DE3309271A1 - Verfahren zur herstellung von immobilisierten mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von immobilisierten mikroorganismenInfo
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Description
TANABE SEIYAKU CO., LTD., OSAKA-SHI / JAPAN
Verfahren zur Herstellung von immobilisierten. Mikroorganismen
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen.
Immobilisierte Mikroorganismen (d.h. an einen Träger gebundene Mikroorganismen) sind für zahlreiche Enzymreaktionen
von grosser Bedeutung und es sind eine Reihe von Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen
bekannt. So wird in US-PS 4 138 292 ein Verfahren zur Herstellung-von immobilisierten Mikroorganismen
beschrieben, bei dem man Mikrobenzellen mit einer Wässrigen Lösung eines Polysaccharide mit 10 w/w-% oder
mehr einer Sulfatgruppe im Molekül, wie Carrageenan, abmischt und man schliessend das Polysaccharid in der
erhaltenen Mischung dann geliert, wobei die Mikrobenzellen innerhalb des Gels eingeschlossen werden und man
auf diese Weise immobilisierte Mikroorganismen erhält. Weiterhin wird in der erwähnten US-Patentschrift auch
die Stabilisierung der enzymatischen Aktivität von immobilisierten Mikroorganismen beschrieben, wobei die
immobilisierte Zubereitung, die man nach dem vorerwähnten Verfahren erhält, mit Glutaraldehyd behandelt wird.
Die Stabilisierung der Enzymaktivität von immobilisierten Mikroorganismen, bei dem man die Glutaraldehydbehandlung,
nachdem die Mikrobenzellen in das Gel eingeschlossen wurden, ist jedoch nicht voll befriedigend, wenn
man sie in grosstechnischem Masse durchführt. Da das vorerwähnte Polysaccharidgel verhältnismässig instabil
gegenüber Scherkräften ist, wird die Gelform während der Glutaraldehydbehandlung leicht beschädigt und es ist
schwierig, diese Behandlung gleichmässig durchzuführen.
Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden, wurden von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung eine Reihe von
Untersuchungen vorgenommen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass man immobilisierte Mikroorganismen mit
hoher Enzymaktivität und hoher Stabilität herstellen kann, indem man die Kulturbrühe eines Mikroorganismus
mit Glutaraldehyd behandelt, nachdem die Kultivierung beendet wurde und nicht erst die Glutaraldehydbehandlung
nach dem Geleinschluss mittels des Polysaccharids vornimmt.
Das Hauptziel der Erfindung ist es, ein neues Verfahren
zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen zur
Verfügung zu stellen, die eine höhere Enzymaktivität und eine höhere Stabilität als die nach den bekannten
Verfahren erhaltenen aufweisen und wobei man die immobilisierten Zubereitungen ohne die vorerwähnten Schwierigkeiten
in grosstechnischem Masse durchführen kann. Diese Aufgabe sowie weitere Aufgaben und Vorteile der
Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.
Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen gezeigt, bei dem man
einen Mikroorganismus in einer Kulturbrühe kultiviert, die behandelte Brühe mit Glutaraldehyd behandelt, nachdem
die Kultivierung beendet ist/ die Mikrobenzellen aus der Brühe sammelt, die Mikrobenzellen mit einer
wässrigen Lösung eines Polysaccharids mit 10 w/w-% oder
mehr Sulfatresten im Molekül vermischt und dann das Polysaccharid in der erhaltenen Mischung geliert, unter
Einschluss der Mikrobenzellen innerhalb der Gelmatrix des Polysaccharids.
Bei der vorliegenden Erfindung können alle Mikroorganismen, welche die gewünschtten Enzymaktivitäten aufweisen/
verwendet werden. Bevorzugte Beispiele für solche Mikroorganismen sind Escherichia coli ATCC
11303 (IAM 1268) mit Aspartaseaktivität, Pseudomonas dacunhae IAM 1152 mit L-Aspartat - ß-decarboxylase-Aktivität
und dergleichen.
Als Kulturbrühe können die üblichen Brühen verwendet
werden, die zur Kultivierung der Mikroorganismen der vorerwähnten Art geeignet sind und die Brühe kann die
geeigneten Mengen an üblichen Bestandteilen, wie Kohlenstoff quellen, Stickstoffquellen, organische Nährstoffe,
anorganische Materialien und dergleichen, enthalten.
Beispiele für das Polysaccharid mit 10 w/w-% oder mehr
an Sulfatresten im Molekül sind Carrageenan, Furcellaran, Zellulosesulfat und dergleichen. Carrageenan ist
ein Polysaccharid mit 20 bis 30 w/w-% Sulfatresten, das man erhält, indem man einen Extrakt von Seealgen
von Rhodopyceae, wie Gigartinaceae und Solievianceae
raffiniert. Gemäss der vorliegenden Erfindung kann im Handel erhältliches Carrageenan, z.B. GENU GEL WG,
GENU GEL CWG und GENU VISCO (Handelsnamen von Carrageenan, hergestellt von Kopenhagen Pectin Factory Ltd.)
verwendet werden. Furcellaran ist ein Polysaccharid mit 12 bis 16 w/w-% Sulfatresten, das man erhält, indem
man eine Art von Seealgen von Rhodopyceae, nämlich Furcellaria fastigiota, extrahiert. Ein solches Produkt
ist beispielsweise Furcellaran, das von der Litex Co. in Dänemark hergestellt wird. Ein Beispiel für Zellulosesulfat
ist KELCO SCS, hergestellt von Kelco Co..
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden zunächst die Mikroorganismen in der Kulturbrühe
kultiviert. Die Kultivierung ist nicht auf ein spezielles Verfahren beschränkt und kann in bekannter Weise
durchgeführt werden. Gewünschtenfalls kann man nach Beendigung der Kultivierung die Enzymaktivität für ein
1. *
7 -
Nebenreaktionssystem der Mikroorganismen in bekannter Weise vor der nächsten Stufe, nämlich der Behandlung
mit Glutaraldehyd, entfernen.
Nach Beendigung der Kultivierung wird die Kulturbrühe mit Glutaraldehyd behandelt. Diese Behandlung kann man
einfach durchführen, indem man Glutaraldehyd mit der Kulturbrühe unter Rühren oder Schütteln vermischt. Vorzugsweise
ist die Menge des zugegebenen Glutaraldehyds so gross, dass die Endkonzentration in der Kulturbrühe
0,1 mM bis 0,5 M, insbesondere 1 mM bis 0,1 M, beträgt. Vorzugsweise führt man die Glutaraldehydbehandlung
bei 0 bis 600C, insbesondere bei 0 bis 400C, durch.
Die für diese Behandlung erforderliche Zeit hängt von der Temperatur ab, aber im allgemeinen wird die Behandlung
während 1 Minute bis 24 Stunden und vorzugsweise 5 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt. Nach der Behandlung
mit Glutaraldehyd werden die Mikrobenzellen gesammelt, z.B. indem man die Kulturbrühe zentrifugiert.
Die so erhaltenen Mikrobenzellen werden mit einer wässrigen Lösung des Polysaccharids mit 10 w/w-% oder mehr
Sulfatgruppen im Molekül (nachfolgend einfach als PoIysaccharid bezeichnet) vermischt. Die wässrige Lösung
des Polysaccharids kann man in einfacher Weise herstellen, indem man ein Polysaccharid mit Wasser von 30 bis
1000C vermischt. Die Konzentration des Polysaccharids
in der Lösung beträgt vorzugsweise 0,2 bis 20 w/w-%, insbesondere 1 bis 10 w/w-%. Die so erhaltene wässrige
Lösung des Polysaccharids wird dann mit den oben genannten Mikrobenzellen zur Herstellung der Mischung abgemischt,
330927
Bei der Herstellung der Mischung werden die Mikrobenzellen vorzugsweise in Wasser, einer physiologischen
Kochsalzlösung oder in einer geeigneten Pufferlösung (pH 3 bis 10/ vorzugsweise pH 4 bis 8) suspendiert und
dann wird die Suspension mit der wässrigen Lösung des Polysaccharids, die man auf 30 bis 600C erwärmt hat,
vermischt.
Die nächste Stufe besteht in der Gelierung des PoIysaccharids
in der Mischung, um die Mikrobenzellen innerhalb der Gelmatrix des Polysaccharide einzuschliessen.
Die Gelierung des Polysaccharids kann man durchführen,
indem man einfach die Mischung kühlt. Lässt man die Mischung beispielsweise bei etwa 0 bis 200C während
1 Minute bis 5 Stunden stehen, so geliert das PoIysaccharid und gleichzeitig werden die Mikrobenzellen
innerhalb der gebildeten Gelmatrix des Polysaccharids eingeschlossen. Das so erhaltene Gel kann man dann in verschiedene
Formen bringen.
Man kann die vorerwähnte Gelierung aber auch auf andere Weise als durch Abkühlen der Mischung vornehmen. Beispielsweise
kann man die Gelierung durchführen, indem man die Mischung mit Ammoniumionen oder einem Metallion
mit einem Atomgewicht von 24 oder mehr (z.B. Kaliumionen, Magnesiumionen oder Kalziumionen) in Berührung
bringt oder indem man die Mischung mit einer Verbindung mit 2 oder mehr basischen funktionellen Gruppen im
Molekül in Berührung bringt (z.B. Methylendiamin, Ethylendiamin und p-Phenylendiamin) oder indem man die
Mischung mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel (z.B. Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol,
Dioxan oder Tetrahydrofuran) in Berührung bringt.
Der nach dem erfindungsgemässen Verfahren so erhaltene
immobilisierte Mikroorganismus kann für zahlreiche Enzymreaktionen in bekannter Weise verwendet werden.
Bei einem Vergleich mit dem in der vorerwähnten US-PS
4 138 292 beschriebenen Verfahren, bei dem die Glutaraldehydbehandlung
nach dem Geleinschluss der Mikrobenzellen durchgeführt wird, zeigt sich, dass beim erfindungsgemässen
Verfahren die Glutaraldehydbehandlung der Kulturbrühe nach Beendigung der Kultivierung erfolgt
und dass man dadurch die nachfolgenden Vorteile erzielt.
Da die Glutaraldehydbehandlung bei dem Verfahren des
Standes der Technik nach dem Geleinschluss erfolgt, kann die Form des Gels geschädigt werden und es ist
auch schwierig, diese Behandlung gleichmässig durchzuführen. Wird dagegen die Glutaraldehydbehandlung beim
erfindungsgemässen Verfahren nach Beendigung der Kultivierung in der Kulturbrühe durchgeführt, kann man die
Schwierigkeiten beim Verfahren des Standes der Technik vermeiden und man kann die Behandlung sehr gleichmässig
und in einfacher Weise vornehmen. Weiterhin weisen die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen
immobilisierten Mikroorganismen eine höhere Enzymaktivität auf als solche, die nach dem Stand der Technik erhalten
wurden. Darüber hinaus behalten die erfindungsgemäss
erhaltenen immobilisierten Mikroorganismen im Vergleich zu denen des Standes der Technik eine höhere
- ίο -
Enzymaktivität während einer längeren Zeit bei einer kontinuierlichen
Enzymreaktion bei.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist infolgedessen sehr
gut für die grosstechnische Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen geeignet.
Die nachfolgenden Beispiele und Versuche beschreiben die Erfindung.
10
10
Jeweils 100 ml-Anteile einer Kulturbrühe (pH 7,0), enthaltend'
Maisquellwasser (2,0 %) , Hefe (2 %), Fumarsäure (1,14%), Diammoniumfumarat (0,5 %), Kaliumdihydrogenphosphat
(0,2 %) und Magnesiumsulfat (0,05 %) wurden in zehn 500 ml-Erlenmeyer-Kolben vorgelegt. Escheri chia coli
ATCC 11303 (IAM 1268) wurde zum Inokulieren in jeden Kolben gegeben. Die Kolben wurden unter Schütteln
bei 300C während 16 Stunden inkubiert und dann zur
Beendigung der Kultivierung auf 50C gekühlt. 25 % einer
wässrigen Lösung von Glutaraldehyd (2 ml) wurden zu den Kolben gegeben, so dass die Endkonzentration an Glutaraldehyd
5 mM betrug und dann wurden die Kolben 30 Minuten geschüttelt. Man sammelte 23 g (Feuchtgewicht) an
Escherichia coli ATCC 11303 durch Zentrifugieren der Kulturbrühe.
Getrennt davon wurde GENU GEL WG (Carrageenan, hergestellt
von Kopenhagen Pectin Factory Ltd., 6 g) in 129 ml warmem Wasser von 450C unter Erhalt einer wässrigen Lösung
von Carrageenan gelöst.
Eine Suspension der vorerwähnten Mikrobenzellen (23 g) in einer physiologischen Kochsalzlösung (23 ml) wurde
mit der Carrageenanlösung bei 400C vermischt und die Mischung liess man 30 Minuten bei 40C zur Gelierung des
Carrageenans stehen. Das erhaltene Gel wurde in Würfelform mit 3 mm.Kantenlänge geformt* Das Gel wurde in eine
Substratlösung (400 ml), enthaltend 1 M Diammoniumfumarat, getaucht und bei 370C 48 Stunden stehen gelassen
und dann mit einer 2 %-igen wässrigen Kaliumchloridlösung gewaschen, unter Erhalt einer immobilisierten
Escherichia coli-Zubereitung (180 g, Feuchtgewicht). Die
so erhaltene immobilisierte Zubereitung hatte eine Aspartase-Aktivität von 48.680 μΜοΙ/h/g Zellen.
Jeweils 120 ml-Anteile einer Kulturbrühe (pH 7,3), enthaltend
Natriumglutamat (3,2 %), Hefe (0,5 %) , Kaliumdihydrogenphosphat
(0,05 %) und Magnesiumsulfat (0,01 %) wurden in zehn 500 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt. Zu
jedem Kolben wurde zum'Inokulieren Pseudomonas dacunhae
IAM 1152 gegeben. In den Kolben wurde durch Schütteln bei 300C während 24 Stunden die Inkubierung vorgenommen;
Nach Beendigung der Kultivierung wurden 26 ml Essigsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 4,75 zu den
Kolben gegeben und die Kolben liess man dann 1 Stunde
bei 300C stehen. Zur Einstellung des pH-Wertes auf einen Wert von 6,0 wurden 86 ml 3 N Natriumhydroxid zu
dem Kolben gegeben und dann kühlte man auf 100C. In
die Kolben wurden dann 2,6 ml einer 25 %-igen wässrigen Glutaraldehydlösung gegeben, bis die Endkonzentration
an Glutaraldehyd 5 mM betrug und die Kolben wurden 30 Minuten geschüttelt. Durch Zentrifugieren der Kulturbrühe
erhielt man 20 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen von Pseudomonas dacunhae IAM 1152.
Getrennt davon wurde GENU GEL WG (Carrageenan, hergestellt von Kopenhagen Pectin Factory Ltd., 4,03 g) in
warmem Wasser von 5O0C (85 ml) unter Erhalt einer wässrigen
Lösung von Carrageenan gelöst.
Eine Suspension der vorerwähnten Mikrobenzellen (20 g) in einer physiologischen Kochsalzlösung (20 ml) wurde
mit der Carrageenanlösung bei 450C vermischt und die erhaltene
Mischung liess man 30 Minuten bei 40C zum Gelieren des Carrageenans stehen.Das erhaltene Gel wurde
in Würfelform von 3 mm Kantenlänge geformt. Das Gelwurde mit einer 2 %-igen wässrigen Kaliumchloridlösung
gewaschen, wobei man eine immobilisierte Pseudomonas dacunhae IAM 1152-Zubereitung (130 g, Feuchtgewicht) erhielt.
Die immobilisierte Zubereitung wies eine L-Aspartat - ß-decarboxylase-Aktivität von 9.050 μΜοΙ/h/g Zellen
auf.
- 13 -
Versuch 1
Es wurde eine Reihe von Ansätzen von kontinuierlichen Enzymreaktionen durchgeführt. Dazu wurde eine immobilisierte
Zubereitung von Escherichia coli mit Aspartaseaktivität,
hergestellt gemäss Beispiel 1, verwendet. Diese erfindungsgemässe Zubereitung eines immobilisierten
Mikroorganismus wird nachfolgend als Zubereitung A bezeichnet. Weiterhin wurde eine immobilisierte Escheri chia coli-Zubereitung
verwendet, die man ohne Glutaraldehydbehandlung erhalten hatte (als Kontrollversuch
für einen immobilisierten Mikroorganismus, nachfolgend als Zubereitung B bezeichnet). Schliesslich wurde eine
immobilisierte Escherichia coli-Zubereitung verwendet,
die man erhalten hatte, indem man die Glutaraldehydbehandlung nach dem Geleinschluss der Mikrobenzellen
vornahm (diese immobilisierten Mikroorganismen werden nachfolgend als Zubereitung C bezeichnet). In den Versuchen
wurde die Stabilität der Enzymaktivität und die Produktivität für L-Aspartamsäure geprüft.
Die Zubereitungen B und C, die als Kontrollen verwendet
wurden, wurden wie folgt hergestellt.
Diese Zubereitung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei jedoch die Glutaraldehydbehandlung
nicht durchgeführt wurde. 30
Diese Zubereitung wurde hergestellt, indem man die vorerwähnte Zubereitung B (10 g, Feuchtgewicht) in 2 %-iger
wässriger Lösung von Kaliumchlorid (100 ml), enthaltend 5 mM Glutaraldehyd, suspendierte und die Suspension
15 Minuten bei 50C schüttelte und dann mit einer 2 %-igen
wässrigen Lösung von Kaliumchlorid wusch.
Kontinuierliche_EnzYmreaktion
Jede immobilisierte Escherichia coli-Zubereitung (4 g)
wurde in eine ummantelte Säule (1,6 cm Durchmesser, 10,5 cm Länge) gegeben und eine 1 M wässrige Lösung von
Ammoniumfumarat, enthaltend 10 M Magnesiumchlorid·
(der pH der Lösung wurde mit Ammoniak auf 8,5 eingestellt) wurde 'kontinuierlich durch die Säule bei 370C mit einer
Fliessrate von 40 ml/h geleitet. Das Eluat aus der Säule wurde in Abständen gesammelt und die Halbwertzeit der
Aspartaseaktivitat (Tage die erforderlich sind, bis die Enzymaktivität um 50 % der Ausgangsaktivität verringert
ist) und die L-Aspartamsäure-Produktivität der immobilisierten Zubereitung wurde bestimmt, indem man die Menge
an L-Aspartamsäure in dem Eluat bestimmte. Die guantitative Messung von L-Aspartamsäure wurde durch Bioassay
unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides P-60 durchgeführt
.
Ergebnisse
30
30
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Aus Tabelle
- 15 -
geht hervor, dass die Zubereitung A (der erfindungsgemäss
zubereitete immobilisierte Mikroorganismus) eine höhere Enzymaktivität beibehält und eine ausgezeichnete
L-Aspartamsäure-Produktivität aufweist, im Vergleich zu
5 den Zubereitungen B und C.
| kontinuier licher Betrieb (Tage) |
Aspartasea säure/h/g Zuberei tung A |
ktivität (μΜοΙ Zellen) Zuberei tung B |
L-Aspartam- Zuberei- tung C |
| 1 | 48.680 | 56.340 | 37.460 |
| 10 | 48.000 | 51.100 | 36.400 |
| 20 | 47.360 | 46.030 | 35.410 |
| 30 | 45.100 | 41.860 | 34.260 |
| 40 | 43.880 | 37.900 | 33.290 |
| 50 | 42.730 | 34.450 | 32.480 |
| 80 | 38.910 | 25.530 | 29.710 |
| 100 | 36.700 | 20.910 | 28.110 |
| 150 | 32.830 | 12.760 | 23.900 |
| 200 | 27.940 | 7.730 | 21.070 |
| 250 | 24.300 | 4.750 | 18.120 |
| Halbwertszeit der Aspartase- aktivität (Tage) |
250 | 70 | 240 |
| L-Aspärtam- . säure-Produk- tivität* |
309 | 100 | 228 |
* L-Aspartamsäure-Produktivität wird als relativer Wert
30 der Gesamtmenge der gebildeten L-Aspartamsäure innerhalb der Halbwertszeit der Enzymaktivität ausgedrückt,
wobei man die gemäss Zubereitung B erhaltene Menge mit 100 einsetzte.
Versuch 2
Es wurden Ansätze der nachfolgenden kontinuierlichen Enzymreaktionen durchgeführt. Hierzu verwendete man
eine immobilisierte Zubereitung von Pseudomonas dacunhae
IAM 1152 mit L-Aspartat-ß-Decarboxylase-Aktivität (erfindungsgemäss
erhaltener immobilisierter Mikroorganismus, der nachfolgend als Zubereitung D bezeichnet wird),
eine immobilisierte Pseudomonas dacunhae IAM 1152-Zubereitung,
die erhalten worden war, ohne Glutaraldehyd (Kontrollprobe eines immobilisierten Mikroorganismus,
nachfolgend als Zubereitung E bezeichnet) und einer immo bilisierten Pseudomonas dacunhae IAM 1152-Zubereitung,
die man erhielt, indem man die Glutaraldehydbehandlung nach dem Geleinschluss der Mikrobenzellen durchführte
(diese Kontrollprobe eines immobilisierten Mikroorganismus wird nachfolgend als Zubereitung F bezeichnet).· Es
wurde die Stabilität der Enzymaktivität und der L-Alanin
Produktivität der jeweiligen Zubereitungen gemessen.
Die Zubereitungen E und F, die als Kontrollen verwendet
wurden, wurden wie- folgt hergestellt.
Diese Zubereitung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel
2 hergestellt, wobei jedoch die Glutaraldehydbehandlung fortgelassen wurde.
Diese Zubereitung wurde hergestellt, indem man 0,2 M
Phosphatpufferlösung (pH 7, 20 ml), enthaltend 1,67 M L-Lysin-Hydrochlorid, zu der vorerwähnten Zubereitung
E (10 g, Feuchtgewicht) gas, worauf man die Mischung dann 10 Minuten bei 1O0C stehen liess. Dann wurden 13,3 ml.
einer 25 %-igen wässrigen Glutaraldehydlösung zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten bei 1O0C stehen gelassen
und anschliessend mit einer 2 %-igen wässrigen Lösung von Kaliumchlorid gewaschen.
Jede der immobilisierten Pseudomonas dacunhae IAM 1152-Zubereitungen
(4 g) wurde in eine ummantelte Kolonne (1,6 cm Durchmesser und 10,5 cm Länge) gegeben und eine
1 M wässrige Lösung von Ammonium-L-Aspartat, enthaltend
-4
10 M Pyridoxalphosphat (der pH-Wert der Lösung wurde
10 M Pyridoxalphosphat (der pH-Wert der Lösung wurde
- mit Ammoniak auf einen Wert von 5,5 eingestellt) wurde kontinuierlich durch die Säule bei 370C mit einer Fliessrate
von 18 ml/h geleitet. Das Eluat aus der Säule wurde in Abständen gesammelt und die Halbwertszeit der
L-Aspartat-ß-decarboxylase-Aktivität (Tage) und die
L-Alanin-Produktivität der immobilisierten Zubereitungen wurde bestimmt, indem man die Menge an L-Alanin in
dem Eluat bestimmte. Die quantitative Messung von L-Alanin wurde durch Bioassay unter Verwendung von Leuconostoc citrocorum
ATCC 8081 durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Aus Tabelle 2 geht hervor, dass die Zubereitung D (der erfindungsgemäss
hergestellte immobilisierte Mikroorganismus) eine höhere Enzymaktivität beibehält und eine ■
sehr gute L-Alanin-Produktivität aufweist, jeweils verglichen
mit den Zubereitungen E und F.
330927
| kontinuier licher Betrieb (Tage) |
L-Aspartat- (μΜοΙ L-AIaJ Zubereit- tung D |
ß-decarboxylase lin/h/g Zellen Zubereit- tung E |
14 | -Aktivität Zuberei tung F |
| 1 | 9.050 | 9.050 | 100 . | 4.680 |
| 10 | 8.910 | 5.520 | 4.550 | |
| 20 | 8.320 | 3.330 | 4.400 | |
| 30 | 8.000 | 2.080 | 4.240 | |
| 40 | 7.530 | 1.210 | 4.120 | |
| 50 | 6.910 | 750 | 4.110 | |
| 70 | 7.530 | 280 | 3.750· | |
| 100 . | 6.910 | -. | 3.390 | |
| 150 | 6.090 | - | 2.910 | |
| 200 | 5.350 | - | 2.470 | |
| 250 | 4.610 | - | 2.Ί90 | |
| 300 | 4.140 | - | 1.860 | |
| 350 | 3.650 | - | 1.600 | |
| Halbwertszeit von L-Aspar- tat-ß-decarb- oxylase-Akti- vitat (Tage) |
270 | 225 | ||
| L-Alanin Produktivi tät * |
1.929 | 831 |
Die L-Alanin-Produktivität wird als ein relativer Wert, bezogen auf die Gesamtmenge von L-Alanin,
die innerhalb der Halbwertszeit produktziert wurde, ausgedrückt, wobei man die Enzymaktivität, die man
unter Verwendung der Zubereitung E erhielt, mit einsetzte.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten
Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet,
dass man einen Mikroorganismus in einer Kulturbrühe kultiviert, die Brühe nach Beendigung
. der Kultivierung mit Glutaraldehyd behandelt, die Mikrobenzellen aus der Brühe sammelt, die Mikrobenzellen
mit einer wässrigen Lösung eines Polysaccharide mit 10 w/w-% oder mehr einer Sulfatgruppe
im Molekül vermischt und dann das Polysaccharid in der erhaltenen Mischung unter Einschluss der Mikrobenzellen
innerhalb der Gelmatrix des Polysaccharids geliert.
S.RABELLASTRASSE 4 . D-80OO MÜNCHEN 81 . TELEFON CO893 911O87 · TELEX O5-29619 CPATHE} ■ TELEKOPIERER 9183
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der Mikroorganismus Escherichia coli
mit Aspartaseaktivität oder Pseudomonas dacunhae mit L-Aspartat - ß-decarboxylase-Aktivität
ist.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Polysaccharid Carrageenan,
Purcellaran oder Zellulosesulfat ist.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man die Behandlung mit
Glutaraldehyd durchführt, indem man eine solche Menge Glutaraldehyd mit der Brühe unter Rühren oder
Schütteln vermischt, dass die Endkonzentration an Glutaraldehyd in der Brühe 0,1 mM bis 0,5 M beträgt.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η -"
zeichnet , dass die wässrige Lösung des Polysaccharids 0,2 bis 20 w/w-% des Polysaccharids
enthält.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikrobenzellen in
Wasser, einer physiologischen Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung mit einem pH von 3 bis 10 suspendiert
und die erhaltene Suspension dann mit der wässrigen Lösung des Polysaccharids bei 30 bis 600C vermischt.
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Country Status (7)
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