DE69420390T2

DE69420390T2 - Hydrolyse von Kaffee mit immobilisierter Beta-Mannanase

Info

Publication number: DE69420390T2
Application number: DE69420390T
Authority: DE
Inventors: Pierre Nicolas; Eric Raetz; Sylviane Reymond; Jean-Luc Sauvageat
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1994-04-07
Filing date: 1994-04-07
Publication date: 1999-12-16
Anticipated expiration: 2014-04-08
Also published as: AU1488595A; ATE183886T1; CN1068503C; NZ270694A; GR3031962T3; US5714183A; PH31646A; DE69420390D1; CN1117349A; EP0676145A1; FI951568A; RU2157407C2; ZA952131B; NO951224D0; CA2144707A1; NO951224L; EP0676145B1; DK0676145T3; JPH07274833A; ES2137277T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hydrolyse von Galactomannanen, die in einem flüssigen Kaffee- Extrakt vorhanden sind.
US 2802920 offenbart die Hydrolyse der Galactomannane, die in einem Kaffee-Extrakt vorhanden sind mit einem beta-Mannanasen- Präparat mit dem Ziel, die Bildung eines Gels beim Gefrieren dieses Extrakts zu verhindern.
Das Patent FR 223139 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Instantkaffee, bei dem der Kaffee in wässriger Lösung mit einer Peroxidase in Anwesenheit eines Peroxids behandelt wird.
Das Dokument "Chemical Abstracts Vol. 88 No. 48996" offenbart die Immobilisierung von Hemicellulasen oder von Mannanasen auf einen porösen Träger, um Xylane oder Mannane aus Holz kontinuierlich zu hydrolysieren.
Food Review, 8/9, 37-39 (1984) beschreibt die industrielle Verwendung von beta-Mannanasen, um die Viskosität eines flüssigen Kaffee-Extrakts zu verringern, was es ermöglicht, ihn bis auf einen erhöhten Trockensubstanzgehalt zu konzentrieren.
Jedoch weist diese industrielle Verwendung der beta- Mannanasen bestimmte Nachteile auf. Denn man vergeudet dieses Enzym, indem man es beispielsweise nur einmal anwendet. Auf der anderen Seite ist die Anwesenheit des Enzyms in dem Endprodukt nicht wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, die Nachteile der früheren Methode zu beseitigen.
Sie betrifft somit insbesondere ein Verfahren zur Hydrolyse von Galactomannanen eines flüssigen Kaffee-Extrakts, bei dem der genannte Extrakt bei einer Temperatur von 20-80ºC mit beta- Mannanasen, die durch kovalente Bindung an einen Träger oder durch Polymerisation der adsorbierten Mannanasen auf einen Träger immobilisiert sind, behandelt wird.
Diese Erfindung stellt auch einen Vorteil dar, da man eine Enzymeinsparung realisiert.
Ein anderer Vorteil beruht auf der Tatsache, daß man keine Abspaltung der beta-Mannanase von dem Trägers beobachtet.
Ein weiterer Vorteil beruht auf der Tatsache, daß man bei einer Temperatur, bei der man keine Bakterienkontamination beobachtet, arbeiten kann.
Ein überraschender Vorteil der vorliegenden Erfindung beruht auf der Tatsache, daß die beta-Mannanasen aufgrund der kovalenten Bindung an einen Träger oder aufgrund der Polymerisation der adsorbierten Moleküle an einen Träger ihre Aktivität nicht verlieren. Ebenso ist die enzymatische Aktivität der immobilisierten beta-Mannanase im Laufe der Zeit relativ konstant.
Schließlich zeigt die vorliegende Erfindung noch den Vorteil, daß man den Kaffee-Extrakt in einem Reaktor vom Rührkessel-Typ hydrolysieren kann und in einem Reaktor, der ein Festbett oder eine Wirbelschicht aus immobilisierten beta- Mannanasen enthält, und dieses trotz der Viskosität des Kaffee- Extrakts.
In der folgenden Beschreibung versteht man unter "Reaktor vom Rührkessel-Typ" ein mechanisch gerührtes System, das eine Suspension an immobilisierten beta-Mannanasen enthält.
Ebenso versteht man unter "ein Festbett aus immobilisierten beta-Mannanasen" immobilisierte beta-Mannanasen auf oder in einem Träger, das in einen gewünschten Reaktor für die kontinuierliche Behandlung eines flüssigen Kaffee-Extrakts gepackt ist.
Man versteht gleichermaßen unter "einer Wirbelschicht aus immobilisierten beta-Mannanasen" immobilisierte beta-Mannanasen auf einem Träger, die in einem gewünschten Reaktor zur kontinuierlichen Behandlung eines flüssigen Kaffee-Extrakts angeordnet ist, aber nicht gepackt ist. Der Fluß des Kaffee- Extrakts fließt von unten nach oben, er trifft dann die Trägerteilchen in der Suspension. Dieser Reaktortyp, der unter dem Namen "Reaktor mit Wirbelschicht" bekannt ist, ist für die Behandlung eines Milieus, das Feststoffe in Suspension enthält, von besonderem Vorteil.
Ferner versteht man unter "Mannobiose" bzw. "Mannotriose" ein Dimer oder ein Trimer von Mannose, und unter "Mannosaccharid" ein Polymer aus wenigstens zwei Mannosen.
Schließlich definiert man eine beta-Mannanase-Einheit als die Menge an beta-Mannanase, die aus Johannisbrotkernmehl eine Menge an reduzierenden Zuckeräquivalenten von 1 umol Mannose pro Minute bei einem pH-Wert 5 und bei 30ºC erzeugt.
Um die Erfindung zu verwirklichen, wird die beta-Mannanase z. B durch kovalente Bindung an die Oberfläche eines traditionellen Trägers oder durch Polymerisation der vorher an die Oberfläche eines traditionellen Trägers adsorbierten beta-Mannanasen immobilisiert.
Man kann auch zum Beispiel den flüssigen Kaffee-Extrakt bei einer Temperatur von 40-70ºC mit immobilisierten Enzymen hydrolysieren.
Vorzugsweise verwendet man dazu z. B. eine Bakterien-beta- Mannanase oder eine Pilz-beta-Mannanase, insbesondere einen beta- Mannanase-Auszug von Aspergillus niger, insbesondere die gereinigte beta-Mannanase von Aspergillus niger, vermarktet unter dem Markennamen Gamanase® (NOVO-NORDISK, Dänemark).
Außerdem kann der flüssige Kaffee-Extrakt auch durch Perkolation einer Extraktionsflüssigkeit durch mit geröstetem und gemahlenem Kaffee gefüllte Zellen erhalten werden. Diese Extraktion kann im Gegenstrom durchgeführt werden, d. h. daß Wasser, das unter Druck eine Temperatur von 150 bis 180ºC aufweisen kann, von unten in eine Zelle eingeführt wird, die eine Charge gerösteten und gemahlenen Kaffee enthält, die am meisten ausgelaugt worden ist, indem sie bereits N Extraktionen ausgesetzt worden ist. Der flüssige Extrakt dieser Zellenextraktion wird dann weitergeleitet, um die Extraktion der Zelle, die die Kaffeecharge enthält, die (N-1) Mal verwendet worden ist, zu durchströmen, und das nacheinander so, bis der flüssige Extrakt die Zelle, die an der Reihe ist, um mit geröstetem und gemahlenem frischen Kaffee gefüllt zu werden, durchdrungen hat. Der endgültige Extrakt, den man am Ausgang der letzten Zelle verwendet, hat eine Temperatur in der Größenordnung von 100ºC. So kann man eine Druckstufe, die von den Zellen gebildet wird, die den am meisten ausgelaugten Kaffee enthalten, von einer Atmosphärendruck-Stufe unterscheiden, die von den Zellen gebildet wird, die den am wenigsten ausgelaugten Kaffee enthalten.
Der flüssige Kaffee-Extrakt kann auch durch Perkolation einer Extraktionsflüssigkeit durch die mit geröstetem und gemahlenem Kaffee gefüllten Zellen in einer Druckstufe erhalten werden. Bei diesem Verfahren, daß unter dem Namen der "Split-Extraktion" bekannt ist, und das in der folgenden Beschreibung "Trenn-Extraktion" genannt werden wird, werden zwei Extraktionsflüssigkeiten verwendet, die Extraktionszellen sind in eine Druckstufe und in eine Atmosphärendruck-Stufe aufgeteilt, jede Stufe wird mit ihrer eigenen Extraktionsflüssigkeit extrahiert. Der Kaffee, der sich in der Atmosphärendruck-Stufe befindet, wird mit einer ersten Extraktionsflüssigkeit unter den Temperatur- und Druckbedingungen, die sehr gemäßigt sind, extrahiert, während der Kaffee, der sich in der Druckstufe befindet, mit einer zweiten Extraktionsflüssigkeit bei Temperatur- und Druckbedingungen, die viel härter sind, extrahiert wird. Es werden somit zwei verschiedene Flüssigextrakte hergestellt, die nach der teilweisen Verdampfung des Extrakts, der zum Beispiel aus der Druckstufe erhalten wird, miteinander vereinigt werden können und dann nach den klassischen Verfahren in Pulver überführt werden.
In der vorliegenden Erfindung kann man nun insbesondere den Extrakt der Druckstufe, der bei der Trenn-Extraktion des gerösteten und gemahlenen Kaffees erhalten wurde, verwenden, bevor man diesen teilweise eindampft.
Man verwendet auch vorzugsweise zum Beispiel den Extrakt der Druckstufe, der in EP 0538512 beschrieben worden ist.
Nach der vorliegenden Erfindung kann der Träger auch ein poröser Träger sein, der besonders z. B. Poren mit einer Größe von 20-200 nm aufweist.
Insbesondere kann der poröse Träger aus der Gruppe gewählt werden, die aus Teilchen von Siliziumdioxid, aus Glas, aus einem Acrylpolymer, besonders dem Acrylpolymer Eupergit-C® (Röhm, Deutschland) und aus Phenolpolymeren, besonders einem Phenolformaldehydharz Duolite® (Supelco, USA) und besonders dem Harz Duolite® S-761, gebildet wird.
Vorzugsweise immobilisiert man die beta-Mannanase mit einer kovalenten Bindung an die Oberfläche des Acrylpolymers Eupergit- C®. Letzteres enthält Oxirangruppen, deren Epoxidringe es ermöglichen, die beta-Mannanasen zu fixieren. So kann man zum Beispiel wenigstens 1900 Einheiten der beta-Mannanase pro g an Eupergit-C® immobilisieren.
Vorzugsweise immobilisiert man die beta-Mannanasen durch Polymerisation der adsorbierten beta-Mannanasen an die Oberfläche der Teilchen eines phenolischen Duolit®-Harzes. Beispielsweise kann man als Polymerisationsmittel Glutaraldehyd verwenden.
In einer bevorzugten ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hydrolysiert man den Kaffee-Extrakt in einem Reaktor vom Rührkesseltyp mit einer immobilisierten beta-Mannanase, die entweder durch kovalente Bindung an den Träger oder durch Polymerisation der adsorbierten Mannanasen an einen Träger immobilisiert ist. Das System kann automatisiert sein und semikontinuierlich mit den drei folgenden Phasen funktionieren. Zuerst füllt man den Kessel mit dem zu behandelnden Kaffee- Extrakt, dann hydrolysiert man unter mechanischem Rühren, dann leert man den Kessel nach einer bestimmten Dauer. Die Retention des Enzyms in dem Reaktor kann mit Hilfe eines im Innenraum des Kessels angeordneten Filters erfolgen. Dieser Filter kann z. B. all die Teilchen mit einem Durchmesser von mehr als 40 um zurückhalten.
Nach dieser Hydrolysemethode kann man beobachten, daß die beta-Mannanasen, die durch eine kovalente Bindung an einen Träger immobilisiert sind, eine gute Stabilität aufweisen, denn sie können z. B. mehr als 60% ihrer enzymatischen Aktivität nach wenigstens 500 aufeinanderfolgenden Hydrolysezyklen von Kaffee- Extrakten behalten.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hydrolysiert man kontinuierlich den flüssigen Kaffee-Extrakt in einem Reaktor, der ein Festbett aus beta- Mannanasen, die entweder durch eine kovalente Bindung an einen Träger, oder durch Polymerisation der adsorbierten beta-Mannanasen an einen Träger immobilisiert sind, enthält. So verwendet, bewahren die immobilisierten beta-Mannanasen eine gute Stabilität, denn sie können mehr als 80% ihrer Enzymaktivität nach mehr als 20 Stunden kontinuierlicher Hydrolyse behalten.
In einer bevorzugten dritten Ausführungsform der vor liegenden Erfindung hydrolysiert man kontinuierlich den flüssigen Kaffee-Extrakt in einem Reaktor, der eine Wirbelschicht aus beta- Mannanasen, die durch eine kovalente Bindung an einen Träger immobilisiert sind, enthält.
Die Beispiele weiter unten dienen der Veranschaulichung des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung. In den Beispielen wird die beta-Mannanase verwendet, die unter der Marke Gamanase® vermarktet wird, die eine spezifische Aktivität von 65000 Einheiten pro g an Proteinen aufweist, und in einigen von den Beispielen wird als Modellsubstrat eine Mischung von 2% löslichem Kaffee in destilliertem Wasser oder eine Lösung von Galactomannanasen, die aus Johannisbrotkernmehl hergestellt worden sind, verwendet, die sehr gut die Ergebnisse zeigen, die man mit einem Kaffee-Extrakt erhalten könnte.
Den Beispielen wird eine Erläuterung der Analyse der Extrakte mittels Chromatographie und der Zeichnungen vorangestellt.

HPTLC-Chromatographie

Man bestimmt mittels Chromatographie qualitativ und quantitativ die Oligosaccharide, die in einem flüssigen Kaffee- Extrakt vorhanden sind, ohne eine vorherige Reinigung von diesem Extrakt durchführen zu müssen. So kann man diese Methode in verschiedenen Tests verwenden, wie zum Beispiel der kinetischen enzymatischen Hydrolyse der Galactomannane und beispielsweise der Messung der enzymatischen Aktivität des Rückstands der hydrolysierten Kaffee-Extrakte.
Dabei verwendet man für die HPTLC-Chromatographie Kieselgelplatten "Silica Gel 60" (Merck 5631/5641). Man legt ein Äquivalent von 80 ug trockenem Kaffee-Extrakt vor und man führt drei aufeinanderfolgende Entwicklungen mit einem Lösemittel durch, das Chloroform, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 30/35/11 enthält. Man behandelt die Platte bei 110ºC innerhalb von 30 Minuten mit einem Reagens, das 4 ml Anilin, 4 g Diphenylamin, 200 ml Aceton und 30 ml 85%ige Phosphorsäure umfaßt.
Man kann auch qualitativ bestimmen, welches die in dem Extrakt vorhandenen Oligosaccharide sind, zum Beispiel die freie Mannose, die Mannobiose, die Mannotriose und die anderen Mannosaccharide, die einen Polymerisationsgrad von unter 8 aufweisen.
Man kann ferner den Gehalt der verschiedenen Oligosaccharide in dem Extrakt bestimmen, indem man das Verhältnis zwischen der Dichte eines Punkts auf der Platte, der einem Oligosaccharid des Extrakts entspricht und der Dichte, die diesem abgeschiedenen Oligosaccharid auf der Platte mit einer bekannten Konzentration entspricht, bestimmt. Man geht ferner davon aus, daß man 100% Hydrolyse der Galactomannane erreicht, wenn nur noch Mannobiose oder Mannotriose vorhanden sind, die die Endprodukte der Reaktion darstellen, bei denen das Enzym nicht mehr fähig ist, diese aufzuspalten.

Zeichnungen

Fig. 1 (a und b): Hydrolyse der Galactomannane in einem Reaktor mit Festbett, der eine beta-Mannanase enthält, die auf dem Duolite® S-761 immobilisiert ist. Darstellung des Hydrolyse- Prozentsatzes als Funktion der Verweilzeit (1a), und der relativen Aktivität des Enzyms als Funktion der Zeit (1b).
Fig. 2 (a und b): Hydrolyse der Galactomannane in einem Reaktor mit Festbett, der eine beta-Mannanase enthält, die auf Siliziumdioxid-Kugeln immobilisiert ist. Darstellung des Hydrolyse-Prozentsatzes als Funktion der Verweilzeit (2a) und der relativen Aktivität des Enzyms als Funktion der Zeit (2b).
Fig. 3 (a und b): Hydrolyse der Galactomannane in einem Reaktor mit Festbett, der eine beta-Mannanase enthält, die auf Eupergit-C® immobilisiert ist. Darstellung des Hydrolyse- Prozentsatzes als Funktion der Verweilzeit (3a) und der relativen Enzymaktivität als Funktion der Zeit (3b).
Fig. 4: Hydrolyse eines Kaffee-Extrakts in einer Wirbelschicht mit einer beta-Mannanase, die auf Eupergit-C® immobilisiert ist. Darstellung des Hydrolyse-Prozentsatzes als Funktion der normalisierten Verweilzeit.
Fig. 5: Hydrolyse eines Kaffee-Extrakts im Rührkessel mit einer beta-Mannanase, die auf Eupergit-C® immobilisiert ist. Darstellung des Prozentsatzes des Test-Mannosaccharid-Produkts als Funktion der Anzahl der Hydrolysezyklen.

Beispiel 1

Man immobilisiert die beta-Mannanase durch Adsorption und Polymerisation an einem Phenolpolymer auf die folgende Weise.
Man verwendet das Harz Duolite® S-761 (Supelco, USA), das Poren mit einer Größe von ungefähr 60 nm aufweist. Man siebt dieses Harz, um Teilchen von 0,2-0,4 mm zu erhalten, man behandelt es innerhalb von einer Stunde mit 0,5 N NaOH, dann wäscht man es mit Wasser, dann behandelt man es innnerhalb von 30 Minuten mit 0,25 N HCl, und schließlich wäscht man es mit destilliertem Wasser bis zu einem pH-Wert von 4. Man fügt 5 g behandeltes Harz hinzu, 25 ml einer Lösung, die aus 5 ml Gamanase® und aus 20 ml eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6 besteht, und man läßt die Gamanase® auf das Harz innerhalb von 12 Stunden bei 22ºC unter leichtem Rühren adsorbieren. Dann wäscht man die Zubereitung mit destilliertem Wasser, dann polymerisiert man die adsorbierten Enzyme innerhalb von 3 Stunden bei 22ºC mit einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd, schließlich wäscht man die Zubereitung mit destilliertem Wasser.
Es wird auch eine Lösung von Galactomannanen hergestellt, indem man 3 g Johannisbrotkernmehl in einem Liter von 0,1 M Acetatpuffer mit einem pH 5 auf 80ºC erhitzt und man verwendet den löslichen Teil für die folgenden Versuche.
So testet man das immobilisierte Enzym in einem traditionellen Reaktor mit Festbett. Dieser Reaktor umfaßt röhrenförmige Glasgehäuse und zwei Nylonfilter (70 um), die eine horizontale Oberfläche an jedem Ende der Körper bilden. Der Reaktor wird in ein Wasserbad bei 30ºC eingetaucht, und die Lösung der Galactomannane wird mit einer peristaltischen klassischen Pumpe gepumpt, dann wird auf 30ºC erhitzt, und danach durch den Reaktor geleitet.
In einer ersten Stufe pumpt man die Lösung der Galactomannane mit verschiedenen Geschwindigkeiten durch den Reaktor. Dann mißt man mit einer traditionellen Methode die Mengen der reduzierenden Zucker, die in dem Eluat als Funktion der Verweilzeit (RT) des Extrakts in dem Reaktor auftauchen. Dann bestimmt man den Prozentsatz der Hydrolyse der Galactomannane als Funktion der Verweilzeit des Extrakts in dem Reaktor. Man geht davon aus, daß man einen Hydrolyseanteil von 100% hinsichtlich der Menge der erzeugten reduzierenden Zucker erhält, wenn diese derjenigen gleich ist, die man in einem getrennten Versuch durch erschöpfende Substrathydrolyse mit einer nicht immobilisierten Gamanase® erhält. Die Ergebnisse sind in Fig. 1a angegeben.
In einer zweiten Stufe läßt man die Lösung der Galactomannane kontinuierlich in den Reaktor einleiten. Deswegen wählt man eine Verweilzeit (RT), die zu Beginn des Versuchs einen Hydrolyseanteil, der unter 100% liegt, ergibt. Man mißt auch regelmäßig die Menge der reduzierenden Zucker, die in dem Eluat auftauchen. Dann kann man beobachten, daß diese Menge als Funktion der Zeit abnimmt, wahrscheinlich aufgrund eines Aktivitätsverlusts des Enzyms. Aus diesem Grund bestimmt man die relative Aktivität (%) des Enzyms als Funktion der Zeit, indem man das Verhältnis zwischen der erhaltenen Menge der reduzierenden Zucker und der Menge, die man am Anfang des Versuchs hatte, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 1b angegeben.
Die Tabelle weiter unten veranschaulicht bestimmte Eigenschaften des Trägers.

Gamanase®, immobilisiert auf Duolite® S-761

Temperatur (ºC) 30
Höhe des Betts (mm) 19
Volumen des Betts (ml) 2,15
Proteine (mg/g Träger) 37,2

Beispiel 2

Man immobilisiert die beta-Mannanase durch kovalente Bindung an Kugeln von Siliziumdioxid X-030 LS (Sepracor, Frankreich), die einen Durchmesser von 0,1-0,3 mm und eine Porengröße von ungefähr 60 nm aufweisen, in der folgenden Weise.
Die Siliziumdioxidkugeln werden vorher mit gamma-Aminopropyltriethoxysilan in der Weise verknüpft, wie in der Methode der Silanisierung in wässrigem Milieu von H. H. Weetall (Methods in Enz., 44, 135-148, 1976) beschrieben ist. Dann behandelt man 5 g der behandelten Siliziumdioxidkugeln mit 50 ml einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 innerhalb von 1 Stunde unter Vakuum, gefolgt von 2 Stunden Atmosphärendruck. Dann wäscht man die Teilchen nacheinander mit destilliertem Wasser, mit einer Lösung von 0,5 M NaCl, und mit einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH- Wert von 6. Dann fügt man dem aktivierten Träger 25 ml einer Lösung hinzu, die 5 ml Gamanase® und 20 ml eines Natriumphosphatpuffers mit pH 6 enthält, dann läßt man bei 4ºC innerhalb von 12 Stunden unter einer Heliumatmosphäre reagieren. Schließlich wäscht man die Kugeln ausgiebig mit destilliertem Wasser, dann mit einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit dem pH-Wert 6.
Dann testet man dieses Präparat in dem Reaktor mit Festbett auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1. Man bestimmt auch den Prozentsatz der Hydrolyse der Galactomannane als Funktion der Verweilzeit des Substrats in dem Reaktor (Fig. 2a) und man bestimmt auch die relative Enzymaktivität als Funktion der Zeit (Fig. 2b).
Die Tabelle weiter unten veranschaulicht bestimmte Eigenschaften des verwendeten Trägers.

Gamanase®, immobilisiert auf Kugeln von Siliziumdioxid X-030 LS

Temperatur (ºC) 30ºC
Höhe des Betts (mm) 20
Volumen des Betts (ml) 2,26
Proteine (mg/g Träger) 34,4

Beispiel 3

Man immobilisiert die beta-Mannanase durch kovalente Bindung an Kugeln des Acrylpolymeren Eupergit-C® (Röhm, Deutschland), die Poren mit einer Größe von ungefähr 35 nm und reaktive Oxirangruppen aufweisen, auf die folgende Weise.
Man gibt zu 5 g Eupergit-C® 37,5 ml einer Lösung, die 7,5 ml Gamanase® und 30 ml 0,5 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7 enthält, und man läßt unter schwachem Rühren 48 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Dann wäscht man das Präparat mit einem 0,5 M Natriumphosphatpuffer mit pH 7.
Dann testet man dieses Präparat in dem Reaktor mit Festbett auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Dann bestimmt man den Prozentsatz der Hydrolyse der Galactomannane als Funktion der Verweilzeit des Substrats im Reaktor (Fig. 3a), und auch die relative Enzymaktivität als Funktion der Zeit (Fig. 3b). Man kann anmerken, daß die Enzymstabilität auf diesem Träger besonders gut ist, denn die immobilisierte beta-Mannanase behält mehr als 80% ihrer enzymatischen Aktivität nach 16 Stunden kontinuierlicher Hydrolyse.
Man kann auch anmerken, daß man keine Abspaltung des Enzyms von dem Träger in das Eluat im Laufe der Zeit beobachtet. Denn wenn man das Eluat innerhalb mehrerer Stunden bei 30ºC inkubiert und man dann versucht, Veränderungen im reduzierenden Zuckeranteil zu messen, beobachtet man keine Veränderung.
Die Tabelle weiter unten veranschaulicht bestimmte Eigenschaften des verwendeten Trägers.

Gamanase®, immobilisiert auf Eupergit-C®

Temperatur (ºC) 30ºC
Höhe des Betts (mm) 24
Volumen des Betts (ml) 2,74
Proteine (mg/g Träger) 31,4

Beispiel 4

Die Immobilisierung wird mit kovalenter Bindung an 5 g traditioneller Glasteilchen mit kontrollierten Poren durchgeführt, die Poren mit einer Größe von ungefähr 70 nm aufweisen und unter anderem Aminopropylgruppierungen (Sigma G5019) umfassen, auf die gleiche Weise verankert wie für die Siliziumdioxidkugeln von Beispiel 2 beschrieben ist.
Dann testet man dieses Präparat in dem Reaktor mit Festbett, der in Beispiel 1 beschrieben ist, unter Verwendung eines 2%igen traditionellen löslichen Kaffee-Extrakts (Nescafé®, Nestlé) in destilliertem Wasser.
Man verändert die Auszüge des Kaffee-Extrakts und man analysiert mittels HPTLC den Extrakt, der den Reaktor verläßt. Man stellt fest, daß bei Verweilzeiten von 64 und 81 s die Reaktionsprodukte zu einem sehr großen Anteil aus Mannobiose und aus Mannotriose zusammengesetzt sind. Spuren an Oligomeren, die vier und fünf Mannosen enthalten, bleiben sichtbar. Wenn die Verweilzeit auf 105 s ansteigt, sind die einzigen vorhandenen Oligosaccharide in dem Extrakt Mannobiose und Mannotriose, was eine komplette Hydrolyse der Galactomannane anzeigt. Die Tabelle weiter unten veranschaulicht die Eigenschaften des verwendeten Trägers.

Gamanase®, immobilisiert auf Glas mit kontrollierten Poren

Temperatur (ºC) 30ºC
Höhe des Betts (mm) 15
Volumen des Betts (ml) 1,69
Proteine (mg/g Träger) 32,2

Beispiel 5

Man verwendet den flüssigen Kaffee-Extrakt, der aus der Druckstufe einer Trenn-Extraktion von gemahlenem Röstkaffee erhalten wurde, wie es in dem Patent EP 0538512 beschrieben ist, um den Reaktor mit Festbett, beschrieben in Beispiel 1, der auf 50ºC gehalten wird, kontinuierlich zu speisen.
Der Reaktor enthält Gamanase®, die auf Eupergit-C® in der Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, immobilisiert ist. Der Auszug wird so angepaßt, daß eine Verweilzeit von 8 Minuten erhalten wird. Die Proben weden regelmäßig innerhalb von 48 Stunden entnommen, um mittels HPTLC-Chromatographie die Oligosaccharidprodukte zu bewerten.
Man beobachtet eine komplette Hydrolyse der Galactomannane des Extrakts, denn die einzigen Oligosaccharide des behandelten Extrakts sind Mannobiose und Mannotriose.

Beispiel 6

Man führt mehrere Hydrolysen des Kaffee-Extrakts, der in Beispiel 5 beschrieben ist, in einer traditionellen vertikalen Kolonne, die eine Wirbelschicht an Gamanasen® enthält, die auf Eupergit-C® immobilisiert sind, durch.
Der Träger umfaßt 28,6 mg an Proteinen pro g Träger, auf die analoge Weise immobilisiert wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Versuche werden bei 65ºC durchgeführt.
Dann mißt man wiederum die Menge der vorhandenen Mannobiose in dem Eluat von jedem Versuch mit der chromatographischen Methode, die vorher beschrieben worden ist. Dann bestimmt man den Prozentsatz der Hydrolyse der Galactomannane als Funktion der normalisierten Verweilzeit des Extrakts in dem Reaktor (min · mg an Proteinen /ml). Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von diesen Versuchen.
Die experimentellen Bedingungen der verschiedenen Versuche sowie die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle weiter unten angegeben.

Beispiel 7

Man führt ungefähr 500 aufeinanderfolgende Hydrolysen des Extrakts, der in Beispiel 5 beschrieben ist, in einem Behälter vom Typ Rührkessel, der eine Suspension der Gamanase® enthält, die auf Eupergit-C® immobilisiert ist, durch.
Die Enzyme sind unter Zugabe von 5 g Eupergit-C®, 37,5 ml einer Lösung, die 7,5 ml Gamanase® und 30 ml eines 1,25 M Natriumphosphatpuffers mit pH 7 enthält, immobilisiert worden. Man läßt unter schwachem Rühren innerhalb von 72 Stunden bei Raumtemperatur reagieren.
Jede Hydrolyse entspricht einem Zyklus von 30 Minuten, bei dem, innerhalb der ersten beiden Minuten eine Pumpe den Extrakt in den Kessel einfüllt, innerhalb der folgenden 26 Minuten läßt man den Extrakt unter Rühren reagieren, dann, in den letzten beiden Minuten, saugt eine Pumpe vom Boden des Kessels den hydrolysierten Extrakt ab. Die immobilisierten Enzyme werden mit einem Filter (40 um), der am Boden des Kessels angeordnet ist, zurückgehalten, der Kessel wird bei 60ºC thermostatisiert und ein Aliquot von jedem Eluat wird mit der HPTLC-chromatographischen Methode, die vorher beschrieben worden ist, analysiert. Dann mißt man die Dichte der Punkte, die der Mannobiose und der Mannotriose entsprechen.
Die Fig. 5 zeigt die relativen Mengen der Mannobiose- und Mannotriose-Produkte als Funktion der Anzahl der Hydrolysezyklen. Man kann bemerken, daß das Enzym besonders langsam seine enzymatische Aktivität verliert, denn die immobilisierte beta- Mannanase behält mehr als 60% ihrer enzymatischen Aktvitität nach 500 aufeinanderfolgenden Hydrolysezyklen des Kaffee-Extrakts.
Die experimentellen Bedingungen sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Gamanase®, immobilisiert auf Eupergit-C® Sukzessive Hydrolyse im Rührkessel

Temperatur (ºC) 60
behandeltes Volumen (ml) 38
Dauer von einem Zyklus (min) 30
Proteine (mg/g Träger) 47,3
immobilisiertes feuchtes Enzym (mg) 400.

Claims

1. Verfahren zur Hydrolyse von Galactomannanen, die in einem flüssigen Kaffee-Extrakt enthalten sind, bei dem man den genannten Extrakt bei einer Temperatur von 20-80ºC mit beta-Mannanasen, die durch kovalente Bindung an einen Träger oder durch Polymerisation der adsorbierten Mannanasen an einen Träger immobilisiert sind, behandelt,

2. Verfahren nach dem Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten beta-Mannanasen behalten:

- mehr als 60% ihrer enzymatischen Aktvitität nach wenigstens 500 aufeinanderfolgenden Hydrolysezyklen der Kaffee-Extrakte in einem Reaktor vom Rührkessel- Typ;

- mehr als 80% ihrer enzymatischen Aktivität nach mehr als 20 Stunden kontinuierlicher Hydrolyse in einem Reaktor, der ein Festbett aus immobilisierten beta- Mannanasen umfaßt.

3. Verfahren nach dem Anspruch 1, bei dem man den genannten Extrakt bei einer Temperatur von 30-70ºC hydrolysiert.

4. Verfahren nach dem Anspruch 1, bei dem der flüssige Kaffee-Extrakt der Extrakt ist, der aus der Druckstufe einer Trenn-Extraktion von gemahlenem Röstkaffee erhalten wurde.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei dem der Träger ein poröser Träger ist.

6. Verfahren nach dem Anspruch 5, bei dem die Trägerporen eine Größe von 20-200 nm aufweisen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man den flüssigen Kaffee-Extrakt kontinuierlich in einem Reaktor hydrolysiert, der ein Festbett aus immobilisierten beta-Mannanasen enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man den flüssigen Kaffee-Extrakt kontinuierlich in einem Reaktor hydrolysiert, der eine Wirbelschicht aus immobilisierten beta-Mannanasen enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man den flüssigen Kaffee-Extrakt in einem Kessel hydrolysiert, der suspendierte, immobilisierte beta- Mannanasen enthält.