DE3131908A1

DE3131908A1 - "immobilisierte aminoacylase-zubereitung und verfahren zu ihrer herstellung"

Info

Publication number: DE3131908A1
Application number: DE19813131908
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Chibata; Motoki Koyoto Fujimura; Takao Takatsuki Mori; Tetsuya Kyoto Tosa
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1980-08-13
Filing date: 1981-08-12
Publication date: 1982-06-09
Also published as: JPS6219835B2; US4390626A; FR2488619A1; GB2082188A; JPS5736986A; FR2488619B1; GB2082188B

Description

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Beschreibung;

Die Erfindung.betrifft eine neue immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Aminoacylase ist bekanntlich ein Enzym, das eine cc-(N-Acyl>L-aminosäure in die entsprechende L-Aminosäure hydrolysiert, so daß dieses Enzym zur optischen Auflösung einer DL-Aminosäure und dergleichen verwendet wird.

In neuerer Zeit ist zur kontinuierlichen Durchführung einer enzymatischen Reaktion mit Aminoacylase die Immobilisierung des Enzyms verwendet worden. So sind z.B. Methoden bekannt, bei denen Aminoacylase durch ionische Bindung, kovalente Bindung oder Gelkonjugierung auf einem wasserunlöslichen Träger adsorbiert oder damit konjugiert wird, um eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung herzustellen. Da die Enzymzubereitung ohne weiteres durch ein einfaches Verfahren erhalten werden kann, ist unter diesen Methoden die Immobilisierung der Aminoacylase durch ionische Bindung oftmals untersucht worden, obgleich dieses Verfahren Nachteile hat, wie z.B. daß es vorkommen kann, daß das Enzym aus einem Träger heraussickert, wenn die Konzentration eines zu behandelnden Substrats oder eine Ionenstärke in einem Reaktionssystem hoch wird, was zu einer niedrigen Stabilität der Enzymzubereitung führt. Weiterhin ist der Druckabfall hoch, wenn die kontinuierliche Reaktion unter Verwendung einer Säule durchgeführt wird, die mit der Enzymzubereitung bepackt ist. So ist es beispielsweise schon vorgeschlagen worden, die Enzymzubereitung dadurch herzustellen, daß man ein Anionenaustauscherharz oder ein poröses Anionenaustauscherharz als wasserunlöslichen Träger verwendet (JA-PS'en 8835/1973 und 16954/1976).

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Diese herkömmlichen Techniken sind aber immer noch weit davon entfernt, den Nachteil, daß bei der Immobilisierung der Aminoacylase durch ionische Bindung es vorkommen kann, daß das Enzym aus einem Träger heraussickert, wenn die Konzentration des zu behandelnden Substrats oder die Ionenstärke in einem Reaktionssystem hoch ist, zu überwinden.

Ausgedehnte Untersuchungen haben nun ergeben, daß eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung, die durch Bindung von Aminoacylase an einen wasserunlöslichen porösen Anionenaustauscher (nachstehend der Einfachheit halber als poröser Anionenaustauscher bezeichnet) und durch Behandlung des resultierenden Produkts mit einem Vernetzungsmittel für Protein hergestellt worden ist, die oben beschriebenen Nachteile nicht aufweist.

Aufgabe der Erfindung ist es daher,, eine neue immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung zur Verfügung zu stellen, die von den oben beschriebenen Nachteilen frei ist und bei der es kaum vorkommen kann, daß das Enzym aus dem Träger selbst bei einer hohen Konzentration des zu behandelnden Substrats und einer hohen lonenstärke in dem Reaktionssystem heraussickert und bei der weiterhin der Druckabfall während der Reaktion niedrig ist. Durch die Erfindung soll auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung zur Verfügung gestellt werden.

Durch die Erfindung wird nun eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung zur Verfugung gestellt, die Aminoacylase und einen porösen Anionenaustauscher enthält, wobei die Aminoacylase an den porösen Anionenaustauscher gebunden und mit einem Vernetzungsmittel für Protein vernetzt ist»

Die erfindungsgemäße immobilierte Aminoacylase-Zubereitung wird dadurch hergestellt, daß Aminoacylase an einen porösen Anionenaustauscher gebunden wird und sodann das resultierende Produkt mit einem Vernetzungsmittel für Protein behandelt wird.

Erfindungsgemäß ist die Herkunft der Aminoacylase, die an den porösen Anionenaustauscher gebunden werden soll, nicht kritisch und jede beliebige Aminoacylase kann verwendet werden, sofern sie die Fähigkeit hat, eine N-Acyl-L-aminosäure zu der entsprechenden L-Aminosäure zu hydrolysieren. Insbesondere wird es bevorzugt, eine Aminoacylase mit einer hohen Enzymaktivität zu verwenden, die durch Pilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium und Mucor hergestellt worden ist. Die zu verwendende Aminoacylase kann aus ihrer Quelle durch bekannte Techniken erhalten werden.

Der poröse Anionenaustauscher, der erfindungsgemäß verwendet wird, ist ein wasserunlösliches poröses Material mit einer geeigneten Teilchengröße, das eine große Anzahl von Poren mit einer Porengröße von etwa mehreren 100 bis mehreren 1000 %. hat und das weiterhin eine große spezifische Oberfläche und ein Porenvolumen hat, in das eine Anionen_austauschergruppe eingeführt worden ist. Insbesondere wird es bevorzugt, als porösen Anionenaustauscher ein poröses Phenolharz (z.B. ein Phenol/Formaldehyd-Kondensat), ein poröses Styrolharz (z.B. ein Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres), poröse Kieselsäure bzw. poröses Siliciumdioxid oder poröses Glas mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von etwa 0,1 bis 1,2 mm, insbesondere 0,3 bis 0,8 mm, und mit einer Porengröße von etwa 150 bis 3000 2. sowie einer spezifischen Oberfläche von etwa 10 bis 150 m /g und

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einem Porenvolumen von etwa 0,5 bis 1 ml/g zu verwenden, in das eine schwach basische Anionenaustauschergruppej, z.B. eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe, wie eine Amino-, Methylamine- oder Dimethylaminogruppe, oder eine stark basische Anionenaustauschergruppe, wie eine quaternäre Ammoniumgruppe, z.B. eine Trimethylammonium- oder Dimethylhydroxyäthylammoniumgruppe, eingeführt worden ist. Bevorzugte Beispiele für den porösen Anionenaustauscher sind Kieselsäure mit einer Porengröße von etwa 1000 S, einem Porenvolumen von etwa 0,8 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 m /g und einer Teilchengröße von bis 200 Iim, in die Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden sind (hergestellt von Rhone-Poulenc Industries unter dem Warenzeichen "Spherosil QMA"), ein poröses Styrol/Divlnylbenzol-Copolymeres mit einer Porengröße von etwa 450 bis 500 S, einem Porenvolumen von etwa O₉96 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 30 m /g und einer Teilchengröße von 0,35 bis 0,55 mm, in die Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden sind (herstellt von Mitsubishi Chemical Industries Ltd. unter dem Warenzeichen "Diaion HPA-25")» ein poröses Polystyrol mit einer Porengröße von etwa 250 S, einem Porenvolumen von etwa 0,35 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 bis 35 m /g und einer Teilchengröße von 0,3 bis 1,2 mm_s In das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden sind (hergestellt von Diamond Shamrock Corporation unter dem Warenzeichen "Duollte A-161")* ein poröses Polystyrol alt einer Porengröße von etwa 250 S', einem Porenvolumen von etwa 0,35 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 bis 35 m/g und einer Teilchengröße von etwa 0,3 bis 1,2 mm, in das Dimethylhydroxyäthylammoniumgruppen eingeführt worden sind (hergestellt von Diamond Shamrock Corporation unter dem Warenzeichen "Duolite A-162^5I)s ein poröses Phenolharz mit einer Porengröße von

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etwa 150 S, einem Porenvolumen von etwa 0,7 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 80 bis 120 m /g und mit einer Teilchengröße von etwa 0,3 bis 1,2 mm, in das phenolische Hydroxygruppen eingeführt worden sind (hergestellt von Diamond Shamrock Corporation unter dem Warenzeichen "Duolite A-561), ein poröses Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres mit einer Porengröße von etwa 300 S, einem Porenvolumen von etwa 0,5 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 m /g und einer Teilchengröße von 0,3 bis 0,8 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden sind (hergestellt von Dow Chemical Co. unter dem Warenzeichen "Dowex MSA-1")» ein poröses Polystyrol mit einer Porengrösse von etwa 300 bis 2000 &, einem Porenvolumen von etwa 0,95 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 42 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,4 bis 0,5 nun, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden sind (hergestellt von Rohm & Haas Co. unter dem Warenzeichen "Amberlite IRA-904") und dergleichen.

Beispiele für geeignete Vernetzungsmittel für das Protein sind aliphatisch^ Dialdehyde mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Glyoxal, Malondialdehyd, Succindialdehyd, Glutaraldehyd, Adipaldehyd und dergleichen. Insbesondere werden . Glyoxal und Glutaraldehyd bevorzugt.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung wird zuerst Aminoacylase ©n den porösen Anionenaustauscher gebunden. Diese Stufe wird vorzugsweise dadurch durchgeführt, daß Aminoacylase mit dem porösen Anionenaustauscher in Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung kontaktiert wird. Sowohl rohe als auch gereinigte Aminoacylase können verwendet werden. Die zu verwendende Menge von Aminoacylase hängt von dem jeweiligen

porösen Anionenaustauscher, der verwendet wird, ab, doch wird es im allgemeinen bevorzugt, etwa 100 bis 10000 Einheiten, insbesondere 1000 bis 5000 Einheiten, Aminoacylase pro 1 ml Austauscher zu verwenden. Beispiele für geeignete Pufferlösungen sind z.B. eine Riosphatpufferlösung und eine Boratpufferlösung, wobei insbesondere eine 0,05- bis 0,1M-Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 7 bis 9 bevorzugt wird.

Der resultierend© poröse Anionenaustauscher, an den die Aminoacylase gebunden worden ist„ wird sodann mit dem Vernetzungsmittel für Protein behandelt. Diese Stufe wird vorzugsweise in der Weise durchgeführt, daß der Austauscher mit dem Vernetzungsmittel in Wasser oder einer Pufferlösung, wie oben beschrieben, kontaktiert wird. Bei dieser Stufe ist, wenn die Konzentration des Vernetzungsmittels zu gering ist, die Vernetzung nicht ausreichend und .es ist daher schwierig, das Aussickern des Enzyms aus dem Austauscher zu verhindern. Wenn andererseits die Konzentration des Vernetzungsmittels zu hoch ist, dann wird das Enzym inaktiviert. Die Menge des Vernetzungsmittel sollte daher entsprechend der Menge des Enzyms, die auf dem porösen Anionenaustauscher adsorbiert ist, eingestellt werden» Im allgemeinen wird es jedoch bevorzugt, das Vernetzungsmittel in einer Endkonzentration von 0,01 bis 0,1 Vol.-%, bezogen auf das Reaktionsgemische zu verwenden.

Alternativ kann die Herstellung der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung auch dadurch durchgeführt werden, daß man nacheinander sowohl die Aminoacylase als auch das Vernetzungsmittel mit dem porösen Anionenaustauscher in Wasser Qder der obengenannten Pufferlösung kontaktiert= Di© letztere Reaktion ist zweckmäßiger als die vorgenann-

te stufenweise Reaktion, da die gewünschte immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung in einem System durch ein einfacheres Verfahren als bei der stufenweise erfolgenden Reaktion erhalten werden kann.

Bei beiden Reaktionen wird es bevorzugt, die Bindung der Aminoacylase an den porösen Anionenaustauscher und die Behandlung mit dem Vernetzungsmittel für Protein bei 4 bis 10⁰C durchzuführen, um die Inaktivierung des Enzyms zu minimalisieren und die Adsorption und die Vernetzungswirksamkeit zu verbessern.

Die Herstellung der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung kann entweder durch ein absatzweise geführtes Verfahren oder ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung einer Säule erfolgen. Bei absatzweiser Durchführung der Herstellung wird die Aminoacylase in Wässer oder einer Pufferlösung aufgelöst und hierzu wird der poröse Anionenaustauscher zugesetzt. Das resultierende Gemisch wird bei den oben zur Bindung beschriebenen Bedingungen gerührt, um ein gebundenes Produkt aus dem Austauscher und dem Enzym zu bilden. Nach der Abtrennung des gebundenen Produkts aus dem Reaktionsgemisch durch eine bekannte Technik, z.B. Dekantierung, Filtrierung oder Zentrif ugierung, wird das gebundene Produkt zu einer Lösung des Vernetzungsmittels für das Protein in Wasser oder einer Pufferlösung gegeben und das Gemisch wird bei den Bedingungen für die Vernetzung, wie oben beschrieben, gerührt, wodurch die gewünschte immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten wird. Alternativ kann, wenn das Vernetzungsmittel für das Protein direkt zu dem obigen Reaktionsgemisch gegeben wird, das das gebundene Produkt enthält, und wenn das resultierende Gemisch bei den gleichen Bedingungen,

wie oben beschrieben, gerührt wird, die gewünschte immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung in einem System erhalten werden. Die so hergestellte immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung kann ohne weiteres aus dem Reaktionsgemisch nach den oben genannten bekannten Techniken abgetrennt werden. Wenn die Herstellung durch ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung einer Säule erfolgt, wird Wasser oder eine Pufferlösung, das bzw. die Aminoacylase enthält, durch eine Säule geleitet, die mit dem porösen Anionenaustauscher bepackt ist. Sodann wird Wasser oder eine Pufferlösung, das bzw. die das Vernetzungsmittel für das Protein enthält, durch die Säule hindurchgeleitet, um die gewünschte immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung zu erhalten. Es wird bevorzugt, sowohl die Lösung der Aminoacylase als auch das Vernetzungsmittel für das Protein durch die Säule mit einer Raumgeschwindigkeit von etwa 0,1 bis 0,5 zu leiten.

Wenn die erfindungsgemäße immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung bei einer enzymatischen Reaktion verwendet wird, dann sickert das Enzym auch dann kaum aus dem porösen Anionenaustauscher heraus, wenn eine hohe Konzentration des zu behandelnden Substrats vorliegt und wenn die Ionenstärke in dem Reaktionssystem hoch ist. Daher kann die immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung eine stabile und hervorragende Enzymaktivität über einen langen Zeitraum aufrechterhalten.

Die Erfindung wird in den folgenden Versuchsbeschreibungen und Beispielen näher erläutert.

Versuchsbeschreibung 1 Verschiedene immobilisierte Aminoacylase-Zubereitungen

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wurden, wie unten beschrieben, hergestellt. Jede Zubereitung wurde kontinuierlich mit einer Substratlösung umgesetzt und das Verhältnis der restlichen Enzymaktivität zu der Anfangsenzymaktivitat wurde nach einer bestimmten Reaktionszeit gemessen.

1. Herstellung der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitungen

(a) Immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung gemäß der Erfindung

Die einzelnen in Tabelle I angegebenen porösen Anionenaustauscher wurden in Wasser aufgequollen und zu dem gequollenen Austauscher (10 ml) wurde eine Lösung von roher Aminoacylase, abgeleitet von Aspergillus oryzae, (50 ml) [hergestellt durch Auflösung von roher Aminoacylase (500 mg, 15000 μ Mol/h) in 0,05M-Hiosphatpuffer (pH 7,5, 50 ml)] gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurde Glutaraldehyd zugesetzt, so daß dessen Endkonzentration in dem Gemisch 0,05 Vol.-% wurde. Nach 18-stündigem Schütteln bei 10⁰C wurde das Reaktionsgemisch filtriert und der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, wodurch die immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten wurde.

(b) Immobilisierte Aminoacylase-Zubereitungen zur Kontrolle (1)

Die einzelnen in Tabelle I angegebenen porösen Anionenaustauscher wurden in Wasser aufgequollen und zu den gequollenen Austauschern (10 ml) wurde eine Lösung von roher Aminoacylase, abgeleitet von Aspergillus oryzae, (50 ml), hergestellt, wie oben unter (a) beschrieben, gegeben. Nach

i8-stündigem Schütteln bei 1O⁰C wurde das Reaktionsgemisch filtriert und der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, wodurch die immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten wurde.

(c) Immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung zur Kontrolle (2)

Es wurde, wie oben unter (a) beschrieben, verfahren, mit der Ausnahme, daß ein Anionenaustauscherharz vom Geltyp anstelle des porösen Anionenaustauschers verwendet wurde, um die immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung herzustellen.

2. Methode

Die jeweiligen, auf die obige Weise erhaltenen immobilisierten Aminoacylase-Zubereitungen (10 ml) wurden in eine Säule gepackt. Wäßrige 0,6M-N-Acetyl-DL-methioninlösung (pH 7,0, enthalten 5 x 10~^ M Co⁺*) wurde durch die Säule bei 37° C geleitet, um eine enzymatische Reaktion durchzuführen. Um die Anfangsenzymaktivität der Zubereitung zu messen, wurde die Substratlösung durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/h geleitet und die Menge von L-Methionin in dem Eluat wurde bestimmt. Die Aktivität wurde.als Menge (Mikromole) von L-Methionin, pro 1 h gebildet, ausgedrückt= Nach Messung der Anfangsenzymaktivität der Zubereitung wurde die enzymatische Reaktion 10 Tage lang weitergeführt, indem die Substratlösung durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 6 ml/h geleitet wurde. Nach 10 Tagen wurde die Restenzymaktivität der Zubereitung nach der gleichen Verfahrensweise wie bei der Messung der Anfangsaktivität gemessen. Das Ver-

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hältnis der Restaktivität zu der Anfangsaktivität wurde in der Weise ausgedrückt, daß die Anfangsaktivität gleich 100 gesetzt wurde.

3. Ergebnisse

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt. Aus dieser wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäße immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung eine erheblich höhere Restenzymaktivität zeigt als die Kontrollzubereitung und daß sie die hohe Enzymaktivität über einen langen Zeitraum beibehält. Demgegenüber verminderte sich die Enzymaktivität der Zubereitung der Kontrolle (1) mit der Zeit. Weiterhin wurde bei der Zubereitung der Kontrolle (1) ein Aussickern des Enzyms aus dem Träger schon in der Anfangsstufe der enzymatischen Reaktion beobachtet. Im Falle der Herstellung der Zubereitung der Kontrolle (2) wurde festgestellt, daß das Enzym überhaupt nicht auf dem Harz adsorbiert wurde.

Tabelle I

Zubereitung

poröser Vernet- Aktivität der immobilisier-Anionen- zungs- ten Aminoacylase** austau- behänd- am Anfang nach 10 Tagen scher* lung

	A	behan delt	100	107
	B		100	88
erfindungsgemäß	C D E	ohne Be	100 100 100	86 90 102
	F	handlung	100	103
	A		100	52
Kontrolle (1)	C	behandelt	100	47
	F	100	37
Kontrolle (2)	G	0	-

*: Die Symbole A bis G in der Tabelle I bezeichnen die fol- ' genden porösen Anionenaustauscher:

A: Poröses Polystyrol mit einer Porengröße von etwa 250 Sl, einem Porenvolumen von etwa 0,35 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 bis 35 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,3 bis 1,2 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden sind (hergestellt von Diamond Shamrock Corporation unter dem Warenzeichen "Duolite A-1.61");

B; Poröses Phenolharz mit einer Porengröße von etwa 150 S, einem Porenvolumen von etwa 0,7 ml/g» einer spezifischen

Oberfläche von etwa 80 bis 120 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,3 bis 1,2 mm, in das phenolische Hydroxygruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Diamond Shamrock Corporation unter dem Warenzeichen "Duolite A-56i")j

ό Ί ό Ί υ U Ö

- 18 -

C: Poröses Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres mit einer Porengröße von etwa 300 Ä, einem Porenvolumen von etwa 0,5 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 m /g land einer Teilchengröße von etwa 0,3 bis 0,8 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Dow Chemical Co. unter dem Warenzeichen "Dowex MSA-1");

D: Poröses Styrol/Divinylbenzoli-Copolymeres mit einer Porengröße, von etwa 450 bis 500 £, einem Porenvolumen von etwa 0,96 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 30 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,35 bis 0,55 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries Ltd. unter dem Warenzeichen "Diaion HPA-25");

E: Poröses Polystyrol mit einer Porengröße von etwa 300 bis 2000 A, einem Porenvolumen von etwa 0,95 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 42 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,4 bis 0,5 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Rohm & Haas Co. unter dem Warenzeichen "Amberlite IRA-904");

F: Poröse Kieselsäure mit einer Porengröße von etwa 1000 S, einem Porenvolumen von etwa 0,8 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 m /g und einer Teilchengröße von 100 bis 200 um, in die Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Rhone-Poulenc Industries unter dem Warenzeichen »Spherosil OMA"); und

G: Herkömmliches Anionenaustauscher-Polystyrolharz vom Geltyp, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Diamond Shamrock Corporation unter dem Warenzeichen "Duolite A-1CHD'),

**;Die Aktivität ist in der Weise ausgedrückt, daß die Anfangsaktivität als 100 gesetzt worden ist»

Versuchsbeschreibung 2

Nach der gleichen Verfahrensweise, wie im Versuchsbericht 1 (a) und (b), beschrieben, wurden die immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung gemäß der Erfindung und die Kontrollzubereitung erhalten, indem poröse Kieselsäure mit einer Porengröße von etwa 1000 S, einem Porenvolumen von etwa 0,8 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 m /g und einer Teilchengröße von etwa 1000 bis 2000 um, in die Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren . (hergestellt von Rhone-Poulenc Industries unter dem Warenzeichen "Spherosil OMA") verwendet wurde.

Die einzelnen, so erhaltenen immobilisierten Aminoacylase-Zubereitungen wurden kontinuierlichen enzymatischen Reaktionen unter Verwendung von N-Acetyl-DL-phenylalanin (pH 7, enthaltend 5 x 10"^ M Co⁺⁺) und N-Acetyl-DL-methlonin (pH 7, enthaltend 5 x 10"*^ M Co⁺⁺) als Substrate unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Aus Tabelle II wird ersichtlich, daß die Enzymaktivität der erfindungsgemäßen immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung über einen langen Zeitraum stabil bleibt. Da bei der Kontrollzubereitung das Enzym aus dem Reaktionssystem bereits im Anfangs stadium der Reaktion aufgrund der hohen

Konzentration des Substrats heraussickerte, war die Enzymaktivität der Zubereitung niedrig und sie verminderte sich weiterhin mit dem Portschreiten der Reaktion.

Angesichts dieser Tatsache wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäße immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung
selbst bei einer hohen Substratkonzentration eine überlegene Wirksamkeit zeigen kann.

Tabelle II

Zubereitung

Substrat Substrat- Aktivität der immokonzen- bilisierten Aminotration acylase*
(M/l) am Anfang nach 20

Tagen

erfindungsgemäß N-Acetyl-DL-

methionin

Kontrolle

N-Acetyl-DL-phenylalanin

N-Acetyl-DL-methionin

N-Acetyl-DL-phenylalanin

0,6
0,4
0,6
0,4

6500 5600 4300 3700

6900 5400 1600 1400

*: Die Aktivität wird als uMol der gebildeten L-Aminosäure/ h/10 ml der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung
ausgedrückt (nachstehend wird die Aktivität in der gleichen Weise ausgedrückt).

Versuchsbeschreibung 3

Die Immobilisierung der Aminoacylase erfolgte unter Verwendung des gleichen porösen Anionenaustauschers wie in der
Versuchsbeschreibung'2, zu dem eine Lösung von roher Amino-

acylase, abgeleitet von Aspergillus oryzae (50 ml) [hergestellt durch Auflösen von roher Aminoacylase (500 mg, 15000 η Mol/h) in 0,05M-Phosphatpufferlösung (pH 7,5)] gegeben wurde. Weiterhin wurde hierzu Glutaraldehyd in der Konzentration gemäß Tabelle III zugesetzt. Die Aufarbeitung erfolgte nach der gleichen Verfahrensweise, wie in der Versuchsbeschreibung 1 beschrieben.

Die resultierenden immobilisierten Aminoacylase-Zubereitungen, deren Glutaraldehydkonzentrationen sich unterschieden, wurden einer kontinuierlichen .enzymatisehen Reaktion unterworfen, wobei 0,6M/l von N-Acetyl-DL-methionin als Substrat verwendet wurden, um ihre Stabilitäten zu vergleichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Aus Tabelle III wird ersichtlich, daß, wenn die Glutaraldehydkonzentration niedrig ist, das Enzym aus dem Reaktionssystem schon in einem frühen Stadium der Reaktion aussickert, was auf eine ungenügende Vernetzung zurückzuführen ist. Wenn andererseits die Glutaraldehydkonzentration hoch ist, dann ist die Enzymaktivität verringert. Dies führt zu einer ungünstigen Erniedrigung der Aktivität der Zubereitung.

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Tabelle III

Zubereitung Konzentration Aktivität der immobili-

von Glutaral- sierten Aminoacylase dehyd (Vol.-%) am Anfang nach 20 Tagen

erfindungsgemäß 0,005 5400 4300

0,01 8700 8500

0,05 6500 6900

0,1 5900 6900

Kontrolle - 4300 1600

Beispiele

Poröse Kieselsäure mit einer Porengröße von etwa 1000 2, einem Porenvolumen von etwa 0,8 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 m /g und einer Teilchengröße von etwa 100 bis 200 um, in die Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Rhone-Poulenc Industries unter dem Warenzeichen "Spherosil QMA.") wurde in Wasser quellen gelassen. Zu der gequollenen porösen Kieselsäure (10 ml) wurde eine Lösung von roher Aminoacylase, abgeleitet von Aspergillus oryzae, (50 ml) [hergestellt durch Auflösung von roher Aminoacylase (500 mg, 1500 uMol/h) in 0,05M-Phosphatpufferlösung (pH 7,5)] zugegeben. Glutaraldehyd wurde zu dem resultierenden Gemisch so zugegeben, daß dessen Endkonzentration in dem Gemisch 0,05 Vol.-% wurde. Nach 18-stündigem Schütteln bei 10⁰C wurde das Reaktionsgemisch filtriert und der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, wodurch eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung (10 ml) erhalten wurde.

Die immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung (10 ml), die auf diese Weise erhalten worden war, hatte eine Aminoacylaseaktivität von 6500 uMol/h.

Beispiel 2

Wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten, wobei ein poröses Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres mit einer Porengröße von etwa 450 bis 500 S, einem Porenvolumen von etwa 0,96 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 30 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,35 bis 0,55 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries Ltd. unter dem Warenzeichen "Diaion HPA-25") verwendet wurde.

Die so erhaltene immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung (10 ml) hatte eine Aminoacylaseaktivität von 5300 μ Mol/h.

Beispiel3

Wie im Beispiel 1 wurde eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten, indem poröses Polystyrol mit einer Porengröße von etwa 250 S, einem Porenvolumen von etwa 0,35 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 bis 35 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,3 his 1,2 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Diamond Shamrock Corporation unter dem Warenzeichen "Duolite A-161") verwendet wurde.

Die so erhaltene immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung (10 ml) hatte eine Aminoacylaseaktivität von 2600 uMol/h.

Beispiel 4

Wie im Beispiel 1 wurde eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten, indem poröses Styrol/Diviny!benzol-

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Copolymeres mit einer Porengröße von etwa 300 S, einem Porenvolumen von etwa 0»5 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 25 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,3 bis 0,8 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Dow Chemical Co. unter dem Warenzeichen "Dowex MSA-1") verwendet wurde.

Die so erhaltene immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung (10 ml) hatte eine Aminoacylaseaktivitat von 2200 η Mol/h.

Beispiel 5

Wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten, indem ein poröses Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres mit einer Porengröße von etwa 300 bis 2000 X, einem Porenvolumen von etwa 0,95 ml/g, einer spezifischen Oberfläche von etwa 42 m /g und einer Teilchengröße von etwa 0,4 bis 0,5 mm, in das Trimethylammoniumgruppen eingeführt worden waren (hergestellt von Rohm & Haas Co. unter dem Warenzeichen "Amberlite IRA-904"). verwendet wurde.

Die so erhaltene immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung (10 ml) hatte eine Aminoacylaseaktivitat von 4600 uMol/h.

Claims

3131903 KRAUS & PATENTANWÄLTE DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON Ο89/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpat d TELEGRAMM KRAUSPATENT 3007 WK/rm TANABE SEIYAKU CO., LTD. Osaka / Japan Immobilisierte Aminoacylase-Zubereltung und Verfahren zu ihrer Herstellung Patentansprüche

1. Immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet , daß sie Aminoacylase und einen wasserunlöslichen porösen Anionenaustauscher enthält, wobei die Aminoacylase an den porösen Anionenaustauscher gebunden und mit einem Vernetzungsmittel für Protein vernetzt ist.

2 ο Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der wasserunlösliche poröse An-

ionenaustauscher eine Porengröße von etwa 150 bis 3000 S, ein Porenvolumen von etwa 0,3 Ms 1,0 ml/g, eine spezifisehe Oberfläche von etwa 10 bis 150 m /g und eine Teil- ■ chengröße von etwa 0,1 bis 1,2 mm hat.

3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der wasserunlösliche poröse Anionenaustauscher ein Material aus der Gruppe poröses Fhenolharz, poröses Styrolharz, poröse Kieselsäure und poröses Glas ist, wobei alle diese Materialien eine Anionenaustauschergruppe aufweisen.

4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustauschergruppe eine primäre Aminogruppe, eine sekundäre Aminogruppe, eine tertiäre Aminogruppe, eine quaternäre Ammoniumgruppe und/oder eine phenolische Hydroxygruppe ist.

5. Zubereitung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß das poröse Styrolharz ein poröses Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres ist, welches eine Anionenaustauschergruppe aufweist.

6. Zubereitung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß das poröse Ehenolharz ein poröses Ehenol/Formaldehyd-Kondensat ist, welches eine Anionenaustauschergruppe aufweist.

7. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zei chnet, daß das Vernetzungsmittel für Protein ein aliphatischer Dialdehyd mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

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8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß der aliphatisch^ Dialdehyd Glyoxal ₉ Malondialdehyd, Succindialdehyd, Glutaraldehyd und/oder Adipaldehyd ist.

9. Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der aliphatische Dialdehyd Glyoxal oder Glutaraldehyd ist.

10. . Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Aminoacylaae-Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Aminoacylase an einen wasserunlöslichen porösen Anionenaustauscher bindet und daß man das resultierende Material mit einem Vernetzungsmittel für Protein behandelt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der wasserunlösliche Anionenaustauscher eine Porengröße von etwa 150 bis 3000 Ä, ein Porenvolumen von etwa 0,3 bis 1,0 ml/g, eine spezifische Oberfläche von etwa 10 bis 150 m/g und eine Teilchengröße von etwa 0,1 bis 1,2 mm hat.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der wasserunlösliche poröse Anionenaustauscher ein Material aus der Gruppe poröses Phenolharz, poröses Styrolharz, poröse Kieselsäure und poröses Glas ist, wobei alle diese Materialien eine Anionenaustauschergruppe aufweisen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustauschergruppe eine primäre Aminogruppe, eine sekundäre Aminogruppe, eine ter-

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tiäre Aminogruppe, eine quaternäre Ammoniumgruppe vind/oder eine phenolische Hydroxygruppe ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet , daß das poröse Ehenolharz ein poröses Ehenol/Formaldehyd-Kondensat mit einer Anionenaustauschergruppe .ist.

15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet , daß das poröse Styrolharz ein poröses Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres mit einer Anionenaustauschergruppe ist.

16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel für Protein ein aliphatischer Dialdehyd mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,· daß der aliphatische Dialdehyd Glyoxal, Malondialdehyd, Succindialdehyd, Glutaraldehyd und/oder Adipaldehyd ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der aliphatische Dialdehyd Glyoxal oder Glutaraldehyd ist.

19. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Aminoacylase an den wasserunlöslichen porösen Anionenaustauscher unter Verwendung von etwa 100 bis 10000 Einheiten Aminoacylase pro 1 ml des Austauschers durchgeführt wird.

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20. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß die Vernetzung unter Verwendung des Vernetzungsmittels für das Protein in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 0,1 Volumen-%, bezogen auf das Reaktionsgemisch, durchgeführt wird.