DE3915277A1 - Verfahren zur reinigung von enzymfluessigkonzentraten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung, insbesondere Desodorierung und Entfärbung von Enzymlösungen, wie sie durch Fer­ mentation von Bakterien oder Pilzen entstehen.

Zahlreiche Enzyme, insbesondere Hydrolasen wie beispielsweise Pro­ teasen, Amylasen oder Lipasen, werden durch Fermentation von Mikro­ organismen hergestellt. Geeignete Mikroorganismen und Herstellver­ fahren sind beispielsweise in den folgenden Patenten bzw. Patent­ anmeldungen beschrieben: DE 18 00 508, DE 22 24 777, DE 25 51 742, US 38 27 938, WO 88/01 293, DE 18 07 185, US 37 40 318, DE 23 34 463, DE 20 26 092, EP 02 32 169, EP 02 20 921, EP 02 47 647 und EP 02 46 678.

Bei der Fermentation der Stämme werden nach Abtrennen der Biomasse Enzymlösungen erhalten, die Farb- und Geruchsstoffe als Beimengungen aufweisen.

Für zahlreiche Anwendungen z.B. für den Einsatz der Enzymlösungen in Flüssigwaschmitteln sind derartige Beimengungen nicht tolerier­ bar. Bei der technischen Herstellung der Enzyme versucht man daher die Verunreinigungen durch Fällungsverfahren abzutrennen. Bisher bekannt gewordene Fällungsverfahren haben jedoch den Nachteil, daß zur Erzielung einer guten Farbqualität erhebliche Ausbeuteverluste in Kauf genommen werden müssen. Soweit zur Fällung die an sich hier günstigen Bentonite verwendet werden, treten zudem Filtrations­ schwierigkeiten auf.

Auf der anderen Seite ist es bekannt, Enzymlösungen gewisse stabi­ lisierende Zusätze beizugeben. Es wird angenommen, daß diese Zusätze Hydrolasen zu maskieren vermögen, und dadurch den Selbstangriff, z.B. bei Proteasen, verhindern. Derartige bekannte Maskierungsmittel sind Borsäure und ihre Salze, Natriumsulfit, mehrfunktionelle Car­ bonsäuren, Hydroxycarbonsäuren oder auch Glykole oder Glycerin. Be­ kannt sind Maskierungsmittel beispielsweise aus DE 31 25 533, EP 00 80 223, EP 00 80 748, EP 01 26 508, DE 34 18 295.

Vor dem Hintergrund dieses Standes der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das es erlaubt, Enzymlö­ sungen von störenden farblichen und geruchlichen Beimengungen unter Minimierung der Ausbeuteverluste zu reinigen und dabei Ausfällungen zu erhalten, die leicht abtrennbar sind.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung und Desodorierung wäßriger durch Fermentation von Bakterien oder Pilzen gewonnener Enzymlösung durch in-situ-Herstellung eines wasserun­ löslichen Niederschlags, Adsorption von nicht gewünschten Beimen­ gungen an diesem Niederschlag und anschließende fest/flüssig-Tren­ nung, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der auf einen pH-Wert zwischen 5 und 11 eingestellten und bei diesem pH-Wert gehaltenen Enzymlösung eine saure, wäßrige Lösung eines Aluminiumsalzes sowie gewünschtenfalls zusätzliche Fällungsmittel zugibt, wasserunlösliche Bestandteile abtrennt, wobei vor oder nach der Fällung gewünschten­ falls ein Maskierungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe:

• - Säuren des Bors und/oder deren wasserlösliche Salze
• - schweflige Säure und/oder deren wasserlösliche Salze
• - Hydroxycarbonsäuren und/oder deren wasserlösliche Salze
• - mehrfunktionelle Alkohole

zugesetzt werden kann.

Die Erfindung schlägt ganz allgemein ein selektives Fällungsverfah­ ren vor, das es erlaubt, unerwünschte Beimengungen aus Enzymlösungen zu entfernen, dabei aber die Enzymaktivität so weit wie möglich zu erhalten. Dabei kann durch Zugabe der unten beschriebenen Maskie­ rungsmittel der Enzymerhaltungsgrad weiter gesteigert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet als Fällungsmittel Alumi­ niumsalze. Als Aluminiumsalze sind Aluminiumhydroxychloride bevor­ zugt. Unter dieser technischen Bezeichnung werden erfindungsgemäß Chlorhydroxyverbindungen des Aluminiums verstanden, z.B. (Al₂(OH)₅Cl) mit 2 bis 3 Mol Kristallwasser. Bevorzugte Materialien sind hier technische Qualitäten, wie sie z.B. zur Wasserreinigung Verwendung finden. Weiter geeignet sind andere wasserlösliche Alu­ miniumsalze, die bei Anheben des pH-Werts in den Neutralbereich Fällungen von Aluminiumhydroxyden bilden. Die erfindungsgemäß ein­ gesetzten Aluminiumsalze werden den Enzymlösungen in Form von sauren wäßrigen Lösungen beigegeben. Diese sauren Lösungen weisen einen pH-Wert um 3 bis 4 und eine Konzentration zwischen 10 und 50 Gew.-% auf. Weiter haben sich Lösungen mit einem Gehalt um 20 Gew.-% als günstig erwiesen. Darüber hinaus kann Aluminiumhydroxychlorid auch in Pulverform direkt in die Enzymlösungen eingerührt werden. Dies ist jedoch weniger bevorzugt.

Beim Fällungsvorgang sollen die Enzymlösungen einen pH-Wert zwischen 5 und 11, vorzugsweise zwischen 5 und 8, aufweisen, da außerhalb dieser pH-Grenzen zum einen die Enzymstabilität beeinträchtigt wer­ den kann, zum anderen das Fällungsmittel teilweise wieder in Lösung gehen könnte. Der Fachmann hat daher darauf zu achten, daß bei Zu­ gabe des Fällungsmittels der pH-Wert nicht unter 5 absinkt. Dies kann beispielsweise durch Zugabe von alkalischen Lösungen, z.B. von Natron- oder Kalilauge, verhindert werden. Auch die Zugabe von Puf­ ferlösungen ist denkbar, muß jedoch auf das Fällungsmittel abge­ stimmt werden.

Die einzusetzende Menge an Aluminiumsalz richtet sich nach dem zu erzielenden Reinigungsgrad. Für viele technische Anwendungen dürften Mengen von 3 bis 5 Gew.-% bevorzugt sein, jedoch werden bereits mit geringeren Einsatzmengen Reinigungseffekte erzielt, z.B. ab 1 Gew.-%. Höhere Einsatzmengen z.B. bis zu 10 Gew.-% sind möglich, dürften sich aber vielfach aus wirtschaftlichen Gründen verbieten.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann vor oder nach der Fällung mit den Aluminiumsalzen eine zusätzliche Fällungsbe­ handlung durchgeführt werden. So kann man eine Fällung erzeugen, indem man ein wasserlösliches Calciumsalz mit einem Alkalimetallsalz einer Phosphorsäure reagieren läßt.

Dabei wird bevorzugt das Verhältnis des Calciumsalzes zum Verhältnis des Salzes der Phosphorsäure so gewählt, daß das Molverhältnis Calcium zu Phosphor zwischen 1,7 und 2,5 : 1 beträgt. Dabei hat sich herausgestellt, daß unter diesen Bedingungen Calciumphosphate mit überwiegend amorpher Struktur und großer Oberfläche entstehen, die für die hier zu fällenden farblichen Verunreinigungen günstige Ad­ sorptionsmittel darstellen. Die Fällungsmittelmenge, bezogen auf Enzymlösung, beträgt üblicherweise 0,5 bis 20 Gew.-%.

Zusätzlich zu dieser Maßnahme können gewünschtenfalls auch weitere Adsorptionsmittel der Enzymlösung beigegeben werden. So kann es ge­ wünscht sein, als weitere Adsorptionsmittel Aktivkohle einzusetzen.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann es auch ge­ wünscht sein, als zusätzliche Adsorptionsmittel Schichtsilikate einzusetzen, insbesondere Bentonite. Werden Bentonite als Adsorp­ tionsmittel mitverwendet, so ist es bevorzugt, Säure-aktivierte Bentonite einzusetzen. Bekanntlich sind Bentonite, insbesondere im sauren Bereich durch Filtration schlecht abzutrennende Feststoffe.

Im Zusammenhang mit der Erfindung hat sich jedoch gezeigt, daß die hier abzutrennenden Festkörper aufgrund ihrer Wechselwirkung leicht filtrierbar sind. Ein besonders bevorzugter Säure-aktivierter Ben­ tonit hat eine Montmorillonit-Kennzahl von 70 und eine Feinheit von 93% kleiner 100 µm. Die Menge an Schichtsilikaten und/oder Aktiv­ kohle beträgt typischerweise 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf Enzymlö­ sung.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann den Enzymlö­ sungen vor oder nach der Fällung ein Maskierungsmittel zugesetzt werden. Bevorzugt ist der Zusatz des Maskierungsmittels vor der Fällung, da dabei geringere Verluste an Enzymaktivität erhalten werden.

Als Maskierungsmittel können zum einen Säuren des Bors und schwe­ felige Säuren sowie deren Alkalimetallsalze zugesetzt werden. Die zuzusetzenden Mengen betragen 0,5 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 3 Gew.-%, bezogen auf Enzymlösungen, wobei sich größere Mengen in erster Linie aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten verbieten. Geeig­ nete Säuren des Bors sind die Borsäure, die Metaborsäure und/oder die Pentaborsäure. Geeignete Alkalimetallsalze sind daher insbesondere Natriumborat, Natriummetaborat, Borax oder Natrium­ pentaborat. Weiterhin geeignet ist das Natriumsulfit.

Als weitere Maskierungsmittel können zusammen mit den vorgenannten oder anstelle derselben Dicarbonsäuren und/oder Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen eingesetzt werden. Bevorzugt sind die Hydro­ xydicarbonsäuren, insbesondere Zitronensäure, Weinsäure und deren Isomere. Die Zusatzmenge beträgt 1 bis 5 Gew.-%. Auch hier verbieten sich höhere Zusatzmengen, in erster Linie aus wirtschaftlichen Ge­ sichtspunkten und nicht wegen Nachlassen der technischen Effekte.

Als weitere Maskierungsmittel können zusammen mit den vorgenannten oder anstelle derselben di- und/oder trifunktionelle Alkohole mit 2 bis 10 C-Atomen eingesetzt werden. Diese Alkohole werden in Mengen von 5 bis 30 Gew.-%, insbesondere 10 bis 25 Gew.-%, bezogen auf En­ zymlösung, eingesetzt. Bevorzugte Alkohole sind Ethylenglykol, Pro­ pylenglykol, Butandiol und Glycerin. Eingesetzt werden können jedoch auch die Di- und/oder Trimeren derselben, also Di- und Triethylen­ glykol bzw. Di- und Tripropylenglykol. Weiter eingesetzt werden kann auch Trimethylolpropan oder Neopentylglykol.

Das erfindungsgemäße Fällungsverfahren zum Reinigen von Enzymlö­ sungen kann an verschiedenen Stellen des Aufarbeitungsprozesses für derartige Enzymlösungen eingesetzt werden. So können beispielsweise die Fällungsmittel direkt der biomassehaltigen Fermenterbrühe zuge­ setzt werden, woraufhin man dann das gefällte Gut zusammen mit der Biomasse durch Mikrofiltration, Zentrifugation oder Filtrationsver­ fahren z.B. in Membranfilterpressen abtrennt.

Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird zunächst die Biomasse abfiltriert und danach die Fällungsstufe zum Reinigen aus­ geführt.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann man auch die von der Biomasse befreiten Enzymlösungen zunächst durch Eindampfen oder Ultra-Filtration aufkonzentrieren und dann erst dem erfindungs­ gemäßen Fällungs-Reinigungs-Verfahren unterziehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum Entfärben und Des­ odorieren von Hydrolaselösungen, insbesondere von Lösungen von Proteasen, Amylasen oder Lipasen. Bei den Proteaselösungen sind die Lösungen alkalischer Proteasen bevorzugt, so z.B. die Lösungen von Subtilisin Proteasen, wie Subtilisin Carlsberg oder Subtilisin BPN′. Dabei weisen die zu behandelnden Enzymlösungen Feststoffgehalte von 2 bis 40 Gew.-% auf und enthalten mehr als 10 000, vorzugsweise mehr als 50 000 und insbesondere mehr als 100 000 proteolytische Ein­ heiten/g.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen in der kosten­ günstigen Abtrennung von Farb- und Geruchsstoffen ohne wesentliche Ausbeuteeinbußen und bei der guten Filtrierbarkeit der Niederschlä­ ge.

Beispiele

Durch Fermentation von Bacillus licheniformis gemäß deutscher Pa­ tentschrift DE 29 25 427 wurde eine biomassehaltige Fermenterbrühe erhalten. Die Fermenterbrühe enthielt Protease in einer Menge von 10 000 Proteaseeinheiten/g. Zu der Fermenterbrühe wurde Borsäure zugegeben, bis ein Borsäuregehalt von 0,5 Gew.-% eingestellt war.

Mit Natronlauge wurde sodann der pH-Wert auf 6 bis 7 eingestellt. Es wurde sodann eine 20 Gew.-%ige Lösung Aluminiumhydroxychlorid in Wasser mit pH 3 (Locron®) zu der Fermenterbrühe zugegeben, bis die eingetragene Menge an Aluminiumhydroxychlorid 4 Gew.-% bezogen auf Gesamtmenge betrug. Nach diesem Schritt wurden während 24 Stunden 4 t unlösliche Anteile durch Filtration abgetrennt. Die so erhaltene Enzymlösung wurde durch Ultrafiltration auf einen Proteasegehalt von 150 000 Proteaseeinheiten/g aufkonzentriert. Zu dem so erhaltenen Konzentrat wurde Aktivkohle zugegeben (3 kg pro 100 kg Konzentrat) und diese anschließend abfiltriert.

Die Restenzymaktivität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteasekonzentrate betrug ca. 80%, verglichen mit unter 60%, wenn man nur eine Calcium-Phosphat-Fällung durchführt und auch auf das Maskierungsmittel verzichtet.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Hellfarbigkeit und Geruchsverbesserung der erhaltenen Lösungen.

Claims (13)

1. Verfahren zur Reinigung und Desodorierung wäßriger durch Fer­ mentation von Bakterien oder Pilzen gewonnener Enzymlösung durch in-situ-Herstellung eines wasserunlöslichen Niederschlags, Ad­ sorption von nicht gewünschten Beimengungen an diesem Nieder­ schlag und anschließende fest/flüssig-Trennung, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man zu der auf einen pH-Wert zwischen 5 und 11 eingestellten und bei diesem pH-Wert gehaltenen Enzymlösung eine saure, wäßrige Lösung eines Aluminiumsalzes sowie gewünschten­ falls zusätzliche Fällungsmittel zugibt, wasserunlösliche Be­ standteile abtrennt, wobei vor oder nach der Fällung gewünsch­ tenfalls ein Maskierungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe:

• - Säuren des Bors und/oder deren wasserlösliche Salze
• - schweflige Säure und/oder deren wasserlösliche Salze
• - Hydroxycarbonsäuren und/oder deren wasserlösliche Salze
• - mehrfunktionelle Alkohole

zugesetzt werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Alu­ miniumsalz Aluminiumhydroxychloride oder Aluminiumsulfate ein­ gesetzt werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als zusätzliche Fällungsmittel sich gegenseitig fällende wasserlösliche Verbindungen, insbesondere Calciumsalze und Alkalimetallsalze der Phosphorsäure eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als zusätzliche Fällungsmittel Adsorptions­ mittel, wie Aktivkohle oder dergleichen einsetzt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Maskierungsmittel Borsäure, Metaborsäure, Pentaborsäure, schweflige Säure und/oder deren Alkalimetallsalze in Mengen von 0,5 bis 3,0 Gew.-% bezogen auf Enzymlösung ein­ setzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Maskierungsmittel Dicarbonsäuren und/oder Hydroxycarbon­ säuren mit 3 bis 10 C-Atomen, insbesondere Zitronensäure oder Weinsäure in Mengen von 1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf Enzymlösung, einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Maskierungsmittel di- oder trifunktionelle Alkohole mit 2 bis 10 C-Atomen einsetzt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Maskierungsmittel Ethylenglykol, Propy­ lenglykol, Butandiol und/oder deren Trimere bzw. Pentamere und/oder Glycerin einsetzt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Aluminiumsalze vor oder nach Abtrennen der Biomasse zusetzt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Aluminiumsalze vor Abtrennen der Biomasse zusetzt, die Fällung gemeinsam mit der Biomasse durch Mikrofil­ tration oder Membranfilterpressen abtrennt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man von Enzymlösungen ausgeht, die zumindest überwiegend Hydrolasen, vorzugsweise Proteasen, Amylasen und/oder Lipasen enthalten.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß man von Enzymlösungen ausgeht, die als Proteasen alkalische Proteasen, insbesondere alkalische Proteasen vom Subtilisin-Typ enthalten.