采用液体菌种，每个栽培瓶的接种量为35-37mL菌液,其中菌丝量湿重约为4.2g/20mL，活菌数约为1700cfu/mL。
培养出菇期间随机抽取2筐，观察菌丝转色、原基显蕾时间、原基数量、整齐度、采收时间等农艺性状，全部采收后计算出平均单产。
实施例2培养生育出菇
培养：培养室温度控制在17℃-19℃，湿度维持在90％左右，CO2浓度控制在2000-3000ppm。培养时间为20-22天。
搔菌：搔菌是一个动作步骤，培养期结束进行搔菌操作，然后转入子实体生长。
培养结束，将发满的栽培瓶采用搔菌机平搔处理，搔菌深度以1-1.5cm为宜，去除表面的老菌块，保持料面平整，补水后进入生育室进行子实体生长出菇。
子实体生长：菌丝恢复至芽出7-8天，温度控制在14-16℃，相对湿度95％-100％，CO2浓度小于2000ppm，无光照；芽出后随菇体的长势调节温度，控制范围在4℃-15℃，相对湿度控制在85％-95％，CO2浓度控制在2000-8000ppm，光照强度5-20LUX。
采收包装：待菇体高度达到套筒纸高度，菌盖未开伞，菌盖直径1-2cm时采收；采收时将整把金针菇采下，刀切去底部培养基，包装后入冷库，冷库温度控制在3℃～5℃。
挖瓶：采收后的瓶框及时运至挖瓶区，把培养料挖除，空瓶筐运至装瓶区域重新使用，废料清运出厂。
实施例3金针菇菌株营养生长阶段菌丝生长特征
图3中左边三支试管种为本次申请专利品种的雪榕金针菇品种“雪榕金针菇X18”，右边三支试管为雪榕自有金针菇品种“X3”。图中可以清楚的看到雪榕金针菇X18试管种菌丝比X3菌丝浓白，气生菌丝旺盛。雪榕金针菇X18菌种块已经看不清了，试管壁气生菌丝旺盛；但是X3的菌种块比较明显，试管壁气生菌丝也相对稀薄。
实施例4不同金针菇菌株之间的菌丝拮抗反应
将雪榕金针菇X18和X3进行拮抗实验，如图4所示，有明显的拮抗线，初步判断雪榕金针菇X18和X3为不同菌种。
实施例5金针菇品种“雪榕金针菇X18”的品种稳定性试验
每周进行一次试验操作，制作品种“雪榕金针菇X18”的摇瓶种接栽培出菇，每次32瓶摇瓶种，接栽培种512瓶，纵向观察比较不同传递代数接种出菇的情况，通过观察，判断品种特性和菌种连续使用过程中的稳定性。
表1雪榕金针菇X18摇瓶接栽培出菇实验采收单产(g/瓶)
| 品种 | 第1次 | 第2次 | 第3次 | 第4次 | 第5次 | 第6次 | 平均单产(g/瓶) |
| X18A | 408.4 | 427.87 | 415.23 | 425.36 | 422.32 | 428.21 | 421.23 |
| X18B | 410.91 | 396.78 | 425.65 | 426.86 | 422.69 | 425.47 | 418.06 |
| X18C | 412.5 | 408.55 | 422.35 | 412 | 409.12 | 415.62 | 413.36 |
试验结果表明，随着传递代数的增加采收单产趋于平稳状态。
实施例6不同品种在培养和生育过程中比较
连续5批次进行种子罐接栽培出菇试验，每批次接种160瓶栽培瓶，通过出菇试验判断金针菇品种“雪榕金针菇X18”的出菇特性、产品质量和单产情况。
表2雪榕金针菇X18与X3芽出数量统计表
注：*示X18与X3相比具有显著差异(P＜0.05)；#示X18与X3相比具有极显著差异(P＜0.01)。
由表2可见，金针菇品种雪榕金针菇X18的芽出数量要明显高于品种“X3”，整体的生长速度略快于“X3”。
表3独立样本生物统计学检验结果
将品种“雪榕金针菇X18”和品种“X3”的切(根数)数据利用生物统计学软件spss分析后得到表3，与对照菌相比，从根部往上10cm切，品种“雪榕金针菇X18”的芽出数量具有极显著差异(P＜0.01)。
表4雪榕金针菇X18和X3单产统计表
由表4可见，品种“雪榕金针菇X18”每批次采收的单产均高出品种“X3”，平均高出22.2g/瓶。
表5独立样本生物统计学检验结果
将品种“雪榕金针菇X18”和品种“X3”的单产数据利用生物统计学软件spss分析后得到表5，与对照菌相比，品种“雪榕金针菇X18”的单产具有极显著差异(P＜0.01)。
表6雪榕金针菇X18和X3的培养生育周期比较
由表6可见，“雪榕金针菇X18”总栽培周期比“X3”缩短了2d，为46天。
表7独立样本生物统计学检验结果
将品种“雪榕金针菇X18”和品种“X3”的培养生育周期数据利用生物统计学软件spss分析后得到表7，与对照菌相比，品种“雪榕金针菇X18”的培养生育周期具有极显著差异(P＜0.01)。
实施例7不同金针菇品种的性状比较
农艺性状的好坏直接关系到金针菇作为商品的质量及食用菌工厂的成本。如图5(A)、图5(B)、表6所示，雪榕金针菇品种“雪榕金针菇X18”比原始菌株产量有明显提高，从产品形态上看，品种“雪榕金针菇X18”的菇盖形状比品种“X3”略小，白度更好；并且菇盖不易凹陷，畸形菇盖较少；整把菇的高度相近，整齐度较好；菇柄的紧实度较好，切根后不容易松散。
表8雪榕金针菇X18和X3的农艺性状比较
表9独立样本生物统计学检验结果
将品种“雪榕金针菇X18”和品种“X3”的农艺性状数据利用生物统计学软件spss分析后得到表9，与对照菌相比，品种“雪榕金针菇X18”的菌柄长度和畸形菇盖发生概率具有极显著差异(P＜0.01)。
实施例8金针菇X18的分子鉴定报告
供试品种
X3，雪榕生物科技股份有限公司自有金针菇品种(已通过上海市品种审定)
雪榕金针菇X18，经X3系统选育而成
供试培养基、试剂及配制方法
(1)PDB液体培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L。
(2)基因组DNA提取试剂：
LETS缓冲液LiCl0.424g，EDTA 0.372g，Tris 0.242g，SDS 0.5g(将上述试剂称好后，溶于90ml的无菌重蒸水中，用HCl调节pH值至7.8-8.0，最后定容至100ml，按50mg：100ml加入蛋白酶K)
PCI试剂苯酚氯仿异戊醇(比例为25：24：1)
(3)ITS扩增反应试剂
引物序列：本研究选用真菌通用引物ITS1F(Gardes&Bruns,1993)/ITS4(White etal.1990)来扩增ITS区，引物序列如下
ITS1 5’-TCC GTAGGT GAACCT GCGG-3’(如SEQ ID No.2所示)
ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(如SEQ ID No.3所示)
引物由英骏维基生物技术有限公司合成，配制成10μM的反应液，-20℃分装保存备用。
电泳用琼脂糖(Spanish)
10×PCR反应缓冲液，25mM MgCl2，TaqDNA聚合酶(Promega)
10mM dNTP(Genview分装)
(4)DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)
主要使用仪器
恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂生产，81-2型
摇床上海一恒
灭菌锅SS-325，TOMY SEIKO CO.LTD.
真空冷冻干燥仪EDWARDS，4K2-4L
PCR扩增仪Mastercycler Gradient(Eppendorf)
水平板电泳仪BIO-RAD
摄像系统Image Master VDS(Pharmacia Biotech)
实验方法
(1)菌丝培养及基因组DNA的提取
将培养好的菌株(PDA)接入PDY液体培养基中，25-28℃振荡(150r/min)培养7-9天，收集菌丝，用无菌超纯水洗涤2-3次，冷冻干燥后，低温保存备用。采用改良过的LETS法提取基因组DNA。具体步骤如下：
①将冻干的菌丝置于预冷的无菌研钵中研磨，加入适量的LETS缓冲液，12000rpm，4℃，离心20min
②取上清，加入等体积的PCI试剂，轻轻混匀10min以上，12000rpm，4℃，离心10min，重复此步骤3-4次。
③取上清，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，在-20℃冰箱中放置片刻，10000rpm，4℃，离心10min。
④用75％乙醇、10mM KAc洗涤沉淀2次，10000rpm，4℃，离心5min。
⑤吸干残液加-20℃预冷的95％乙醇，轻轻混匀，10000rpm，4℃，离心10min，自然晾干。
⑥加适量TE buffer溶解沉淀，加入2μl RNase(1mg/ml)37℃水浴1h去除RNA。
⑦取2μl DNA样品经1％的琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的质量。
(2)ITS区的PCR扩增
扩增反应体系(25μl)：10×PCR buffer 2.5μl，MgCl2(25mmol/L)2.0μl，dNTP(10mmol/L)0.5μl，引物ITS1F/ITS4(10μmol/L)各1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，DNA模板10ng，加无菌双蒸水补足。PCR反应条件为94℃2min；94℃15s，62℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。
反应结束后取10μl扩增产物，经1.2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后置于VDS凝胶成像系统照相。
(3)PCR扩增产物的纯化
①PCR扩增产物经琼脂糖电泳后，在紫外灯下切取含有目的条带的琼脂糖凝胶。
②称量凝胶重量，以1mg＝1μl换算凝胶体积。
③加入3倍体积的Buffer DE-A，悬浮均匀后75℃加热，每隔2-3分钟混合一次，直至凝胶完全融化，约6-8分钟(凝胶块必须完全融化，以充分释放凝胶中的DNA)。
④按Buffer DE-A体积的50％加入Buffer DE-B，混合均匀。
⑤将DNA-prep Tube置于2mlMicrofuge Tube中，将步骤5中的混合液移入DNA-prep Tube中，12000g离心1分钟。
⑥弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，加入500μl BufferW1，12000g离心1分钟。
⑦弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2mlMicrofuge Tube中，加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2，12000g离心1分钟，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。
⑧将DNA-prep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，12000g离心1分钟。(9)将DNA-prep Tube置于另一已灭菌的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25μl已65℃预热的洗脱液，室温静置1分钟。12000g离心1分钟洗脱DNA。
⑨用无菌枪头取2μl经琼脂糖凝胶电泳检测回收效果。
(4)ITS区的PCR扩增产物的序列测定
序列测定委托上海生工公司进行测序。
(5)ITS序列的准确定位和系统发育树的构建
根据Genbank中已有金针菇的ITS序列资料，确定ITS序列的长度。利用ClustalX2.1软件对FastA格式的DNA序列进行排列分析。将重排后得到的金针菇ITS序列，以Flammulinavelutipes和Flammulina fennae作为外类群，利用MEGA 4.1软件中的neighbour-joining methods进行聚类分析，建立基于ITS序列的系统发育树。
结果与分析
(1)DNA提取效果，见图6。通过图6可以看出DNA的质量较好，完全可以满足本试验的要求。
(2)ITS序列比对：具体序列序列比对结果：
X18GACGGAGGAC CCTCACGGGT TCTTCGTACG TGCACGTCTG GGGTTGCAGC TTTCTTCGTC
X3J...-.......T................................................
X18 CACCTGTGCA CACTCTGTAG GTCTGGATAC CCCATTGGAA GGGTGCGCTT TTTGCGCTCC
X3J............................................................
X18 CTTTGCCTTC CAGGCCTATG TCTTACAAAC ACTATAGTAT GTAACGAATG TCATTGATTA
X3J............................................................
X18 TTGGACTTCA CTGTCCTTTAAACTAAATAC AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGCTCTCG
X3J............................................................
X18 CATCGATGAAGAACGCAGCG AAATGCGATA ACTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC
X3J............................................................
X18 ATCGAGCCTT TGAACGCACC TTGCGCCCTT TGGTACTCCG AAGGGCATGC CTGTTTGAGT
X3J......T.....................................................
X18 GTCAGTAACT TCTCAACCTC CCTCACTTTG TTGTGAGCTG GCGGATTGGA CGTGGGGGCT
X3J............................................................
X18 TGCTGGACCT TATCTTTGGG TTCAGCTCCC CTGAAATGCA TTAGCAGAAA CCGTTACCTT
X3J............................................................
X18 TTGGCGCGCT GCAGCTGTGA TAATTATCTACGGCTATGGC TGGGCCGACT GTGTTGTAGC
X3J.............................................T..............
X18GCTCGTCTCG TCTCTGAAGT GGTTTCGCCT TAGTTGGTGC TTCCCTTTGC CTTCTCTCTC
X3J............................................................
X18ACGAGAGATA CCTGTGGCGC GAGTGCGCGG GCTATTCCGC TTCTAACCGT CCCCCTTGTG
X3J................A.....................................-.....
X18GG
X3J..
通过与GenBank中相关序列的比较分析确定，金针菇X18的ITS序列长度为662bp左右。
金针菇X18的DNA测序结果：(如SEQ ID No.1所示)
AGGCCTATGTCTTACAAACACTATAGTATGTAACGAATGTCATTGATTATTGGACTTCACTGTCCTTTAAACTAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTACTCCGAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCAGTAACTTCTCAACCTCCCTCACTTTGTTGTGAGCTGGCGGATTGGACGTGGGGGCTTGCTGGACCTTATCTTTGGGTTCAGCTCCCCTGAAATGCATTAGCAGAAACCGTTACCTTTTGGCGCGCTGCAGCTGTGATAATTATCTACGGCTATGGCTGGGCTGACTGTGTTGTAGCGCTCGTCTCGTCTCTGAAGTGGTTTCGCCTTAGTTGGTGCTTCCCTTTGCCTTCTCTCTCACGAGAGATACCTGTGGCGCGAGTGCGCGGGCTATTCCGCTTCTAAC
(3)各菌株间的遗传距离
表10金针菇的遗传距离
从表7可以看出，供试的金针菇菌株遗传距离均极小，ITS序列差异均很小，这说明这些菌株ITS序列的演化速度较慢。
(4)系统发育树，如图7所示。
由图7可以看出，雪榕金针菇X18同X3J有差异，但差异很小，而且同GenBank中的金针菇MG722735.1亲缘关系也较近。
虽然金针菇的ITS序列比对结果和系统发育树表明供试的2个菌株在ITS序列上没有较大差异，亲缘关系较近，但不能排除在人工作用下它们的子实体在外观、产量等农艺性状上有差异甚至是显著差异，即品种间的差异。
实施例9本发明提供的“雪榕金针菇X18”的生物学特征
菌丝体：雪榕金针菇品种“雪榕金针菇X18”菌丝在22-24℃生长旺盛，气生菌丝浓白，菌落蓬松，菌丝生长速度快。
菌盖：雪榕金针菇品种“雪榕金针菇X18”菌盖伞形，呈纯白色，大小基本一致，菌盖直径5-8mm，边缘整齐内卷。
菌褶：雪榕金针菇品种“雪榕金针菇X18”菌褶为白色，长短交替，与菌柄的着生关系均是直生。
菌柄：雪榕金针菇品种“雪榕金针菇X18”菌柄细长，中间直径为2-4mm，平均长度140-200mm，肉质脆嫩，菌柄与菌盖的着生关系是中生，菌柄白色。
子实体：子实体丛生，基部相连，菌肉白色，无任何苦味。
孢子：孢子印均为白色，产孢子能力强，孢子卵球形，直径5μm左右。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海雪榕生物科技股份有限公司
<120> 金针菇X18及其栽培方法
<130> MP1807303
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 516
<212> DNA
<213> X18(X18)
<400> 1
aggcctatgt cttacaaaca ctatagtatg taacgaatgt cattgattat tggacttcac 60
tgtcctttaa actaaataca actttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag 120
aacgcagcga aatgcgataa ctaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt 180
gaacgcacct tgcgcccttt ggtactccga agggcatgcc tgtttgagtg tcagtaactt 240
ctcaacctcc ctcactttgt tgtgagctgg cggattggac gtgggggctt gctggacctt 300
atctttgggt tcagctcccc tgaaatgcat tagcagaaac cgttaccttt tggcgcgctg 360
cagctgtgat aattatctac ggctatggct gggctgactg tgttgtagcg ctcgtctcgt 420
ctctgaagtg gtttcgcctt agttggtgct tccctttgcc ttctctctca cgagagatac 480
ctgtggcgcg agtgcgcggg ctattccgct tctaac 516
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (10)
1.金针菇，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.14986。
2.如权利要求1所述的金针菇在制备降低胆固醇、缓解疲劳、抑制癌细胞和/或提高免疫力的药物中的应用。
3.如权利要求1所述的金针菇的液体培养基，其特征在于，以质量份计，所述培养基包括：
4.如权利要求1所述的金针菇的栽培培养基，其特征在于，以质量份计，包括如下组分：
5.如权利要求1所述的金针菇的系统选育方法，其特征在于，取原始菌株经菌丝翻接、培养、搔菌、子实体生长，选择菇形好的子实体组织分离接入PDA培养基中，选择产量高、菇体健壮、菇型好的菌株，获得所述金针菇。
6.如权利要求1所述的金针菇的培养方法，其特征在于，取如权利要求1所述的金针菇接种至培养基培养。
7.如权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于，所述培养包括菌丝翻接、摇瓶培养、发酵罐培养和栽培瓶培养。
8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述菌丝翻接采用PDA培养基，所述金针菇的接种量为1块菌块，菌块大小为5*5*3mm，活菌数约为1200cfu/g；
所述金针菇的接种量为4块菌块，每块菌块大小为5*5*3mm，活菌数约为1200cfu/g；
所述金针菇的接种量为600mL菌液，活菌数约为1700cfu/mL；
所述金针菇的接种量为20mL菌液，活菌数约为1700cfu/mL。
9.如权利要求7或8所述的培养方法，其特征在于，所述摇瓶培养的培养温度为22℃，培养转速为150rpm/min；培养时间为7天；
所述发酵罐培养的培养温度为22～23℃，培养时间为7天；
所述栽培瓶培养为于培养室温度控制在17℃-19℃，湿度维持在90％左右，CO2浓度控制在2000～3000ppm；培养时间为20-22天。
10.如权利要求7至9任一项所述的培养方法，其特征在于，所述培养期的菌丝恢复至芽出需要7-8天，这期间的生长条件为：温度控制为14℃～16℃，湿度为95～100％，CO2浓度为2000ppm以下，无光照；出芽后调节温度4℃～15℃，相对湿度为85％～95％，CO2浓度为2000～8000ppm，光照强度5～20LUX，生长时间为20～21天。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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