CN107779406A - 灰树花设施化栽培新品种及其液体发酵菌种制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灰树花设施化栽培新品种及其液体发酵菌种制作方法，属于一种食药用菌及其液体发酵菌种制作方法。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14354，保藏日期2017年07月19日。本发明灰树花新品种较耐低温，栽培周期短，生物学转化率可达40％；网格架设施化栽培空间利用率大大提高，避免传统覆土栽培模式费时费工的栽培模式，可以半自动化栽培，适宜东北和华北地区设施栽培。该品种灰树花液体发酵菌种制作技术具有成本低、周期短、发菌迅速、纯度高、污染少等优势。

Description

灰树花设施化栽培新品种及其液体发酵菌种制作方法

技术领域

本发明属于一种食药用菌设施化栽培新品种及其液体发酵菌种制作方法，尤其是指灰树花设施化栽培新品种及其液体发酵菌种制作方法。

背景技术

灰树花[Grifolafrondosa(Fr.)Gray]又名栗子蘑，莲花菇，千佛菌，云蕈、日本的商品名称为“舞茸”。子实体肉质，短柄，呈珊瑚状分枝，末端生扇形至匙形菌盖，重叠成丛；是一种中温型、好氧、喜光的木腐菌，夏秋季发生于栎树、板栗、栲树、青冈栎等壳斗科树种及阔叶树的树桩或树根上。

灰树花是世界上新开发的一种大型优良食、药两用真菌，其味道鲜美，营养丰富，且具有抗肿瘤、增强免疫力、降血压、抑制艾滋病及抗病毒等多种药用价值；因为其特殊的生物学特性，主要生长于中年栗树根部周围，目前为产栗区特有，所以野生量小，市场紧俏，价格昂贵目前，国内已经开展了灰树花栽培技术、生态条件与营养分析等方面的研究，但由于种质资源匮乏和投入不足，关于灰树花品种的选育研究还比较少，育种后劲明显不足，并且对野生灰树花种质资源的调查、采集、保藏和开发利用严重落后，造成育种的种质材料少，遗传背景过窄，难以选育出符合当今和未来市场需求的优良品种，而满足灰树花产业化、规模化生产的种类更是少之又少。迄今为止，国内所用规模生产的灰树花菌种主要引自日本和部分野生驯化菌种，存在着适应性差、抗杂菌能力弱、转化效率低等不足之处，因此菌株品质成为限制灰树花进一步发展的主要因素。

无论是固体栽培还是深层液体发酵，品质优良的菌种都是关键，并且鉴于生产菌种存在的问题，开展灰树花育种和种质资源创新方面的研究是非常有必要的。

目前国内乃至世界上食用菌的设施化工厂化栽培已经成为主流，液体菌种因为具有生产周期短，菌龄一致，菌丝发育点多，接种后萌发快，且成本低等优点，更是设施化以及工厂化栽培食用菌的核心技术之一，所以灰树花的液体菌种的制作技术也就有着迫切的研发需求和应用前景。

发明内容

本发明提供一种灰树花设施化栽培新品种及其液体发酵菌种制作方法，以解决因其特殊的生物学特性，野生量小，且现有栽培技术和品种栽培周期长，市场紧俏，价格昂贵等问题。

本发明采取的技术方案是：灰树花设施化栽培新品种，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14354，保藏日期2017年 07月19日。

本发明灰树花设施化栽培新品种的液体发酵菌种制作方法，包括下列步骤：

(一)、固体原种培养基扩繁

(1)配制与分装固体原种培养基

固体原种培养基配方：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L；

洗净去皮土豆切成3cm见方小块，称取200g，与1.3L水在锅中煮沸，待土豆煮至软化后用四层纱布过滤得到滤液，再次加热煮沸5min左右，搅拌同时加入20g葡萄糖与20g琼脂粉，待药品完全溶解后将滤液定容至1L，趁热分装入1L玻璃三角瓶内， 500mL/瓶；

(2)固体原种培养基的灭菌

三角瓶顶部加封透气膜与一张120mm×120mm报纸，防止灭菌时冷凝水进入玻璃三角瓶，用皮筋系牢后装入框中，设置灭菌参数121℃，30min，待压力表降至0个大气压、温度降至80℃以下后出锅，取出后放入超净工作台自然降温；

(3)固体原种培养基的分装

待上述玻璃三角瓶中培养基降温至38～40℃，尚未凝固且不烫手时，在酒精灯火焰附近迅速分装至培养皿，每个培养皿内倒固体原种培养基10-15mL，盖上培养皿盖，冷却至凝固，随后用封口膜密封缝隙，用以保存培养基水分，即得到固体原种培养基；

(4)固体原种培养基接种

将上述做好的固体原种培养基，放置于超净工作台紫外杀菌30min，随后打开风机吹淋10min，10min后开启照明，进行无菌操作，首先酒精擦手，进入工作台内晾干，点燃酒精灯置于平板后方，便于火焰在风作用下朝向平板操作区域，接种刀与接种钩在酒精灯外焰加热至红热后自然降温，待进入平板部分降至室温左右即可放在酒精灯火焰附近备用，打开活化好的母种，用接种刀进行培养基划分，随后在火焰附近用接种钩挑取3mm×3mm母种菌块置于固体原种培养基中央，用封口膜进行封闭，取出并静置暗培养7d；

(二)液体摇瓶培养基制作

(1)液体摇瓶培养基配制

液体摇瓶培养基配方：玉米粉25g/L，蔗糖25g/L，麦麸20g/L，酵母浸粉2g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾5g/L；

根据上述配方称取玉米粉、麦麸于不锈钢锅中，加1.3L水煮沸10min，用四层纱布过滤，得到滤液，将滤液定容至1L，加入其他药品，充分搅拌均匀，分装至1L的玻璃三角瓶中，每1L玻璃三角瓶装培养液400mL，并加入1个40mm×3mm磁力搅拌子，玻璃三角瓶加装想配套硅胶塞，并用锡箔纸加盖硅胶塞外部；

(2)液体摇瓶培养基灭菌

将配置好的液体摇瓶培养基放入立式高压灭菌锅内，在121℃下灭菌30min后取出，冷却待用；

(3)液体摇瓶培养基接种

将冷却好的液体摇瓶培养基置于超净工作台中，紫外杀菌30min后，打开风机吹淋10min，随后开启照明，进行无菌操作。首先酒精擦手，进入工作台内晾干，点燃酒精灯置于平板后方，便于火焰在风作用下朝向平板操作区域，接种刀在酒精灯外焰加热至红热后自然降温；待进入平板部分降至室温左右即可放在酒精灯火焰高度备用，打开准备好的固体原种，用接种刀进行培养基划分成3mm×3mm的菌块，随后在酒精灯外焰灼烧摇瓶瓶口包裹得锡箔纸，随后打开锡箔纸，将硅胶塞拧松，在火焰旁打开硅胶塞并使瓶口与火焰维持同等高度以免污染，用接种刀区划分后的菌块至摇瓶内，盖上摇瓶硅胶塞和外部锡箔纸，接种刀在酒精灯外焰重新灭菌、冷却以备下一轮接种操作，每个液体摇瓶接3mm×3mm固体原种9-10块，整个接种操作过程中，接种刀与培养基均不可接触培养皿上盖以及摇瓶壁，以免杂菌污染；

(4)液体摇瓶培养基振荡培养

将接种好的液体摇瓶三角瓶置于恒温振荡摇床中进行培养，设置参数180rpm，24.2 ℃，暗培养，每天观察三角瓶中菌丝球生长状态，培养10d后，观察摇瓶中菌球性状，若菌丝球均匀、稠密分布，且静止2-4h不下沉，即为液体摇瓶培养基培养完毕(图9)。

(5)液体摇瓶培养基菌丝球粉碎

将培养好的液体摇瓶菌种放置于磁力搅拌器上，进行菌丝球粉碎处理，约1.5-2h后，菌丝球被打成匀浆状态备用；

(三)发酵罐菌种制作

(1)发酵罐检查和清洗

检查发酵罐外观是否有破损，阀门、软管接口处是否老化，首先将发酵罐外部用清水淋洗干净，顶部接种口、外部观察窗、底部阀门重点清洗，进气软管必须清洗干净，随后打开顶部螺栓，对内部残留菌液进行稀释和清洗，做好观察窗的清洁工作，便于对发酵液性状进行观察，清洗后的污水通过下部阀门排出，若菌球较多时可卸下阀门加大流量；

(2)发酵罐菌种配制

发酵罐菌种培养基配方：土豆100g/L，红糖15g/L，葡萄糖10g/L，麦麸45g/L，蛋白胨2.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，甘油0.3ml/L，pH自然；

根据配方称取原料，于不锈钢锅中。土豆煮至松软；麦麸沸腾后继续煮制10min，趁热用四层纱布过滤，滤液中加入剩余药品，搅拌均匀后再次过滤，将滤液装入发酵罐，定容至100L，检查发酵罐封闭性；

(3)发酵罐灭菌和冷却

发酵罐下部接种口用锡箔纸包裹，发酵罐推入高压灭菌锅，将发酵罐底部进气软管接到锅炉进气阀处，保证上部出气软管畅通，设置参数121℃，灭菌时长120min；

(4)发酵罐接种

打开发酵罐接种口之前先用酒精棉擦拭接种口周围，并将用95％酒精完全浸湿的酒精棉放置于接种口周边凹槽处并点燃灭菌，点燃的过程中打开接种盖，准备好的液体摇瓶在酒精火焰灼烧锡箔纸后缓缓打开，将液体药瓶菌种倒入发酵罐内，整个过程中注意酒精不能烧干，每个发酵罐接种液体摇瓶菌种400mL。

(5)发酵罐菌种发酵培养

将接种后的发酵罐推入发酵罐室，下部通气，压力0.05-0.06MPa，培养温度21-22℃，利用通入的无菌气体提供氧气，同时起到震荡打碎菌丝体的作用，每天观察记录发酵菌种长势情况，恒温培养6d-7d，液体菌种制作完毕。

本发明灰树花设施化栽培新品种已于2017年07月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏号为CGMCC No.14354，分类命名：灰树花Griflola frondosa。

本发明灰树花新品种较耐低温，栽培周期短，生物学转化率可达40％；网格架设施化栽培空间利用率大大提高，避免传统覆土栽培模式费时费工的栽培模式，可以半自动化栽培，适宜东北和华北地区设施栽培。该品种灰树花液体发酵菌种制作技术具有成本低、周期短、发菌迅速、纯度高、污染少等优势。

附图说明

图1是“吉灰0161”不同阶段发育图；

图2是野生灰树花0467的图；

图3是灰树花菌株对短密青霉的拮抗效果图，注：A：抗性强；B：抗性较强；C：抗性较弱；D：无抗性；

图4是灰树花菌株对深绿木霉的拮抗效果图；

图5是不同灰树花菌株酯酶同工酶谱图；

图6是不同灰树花菌株多个农艺性状聚类分析图；

图7是灰树花不同菌株资源的UPGMA聚类图；

图8是吉灰0161网格架出菇图；

图9是灰树花液体摇瓶菌种图；

图10是灰树花发酵菌种状态图。

具体实施方式

本发明在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.14354，保藏日期2017年07月19日。

本发明灰树花设施化栽培新品种的品种特性及生长发育条件：

以下将本发明品种命名为：“吉灰0161”。

(一)、本发明品种特征及特性

灰树花“吉灰0161”在PDA培养基上菌落白色，光学显微镜下菌丝无色，分支性强，具锁状联合。菌丝体白色，气生菌丝发达，爬壁性强。在24℃暗条件下10d即可长满 9cm直径的平皿。菌柄多次分枝，菌盖呈覆瓦状，肉质，花瓣状，灰黑色被细绒毛，成熟时光滑，菌肉白色，味道浓密，子实层面白色，细孔状。菇体灰黑色，菇体紧凑、形状极美，肉质细嫩，菌盖正面具环纹，参见图1。

(二)栽培生物学特性如下：

(1)温度：“吉灰0161”属中温品种，菌丝生长最适温度22-24℃；原基形成适宜温度为16-19℃；子实体生长最适温度18-20℃。

(2)湿度：栽培料培养基适宜含水量63-67％；菌丝生长适宜的空气相对湿度 65-70％；子实体生长阶段空气相对湿度90-95％。

(3)光照：菌丝培养阶段，无需光照，暗培养；在进行菌丝扭结时，给予散射光刺激；待出现原基及子实体生长时均需要一定散射光线；光线强度影响子实体的色泽，适当强度光照，子实体色泽较深，肉厚，品质好；光照不足时，子实体色泽较浅，柄长，肉薄，品质较差。

(4)空气：菌丝培养过程需要适当通风，CO₂含量不高于2500ppm；子实体形成、分化和发育过程中氧气不足、二氧化碳浓度过高时，不易形成子实体，或子实体原基不分化，或出现畸形菇等，适宜CO₂含量500-1500ppm。

(5)酸碱度：菌丝生长在pH值4.0-9.0范围内均能生长，在栽培中，栽培料的pH 值为7.5-8.5时较适宜。

本发明品种来源及选育过程

亲本来源：“吉灰0161”是吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心2013年9月中下旬到吉林省长白山采集时发现的野生灰树花品种0467，如图2，经分离筛选，驯化所得。

(一)选育过程：

(1)分离及鉴定

该品种是通过对野外采集亲本，采用组织分离技术，对不同组织部位分离、比较，并筛选长势健壮的菌株，反复提纯，选取菌丝洁白浓密，长势快的菌株作为初筛菌株。

以真菌通用引物ITS1和ITS4作为DNA模板的引物进行PCR扩增，PCR产物直接测序，序列长度在568bp～640bp之间。将得到的ITS测序结果提交到GenBank进行比对，与灰树花(Grifolafrondosa)同源性均在98％～100％。故鉴定为灰树花菌株。

(2)拮抗实验

分别对初筛菌株进行平皿拮抗实验，以灰树花生产中分离获得的青霉菌菌株P1短密青霉，木霉菌菌株T1深绿木霉作为拮抗菌株。分别将灰树花菌株与拮抗菌种进行同时培养，选择拮抗能力较强的菌株，作为复筛菌株。同时将对照菌株“庆灰151”进行拮抗实验，发现对照菌株抗杂菌能力较差。“吉灰0161”对短密青霉的拮抗能力可以达到抗性强的级别如图3-A，而对照菌株“庆灰151”对短密青霉的拮抗能力很差为无抗性的级别如图3-D；两菌株对深绿木霉的抗性均较差，如图4所示。

(3)酯酶同工酶的多态性分析

图5为不同灰树花菌株酯酶同工酶谱，自左向右不同菌株之间酶带数目和迁移位置有所不同，左1为本发明菌株“吉灰0161”的酯酶同工酶带，右1为对照菌株“庆灰 151”品种的酯酶同工酶带。两者有显著的差异。

(4)农艺性状聚类分析

对上述获得的菌株及对照菌株同时进行栽培出菇培养，记录各菌株的菌丝生长速度、生长周期、子实体鲜重、酶活等多个农艺性状，通过Excel统计每个数量性状的 value值、标准差及变异系数等，再利用SPSS20.0对多个灰树花的相关的农艺性状value 值量纲化处理，利用离差平方和法进行系统聚类。最终对不同灰树花菌株进行遗传多样性和聚类分析。

灰树花出菇试验在吉林农业大学菌菜基地进行，采用瓶栽法，每瓶装干料280g，含水量60-65％，接种后于22～25℃下进行暗培养，待菌丝长满瓶时进行18天后熟，促使菌丝进行后熟生长，利于营养生长向生殖生长的转化，之后转移至生育室进行出菇培养。出菇期间记录原基形成时间(X1)，生长周期(X2)，采用划线法计算菌丝PDA 培养基生长速度(X3)和木屑培养基生长速度(X4)。采收后记录灰树花子实体色泽(X5)；子实体鲜重(X6)；游标卡尺测量菌盖直径(X7)和厚度(X8)。灰树花菌丝满瓶时漆酶(X9)测定，子实体色泽采用赋值法，1代表白色，2代表灰白色，3代表灰褐色，木屑培养基生长速度采用18mm×20mm试管恒温培养测试。

结果如图6，将不同灰树花菌株分为两大类别，Ⅰ类包括9个菌株，Ⅱ类包括5个菌株，往下又各自分为两大亚类别，共4个大分支群。第Ⅰ类总体灰树花菌株农艺性状子实体鲜重较高，单产高，均为灰褐色，Ⅰ1亚类生长期较长，对照菌株“庆灰151”归于此类群，而Ⅰ2亚类生长周期较短，“吉灰0161”归于此类群。第Ⅱ类总体灰树花农艺性状子实体鲜重较低；在子实体特征上，菌盖不分化形成鹿角菇，但在木屑培养基上生长速度快，单产低，菌盖直径中等，厚薄适中。

(5)EST-SSR对灰树花不同资源的遗传多样性分析

利用筛选适合灰树花的12对EST-SSR引物对不同灰树花种质资源进行扩增，共得到64个等位位点。扩增片段的长度在108-312bp。12对EST-SSR引物的PIC值在 0.16-0.67之间，平均为0.52。

利用上述多态性引物所的结果，在EXCEL中制作0，1矩阵，并用Ntsys2.1进行聚类分析，结果表明不同灰树花菌株的相似系数范围在0.24-1之间，见图7。

由图7可以看到，不同灰树花菌株在相似系数0.62水平上聚为9类。其中对照菌株“庆灰151”与本发明菌株“吉灰0161”分别被聚在了不同的分支上，说明两菌株的遗传距离较远。即从分子生物学角度可以确定对照菌株“庆灰151”与本发明菌株“吉灰0161”为不同的品种。

结合以上拮抗实验、酯酶同工酶的多态性分析、农艺性状聚类分析、EST-SSR对灰树花不同资源的遗传多样性分析等从形态学、生理生化、及分子生物学角度，均显示拟申请菌株“吉灰0161”与对照菌株“庆灰151”为不同的菌株，且在抗病能力及农艺性状等方面均优于对照菌株，即可得出本发明菌株“吉灰0161”为新品种。

(二)本发明新品种生产示范及经济效益情况

(1)本发明新品种生产示范

2015年在实验室中做了几批出菇试验都顺利出菇，出菇表现良好，性状稳定。并于2015、2016年进行了拟申请品种“吉灰0161”和对照品种“庆灰151”的对比出菇试验。实验结果表明：拟申请品种“吉灰0161”在发菌期间，较对照品种“庆灰151”的抗杂能力更强，菌丝生长更加迅速，栽培周期较对照品种短20天左右，原基形成率达98％，出菇温度、产量、抗病性、商品性状等均表现突出。

2016年8月在吉林农业大学菌菜基地进行拟申请品种“吉灰0161”和对照品种“庆灰151”的生产对比试验，每个品种各10000袋，采用17×33厘米聚丙烯袋装料，两个品种都在同一环境下进行养菌与出菇，保证试验数据的可靠性。

稳定性：本品种经过4个周期组织分离，大面积应用，其相关特征均表现稳定，产量稳定。

一致性：该品种经过2万多袋栽培，没有发生变异，抗逆性较强，品质好，生物转化率高，耐运输，商品合格率85％以上。

试验结果表明：拟申请品种“吉灰0161”比对照品种“庆灰151”养菌时间短，出菇早，产量高，抗病性强，商品性状好，鲜品口感佳。

表1 吉灰0161与庆灰151栽培对比试验

品种

接种日期

发菌天数

出菇起始日

生物转化率

污染率

采菇潮数

吉灰0161

6月29日

27天

7月29日

40％

5％

2

庆灰151

6月29日

52天

8月18日

30％

10％

2

表2 商品性状调查结果(长度单位㎝；重量单位g)

品种

颜色

形状

肉厚

平均单朵重

菇质

口感

吉灰0161

深灰色

聚生多分枝

0.29

180

韧性强耐储运

好

庆灰151

浅灰色

聚生多分枝

0.26

150

较脆不耐运输

好

(2)产量与效益分析

拟申请新品种“吉灰0161”与对照品种“庆灰151”各栽培10000袋。拟申请新品种“吉灰0161”转化率40％，产菇3200斤，因品质好，平均批发单价20元，产值64000元；对照品种转化率30％，产菇2600斤，因品质不如新品种，平均批发价15元，产值39000 元，与新品种相比，少收入25000元。这些都说明拟申请新品种“吉灰0161”产量高、质量好、经济效益明显，推广应用前景非常好。

(3)适宜种植区域

采用工厂化网格架栽培或大棚内吊袋栽培法，东北及华北均可种植，见图8。

(4)外观品质性状

菌柄多次分枝，菌盖呈覆瓦状，肉质，花瓣状，灰黑色被细绒毛，成熟时光滑，菌肉白色，味道浓密，子实层面白色，细孔状。菇体灰黑色，菇体紧凑、形状极美，肉质细嫩，菌盖正面具环纹。

该品种经过生产实验，大面积推广试验等，完成了野生品种的驯化程序，实现遗传性状稳定，适应北方地区气候条件生长，具有味道鲜美，培养周期短，耐低温，产量高，耐储存，商品性状好等特点。因此该品种受到栽培单位和广大消费者的一致欢迎。

(4)质量鉴定

本发明新品种“吉灰0161”菌株栽培袋菌丝生长温度范围5-32℃，最适22-25℃；菌丝长满袋无需后熟；子实体呈菌柄多次分枝，菌盖呈覆瓦状，肉质，花瓣状；出菇温度范围14-22℃，低于14℃或高于22℃不出菇，或菇体畸形；出菇期空气相对湿度在 88-95％，出菇空气相对CO₂浓度需500-1500ppm；原基形成需要光刺激；适宜设施化袋料栽培。

实施例1本发明灰树花设施化栽培新品种的液体发酵菌种制作方法

灰树花固体栽培其子实体生长周期长，产量较低且不稳定；而进行液体发酵培养具有周期短、成本低、产量较高，等优点，但目前灰树花大规模发酵罐培养的工艺尚未成熟，培养周期较长，菌丝性状不均匀，成为液体菌种栽培灰树花的限制因素。

本发明对灰树花新品种“吉灰0161”进行液体发酵方法的研制，获得一套适合新品种“吉灰0161”的发酵方法，具体步骤如下：

(一)、固体原种培养基扩繁

(1)配制与分装固体原种培养基

固体原种培养基配方：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L；

洗净去皮土豆切成3cm见方小块，称取200g，与1.3L水在锅中煮沸，待土豆煮至软化后用四层纱布过滤得到滤液，再次加热煮沸5min左右，搅拌同时加入20g葡萄糖与20g琼脂粉，待药品完全溶解后将滤液定容至1L，趁热分装入1L玻璃三角瓶内， 500mL/瓶；

(2)固体原种培养基的灭菌

三角瓶顶部加封透气膜与一张120mm×120mm报纸，防止灭菌时冷凝水进入玻璃三角瓶，用皮筋系牢后装入框中，设置灭菌参数121℃，30min，待压力表降至0个大气压、温度降至80℃以下后出锅，取出后放入超净工作台自然降温；

(3)固体原种培养基的分装

待上述玻璃三角瓶中培养基降温至38～40℃，尚未凝固且不烫手时，在酒精灯火焰附近迅速分装至培养皿，每个培养皿内倒固体原种培养基10-15mL，盖上培养皿盖，冷却至凝固，随后用封口膜密封缝隙，用以保存培养基水分，即得到固体原种培养基；

(4)固体原种培养基接种

将上述做好的固体原种培养基，放置于超净工作台紫外杀菌30min，随后打开风机吹淋10min，10min后开启照明，进行无菌操作，首先酒精擦手，进入工作台内晾干，点燃酒精灯置于平板后方，便于火焰在风作用下朝向平板操作区域，接种刀与接种钩在酒精灯外焰加热至红热后自然降温，待进入平板部分降至室温左右即可放在酒精灯火焰附近备用，打开活化好的母种，用接种刀进行培养基划分，随后在火焰附近用接种钩挑取3mm×3mm母种菌块置于固体原种培养基中央，用封口膜进行封闭，取出并静置暗培养7d；

(二)液体摇瓶培养基制作

(1)液体摇瓶培养基配制

液体摇瓶培养基配方：玉米粉25g/L，蔗糖25g/L，麦麸20g/L，酵母浸粉2g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾5g/L；

根据上述配方称取玉米粉、麦麸于不锈钢锅中，加1.3L水煮沸10min，用四层纱布过滤，得到滤液，将滤液定容至1L，加入其他药品，充分搅拌均匀，分装至1L的玻璃三角瓶中，每1L玻璃三角瓶装培养液400mL，并加入1个40mm×3mm磁力搅拌子，玻璃三角瓶加装想配套硅胶塞，并用锡箔纸加盖硅胶塞外部；

(2)液体摇瓶培养基灭菌

将配置好的液体摇瓶培养基放入立式高压灭菌锅内，在121℃下灭菌30min后取出，冷却待用；

(3)液体摇瓶培养基接种

将冷却好的液体摇瓶培养基置于超净工作台中，紫外杀菌30min后，打开风机吹淋10min，随后开启照明，进行无菌操作。首先酒精擦手，进入工作台内晾干，点燃酒精灯置于平板后方，便于火焰在风作用下朝向平板操作区域，接种刀在酒精灯外焰加热至红热后自然降温；待进入平板部分降至室温左右即可放在酒精灯火焰高度备用，打开准备好的固体原种，用接种刀进行培养基划分成3mm×3mm的菌块，随后在酒精灯外焰灼烧摇瓶瓶口包裹得锡箔纸，随后打开锡箔纸，将硅胶塞拧松，在火焰旁打开硅胶塞并使瓶口与火焰维持同等高度以免污染，用接种刀区划分后的菌块至摇瓶内，盖上摇瓶硅胶塞和外部锡箔纸，接种刀在酒精灯外焰重新灭菌、冷却以备下一轮接种操作，每个液体摇瓶接3mm×3mm固体原种9-10块，整个接种操作过程中，接种刀与培养基均不可接触培养皿上盖以及摇瓶壁，以免杂菌污染；

(4)液体摇瓶培养基振荡培养

将接种好的液体摇瓶三角瓶置于恒温振荡摇床中进行培养，设置参数180rpm，24.2 ℃，暗培养，每天观察三角瓶中菌丝球生长状态，培养10d后，观察摇瓶中菌球性状，若菌丝球均匀、稠密分布，且静止2-4h不下沉，即为液体摇瓶培养基培养完毕(图9)。

(5)液体摇瓶培养基菌丝球粉碎

将培养好的液体摇瓶菌种放置于磁力搅拌器上，进行菌丝球粉碎处理，约1.5-2h后，菌丝球被打成匀浆状态备用；

(三)发酵罐菌种制作

(1)发酵罐检查和清洗

检查发酵罐外观是否有破损，阀门、软管接口处是否老化，首先将发酵罐外部用清水淋洗干净，顶部接种口、外部观察窗、底部阀门重点清洗，进气软管必须清洗干净，随后打开顶部螺栓，对内部残留菌液进行稀释和清洗，做好观察窗的清洁工作，便于对发酵液性状进行观察，清洗后的污水通过下部阀门排出，若菌球较多时可卸下阀门加大流量；

(2)发酵罐菌种配制

发酵罐菌种培养基配方：土豆100g/L，红糖15g/L，葡萄糖10g/L，麦麸45g/L，蛋白胨2.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，甘油0.3ml/L，pH自然；

根据配方称取原料，于不锈钢锅中。土豆煮至松软；麦麸沸腾后继续煮制10min，趁热用四层纱布过滤，滤液中加入剩余药品，搅拌均匀后再次过滤，将滤液装入发酵罐，定容至100L，检查发酵罐封闭性；

(3)发酵罐灭菌和冷却

发酵罐下部接种口用锡箔纸包裹，发酵罐推入高压灭菌锅，将发酵罐底部进气软管接到锅炉进气阀处，保证上部出气软管畅通，设置参数121℃，灭菌时长120min；

(4)发酵罐接种

打开发酵罐接种口之前先用酒精棉擦拭接种口周围，并将用95％酒精完全浸湿的酒精棉放置于接种口周边凹槽处并点燃灭菌，点燃的过程中打开接种盖，准备好的液体摇瓶在酒精火焰灼烧锡箔纸后缓缓打开，将液体药瓶菌种倒入发酵罐内，整个过程中注意酒精不能烧干，每个发酵罐接种液体摇瓶菌种400mL。

(5)发酵罐菌种发酵培养

将接种后的发酵罐推入发酵罐室，下部通气，压力0.05-0.06MPa，培养温度21-22℃，利用通入的无菌气体提供氧气，同时起到震荡打碎菌丝体的作用，每天观察记录发酵菌种长势情况，恒温培养6d-7d，液体菌种制作完毕，发酵菌种即可使用。

优良的发酵菌种要求菌种具有一定粘稠度，菌球均匀，中心具白色生长点，四周菌丝呈绒毛状，见图10。

实验例1本发明“吉灰0161”灰树花设施化栽培方法包括下列步骤：

工厂化及设施化栽培可以长年循环栽培，利用自然条件大棚内栽培，菌丝生长适宜温度在22-24℃，子实体生长温度范围为10-30℃，最佳出菇温度16-19℃，低于10℃不会现原基，高于30℃以上容易出现畸形菇，还会发生病害。

本发明针对“吉灰0161”的设施化液体菌种栽培的灰树花的方法包括下列步骤：

1栽培料配方

玉米芯20％、硬杂锯末39％、硬杂木屑19％、豆柏10％、麦麸10％、石膏1％、石灰1％；

2拌料

将玉米芯、木屑、麦麸、豆柏等按比例放入搅拌器进行干拌30min，加水60-65％搅拌30min，测定含水量60-65％；

3装袋

将拌好的培养料用17×33厘米聚丙烯袋装料或聚乙烯袋，采用机械装袋，袋口用套环及插棒封好；

4灭菌

采用高压灭菌，将装好培养料的菌袋竖放到栽培框中，设定100℃-10min，115℃-10min，121℃-90min；

采用常压灭菌，将装好培养料的菌袋横竖整齐摆放在灭菌锅内，菌袋摆满灭菌锅后，(每锅3000袋左右)用两层塑料布(不能有微孔以防灭菌漏气)一层苫布将灭菌锅四面压严，四角留有放气口，加温后待放气口冒出蒸汽达80℃以上时将放气口全部压严，当灭菌锅内部达到100℃时开始计算时间，保持12-25小时；

5接种

将出锅的菌袋凉至30℃以下时方可进行接种，接种环境采用无菌室、接种箱或接种帐进行接种，接种过程完全按照无菌操作规程进行，接种量为30mL/袋；

6养菌

接好菌种的菌袋摆放在大棚内，养菌温度22-24℃，室内保持空气新鲜，每天通风3次，每次20-30分钟，培养25-28天菌丝即可长满菌袋；

7设施化栽培出菇

网格架出菇：将养菌完毕的菌包分别插入到各个网格架中，用洁净的刀片分别在一端割一个2-3cm的“v”型口，设定温度18-20℃，湿度92-96％，暗培养2天，适当通风；菌丝回复后进行散射光照射，温度16-18℃，湿度90-95％，保持良好通风；待原基形成后设定温度17-19℃，湿度90-95％，保持良好通风，保持棚内空气新鲜，如通风不良会出现畸形菇，菇蕾形成期要有散射光照，并保持出菇棚卫生条件良好，防止病虫害发生，见图8；

大棚出菇：根据出菇棚大小进行摆袋一头出菇；

8采收

当菇盖完全展开呈花朵状，子实体背面菌管形成即进入成熟采收阶段，菇盖边缘稍有向外伸展，色泽变浅，在未弹射孢子粉时将一整朵菇全部采下，采收方法，用手把住菇根，将菇整体采下，不能留有菇根残留在料面上，影响下潮出菇易感染病虫害，将采下的整菇规整放入筐内。

适宜地区：

采用工厂化网格架栽培或大棚内吊袋栽培法，东北及华北均可种植。

Claims (2)

1.一种灰树花设施化栽培新品种，其特征在于：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.14354，保藏日期2017年07月19日。

2.如权利要求1所述的灰树花设施化栽培新品种的液体发酵菌种制作方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)、固体原种培养基扩繁

(1)配制与分装固体原种培养基

固体原种培养基配方：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L；

洗净去皮土豆切成3cm见方小块，称取200g，与1.3L水在锅中煮沸，待土豆煮至软化后用四层纱布过滤得到滤液，再次加热煮沸5min左右，搅拌同时加入20g葡萄糖与20g琼脂粉，待药品完全溶解后将滤液定容至1L，趁热分装入1L玻璃三角瓶内，500mL/瓶；

(2)固体原种培养基的灭菌

三角瓶顶部加封透气膜与一张120mm×120mm报纸，防止灭菌时冷凝水进入玻璃三角瓶，用皮筋系牢后装入框中，设置灭菌参数121℃，30min，待压力表降至0个大气压、温度降至80℃以下后出锅，取出后放入超净工作台自然降温；

(3)固体原种培养基的分装

待上述玻璃三角瓶中培养基降温至38～40℃，尚未凝固且不烫手时，在酒精灯火焰附近迅速分装至培养皿，每个培养皿内倒固体原种培养基10-15mL，盖上培养皿盖，冷却至凝固，随后用封口膜密封缝隙，用以保存培养基水分，即得到固体原种培养基；

(4)固体原种培养基接种

将上述做好的固体原种培养基，放置于超净工作台紫外杀菌30min，随后打开风机吹淋10min，10min后开启照明，进行无菌操作，首先酒精擦手，进入工作台内晾干，点燃酒精灯置于平板后方，便于火焰在风作用下朝向平板操作区域，接种刀与接种钩在酒精灯外焰加热至红热后自然降温，待进入平板部分降至室温左右即可放在酒精灯火焰附近备用，打开活化好的母种，用接种刀进行培养基划分，随后在火焰附近用接种钩挑取3mm×3mm母种菌块置于固体原种培养基中央，用封口膜进行封闭，取出并静置暗培养7d；

(二)液体摇瓶培养基制作

(1)液体摇瓶培养基配制

液体摇瓶培养基配方：玉米粉25g/L，蔗糖25g/L，麦麸20g/L，酵母浸粉2g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾5g/L；

根据上述配方称取玉米粉、麦麸于不锈钢锅中，加1.3L水煮沸10min，用四层纱布过滤，得到滤液，将滤液定容至1L，加入其他药品，充分搅拌均匀，分装至1L的玻璃三角瓶中，每1L玻璃三角瓶装培养液400mL，并加入1个40mm×3mm磁力搅拌子，玻璃三角瓶加装想配套硅胶塞，并用锡箔纸加盖硅胶塞外部；

(2)液体摇瓶培养基灭菌

将配置好的液体摇瓶培养基放入立式高压灭菌锅内，在121℃下灭菌30min后取出，冷却待用；

(3)液体摇瓶培养基接种

将冷却好的液体摇瓶培养基置于超净工作台中，紫外杀菌30min后，打开风机吹淋10min，随后开启照明，进行无菌操作。首先酒精擦手，进入工作台内晾干，点燃酒精灯置于平板后方，便于火焰在风作用下朝向平板操作区域，接种刀在酒精灯外焰加热至红热后自然降温；待进入平板部分降至室温左右即可放在酒精灯火焰高度备用，打开准备好的固体原种，用接种刀进行培养基划分成3mm×3mm的菌块，随后在酒精灯外焰灼烧摇瓶瓶口包裹得锡箔纸，随后打开锡箔纸，将硅胶塞拧松，在火焰旁打开硅胶塞并使瓶口与火焰维持同等高度以免污染，用接种刀区划分后的菌块至摇瓶内，盖上摇瓶硅胶塞和外部锡箔纸，接种刀在酒精灯外焰重新灭菌、冷却以备下一轮接种操作，每个液体摇瓶接3mm×3mm固体原种9-10块，整个接种操作过程中，接种刀与培养基均不可接触培养皿上盖以及摇瓶壁，以免杂菌污染；

(4)液体摇瓶培养基振荡培养

将接种好的液体摇瓶三角瓶置于恒温振荡摇床中进行培养，设置参数180rpm，24.2℃，暗培养，每天观察三角瓶中菌丝球生长状态，培养10d后，观察摇瓶中菌球性状，若菌丝球均匀、稠密分布，且静止2-4h不下沉，即为液体摇瓶培养基培养完毕(图9)。

(5)液体摇瓶培养基菌丝球粉碎

将培养好的液体摇瓶菌种放置于磁力搅拌器上，进行菌丝球粉碎处理，约1.5-2h后，菌丝球被打成匀浆状态备用；

(三)发酵罐菌种制作

(1)发酵罐检查和清洗

检查发酵罐外观是否有破损，阀门、软管接口处是否老化，首先将发酵罐外部用清水淋洗干净，顶部接种口、外部观察窗、底部阀门重点清洗，进气软管必须清洗干净，随后打开顶部螺栓，对内部残留菌液进行稀释和清洗，做好观察窗的清洁工作，便于对发酵液性状进行观察，清洗后的污水通过下部阀门排出，若菌球较多时可卸下阀门加大流量；

(2)发酵罐菌种配制

发酵罐菌种培养基配方：土豆100g/L，红糖15g/L，葡萄糖10g/L，麦麸45g/L，蛋白胨2.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，甘油0.3ml/L，pH自然；

根据配方称取原料，于不锈钢锅中，土豆煮至松软；麦麸沸腾后继续煮制10min，趁热用四层纱布过滤，滤液中加入剩余药品，搅拌均匀后再次过滤，将滤液装入发酵罐，定容至100L，检查发酵罐封闭性；

(3)发酵罐灭菌和冷却

发酵罐下部接种口用锡箔纸包裹，发酵罐推入高压灭菌锅，将发酵罐底部进气软管接到锅炉进气阀处，保证上部出气软管畅通，设置参数121℃，灭菌时长120min；

(4)发酵罐接种

打开发酵罐接种口之前先用酒精棉擦拭接种口周围，并将用95％酒精完全浸湿的酒精棉放置于接种口周边凹槽处并点燃灭菌，点燃的过程中打开接种盖，准备好的液体摇瓶在酒精火焰灼烧锡箔纸后缓缓打开，将液体药瓶菌种倒入发酵罐内，整个过程中注意酒精不能烧干，每个发酵罐接种液体摇瓶菌种400mL，

(5)发酵罐菌种发酵培养

将接种后的发酵罐推入发酵罐室，下部通气，压力0.05-0.06MPa，培养温度21-22℃，利用通入的无菌气体提供氧气，同时起到震荡打碎菌丝体的作用，每天观察记录发酵菌种长势情况，恒温培养6d-7d，液体菌种制作完毕。