DE3309271C2

DE3309271C2 - Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen

Info

Publication number: DE3309271C2
Application number: DE3309271A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka Chibata; Satoru Suita Osaka Takamatsu; Tetsuya Kyoto Tosa
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1982-03-19
Filing date: 1983-03-15
Publication date: 1986-10-09
Also published as: US4526867A; SE457961B; JPS6214274B2; JPS58162293A; FR2523597B1; GB2116997A; SE8301406L; SE8301406D0; CH660199A5; GB8306231D0; DE3309271A1; GB2116997B; FR2523597A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Immobilisieren von Mikroorganismen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus in einer Kulturbrühe kultiviert, die Brühe nach Beendigung der Kultivierung mit Glutar aldehyd behandelt, die Mikrobenzellen aus der Brühe sammelt, die Mikrobenzellen mit einer wäßrigen Lösung eines Polysaccharids mit 10 w/w-% oder mehr einer Sulfatgruppe im Molekül vermischt und dann das Polysaccharid in der erhaltenen Mischung unter Einschluß der Mikrobenzelllen innerhalb der Gelmatrix des Polysaccharids geliert. Das Verfahren ist geeignet zur industriellen Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen.

Immobilisierte Mikroorganismen (d. h. an einen Träger gebundene Mikroorganismen) sind für zahlreiche Enzymreaktionen von großer Bedeutung und es sind eine Reihe von Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen bekannt So wird in US-PS 41 38 292 ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen beschrieben, bei dem man Mikrobenzellen mit einer wäßrigen Lösung eines Polysaccharide mit 10 Gew.-/Gew.-% oder mehr einer Sulfatgruppe im Molekül, wie Carrageenan, abmischt und man anschließend das Polysaccharid in der erhaltenen Mischung geliert, wobei die Mikrobenzellen innerhalb des Gels eingeschlossen werden und man auf diese Weise immobilisierte Mikroorganismen erhält. Weiterhin wird in der erwähnten US-Patentschrift auch die Stabilisierung der enzymatischen Aktivität von immobilisierten Mikroorganismen beschrieben, wobei die immobilisierte Zubereitung, die man nach dem vorerwähnten Verfahren erhält, mit Glutaraldehyd behandelt wird.

Die Stabilisierung der Enzymaktivität von immobilisierten Mikroorganismen, bei der man die Glutaraldehydbehandlung durchführt, nachdem die Mikrobenzellen in das Gel eingeschlossen wurden, ist jedoch nicht voll befriedigend, wenn man sie in großtechnischem Maße durchführt. Da das vorerwähnte Polysaccharidgel verhältnismäßig instabil gegenüber Scherkräften ist, wird die Gelform während der Glutaraldehydbehandlung leicht beschädigt und es ist schwierig, diese Behandlung gleichmäßig durchzuführen.

Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden, wurde eine Reihe von Untersuchungen vorgenommen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß man immobilisierte Mikroor- <v*t«icmoM rvti» Unkai· Pn^iimnktiiiitnt iin/4 linker C + aKili + ät

herstellen kann, indem man die Kulturbrühe eines Mikroorganismus mit Glutaraldehyd behandelt, nachdem die Kultivierung beendet wurde und nicht erst die GIutaraldehydbehandlung nach dem Geleinschluß mittels des Polysaccharide vornimmt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen zur Verfugung zu stellen, die eine höhere Enzymaktivität und eine höhere Stabilität als die nach den bekannten Verfahren erhaltenen aufweisen und wobei man die immobilisierten Zubereitungen ohne die vorerwähnten Schwierigkeiten in großtechnischem Maße durchführen kann.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst
Bei der vorliegenden Erfindung können alle Mikroorganismen, welche die gewünschten Enzymaktivitäten aufweisen, verwendet werden. Bevorzugte Beispiele für solche Mikroorganismen sind Escherichia coli mit Aspartaseaktivität und Pseudomonas dacunhae mit L-Aspaitat-^-decarboxylase-Aktivität

Als Kulturbrühe können die üblichen Brühen verwendet werden, die zur Kultivierung der Mikroorganismen der vorerwähnten Art geeignet sind und die Brühe kann die geeigneten Mengen an üblichen Bestandteilen, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, organische Nährstoffe und anorganische Materialien, enthalten.

Beispiel für das Polysaccharid mit 10 Gew.-/Gew.-°/o oder mehr an Sulfatresten im Molekül sind Carrageenan, Furcellaran und Zellulosesulfat. Carrageenan ist ein Polysaccharid mit 20 bis 30 Gew.-/Gew.-% Sulfatresten, das man erhält, indem man einen Extrakt von Seealgen von Rhodopyceae, wie Gigartinaceae und Solievianceae raffiniert Gemäß der vorliegenden Erfindung kann im Handel erhältliches Carrageenan verwendet werden. Furcellaran ist ein Polysaccharid mit 12 bis 16 Gew.-/Gew.-% Sulfatresten, das man erhält, indem man eine Art von Seealgen von Rhodopyceae, nämlich Furcellaria fastigiota, extrahiert.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zunächst die Mikroorganismen in der Kulturbrühe kultiviert. Die Kultivierung ist nicht auf ein spezielles Verfahren beschränkt und kann in bekannter Weise durchgeführt werden. Gewünschtenfalls kann man nach Beendigung der Kultivierung die Enzymaktivität für ein Nebenreaktionssystem der Mikrooganismen in bekannter Weise vor der Stufe, nämlich der Behandlung mit Glutaraldehyd, entfernen.

Nach Beendigung der Kultivierung wir die Kulturbrühe mit Glutaraldehyd behandelt. Diese Behandlung kann man einfach durchführen, indem man Glutaraldehyd mit der Kulturbrühe unter Rühren oder Schütteln vermischt. Vorzugsweise ist die Menge des zugegebenen Glutaraldehyds so groß, daß die Endkonzentration in der Kulturbrühe 0,1 mM bis 0,5 M, insbesondere 1 mM bis 0,1 M, beträgt. Vorzugsweise führt man die Glutaraldehydbehandlung bei 0 bis 60° C, insbesondere bei 0 bis 4O⁰C, durch. Die für diese Behandlung erforderliche Zeit hängt von der Temperatur ab, aber im allgemeinen wird die Behandlung während 1 Minute bis 24 Stunden und vorzugsweise 5 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt. Nach der Behandlung mit Glutaraldehyd werden die Mikrobenzellen gesammelt, z. B. indem man die Kulturbrühe zentrifugiert.

Die so erhaltenen Mikrobenzellen werden mit einer wäßrigen Lösung des Polysaccharids mit 10 Gew.-/Gew.-°/o oder mehr Sulfatgruppen im Molekül

mischt. Die wäßrige Lösung des Polysaccharids kann man in einfacher Weise herstellen, indem man ein Polysaccharid mit Wasser von 30 bis 100"C vermischt. Die Konzentration des Polysaccharids in der Lösung beträgt vorzugsweise 0,2 bis 20 Gew.-/Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-/Gew.-°/o. Die so erhaltene wäßrige Lösung des Polysaccharids wird dann mit den oben ge-

nannten Mikrobenzellen zur Herstellung der Mischung abgemischt

Bei der Herstellung der Mischung werden die Mikrobenzellen vorzugsweise in Wasser, einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einer geeigneten Pufferlösung (pH 3 bis 10, vorzugsweise pH 4 bis 8) suspendiert und dann wird die Suspension mit der wäßrigen Lösung des Polysaccharide, die man auf 30 bis 60° C erwärmt hat, vermischt.

Die nächste Stufe besteht in der Gelierung des PoIysaccharids in der Mischung, um die Mikrobenzellen innerhalb der Gelmatrix des Polysaccharids einzuschließen. Die Gelierung des Polysaccharids kann man durchführen, indem man einfach die Mischung kühlt Läßt man die Mischung beispielsweise bei etwa 0 bis 20° C während 1 Minute bis 5 Stunden stehen, so geliert das Polysaccharid und .gleichzeitig werden die Mikrobenzellen innerhalb der gebildeten Gelmatrix des Polysaccharids eingeschlossen. Das so erhaltene Gel kann man dann in verschiedene Formen bringen.

Man kann die vorerwähnte Gelierung aber auch auf andere Weise als durch Abkühlen der Mischung vornehmen. Beispielsweise kann man die Gelierung durchführen, indem man die Mischung mit Ammoniumionen oder einem Metallion mit einem Atomgewicht von 24 oder mehr (z. B. Kaliumionen, Magnesiumionen oder Kalziumionen) in Berührung bringt oder indem man die Mischung mit einer Verbindung mit 2 oder mehr basischen funktionellen Gruppen im Molekül in Berührung bringt (z. B. Methylendiamin, Ethylendiamin und p-Phenylendiamin) oder indem man die Mischung mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel (z. B. Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Dioxan oder Tetrahydrofuran) in Berührung bringt.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren so erhaltene immobilisierte Mikroorganismus kann für zahlreiche Enzymreaktionen in bekannter Weise verwendet werden.

Bei einem Vergleich mit dem in der vorerwähnten US-PS 41 38 292 beschriebenen Verfahren, bei dem die Glutaraldehydbehandlung nach dem Geleinschluß der Mikrobenzellen durchgeführt wird, zeigt sich, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren die Glutaraldehydbehandlung der Kulturbrühe nach Beendigung der Kultivierung erfolgt und daß man dadurch die nachfolgenden Vorteile erzielt.

Da die Glutaraldehydbehandlung bei dem Verfahren des Standes der Technik nach dem Geleinschluß erfolgt, kann die Form des Gels geschädigt werden und es ist auch schwierig, diese Behandlung gleichmäßig durchzuführen. Wird dagegen die Glutaraldehydbehandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nach Beendigung der Kultivierung in der Kulturbrühe durchgeführt, kann man die Schwierigkeiten beim Verfahren des Standes der Technik vermeiden und man kann die Behandlung sehr gleichmäßig und in einfacher Weise vornehmen. Weiterhin weisen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen immobilisierten Mikroorganismen eine höhere Enzymakitivtät auf als solche, die nach dem Stand der Technik erhalten wurden. Darüber liiiuiuS ücuuiicii die criiiidüfigSgcmäu cfhälicficn iiTiiijO-bilisierten Mikroorganismen im Vergleich zu denen des Standes der Technik eine höhere Enzymaktivität während einer längeren Zeit bei einer kontinuierlichen Enzymreaktion bei.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist infolgedessen sehr gut für die großtechnische Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen geeignet.

Die nachfolgenden, nachgereichten Beispiele und Versuche beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1

Jeweils 100-ml-Anteile einer Kulturbrühe (pH 7,0), enthaltend Maisquellwasser (2,0%), Hefe (2%), Fumarsäure (1,14%), Diammoniumfumarat (0,5%), Kaliumdihydrogenphosphat (0,2%) und Magnesiumsulfat

ίο (0,05%) wurden in zehn 500-ml-Erlenmeyer-Kolben vorgelegt Escherichia coli wurde zum Inokulieren in jeden Kolben gegeben. Die Kolben wurden unter Schütteln bei 30° C während 16 Stunden inkubiert und dann zur Beendigung der Kultivierung auf 5° C gekühlt 25% einer wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd (2 ml) wurden zu den Kolben gegeben, so daß die Endkonzentration an Glutaraldehyd 5 mM betrug und dann wurden die Kolben 30 Minuten geschüttelt Man sammelte 23 g (Feuchtegewicht) an Escherichia coli durch Zentrifugieren der Kulturbrühe.

Getrennt davon wurden 6 g Carrageenan in 129 ml warmem Wasser von 45° C unter Erhalt einer wäßrigen Lösung von Carrageenan gelöst
Eine Suspension der vorerwähnten Mikrobenzellen (23 g) in einer physiologischen Kochsalzlösung (23 ml) wurde mit der Carrageenanlösung bei 4O⁰C vermischt und die Mischung ließ man 30 Minuten bei 4° C zur Gelierung des Carrageenans stehen. Das erhaltene Gel wurde in Würfelform mit 3 mm Kantenlänge geformt.

Das Gel wurde in eine Substratlösung (400 ml), enthaltend 1 M Diammoniumfumarat, getaucht und bei 37° C 48 Stunden stehen gelassen und dann mit einer 2%igen wäßrigen Kaliumchloridlösung gewaschen, unter Erhalt einer immobilisierten Escherichia coli-Zubereitung (180 g, Feuchtgewicht). Die so erhaltene immobilisierte Zubereitung hatte eine Aspartase-Aktivität von 48.680 μΜοΙ/h/g Zellen.

Beispiel 2

Jeweils 120-ml-Anteile einer Kulturbrühe (pH 7,3), enthaltend Nctriumglutamat (3,2%), Hefe (0,5%), KaIiumdihydrogenphosphat (0,05%) und Magnesiumsulfat (0,01%) wurden in zehn 500-ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt. Zu jedem Kolben wurde zum Inokulieren Pseudomonas daeunhae gegeben. In den Kolben wurde durch Schütteln bei 30° C während 24 Stunden die Inkubierung vorgenommen. Nach Beendigung aer Kultivierung wurden 26 ml Essigsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 4,75 zu den Kolben gegeben und die Kolben ließ man dann 1 Stunde bei 3O⁰C stehen. Zur Einstellung des pH-Wertes auf einen Wert von 6,0 wurden 86 ml 3 N Natriumhydroxid zu dem Kolben gegeben und dann kühlte man auf 10° C. In die Kolben wurden dann 2,6 ml einer 25%igen wäßrigen Glutaraldehydlösung gegeben, bis die Endkonzentration an Glutaraldehyd 5 mM betrug und die Kolben wurden 30 Minuten geschüttelt. Durch Zentrifugieren der Kulturbrühe erhielt man 20 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen von Pseudomonas daeunhae.

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mem Wasser von 5O⁰C (85 ml) unter Erhalt einer wäßrigen Lösung von Carrageenan gelöst.

Eine Suspension der vorerwähnten Mikrobenzellen (20 g) in einer physiologischen Kochsalzlösung (20 ml) wurde mit der Carrageenanlösung bei 45° C vermischt und die erhaltene Mischung ließ man 30 Minuten bei 4° C zurr. Gelieren des Carrageenans stehen. Das erhal-

tene Gel wurde in Würfelform von 3 mm Kantenlänge geformt Das Gel wurde mit einer 2%igen wäßrigen Kaliumchloridlösung gewaschen, wobei man eine immobilisierte Pseudomonas dacunhae-Zubereitung (130 g, Feuchtgewicht) erhielt Die immobilisierte Zubereitung wies eine L-Aspartat-^-decarboxylase-Aktivität von 9.050 μΜοΙ/h/g Zellen auf.

Versuch 1

Es wurde eine Reihe von Ansätzen von kontinuierlichen Enzymreaktionen durchgeführt Dazu wurde eine immobilisierte Zubereitung von Escherichia coli mit Aspartaseaktivität hergestellt gemäß Beispiel 1, verwendet Diese erfindungsgemäße Zubereitung eines immobilisierten Mikroorganismus wird nachfolgend als Zubereitung A bezeichnet Weiterhin wurde eine immobilisierte Escherichia coli-Zubereitung verwendet, die man ohne Glutaraldehydbehandlung erhalten hatte (als Kontrollversuch für einen immobilisierten Mikroorganismus, nachfolgend als Zubereitung B bezeichnet). Schließlich wurde eine immobilisierte Escherichia coli-Zubereitung verwendet, die man erhalten hatte, indem man die Glutaraldehydbehandlung nach dem Geleinschluß der Mikrobenzellen vornahm (diese immobilisierten Mikroorganismen werden nachfolgend als Zubereitung C bezeichnet). In den Versuchen wurde die Stabilität der Enzymaktivität und die Produktivität für L-Aspartamsäure geprüft

Die Zubereitungen B und C, die als Kontrollen verwendet wurden, wurden wie folgt hergestellt

Zubereitung B

Diese Zubereitung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei jedoch die Glutaraldehydbehandlung nicht durchgeführt wurde.

Zubereitung C

Diese Zubereitung wurde hergestellt, indem man die vorerwähnte Zubereitung B (10 g, Feuchtgewicht) in 2%iger wäßriger Lösung von Kaliumchlorid (100 ml), enthaltend 5 mM Glutaraldehyd, suspendierte und die Suspension 15 Minuten bei 5° C schüttelte und dann mit einer 2%igen wäßrigen Lösung von Kaliumchlorid wusch.

Kontinuierliche Enzymreaktion

Jede immobilisierte Escherichia coli-Zubereitung (4 g) wurde in eine ummantelte Säule (1,6 cm Durchmesser, 10,5 cm Länge) gegeben und eine 1 M wäßrige Lösung von Ammoniumfumarat, enthaltend 10~³ M Magnesiumchlorid (der pH der Lösung wurde mit Ammoniak auf 8,5 eingestellt) wurde kontinuierlich durch die Säule bei 37° C mit einer Fließrate von 40 ml/h geleitet. Das Eluat aus der Säule wurde in Abständen gesammelt und die Halbwertzeit der Aspartaseaktivität (Tage, die erforderlich sind, bis die Enzymaktivität um 50% der Ausgangsaktivität verringert ist) und die L-Aspartamsäure-Produktivität der immobilisierten Zubereitung wurde bestimmt, indem man die Menge an L-Aspartamsäure in dem Eluat bestimmte. Die Quantitative Mes-

sung von L-Aspartamsäure wurde durch Bioassay unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides P-60 durchgeführt

Ergebnir.se

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Aus Tabelle 1 geht hervor, daß die Zubereitung A (der erfindungsgemäß zubereitete immobilisierte Mikroorganismus) eine höhere Enzymaktivität beibehält und eine ausgezeichnete L-Aspartamsäure-Produktivität aufweist im Vergleich zu den Zubereitungen B und C.

Tabelle 1

kontinuierlicher Betrieb Aspartaseaktivität (Tage) (μΜοΙ L-Aspartam-

säure/h/g Zellen) Zuberei- Zuberei- Zubereitung A tung B tung C

1	48.680	56340	37.460
10	48.000	51.100	36.400
20	47360	46.030	35.410
25 30	45.100	41.860	34.260
40	43.880	37.900	33.290
50	42.730	34.450	32.480
80	38.910	25.530	29.7 ΪΟ
100	36.700	20.910	28.110
30 150	32.830	12.760	23.900
200	27.940	7.730	21.070
250	24300	4.750	18.120
Halbwertszeit der	250	70	240
35 Aspartaseaktivität
(Tage)
L-Aspartamsäure-	309	100	228
Produktivität*)

*) L-Aspartamsäure-Produktivität wird als relativer Wert der Gesamtmenge der gebildeten L-Aspartamsäure innerhalb der Halbwertszeit der Enzymaktivität ausgedrückt, wobei man die gemäß Zubereitung B erhaltene Menge mit 100 einsetzte.

Versuch 2

Es wurden Ansätze der nachfolgenden kontinuierlichen Enzymreaktionen durchgeführt. Hierzu verwendete man eine immobilisierte Zubereitung von Pseudomonas dacunhae mit L-Aspartat-^-Decarboxylase-Aktivität (erfindungsgemäß erhaltener immobilisierter Mikroorganismus, der nachfolgend als Zubereitung D bezeichnet wird), eine immobilisierte Pseudomonas dacunhae-Zubereitung, die erhalten worden war ohne Glutaraldehyd (Kontrollprobe eines immobilisierten Mikroorganismus, nachfolgend als Zubereitung E bezeichnet) und einer immobilisierten Pseudomonas dacunhae-Zubereitung, die man erhielt, indem man die Glutaraldehydbehandlung nach dem Geleinschluß der Mikrobenzellen durchführte (diese Kontrollprobe eines immobilisierten Mikroorganismus wird nachfolgend als Zubereitung F bezeichnet). Es wurde die Stabilität der Enzymaktivität und der L-Alanin-Produktivität der jeweiligen Zubereitungen gemessen.

Die Zubereitungen E und F, die als Kontrollen verwendet wurden, wurden wie folgt hergestellt.

Zubereitung E

Tabelle 2

kontinuierlicher Betrieb	L-Aspartat-^-decarboxylase-	Zuberei	Zuberei
(Tage)	Aktivität	tung E	tung F
		9.050	4.680
		5.520	4.550
	(μΜοΙ L-Alanin/h/g Zellen)	3330	4.400
1	Zuberei	Z080	4.240
10	tung D	1.210	4.120
20	9.050	750	4.110
30	8.910	280	3.750
40	8320	—	3390
50	8.000	—	2310
70	7530	—	2.470
100	6.910		2.190
150	7.530	—	1.860
200	6.910		1.600
250	6.090
300	5350
350	4.610
4.140
3.650

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Diese Zubereitung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 hergestellt, wobei jedoch die Glutaraldehydbehandlung fortgelassen wurde.

Zubereitung F

Diese Zubereitung wurde hergestellt, indem man 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7, 20 ml), enthaltend 1,67 M L-Lysin-Hydrochlorid, zu der vorerwähnten Zubereitung E (10 g, Feuchtgewicht) gab, worauf man die Mischung dann 10 Minuten bei 10⁰C stehen ließ. Dann wurden 133 ml einer 25% igen wäßrigen Glutaraldehydlösung zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten bei 10°C stehen gelassen und anschließend mit einer 2°/oigen wäßrigen Lösung von Kaliumchlorid gewaschen.

Kontinuierliche Enzymreaktion kontinuierlicher Betrieb
(Tage)

L-Aspartat-^-decarboxylase-Aktivität

(μΜοΙ L-Alanin/h/g Zellen) Zuberei- Zuberei- Zubereitung D tung E tung F

Halbwertszeit von 270 14 225

L-Aspartat-^-decarboxylase-Aktivität
(Tage)

L-Alanin- 1.929 100 831

Produktivität·)

*) Die L-AIanin-Produktivität wird als ein relativer Wert, bezogen auf die Gesamtmenge von L-Alanin, die innerhalb der Halbwertszeit produziert wurde, ausgedrückt, wobei man die Enzymaktivität, die man unter Verwendung der Zubereitung E erhielt, mit 100 einsetzte.

Jede der immobilisierten Pseudomonas dacunhae-Zubereitungen (4 g) wurde in eine ummantelte Kolonne (1,6 cm Durchmesser und 10,5 cm Länge) gegeben und eine 1 M wäßrige Lösung von Ammonium-L-Aspartat, enthaltend 10~⁴ M Pyridoxalphosphat (der pH-Wert der Lösung wurde mit Ammoniak auf einen Wert von 5.5 eingestellt) wurde kontinuierlich durch die Säule bei 37° C mit einer Fließrate von 18 ml/h geleitet. Das Eluat aus der Säule wurde in Abständen gesammelt und die Halbwertszeit der L-Aspartat-^-decarboxylase-Aktivität (Tage) und die L-Alanin-Produktivität der immobilisierten Zubereitungen wurde bestimmt, indem man die Menge an L-Aianin in dem Eluat bestimmte. Die quantitative Messung von L-Alanin wurde durch Bioassay unter Verwendung von Leuconostoc citrocorum durchgeführt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die Zubereitung D (der erfindungsgemäß hergestellte immobilisierte Mikroorganismus) eine höhere Enzymaktivität beibehält und eine sehr gute L-Alanin-Produktivität aufweist, jeweils verglichen mit den Zubereitungen E und F.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen unter Verwendung eines in einer Kulturbrühe kultivier ien Mikroorganismus, von Glutaraldehyd und einer wäßrigen Lösung eines Polysaccharids mit 10 Gew.-/Gew.-% oder mehr einer Sulfatgruppe im Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturbrühe nach Beendigung der Kultivierung mit Glutaraldehyd behandelt, die Mikroorganismenzellen aus der Brühe sammelt, die Mikroorganismenzellen mit einer wäßrigen Lösung des Polysaccharide vermischt und dann das Polysaccharid in der erhaltenen Mischung unter Einschluß der Mikroorganismenzellen innerhalb der Gelmatrix des Polysaccharide geliert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine solche Menge Glutaraldehyd mit der Kulturbrühe unter Rühren oder Schütteln vermischt, daß die Endkonzentration an Glutaraldehyd in der Kulturbrühe 0,1 mM bis 0,5 M beträgt