DE1939347A1 - Enzymatisch aktive Substanzen - Google Patents
Enzymatisch aktive SubstanzenInfo
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Description
DR. E. WIEGAND DIPL.-ING. W. NIEMANN 193934'?'
DR. M. KÖHLER* DIPL-ING. C GERNHARDT
TELEFON: 555476 8000 Mö NCH EN 15, 1# AUSUSt 1969
,TELEGRAMME=KARPATENt NUSSBAUMSTRASSEIO
. .14393/69 7/de
Unilever Ii. V.
Rotterdam (Holland)
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Enzymatisch aktive Substanzen
Die Erfindung beziehtsich auf enzymatisch aktive
Substanzen, ein Verfahren zur Herstellung solcher Substanzen und Verfahren zur Anwendung dieser Substanzen
zur Ausführung von enzymatischem Reaktionen in vitro.
Es ist bekannt, chemische Reaktionen in z. B. wäßrigen Medien in vitro mit Hilfe von Enzymen auszuführen,
Die Abtrennung der Reaktionsprodukte von dem Enzym ist
jedoch oft schwierig, und das Enzym kann nur einmal benutzt
werden, weil es meistens seine Aktivität während des Abtrennvorgangs verliert. ,
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Es ist vorgeschlagen worden, die Enzyme an einem Träger zu fixieren, der in dem Medium unlöslich
ist, in welchem die enzymatisch^ Reaktion ausgeführt werden soll, wobei dieses Medium gewöhnlich
ein wäßriges Medium ist.
Es ,ist vorgeschlagen worden, Enzyme hochmolekularem, organischem Trägermaterial, wie z.B. Cellulosederivaten, einzuverleiben. Das Trägermaterial
wurde in einem organischen Lösungsmittel
oder einer Mischung von Lösungsmitteln, gelöst, denen ein trockenes Enzympräparat zugegeben wurde, wonach das Lösungsmittel entfernt wurde und
hochmolekulares Material, in dem Enzyme eingebettet sind, erhalten wurde.
Es ist ferner vorgeschlagen worden, enzymatisch aktives synthetisches Harzmaterial, wie Polyacrylamidharz,
durch Polymerisieren von Acrylamid in einem Medium, das ein Vernetzungsmittel und
einen Polymerisationskatalysator enthält, in Gegenwart eines Enzyms zu polymerisieren.
Beide Verfahren erfordern die Verwendung von
organischen Reagenzien, welche die JOrtivität
oder Stabilität des Enzyms beeinflussen können und haben ihre eigenen
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SAD ORfGlNAi.
speziellen Nachteile. Beide Verfahren haben den Nachteil,
daß nur ein kleiner Teil des aktiven Enzyms tatsächlich in solcher Weise eingeschlossen wird, daß es
nicht ausgewaschen werden kann.
Die Erfindung sieht wäßriges Silieiumdioxydgel vor,
in dem Enzympräparate eingebettet sind sowie Verfahren
für die Herstellung von solchen Zubereitungen und Verfahren
zur Ausführung von enzymatisehen Reaktionen in
der Gegenwart eines wäßrigen Silieiumdioxydgel und Enzym umfassenden Systems.
Durch die Erfindung werden zahlreiche Vorteile erzielt.
Ein Vorteil besteht darin, daß das Enzym sich
dauernd in einem wäßrigen Medium sowohl während der Her-
und Enzym stellung des wäßriges Silieiumdioxydgel' umfassenden Materials
als auch während seines Gebrauchs befindet. Das wäßrige
Silieiumdioxydgel umfaßt ein Netzwerk bestehend aus SiO.-Tetraedern, das eine variable Menge von Wasser in
Abhängigkeit von der Art des Enzyms, das eingebettet ist,
enthält. Dieses wäßrige Silieiumdioxydgel ist nicht mit Silieiumdioxydgel von niedrigem Wassergehalt zu verwechseln,
das gewöhnlich durch'Trocknen von wäßrigem Siliciumdiöydgel
bei etwa 120° G erhalten wird.und das gewöhnlich einen Wassergehalt von weniger als etwa 10 #, bestimmt
durch Zünden bei 1200° C, hat. Dieses Silieiumdioxydgel von niedrigem Wassergehalt wird zweckentsprechend SiIiciumdioxydxerogel
genannt.
Unter Enzympräparaten wird irgendein Enzym oder eine
Kombination von Enzymen im gelösten, dispergierten, suspendierten,
emulgierten oder trockenen Zustand ebenso wie Enzyme, die in Teilchen, z. B. in Porm von an Teilchen
gebundenen Enzymen, Zellorganellen, Zellfragmenten,
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gefriergetrockneten oder dehydratisieren Zellen, Ruheoder
Dauersporen von Bakterien, Pilzen und Hefen, verstanden.
In diese !Definition sind auch' Mikroorganismen
eingeschlossen, die unter Bedingungen angewendet werden,
unter denen aktives Wachstum nicht eintritt.
Enzymzubereitungen, die mit proteolytischen Enzymen
verunreinigt sind, welche sonst das Enzym aufspalten können, können mit Erfolg eingebettet werden und behalten ihre
Aktivität. ·
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders zur
Einverleibung von in Teilchen auftretenden Enzymen in wäßriges Siliciumdioxydgel geeignet. Geeignete Enzympräparate, die in Siliciumdioxydgel eingebettet werden
können, sind z. B. Acetylcholinesterase, Chymotrypsin,
alkalische Phosphatase, Catalase, Lipoxidase und Prostaglandin
synthetisierendes Enzym.
um Verfall oder Beeinträchtigung des Enzympräparats durch Mikroorganismen zu vermeiden, können Konservierungsmittel,
z. B. Tetracycline in einer geeigneten Stufe der Herstellung Wder Anwendung zugegeben werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden
Enzyme in wäßrigem Siliciumdioxydgel eingeschlossen,
indem man ein wäßriges Siliciumdioxydsol in Gegenwart eins Enzympräparats geliert.
Die während der Herstellung der eingebetteten Enzyme angewendeten Bedingungen können in weitem Umfang
variieren und sind in erster Linie von der Stabilität
des Enzympräparats, das eingebettet wird, abhängig.
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Es ist bekannt, daß die Stabilität von verschiedenen Enzymen
gegenüber Chemikalien und Wärme unterschiedlich ist. Bei manchen Enzymen kann es notwendig sein, besondere Vorsichtsmaßnahmen zu beobachten, um ihre Aktivität zu behalten, und so kann es erwünscht sein, die
Herstellung des eingebetteten Enzyms in einer inerten
Gasatmpsphere und/oder bei niedriger Temperatur auszuführen.
Unter der Voraussetzung, daß die Bedingungen, wie pH-Wert,Temperatur usw., für das eingebettete Enzym
geeignet sind, kann die wäßriges Siliciumdioxydgel und Enzym umfassende Zubereitung, die gewöhnlich ein gallertartiges Aussehen hat, weiter durch Dehydratisierung verfestigt
werden, und es kann ihr dann die gewünschte Form, z. B. durch· Granulieren, Sprühtrocknen oder dadurch,
daß sie auf andere Gegenstände durch Überziehen, Bürsten
oder Aufsprühen aufgebracht wird, gegeben werden. Es ist auch möglich, die Gelierung des Siliciumdioxydsols,
welches.das Enzympräparat enthält, in Gegenwart eines
geeigneten Trägers, wie Bimsstein, prorösem Kunststoff,
porösen Glaskugeln usw.,auszuführen, so daß die wäßriges
Siliciumdioxydgel und Enzym umfassende Zubereitung auf oder in dem Träger abgesetzt wird. Wenn poröses
Material zur Anwendung gelangt, kann das Absetzen des
Siliciumdioxydsol-Enzym-Systems auf den Wänden der
Kapillaren durch geeignete Wahl der Siliciumdioxydkon*-
zentration und nachfolgende ßelierung zur Bildung des
Systems aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym ausgeführt werden. '
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Eine "bevorzugte Art und Weise zum Dehydratisieren gewisser Zubereitungen aus wäßrigem Siliciumdioxydgel
und Enzym ohne Verlust von enzymatischer Aktivität besteht
darin, das. Vasser aus dem Gel in einem Stahlzylinder zwischen zwei Papierfiltern, die durch poröse Stahlscheiben
gehalten werden, auszudrücken. Auf diese Weise wird ein homogenes Produkt auf schnelle und reproduzierbare
Weise erhalten.
Die Dehydratisierung der wäßriges Siliciumdioxydgel und Enzym umfassenden Zubereitung soll nicht über ein
Wassergehalt hinaus fortgesetzt werden, bei welchem die enzymatisch^ Aktivität scharf abfällt. Bei einem Wassergehalt
von 10 #, berechnet auf SiCL des wäßrigen SiIiciumdioxydsols,
ist die enzymatisch^ Aktivität der meisten Enzympräparate, die in Siliciumdioxydgel eingebettet
sind, praktisch verschuwnden.
Siliciumdioxydsol kann nach verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Umsetzung von
Alkalisilicat mit einer Säure, mittels Ionenaustauschharzen,
die Alkaliionen aus dem Silicat entfernen, durch Hydrolyse einer organischen Silieiumverbindung usw.
Siliciumdioxydsole, welche primäre teilchen einer
verhältnismäßig gleichförmigen Größe enthalten, können
durch Umsetzung von Säure und Silicat unter sorgfältig
geregelten Bedingungen erhalten werden. Diese Bedingungen können eine Erhitzung einer verdünnten Silicatlösung auf
60 - 100° C, eine Neutralisierung mit Säure auf einen
pH-Wert von 8-10,7 und darauf folgenden gleichzeitigen Zusatz von mehr Silicat und mehr Säure in solchen Anteilen, daß der pH-Wert innerhalb des vorbestimmten Bereiche
gehalten wird, umfassen. '
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Auf diese Weise werden Siliciuradioxydsole mit
primären Teilchen, die £ine gleichförmige Größe
in dem Bereich von wenigen "bis zu mehreren hundert nm
(1 nm = 10 τη) Durchmesser aufweisen, erzeugt. Durch
Gelierung dieser Sole werden wäßrige Siliciumdioxydgele
erhalten, in denen die primären Teilchen in solcher Weise miteinander verbunden sind, daß ziemlich
gleichförmige Käfige gebildet werden, deren G-röße von
der Größe der primären Teilchen abhängig ist. So kann die Größe der Käfige zwischen den primären Teilchen
der Größe des Enzympräparats, das eingebettet werden soll, einverleibt werden.
Eine Gelierung von wäßrigem Siliciumdioxydsol kann
spontan stattfinden, aber im allgemeinen ist es erwünscht,
die Gelierung zu beschleunigen, was auf verschiedene Weise erfolgen kann, z. B. durch Zusatz von
geringen Mengen von Elektrolyten (Salzen) und Einstellung des pH-Werts gemäß dem einzubettenden Enzympräparat.
Wenn das System aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym hergestellt wird, ist es nicht notwendig, das Enzympräparat
zuzusetzen, bevÜSr die Gelierung des Siliciumdioxydsols
beginnt. Dies kann auch erfolgen, während die Gelierung stattfindet. TJm ein Enzym zu erhalten, das in
genügender Weise in dem wäßrigen Siliciumdioxydgel eingebettet ist, soll es zugesetzt werden, bevor eine Gelierung
zu schnell stattfinden und. auch ein Rühren zu schwierig werden würde.
Es ist gefunden worden* das wäßriges Silieiumdi-"
oxydgel und Enzym umfassende Zubereitungen wiederholt
zur Ausführung von enzytnatischen Verfahren, z. B. durch.
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Rühren der Siliciumdioxydgelzubereitung in einer Substratlösung, gegebenenfalls in Gegenwart von geeigneten
Cofaktoren, und nachfolgende Gewinnung der Siliciumdioxydgel und Enzym umfassenden Zubereitung, die
ihre Aktivität für weitere Arbeitsvorgänge behalten haben kann, aus dem Produkt der enzymatischen Umwandlung
zur Anwendung gelangen können.
Es ist ferner gefunden worden, daß solchejenzymatischen
Verfahren dadurch' ausgeführt werden können, daß man eine Lösung eines Substrats durch Säulen aus
oder, mit der wäßriges Siliciutndioxydgel und Enzym umfassenden Zubereitung, gegebenenfalls in Mischung mit
geeigneten inerten Volumenausdehnern, hindurchführt,
wobei das Ausmaß oder die Geschwindigkeit und der Grad
der Umwandlung eine Funktion der Parameter der Säule
und der Durchflußgeschwindigkeit durch die Säule ist. '
Die Verwendung von Enzymsäulen hat (£en Vorteil , daß
infolge des FUeßprinzips die Reaktionsteilnehmerkonzentration optimal gehalten- werden kann.
Die Verwendung von wäßriges Siliciumdioxydgel und Enzym umfassenden Zubereitungenir die auf oder in porösem Material in Säulen abgesetzt sind, ist besonders
vorteilhaft mit Bezug auf die Fließgeschwindigkeit.
Es können Mehrstufenumwandlungen eines Substrats
dadurch ausgeführt werden, daß man eine Kombination von Enzymen, die in wäßrigem Siliciumdioxydgel eingebettet
sind, oder eine Kombination von getrennten Enzym-Siliciumdioxydgelzubereitungen
entweder in einer Säule oder in mehreren Betten oder Säulen hintereinander anwendet.
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wäßriges 'Siliciumdioxydgel und Enzym umfassenden Zubereitungen
gemäß der Erfindung zeigen eine gute Stabilität bei Lagerung und können für synthetische und
analytische Zwecke Anwendung finden. Es kann insbesondere die Erzeugung von Aromaverbindungen in wirksamer
Weise ausgeführt werden.
Die wäßriges Siliciumdioxydgel und Enzym"umfassenden-Systeme
gemäß der Erfindung und ihre Herstellung
und Anwendung weisen insbesondere die folgenden Vorteile und Merkmale auf:
1. Die Enzyme können in z. B. gelöstem oder dispergiertem
Zustand einverleibt werden, so daß keine Notwendigkeit besteht, sie in die Trockenform vor dem
Einschließen umzuwandeln, was einen Verlust an enzymatischer Aktivität nach sich ziehen würde.
2. Das System aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym
kann, obwohl es stark hydratisiert ist, leicht wie eine feste oder halbfeste Substanz gehandhabt werden,
während die Mikroumgebung der eingebetteten Enzyme stark
Wasser ähnelt, welches das natürliche Medium von Enzymen
ist, wobei sie gewöhnlich ihre höchste Aktivität zeigen. ■_.■■'■-
3. Die Systeme aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym
werden in Abwesenheit von organischen Reagenzien und unter Verwendung von milden Bedingungeny wie Umgebungstemperatur,
Zusatz von geringeren Mengen von Elektrolyten (Salzen), pH-Bedingungen von gewöhnlich 5-8,
wobei eine Gelierung des Siliciumdioxydsols innerhalb
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einer Zeitdauer im Bereich, von einigen Minuten "bis zu
mehreren Stunden herbeigeführt werden kann, hergestellt.
4. Bei wäßrigem Siliciumdioxydgel kann die Menge von einverleibtem Wasser innerhalb weiter Bereiche von
10 - 5000 i» Wasser, bezogen auf das Gewicht von SiO2,
eingestellt werden (in dem letztgenannten EaIl wird auch eine steife Masse erhalten), so daß gerade die
Erfordernisse des Enzyms und Substrats getroffen werden.
5. Wäßriges Siliciumdioxydgel hat eine "offene" Struktur und ist den Substratmolekülen eines weiten Molekulargrößenbereichs
zugänglich.
6. Das Siliciumdioxydgelnetz-werk besteht aus miteinander
verbundenen kugelförmigen Teilchen (primären Seilchen),
die von etwa einigen bis mehreren hundert Millimikron variieren können. Die Größe der Käfige variiert
mit der Größe der primären Teilchen und kann daher so
eingestellt werden, daß eine Zubereitung von optimaler
Aktivität erhalten wird.
100 ml dreifach destilliertes Wasser wurden in ein
Gefäß eingebracht, das mit den Elektroden einer automatischen Titrier einheit ausgestattet worden war. Unter
kräftigem Rühren wurden insgesamt 520 ml 2n-HCl in einem
konstanten Fluß zu dem. destillierten Wasser zugegeben;
gleichzeitig wurde eine Wasserglaslösung, die durch Mischen von. 260 ml Wasserglas 4-1 ° Be, molares Verhältnis
O r SiO2 β 1 : 3,42, und von 240 ml dreifach destilliertem Wasser erhalten war, von einer automatischen *
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Titriereinheit (Radiometer Copenhagen TTT1) in solcher
Weise dosiert, daß der pH-Wert in dem Behälter auf einem konstanten Viert 'von 1,6 gehalten wurde. Die
Temperatur wurde auf Raumtemperatur gehalten.
Das erhaltene klare Siliciumdioxydgel, das 8,2 # SiO2 und ± '4,1 % WaCl enthält ,wurde in einem Zellglasdialysator
von 28 mm Durchmesser (Cellophandialysierrohr von Kalle A.G., Wiesbaden, Biebrich, Deutschland.)
gegen einen konstanten Strom von verdünnter Salzsäure
etwa 20 Stdns.
mit einem pH-Wert von 1,6/dialysiert. Je Beschickung
von 1,3 Liter Siliciumdioxydsol wurden insgesamt 100 - 120 Liter verdünnte Salzsäure angewendet. Nach der
Dialyse enthielt das Sol 5,5 - 6,5 # SiO2 und etwa
0,02 fo NaCl. Beim Lagern des Sols bei 0° C wurden keine gelatinösen Niederschläge gebildet, bevor 4-5 Wochen
verstrichen waren.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen
näher erläutert. ·
3,8 mg eines Acetylcholinesterasepräparats (Sigma
Chem., St. Louis, Mo., USA) wurden in 1 ml Wasser gelöst. 25 mg Kaliumdihydrogenphösphat wurden in 25 ml eines
frisch bereiteten Siliciumdioxydsols gelöst (das wie oben
beschrieben erhalten war), und der pH-Wert wurde auf
7,5 eingestellt. Das gelöste Enzym wurde dann rasch zu 9»4 g des Siliciumdioxydsols zugegeben, wonach die Mischung
geliert wurde. Die so erhaltene Zubereitung aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym enthielt je Gramm '
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0,365 mg des Acetylcholinesteräsepräparats. Die enzymatische
Aktivität der Zubereitung aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym wurde wie folgt bestimmt:"
2 g der G-elzubereitüng wurden durch, ein Sieb
(Maschenweite 0,1 mm) gedrückt und zu 11 ml einer 0,01
molaren Phosphätpufferlösung (pH-Wert 7,4) in einem
Gefäß zugegeben, das mit den Elektroden einer automatischen Titriereinheit ausgestattet war, und es wurden
3 ml einer wäßrigen 0,2 molaren Magnesiumchloridlösung
hinzugefügt.Der pH-Wert der' Mischung wurde auf 7,4 eingestellt, bis er konstant war.Dieses mußte mehrmals wegen der
Austauschkapazität des Siliciumdioxydgels ausgeführt werden,
Danach, wurde 0,5 ml einer wäßrigen 0,055 molaren Lösung
von Acetylcholinhydrochlorid zugegeben (das durch das
Enzym in Essigsäure und Cholinhydrochlorid umgewandelt wurde). Die gebildete Essigsäure wurde mittels einer
automatischen Titriereinheit mit einer wäßrigen 0,02 n-Natriumhydroxydlösung
titriert, und die Aktivität der Acetylbholinestefase wurde als Natriumhydroxydverbrauch,
ausgedrückt in g Äquivalenten je Minute, bestimmt.
Durch Vergleich der so bestimmten Aktivität mit der
Aktivität von einem mg des Ausgangsenzymmaterials in
gelöstem Zustand, wurde die relative Aktivität des eingebetteten Enzymmaterials bestimmt. Es wurde eine relative
Aktivität von 62 fo gefunden. Um zu untersuchen, ob eine
Absorption oder vielmehr ein Einschluß vorlag, wurde
das System aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym mit
einer 10 $igen wäßrigen Lösung von Methylaminhydrochlorid
(das laufend zur Desorption absorbierter Proteine verwendet wird) und danach dreimal mit Teilmengen der
0,01 molaren Phosphatpufferlösung ausgewaschen. Die wäßriges Siliciumdioxydgel und Enzym umfassende Zubereitung zeigte eine relative Aktivität von 58 # im Vergleich
mit dem Ausgangsenzymmaterial. Perner wurde eine
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Menge von 1,6 g von wäßrigem Siliciumdioxydgel, das wie
vorstehend beschrieben bearbeitet war, jedoch in Abwesenheit des Enzyms, 1 i/2 Stunden in einer Lösung von
2 mg des Ausgangsacetylcholinesteräsepräparats in 4ml
Wasser geschüttelt. Nach Unterbrechen des Rührens wurde
die Mischung zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit
enthielt 1,48 mg aktives Enzymmaterial, wie dies aus
der Aktivität "bestimmt wurde, und das wäßrige Siliciumdioxydgel wurde dreimal mit Mengen der 0,01 molaren
Phosphatpufferlösung ausgewaschen. Das wäßrige Siliciumdioxydgel zeigte dann eine enzymatische Aktivität entsprechend 0,05 mg des Enzyms.
Das in Siliciumdioxyd eingebettete Enzym, hergestellt
gemäß dem vorstehend geschilderten Versuch, wurde mit dem gleichen Enzym verglichen, das in einem Acrylamidgel
eingebettet war, welches aus den folgenden Bestandteilen
hergestellt worden war:
Lösung Ai 40 g Acrylamid in 100 ml I/IO n-Phosphat--;:..
pufferlösung, pH-Wert 7,4
Lösung B: 2,3 g ^,N'-Methylenbisacrylamid in 100 ml
Phosphatpufferlösung, pH-Wert 7,4 '
Lösung C: 3 mg Riboflavin in 10 ml I/IO n-Phosphatpufferlösung,
pH-Wert 7,4
Lösung D: 3 mg NH4S2O8 in 10ml I/IO η-Phosphatpufferlösung, pH-Wert 7,4 -''■■.
Lösung E: 6 mg Acetylcholinesterase in 1 ml Phosphatpufferlösung,
pH-Wert 7,4.
Die Gel-Enzymzubereitung wurde dadurch hergestellt, daß man 1 ml der Lösung A mit 4 ml der Lösung B mischte
und 1 ml der Enzymlösung E hinzugab. Die Photopolymerisation durch direktes Sonnenlicht wurde dadurch katalysiert, daß man jeweils 1/I0 ml der Lösung 0 und Ι/ίο ml
der Lösung D hinzugab. Die Polymerisation war Ia etwa
10 Minuten vollendet. Das Gel wurde fein dispergiert,
indem es durch ein Sieb (0,1 mm) Mndurchgedrückt wurde.
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Obwohl diese Zubereitung eine relative Aktivität von
etwa 66 fi zeigte, verringerte sich die Aktivität sogleich beim Auswaschen auf etwa 5 f°, wobei die Waschflüssigkeit
so etwa 63 % der enzymatischen Aktivität enthielt.
10 mg des trockenen Acetylcholinesterasepräparats wurden in 10 ml einer Lösung mit einem Gehalt von
2,1 Cellulosenitrat, 52,8 ■ # Diäthyläther, 14,1 ¥>
-Äthylalkohol, 20,9 $ Aceton, 6,4 $>
Amylalkohol und 3,7 $ Xthylenglykoläther suspendiert. Die Suspension
wurde auf eine flache G-lasschale mit einer Oberfläche
von 44 cm gegossen und die flüchtigen Komponenten wurden durch einen sehr schwachen Stickstoffstrom in 75
Minuten verdampft, wonach die gebildete Membran mit 100 ml
Wasser bespült und in kleine Stücke geschnitten wurde.
Die 100 ml Wasser enthielten den größeren £eil der Aktivität, die Membran enthielt nur etwa 7 %, wobei dieser
Gehalt sich beim Auswaschen auf weniger als 0,5 # verringert..
In der Weise, wie sie In Beispiel 1 beschrieben ist,
wurde eine Menge von 6 mg eines Aeetylcholinesteräsepräparats
in 50 ml wäßrigem Siliclumdioxydgel eingebettet. Die erhaltene Siliciuindloxydgel-Enzymzubereltung
wurde auf 23 $> des ursprünglichen Gewichts (was etwa
360 # Wasser, bezogen auf SiOg, ist) dehydratisiert.
.Das dehydratisierte Gel wurde sorgfältig in einem Mörser
pulverisiert und gesiebt. Aus der Sie"bfraktlon mit Abmessungen
zwischen 0,6 und Q825 mm wurden die leinstoffe
durch Waschen und Dekantieren entfernt. Mit 3,5g der·
Teilchen, die so höchstens 1,77 wg des Acetylcholin-
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esterasepräparats enthielten, wurde ein Rohr mit einem
Innendurchmesser von 7 jnm gefüllt. Diese Säule wurde
auf 25° C mit Hilfe eines Thermostaten gehalten. Es
wurde eine Substratlösung durch die Säule geführt.
Diese Substratlösung bestand aus 0,33 mg/ml Acetylcholinhydrochlorid
in 0,01 molarer Phosphatpufferlösung, pH-Wert
7,4, mit einem Gehalt von 8 mg/ml MgCl2*6 H2O
und (gegen das Wachstum von Mikroorganismen) 100 mg/l
Oxytetracyclin und 1 ml/l Pimafücinsuspension (2,5 #).
Während des Versuchs wurde die Vorratslösung ge—
oberhalb 0° C gehalten um
wenn sie in die Säule eintrat.
wenn sie in die Säule eintrat.
rade oberhalb 0° C gehalten und wurde nur angewärmt,
Bei einem Ausmaß von 75 ml/Std. wurden 80 % des
Acetylcholinhydrochlorids umgewandelt. Durch Herabsetzung der Fließgeschwindigkeit auf 37,5 ml/Std. wurde das gesamte
Substrat umgewandelt. Diese Säule wurde dauernd während 4 Tagen benutzt, während dieser Zeit wurde kein
Verlust von Aktivität beobachtet.
In derselben«Weise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben
ist, wurden 6,8 mg Acetylcholinesterase.zu 9 ml
Siliciumdioxydsol (eingestellt auf einen pH-Wert von 7,4)
hinzugefügt, und diese Mischung wurde zu 3,12 g Bimsstein (Teilchendurchmesser etwa 3 mm) in einem evakuierten
Gefäß zugegeben·, wonach der Atm ο Sphären druck
wiederhergestellt wurde, um sämtliche Poren des Bimssteins mit der Enzym-Solmischung zu füllen.
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■: ' . ■ .Ζ : ■■■■"■ : -16 - ■ ; V- -
Derjenige Teil, der nicht von den Poren zurückgehalten wurde, würde durch Absaugen über einem Glasfilter
entfernt. Alles dies wurde ausgeführt, bevor die SoI-Enzymmischung
gelierte. 2,/|8g Sol (mit einem Gehalt von
1,69 mg Enzympräparat) wurden durch den Bimsstein zurückgehalten. Mach dem Gelatinieren wurden die Teilchen
in eine Säule eingebracht, die, wie in Beispiel 1a be·^=
schrieben, benutzt wurde. Bei einer Pumpengeschwindigkeit von 18 ml/St, wurden 85 % des Substrats umgewandelt.
Diese Aktivität war konstant während der Versuchszeit, welche 5 Tage betrug,
Beispiel 2 : ; ■; . .' -
In 100 ml dialysiertem Siliciümdioxydsol, das nach
dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt war,
wurden 200 mg KH2PO. gelöst, und der pH-Wert wurde auf
3 - 4 durch Zusatz einer 4n-HaOH-lösung eingestellt.' *
Danach wurden 30 mg Trypsin (von Koch-Light, Colnbrook, Bucks., England),in 5 ml wäßriger 10 η-Salzsäure gelöst, zugegeben, und der pH-Wert der sich ergebenden
Mischung wurde auf 8,0 durch weiteren Zusatz von 4ε-KaOH
eingestellt. Nach mehreren Minuten hatte sich ein festes kompaktes Gel (SiO2-Gehalt 5,2 - 6,2 $ gebildet.
Die Trypsinaktivität dieses Gel-Enzymsystems wurde
wie folgt bestimmt:
2 g des Gels wurden durch ein Sieb mit Maschen von
0,1 mm Durchmesser gedrückt und darauf zu 15 ml einer
0,01 molaren Phosphat'pufferlösung (einer lösung von
680 mg KH2PO^ in 1 1 dreifach destilliertem Wasser, eingestellt auf einen pH-Wert von 8,0 durch Zusatz von
0,1 n-NaOH) zugegeben, infolge der Ionenaustauschaktivität
des Siliciumdioxydgels blieb der pH-Wert des Systems
nicht konstant. D er pH-Wert wurde daher unter dauerndem
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BAD
Rühren eingestellt, bis dieser 'Wert bei 8,0 konstant
blieb. Danach wurden 100 mg n-a-Benzoyl-argininäthylester
(BAEE), in 0,5 ml der vorgenannten Phosphatpufferlösung gelöst, zugegeben. Aktives Trypsin hydrolysiert
diesen Ester, wobei freie Säure gebildet wird» Die Aktivität wurde in einem Wasserthermostaten' durch
dauerndes Titrieren der Säure mit-einer 0,0025 n-NaOH-Lösung
unter Verwendung"einer automatischen Titriereinheit,
die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt war, und unter Konstanthalten der Temperatur mit einem Thermostaten
bei 25° C gemessen. Der NaOH-Verbrauch je Minute
liefert ein Maß für die Aktivität der Zubereitung, die in Gramm-Äquivalent je min/g-Zubereitung ausgedrückt
wird. Infolge der Ionenaustauschaktivität des wäßrigen
Siliciumdioxydgels wurde der pH-Wert wieder nach dem ■
Zusatz des BAEE gestört, und das Ausmaß des Verbrauchs
von NaOH mußte bestimmt werden, nachdem eine gewisse
Menge NaOH schon zugesetzt worden war. Diese Menge von
NaOH wurde in derselben Weise in einem Kontrollversuch
bestimmt, der mit einer gleichen Menge von wäßrigem Siliciumdioxydgel in Abwesenheit von Enzym ausgeführt
wurde. Die Aktivität der Zubereitung wurde mit der gleichen Menge von gelöstem Enzym verglichen, wie sie in
dem Siliciumdioxydgel eingebettet war. So wurde eine relative
Aktivität von 55 - 65 % gefunden.
Das so erhaltene Gel-Enzymsystem wurde dann unter Vakuum über konzentrierter Schwefelsäure dehydratisiert,
bis etwa 15 i° des Originalgelgewichts zurückblieben
(etwa 200 #Wasser, bezogen auf, SiO2). Die so erhaltenen
festen körnigen Teilchen können als solche benutzt werden. Um die Aktivität unter Standardbedingungen zu bestimmen, wurde eine Menge in einem Mörser pulverisiert
und durch ein Sieb mit 0,1 mm Maschen gesiebt. Die Aktivität wurde bestimmt, wie dies vorstehend beschrieben
„wurde. JE)s war ersichtlich, daß keine Aktivität während
009813/1509
'-..■■ . - 18,- ..:■■■■■.:.. ■ ■■. ■
Dehydratation verlorenging. Auch nach mehrmaligem Auswaschen
der Körner mit entweder dreifach destilliertem Wasser oder der obengenannten Pufferlösung, war es ersichtlich, daß die Aktivität sich nicht verringert hatte.
Ein Vergleich der Stabilität bei 25° G von gelöstem Trypsin mit derjenigen des obengenannten Trypsins, das
in wäßrigem Siliciumdioxydgel eingebettet war, wurde
wie folgt hergestellt: -
wie folgt hergestellt: -
Es■ wurde .eine Vorratslosung von Trypsin in TCf^n-HGl
mit einem Gehalt von 1 mg Enzymmaterial je ml hergestellt. Diese Lösung ist stabilwährend mehrerer
Stunden und wurde bei dem folgenden Versuch verwendet:
Stunden und wurde bei dem folgenden Versuch verwendet:
Zu .einer Lösung von 100 mg BAEE in 15 ml (0,01
molarer) Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0 wurde 0,2. ml TrypsinlÖsung in dem Zeitpunkt t = 0 zugesetzt. Das Ausmaß der Umwandlung wurde in der obengeschildert en Weise bestimmt, und es wurde gefunden,
daß 5,7 x 10 ~ Gramm-Äquivalent BAEE je Minute umgewandelt wurden.
molarer) Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0 wurde 0,2. ml TrypsinlÖsung in dem Zeitpunkt t = 0 zugesetzt. Das Ausmaß der Umwandlung wurde in der obengeschildert en Weise bestimmt, und es wurde gefunden,
daß 5,7 x 10 ~ Gramm-Äquivalent BAEE je Minute umgewandelt wurden.
Bei den nachstehenden 4 Versuchen wurde diese Arbeitsweise wiederholt; es wurde jedoch die 0,2 ml TrypsinlÖsung
zu der Pufferlösung zugegeben, liach verschiedenen
Zeiträumen von 3, 15» 45 bzw.60 Hinuten wurden^ 100 mg
BAEE zugegeben, und es vmrde das Ausmaß der Umwandlung bestimmt. Die gefundenen Vierte sind in der nachstehenden Tabelle angegeben :
BAEE zugegeben, und es vmrde das Ausmaß der Umwandlung bestimmt. Die gefundenen Vierte sind in der nachstehenden Tabelle angegeben :
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SAD ORIGINAL
Bauer der enzymatischem- Um- ümy/andlungsausmaß
s et sun rc nach t = O (ain) fE-Lvn. /pin - - -
O 5,7 χ 10~4
3 "■■'■■■ 4,5χ io"4
15 4,0 χ 1Ό"4
45 3,5 x 10~4
■. , 60 3,2 χ 1Ό"4
Ferner wurde das Umwandlungsausmaß einer Menge von
150 mg des teilweise dehydratisierten wäßrigen Siliciumdioxydgels,
das eingetettetes !Trypsin„enthielt, untersucht,
nachdem 15 ml Phosphatpufferlösung zugegeben
worden waren. ("Vgl. die oben beschriebene Aktivitätsbestiunung.)
Es wurde ein Umv/anälungsausmaß von BAEE
von 5,1 x 10 ^ g-ÄqUo/min gefunden. Das System aus
wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym wurde abfiltriert,
und in einem dauauffulgenden ähnlichen Versuch wurde
eine andere Menge von BAEE umgewandelt. Die gefundene Aktivität betrug 4,9 x 10 g-A'qu./min, sie blieb bei
den folgenden Umwandlungen fast konstant. Die Arbeitsweise wurde nach Stehenlassen d-es ursprünglichen Systems
aus wäßrigem Siliciumdioxydgel und Erypsin während 1 und
2 Std. wiederholt. Es wurden die gleichen Werte für das Umwandlungsausmaß beobachtet.
Bei einem Vergleichsversuch wurden G rag l'rypsin
in Polyacrylamidgel, -in der im Beispiel 1 beschriebenen
Weise, eingeschlossen. Obwohl diese Zubereitung eine relative
Aktivität bis zu 74 %:_-zeigte, nahm diese Aktivitat
beim Ausspulen auf etwa 7 f° ab, wobei die Spülflüssigkeit
etwa 68 f» der Aktivität enthielt. .
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ÖAD ORIGINAL
Auf die gleiche Weise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben
v/urde, wurde ein Vergleich gemacht, in dem
man 10 mg Trypsin in einer Cellulosenitratiaembran einschloß.
Nach Ausspulen wurde der größere Teil der Aktivität in der Spülflüssigkeit gefunden, wobei die Membran
weniger als 0,5 % der Aktivität zeigte.
Auf die gleiche Weise,- wie sie in Beispiel 2 beschrieben
wurde, wurde eine Menge von 300 mg Trypsin in wäßrigem Siliciumdioxydgel, anstatt der in Beispiel 2
genannten Menge von 30 mg, eingebettet. Das System aus
wäßrigem Siliciumdioxydgel und Enzym zeigte etwa 70 fo
der Aktivität des bei der Herstellung des Gels verwendeteten
Trypsins. Das so erhaltene Gel konnte auch ebne weiteren Verlust an Aktivität dehydratisiert werden,
bis etwa 15 f° des Gelgewichts, entsprechend 300 $>
Wasser, bezogen auf SiOp, zurückgeblieben waren.
Beispiel 4 ' .
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde eine Siliciumdioxydgel-Trypsinzubereitung
aus nur 2 mg Trypsin anstatt von 30 mg Trypsin, wie dies in Beispiel 2 angegeben wurde,
hergestellt und auf 20 $ .des ursprünglichen Gelgewichts
dehydratisiert (was etwa 300 $ Wasser, bezogen auf SiO2, ist). Das dehydratisierte Gel wurde sorgfältig
in einem Mörser pulverisiert und gesiebt. Aus der Siebfraktion mit Abmessungen zwischen 0,6 und 0,25 tarn wurden
die Feinstoffe durch Waschen und Dekantieren entfernt«
Mit 3 g der Teilchen, die so höchstens 0,33 mg Trypsin enthielten, wurde ein Rohr mit einem Innendurch-
009813/1509
-;tr BAD ORIGINAL
messer von 7 mm-auf eine Betthöhe von 7 cm gefüllt* Diese
Säule wurde mit Hilfe eines Ihermostaien auf 25° Q gehalten.
Es.wurde eine Lösung von 1 ag/al n-a-Benzoylargininäthylester
(BJiEE) in 0,01 molarer Phosphatpuffer-Lösung,
pH-Wert 8, (in der 400 mg SiOg je 1 durch Neutralisieren der berechneten Menge Wasserglas aufgelöst worden war) durch die Säule in iinem Ausmaß von
1,2 ml/min geführt. Die hindurchgeführte, BAEE-^Lö sung - ■■
wurde in der Zeit des Versuchs, die 72 Stunden betrüg, vollständig umgewandelt.Indieser Zeitwurden insgesamt
etwa 5 g BAEE umgewandelt.
In 25 ml. dialysiertein Siliciumdiöxydsol, das wie
oben beschrieben erhalten würde, wurden 30 mg MgSO.
(wasserfrei) gelöst. Die Lösung wurde auf einen ph-Wert
von,7 mit 4- n-NaOH-Losung eingestellt, wonach
30 mg alkalische Phosphatase (von Koch-Light, Coinbrook,
Bucks., England),in 6 ml einer "Iris»-Pufferlösung gelöst, zugegeben wurden (diese "Iris"-Pufferlösung wurde durch Auflösen von 0,01 gmöl Iris(hydroxymethyl)aminomethan
(="Trislf) und 0r0i Mol MgSO. (wasserfrei) in 1 1 Wasser erhalten, wobei der pH-Wert mit
Essigsäure auf 8,& eingestellt wurde). Die Mischung
gelierte, und nach einer halben1 Stunde wurde die steife
Masse mit Hilfe eines Spachtels zerkleinert und gründlich mit der vorgenannten "Iris"-Pufferlösung ausgespült. Die ausgespülte Masse wog 29,3 g und enthielt
so theoretisch 1,2 mg Enzym je g G-el. Das ausgespülte
Gel wurde durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,1 mm gedrückt.
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BAD ORIGINAL
Die Aktivität der Gel-Enzymzubereitung'wurde wie folgt bestimmt":"
Es wurde als Substrat eine 0,01 molare Lösung von
Dinatriumphenylphosphat in der obengenannten "Tris"-Pufferlösung
genommen. 5 ml dieser lösung und 2 g der ausgespülten und zerkleinerten Seuchen wurden in ein
Rohr eingeführt, das mit einem geschliffenen G-lasstopfen
versehen war. Das Rohr wurde dauernd langsam umgedreht, um eine gute Mischung des Inhalts herbeizuführen.. Nach
genau.-1Ö; min- wurden 2 ml einer 0,4 n-NaOH-Lösung zug-egeben,
um die Reaktion anzuhalten, und das Silieiumdioxydgel
wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die Menge an gebildetem Phenol wurde durch Messen der Ultraviolettabsorption
bei 278 nm in einer Zelle von 1 cn bestimmt.
Durch 'Anwendung-'derselben-analytischen Arbeitsweise
auf verschiedene bekannte Mengen von gelöster alkalischer Phosphatase konnte der Gehalt an aktivem Enzym
der Siliciumdioxydgelteilchen bestimmt werden; dieser entsprach 60. $ der Menge an Enzym, das theoretisch; in
der Probe vorhanden sein sollte.
Es wurde eine Siliciumdioxydgellipoxydasezubereitung,
nach der im Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise
hergestellt, wobei jedoch 7 mg I»ipoxydase(von
Sigma Chem., St. Louis, Mo., USA) in 5 ml Pufferlösung
(0,05 molare Lösung von HH.G1 und NH.OH mit einem pH-Wert
von 9) gelöst wurden. Die Aktivität der so erhaltenen Siliciumdioxydgel-Lipoxydasezubereitung wurde
wie folgt bestimmt?
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BAD ORIGINAL
Das Gel wurde durch, ein Sieb gedrückt (Kaschengröße
0,1 mm). Es-wurde eine Substratlösung aus 198 rag reiner Linolsäure hergestellt, die unter allmählicher
Zumischung von 2,05 ml 1 n-NH^OPI au einer homogenen
Paste verrieben" wurde, welche in 98 ml -V/asser- emulgiert
wurde. In der Emulsion wurden danach 178 mg NH.Gl gelöst. Schließlich wurde diese Emulsion mit Sauerstoff
gesättigt. 2 g des gesiebten Gels wurden in ein Rohr
mit einem geschliffenen Glasstopfen eingebracht.- 5 nil
Substrat wurden bei der Zeit t = O zu dem Gel zugesetzt,
wonach, das Rohr dauernd geschüttelt wurde. Nach genau
5 miii wurde das Rohr mit 5 ml But an öl geschüttelt, wonach, sein Inhalt zentrifugiert wurde, um eine rasche
Trennung in 2 Phasen zu erhalten. Yon der oberen Phase (Butanolphase) wurden 2 ml abpipettiert und mit 6 ml
Methanol verdünnt. Von dieser Lösung wurde die Ultraviolettabsorption bei 234 nm gemessen. Diese Absorption
ist ein Ka3 für die Konzentration des gebildeten Konjugierten
Diensystems. Durch Anwendung der gleichen analytischen Arbeitsweise auf verschiedene bekannte Standardlösungen
von lipoxyda.se" in einer 0,05 molaren NH4Cl-NH.OH-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9,0 und
Auftragen der Menge von Lipoxydase gegen die Extinktion bei 234- nm war es möglich,, durch graphische Interpolation
des für die in dem wäßrigem Siliciumdioxydgel eingebetteten Lipoxydase gefundenen Uerts den Prozentsatz der
Von dem Enzym behaltenen Aktivität zu bestimmen. Es wurden Werte von 50 - 60 # der i;r sprünglich en Aktivität
gefunden.
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gAD
19393A7
.. : "·:".-■■ : Beispiel 7 - . ; ;. : ;
Eine Prostaglandin synthetisierende Enzym Zubereitung (PGSE) wurde auf folgende Welse hergestellt:
25 g frische Schafsvesicuiardrüsen, von denen
Bindegewebe und Fett entfernt worden waren, wurden bei 0 C homogenisiert, zuerst in einoLi Haushaltsmischer
(Turmix) und danach in einem Bühlerhomogenisator in 50 ml
0,1 molarer Phosphatpufferlösung (pK-Wert 7,5). Die
homogene Masse wurde bei 10000 g (g = Gravitation)
15 min bei 2 — 3 C zentrifugiert. Die überstehende
W Flüssigkeit wurde dekantiert und 1 Std. bei 100000 g
zentrifugiert. Dieses zweite Zentrifugat, welches das
PGSE enthielt, wurde gefriergetrocknet. Die Ausbeute
betrug -'etwa 2 g (bestehend aus -etwa >0 c/o Protein). Von
dieser Zubereitung, die als an Teilchen gebundenes Enzympräparat angesehen werden sollte, wurden 100 mg
in 5 ml 0,1 molarer Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5)
emulgiert. 20 ml Siliciumdioxydsol, das wie obenbeschrieben
hergestellt war, wurden auf 0° G gekühlt,· und der
pH-¥ert wurde mit Hilfe von NaOH auf 6 eingestellt. Die
Enzymemulsion wurde dann rasch zu diesem Siliciumdioxydsol zugegeben.
Nach diesem Zuatz wurde der pH-Wert der Kiachung
auf einen Wert von 7,5 eingestellt, wonach die Mischung
geliert wurde. '
Von dem so erhaltenen Gelpräparat wurden 2g (entsprechend
2 mg Protein) zu 2 ml Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5, 0,1 molar) zugegeben, zu der 0,6 mg des
Cofaktors Glutathion (γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycin),
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BAD OBJGifJÄL
0,1 mg des Substrate Dihomo-y-linolensäure (gesamte
Gis 8, 11, 14-Eicosa-triensäure) und 0,1 mg Hydrochinon
augesetzt worden waren. Diese Mischung aus wäßriges Siliciumdioxydgel und Enzyme umfassender Zubereitung
und die Lösung, die mit Luft gesättigt war und das Substrat enthielt, wurden 15 min bei 35° 0 geschüttelt,
wonach die Reaktion durch Ansäuerung mit Zitronensäure
auf einen pH-Wert unter 3 unterbrochen wurde. Danach wurde die Mischung dreimal mit 1 ml [Teilmengen Diäthyläther
geschüttelt. Die Ätherschichten wurden gesammelt, vereinigt
und mit Wasser gewaschen, bis die ÄtherlÖsung neutral reagierte. Danach wurde die A'therlösung eingedampft,
und der Rückstand wurde in 1 ml Methanol aufgenommen. 0,1 ml dieser Lösung wurde in eine 1 cm
Quarzzelle zusammen mit 2,4- ml Methanol und 0,5 ml 3n-K0H in wäßrigem Methanol (mit einem Gehalt von 75 $
Methanol)· eingebracht. Nach etwa 5 tain wurde die Menge
des gebildeten Prostaglandin E. aus der Erhöhung der
Ultraviolettabsorption bei 237 nm infolge Umwandlung
von PGE1 in PGE1 237 bestimmt. Im Vergleich mit 2 rag."'
Protein der gleichen PGSE-Zubereitung ' in 2 ml Pufferlösung,· aufgebracht bei 0° C, hatte das in Siliciumdioxydgel eingebettete Präparat 50 $ seiner Aktivität
zurückbehalten.
Auf die gleiche Weise, wie sie in BeispieleJ beschrieben
wurde, wurde eine Menge eines Ureasepräparats (von Sigma, St. Louis, Mo., USA) in einem wäßrigen
Siliciumdioxydgel (pH-Wert 8).eingebettet. Nach Gelierung
wurde die Gel-Enzymzubereitung auf 12 1/2 $ des
ursprünglichen Gewichts, was etwa 150 $ Wasser, bezogen
auf SiO9, ist, dehydratisiert. Das sich ergebende Pro-
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ORIGINAL·
dukt enthielt je Gramm 41 mg des Ureasepräparats."
Nach Pulverisieren und Sieben der Probe zu kleineren
Teilchen als'solche mit 0,1 mm wurde die enzymatische
Aktivität der Zubereitung aus wäßrigein Siliciumdioxydgel
und Enzym durch Titrieren in analoger Weise wie derjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, bestimmt.
Der .verwendete Puffer bestand aus einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung (pH-Wert 8,0) anstatt der 0,1 molaren
mit einem pH-Wert von 7»4»in Beispiel 1, und das Substrat
bestand aus 300 mg Harnstoff in 3 ml Pufferlösung ·
anstelle von Acetylcholinhydrochlorid in Beispiel 1.
Das gebildete Ammoniak wurde bei einem konstanten pH-Wert
mit 0,2 n-HCl titriert. Obwohl bei einem pH-Wert.
von 8,0 nur etwa eine Hälfte des gebildeten Ammoniaks
titriert wird,'was die Folge von auch gebildetem Kohlendioxyd ist, konnte die Aktivität des Ureasepräparats
auf diese Weise in Gramm-Äquivalenten je min ausgedrückt
werden, was offensichtlich kein absolutes Maß ist. Durch Vergleich der so bestimmten Aktivität mit der Aktivität
von 1 mg des Ausgangsenzymmaterials in dem gelösten Zustand wurde die relative Aktivität des eingebetteten
Enzyms bestimmt. Es wurde eine relative Aktivität von etwa 40 $>
gefunden. Die Aktivität-wurde nicht durch
mehrmaliges gründliches Spülen der Gel-Enzymteilchen mit
der verwendeten Pufferlösung beeinträchtigt. ;
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Auf die gleiche Y/eise, wie sie in Beispiel 4 be- ""
schrieben wurde, wurde eine Siiule aus 4,2 g Gel-Ürease-TcileheIi
hergestellt, die je g etwa 2o mg. Urease-Präparat
enthielten. So enthielt die Säule etv/a 84 mg Urease.
Eine Lösung von Io mg/ml Harnstoff in ο,ΐ molare Phosphatpufferlösung
(pH-'7ert 8,o), die r.it SiO^ in der in Beicpiel
4 beacliriebenen \7eise gesättigt war, wurde durch
die Säule g-afüjirt. Bei einen Ausmaß oder; einer Geschwindigl'cit
von 15o til/li wurden etwa 77/5 des Harnstoffs um—
gewandelt j bei einer Geschv/indiglceit voxi_ 75 nl/h wurden
■ loovo ur-gewandelt.
Beispiel Io ;
Ss wurde ein Katalasepräparat von Kcch-Light CoInbrook,
Bucks, England, in Sili'ciumdioxydhydrogel in der gleichen Welse einverleibt, wie.sie in Beispiel 1 beschrieben
wurde.Sie erhaltene Zubereitung enthielt je g
etv/a 1 rag des Enzympräparat es. Die Gel-Snsyinzubereitung
vrarde zerkleinert und gründlich durchgespült. Die enzy-/
natische Aktivität der Siliciumdioxydgel-Enzymzubereitung
wurde wie folgt bestimiiit:
Eine geeignete Menge von Teilchen, die kleiner als. o,l iar. waren, wurde zu etwa Io ml entlüfxeter o,l molarer
Phosphatpufferlösung (pH-Y/ert 7,o) zugegeben. o,2 ml von
0,3/aigen KpOp vrurdeh zugesetzt, und es wurde die Abnahme der
ripOp-Konzentration in b ekannter Y/eise mit Hilfe eines
Piatin-Kalomel-Elektrodensystems gemessen, während kontinuierlich der erzeugte 0« dadurch entfernt wurde, daß
man Stickstoff in Blasen durch das R eakt ions medium.-führte-.
Die HpOp-lvonaentration wurde logarithmisch aufgezeichnet,
00981371505
BAD
uiici es wurde eine gerade Linie erhalten. Die lie igung dieser Linie, ausgedrückt in see" , v/urcü als !.laß für die
Aktivixät der Präparate verwendet. lar die sogenannte
11 Hatalase-Fähigkeit" (vgl. z.B. "Enzymes" von Iu0 Dixon
und.E.G. Y/ebb, Longmans London (1964), Seite 16). Durch
Vergleich der Aktivität mit der Aktivität von 1 mg des Äusgangs-SiazymEiaterials wurde eine relative Aktivität
von etwa 2oc/o gefunden, die auch nach weiterem gründlichen Spülen konstant blieb.
' : '. BeisOie-1 -1-1
3ine I/Ienge von 1,8 g nassen Sporen Penicillium ;
roqueforti v/urde in einer physiologischen oalzlösung bei
einem Gesamtvolunen von 7 al suspendiert. 1 ml dieser
et'.va Io ° Sporen enthaltenden. Suspension v/urde-zu 4,5 ml.-.';
Siliciumdioxydsoi, eingestellt auf einen pII~Y/ert von 7, ο}
zugegeben, wonach die Mischung gelieren gelassen wurde.
Das so erhaltene Siliciumdioxydgel wurde mit einem Spatel
zerkleinert und dreimal mit Io ml Pufferlösung (o,öl mo-
: lar Phosphatlösung: mit; einem pH-Wert von 7) gespült.
Die ausgespülten Teilchen wurden in eine loo ml-?lasche
mit, Glasstopfen eingebracht. Eine Henge von 2o ml einer
Ψ Substratlösung, bestehend aus 1 g/l Lösung von !Fettsäuren
in wäßriger o,öl Phosphatpufferlösung (pK-V/ert 7)
zugegeben; die Fettsäuren bestanden aus 19,o^ Sssigsäure,
18,8^ Buttersäure, 11,2^ Capronsäure, lo,6c^ Caprylsäure,
19,6^fa Gaprinsäure und 21,4$ Laurinsäure.
Gemäß der Literatur ist dies eine gute Durchschnittszusammensetzung der freien C2-0-L2~Ile'b"i;säuren, wie sie in
skandinavischem Blaukäse und in Hoquefortkäse vorkommen,
wobei Ig Fettsäuren repräsentativ für etwa 25o g Käse ist,
00981371509
Unter aseptischen Bedingungen wurde: die Mischung der
Fottsäuren/Pufferlösung und der Siliciumdioxydgel-Enzymsubereitung
schwach bei Umgebungstemperatur gerührt; nach
13 Stunden wurde dar starke Geruch von Methylketonen festgestellt,
wobei die C-esamtaromaempf indung dem. charakteristischen
Aroma von Roquefortkäse sehr ähnlich war.
Die Sporen enthaltenden Teilchen wurden durch Zentrifugieren
entfernt, die überstehende Flüssigkeit wurde auf iietliy !ketone analysiert'. Es wurden die folgenden
!.langen (mittels Gaschromatographie) gefunden, wobei die
Y/erte in den Klammern die Prozentsätze der entsprechenden umgewandelten
fettsäuren zeigen: .
2-Heptanon 5,25 mg/l (4,8 fo auf Caprylsäure)
2-iIonanon 6,5o mg/1 (3,2 <?o auf Caprinsäure)
2-TJnd.ecanon ο, 35 mg/l (ο, 2 eß>
auf Laurinsäure).
Es wurden keine Sporen in der überstehenden Flüssigkeit
gefunden, und die in den Siliciumdioxydgelteilchen
eingeschlossenen Sporen keimten nicht innerhalb der Versuchszeit.
Bei einem entsprechenden Versuch unter Verwendung
der gleichen Menge von Sporen, jedoch ohne Siliciumdioxydgel
wurden die folgenden Mengen von Methy!ketonen
gefunden:
2-Heptanon 8,45 mg/1 (7,7 cß>
auf Oaprylsäure) 2-lionanon. 4,95 mg/1 .(2,5 $ auf Caprinsäure)
2-Undecanon ο,35 mg/l (ο,2 cß>
auf .Laurinsäure)„
Es v/urde ferner festgestellt, daß es möglich ist;
diese Käsearomen unter Verwendung einer Säule der in SiIi-
.009813/1509
eiumdio:cyd einjebetteten Sporen, durch, welche die Subctratiösung
perkoliert wurde, kontinuierlich herausteilen.
l 12
-iine- klenge von 5 g nass era Z-el !material von Cladospori
butyri wurde in einer physiologischen. Salzlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen Io ml beurug und
- etwa 9 x Io . Zellen je ml enthalten waren.
P In der gleichen Weise wie dies in Beispiel 11 be-
■ .-■ schrieben vmrde, v/urde 1 ml dieser Suspension in einem
SiliciuEdioxydhydrogel eingeschlossen, das dann, zerklei-•
nert und ausgespült wurde und mit 2o ml des gleichen Substrats gemischt wurde, wie es in Beispiel 11 verwendet wird. ; : ; : -
.'"■■■- Schon nach 2o-minutigem schwachen !röhren der. erhaltenen-Mischung
wurde ein Käsearoma klar wahrgenommen. Itfach 18 Stunden wurden die Gelteilchen durch Zentrifugieren entfernt, und die gebildeten Llethylkexone v/urden bestimmt. .' " : ; :■■.": -
Die folgenden LIengen wurden (durch GasChromatographie ) festgestellt:
2-Heptanon 3o,5 mg/l
2-lTonanon 9,3 mg/l ;
2-ündecanon o,l mg/l
Es wurden keine Zellen in der überstehenden flüssigkeit
gefunden und die in den Siliοiumdioxydgelteliehen eingeschlossenen Zellen keimten nicht innerhalb der Versuchszeit.
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BAD ORIGINAL
3e,i ci:»c:^. entsprechenden 7or.3uch -arrter Verv/endung
ucr ^leiciiei: LIen^on von Zellen, -jedo-cii oLiie daj SiIiiaxyü^öl
wurden die folgenden Werte gefunden:
2-jJOnanon 17, 5 rcs/l
2-ündecanori 1,1 rn^/l.
00981371509
ÖAD
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven
Substanzen, dadurch gekennzeichnet., daß ein wäßriges Siliciumdioxydgel in Gegenwart eines Enzympräparats hergestellt
wird. .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß ein wäßriges Siliciumdio::ydsol in Genwart eines
Enzympräparats geliert wird.
3· Verfahren nach Anspruch- 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß ein wäßriges Siliciumdioxydgel in einer Lösung hergestellt wird, die in Teilchen auftretende Enzyme
enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriges Siliciuadioxydgel in einer Lösung hergestellt wird, die Enzyme im gelösten Zustand
enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 "bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ein wäßriges Siliciumdioxydgel
und Enzym umfassende Zubereitung in Gegenwart eines porösen Trägers hergestellt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die ein wäßriges Siliciumdioxydgel
und Enzym umfassende Zubereitung auf einen Wassergehalt von nicht weniger als 10 $ Wasser, bezogen auf das
Gewicht von SiOp, dehydratisiert wird.
0 098 13/15 09
BAD ORIGINAL
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Dehydratisierungsverfahren in Kombination
mit Maßnahmen ausgeführt wird» welche der das wäßrige
Siliciumdioxydgel und Enzym umfassenden Zubereitung eine
erwünschte Form erteilen. ""..._.-.
8» Enzymatisch aktive Zubereitungen, wiche wäßriges
Siliciumdioxydgel umfassen, in dem Enzyme eingebettet
sind.
9. Enzymatisch aktive Zubereitungen gemäß Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß sie Wasser in einer Menge von
10 - 5000 #, bezogen auf das Gewicht von SiO2, des wäßrigen Siliciumdioxydgels enthalten.
10. Geformte Gebilde zur Ausführung von enzymatischen
Verfahren in flüssigen Medien, dadurch gekennzeichnet,
daß sie wäßriges Siliciumdioxydgel umfassen, in dem Enzyme eingebettet sind.
11. Säulen, die wäßriges Siliciumdioxydgel und Enzym umfassende Zubereitungen gemäß einem der Ansprüche
8 bis 10 enthalten.
009813/15 09 aÄD ORIGINAL
19393A
12. Verwendung von Säulen gemäß Anspruch 11 zur Ausführung von enzymatisehen Prozessen, wobei eine
Lösung eines Substrats durch die Säule geführt wird.
IJ). Verwendung von enzymatisch aktiven Zubereitungen
gemäß einem der Ansprüche 8 bis IO zur Ausführung von enzymatischen Prozessen, wobei eine Lösung eines
Substrats, gegebenenfalls unter Rühren mit der Zubereitung
in Berührung gebracht und die Zubereitung nach erfolgter
Wirkung entfernt wird.
009813/1609 Bad ofi,G/(WL
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LU56634 | 1968-08-02 |
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Publication Number | Publication Date |
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GB (1) | GB1267685A (de) |
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