DE2723166A1 - Verfahren zur herstellung von polysaccharid 2 - Google Patents

Verfahren zur herstellung von polysaccharid 2

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Description

272316b
29 360 o/wa
TATE & LYLE LIMITED, LONDON/ENGLAND
Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid 2
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines alginatartigen Polysaccharids durch Kultivierung von Bakterien der Spezies Azotobacter vinelandii.
Alginsäure, eine hydrophile kolloidale Kohlenwasserstoffsäure, ist ein variables Block-Copolymeres, das sich aus D_-Mannuronsäure- und L.-Guluronsäure-Einheiten zusammensetzt. Obwohl Alginsäure selbst praktisch unlöslich in Wasser ist, kann sie einfach durch Neutralisieren mit geeignetem Alkali löslich gemacht werden. Eine der besonderen Eigenschaften
von Alginat lösungen ist deren hohe Viskosität bei niedrigen Konzentrationen, wobei, falls gewisse zweiwertige Ionen wie Kalzium oder Magnesium zugesetzt werden zu den Lösungen von Alginaten, eine Gelierung eingeleitet wird. Die besonderen physikalischen Eigenschaften von Alginsäure und Alginaten ermöglicht eine vielfältige industrielle Verwertung in Form von Emulgatoren, Stabilisatoren und Verdickungsmitteln.
Alginate und Alginsäuren sind technisch durch Extraktion gewisser Spezies von braunem Seetang, beispielsweise Laminaria digitata und Ascophyllum nodosum, worin sie einen erheblichen Anteil an den Zellwandungen ausmachen, gewonnen worden. Diese üblichen Seetangextraktionsverfahren weisen aber den Nachteil auf, dass sie von einem Nachschub von Alginat enthaltendem Seetang als Ausgangsmaterial abhängig sind. Das Verfahren ist schwierig durchzuführen wegen der Mengen an benötigtem Seetang und eine erhebliche weitere Reinigung kann erforderlich sein, insbesondere für ein für Lebensmittelzwecke oder pharmazeutische Zwecke verwendetes Material.
Wegen dieser Schwierigkeiten wurden in den vergangenen Jahren alginatähnliche Polysaccharide durch Kultivieren von verschiedenen Spezies von Azotobacter, insbesondere Azotobacter vinelandii gebildet. Die durch diese Mikroorganismen gebildete Aginsäure ist strukturell ähnlich der aus Seetang gewonnen, mit der Ausnahme, dass sie partiell acetyliert ist.
Es ist bekannt, dass bei der Herstellung von Polysacchariden unter Verwendung von Stämmen von Azotobacter vinelandii eine Anzahl von Faktoren kritisch ist, insbesondere der pH-Wert des Mediums und auch die Menge an Phosphat in dem Medium.
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In der GB-PS 1 331 771 wird ein Verfahren beschrieben und beansprucht zur Herstellung eines Polysaccharids, bei dem ein Mikroorganismus der Spezies Azotobacter vinelandii unter /v aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium kultiviert wird, wobei das Nährmedium wenigstens ein Monosaccharid und/oder Oisaccharid als Kohlenstoffquelle und als wesentli- ._;■_■, ehe Bestandteile Quellen von Molybdän, Eisen, Phosphat, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält, und wobei kontrollierte pH-Bedingungen erforderlich sind, nämlich derart, dass ein pH im Bereich von 6,5 bis 8,5 wenigstens während der ersten Hälfte der Fermentationsperiode aufrechterhalten wird und ein pH-Bereich im Bereich von 4,5 bis 8,5 für den Rest der Fermentationsperiode, falls eins solche vorhanden ist, bis eine erhebliche Bildung an Polysaccharid erfolgt ist, worauf dann das gebildete Polysaccharid isoliert wird. Das in diesem Verfahren verwendete Kulturverfahren kann eine absatzweise oder eine kontinuierliche Kultur sein.
In der GB-PS 1 394 413 wird eine besondere Auswahl für diese i Bedingungen angegeben, wobei man besonders gute Ausbeuten an Polysacchariden erhält. In dieser Patentschrift wird ein ähnliches Verfahren wie in der vorerwähnten Patentschrift beschrieben und beansprucht, aber die Konzentration an Phosphat in dem Medium wird auf O,1 bis 0.8 mmol begrenzt und während der Kultivierung wird der pH des Mediums im Bereich von 7,0 bis 8,2 aufrecht gehalten.
In der GB-PS 1 394 413 wird wiederum betont, dass man die besten Ergebnisse mit niedrigen Phosphatkonzentrationen erzielt. Unter kontinuierlichen Kulturbedingungen begrenzt eine Komponente des Mediums immer das Wachstum der Mikroorganismen:
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a Lie anderen Nährstoffe werden im Überschuss zur Verfügung gestellt. Bei niedrigen Phosphatmengen kann das Phosphat selbst das limitierende Substrat sein, in Abhängigkeit von der Zugängigkeit der anderen Nährstoffe.
Der Zucker, entweder ein Monosaccharid oder ein Disaccharid, der in dem Kulturmedium verwendet wird, ist die Quelle aus der das Polysaccharid aufgebaut wird. Deshalb wird üblicherweise sowohl bei einem absatzweisen wie bei einem kontinuierlichen Verfahren eine unbegrenzte Menge an Zucker zu dem Mikroorganismus gegeben, so dass man ein Maximum an Ausbeute an PoLysaccharid erhält und jede Kürzung an Zucker wird als nachteilig auf die Gesamtausbeute angesehen. Der überschuss an Zucker, welcher nicht von den Mikroorganismen verbraucht wurde, bleibt in dem Kulturmedium nachdem die Zellen und das Polysaccharid entfernt worden sind. Dieses Verfahren ist natürlich verschwenderisch hinsichtlich der Zuckerquellen aber verursacht auch erhebliche Verschmutzungsprobleme, wenn der Abfluss in Gewässern, wie Flüssen oder Seen assimiliert wird. Der Überschuss an Zucker bedingt in dem Abfluss einen hohen biologischen Sauerstoffbedarf (B.0.D.) und ergibt somit eine Entoxidierung des Wassers in welches der Abfluss fliesst, wodurch dann das tierische und pflanzliche Leben nachteilig beeinflusst werden. Jeder Versuch, die Menge an zugeführtem Zucker bei einem kontinuierlichen Fermentationsverfahren dieser Art zu beschränken, stösst auf erhebliche Probleme, weil das System unstabil wird und nur schwierig kontrolliert werden kann.
überraschenderweise wurde nun gefunden, dass bei einer tatsächlichen Beschränkung der Zuckerzufuhr zu einem kontinuierlichen
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Fermentationssystem derart, dass der Zucker der wachstumsbeschränkende Bestandteil in dem Medium wird, eine gute Ausbeute an Polysaccharid erzielt wird und dass das System stabil und leicht zu kontrollieren ist, während der Abfluss im wesentlichen frei von Zucker ist und infolgedessen einen sehr viel niedrigeren B.O.D. hat.
Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide zur Verfügung gestellt, wobei das Polysaccharid aus einem partiell acetylierten variablen Block-Vopolymeren von 1-4-verbundenen D-Mannuronsäure- und -L-Guluronsäure-Resten besteht, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Bakterium der Spezies Azotobacter vinelandii kontinuierlich unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Kulturmedium kultiviert, wobei das Kulturmedium als wesentlichen Bestandteil wenigstens ein Monosaccharid oder Disaccharid als Kohlenstoffquelle und Quellen von Phosphat, Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält und wobei das Medium eine fixierte Quelle an Stickstoff und/oder Stickstoff enthaltendem Belüftungsgas enthält und die Konzentration der durch das Saccharid gegebenen Kohlenstoffquelle in dem Medium limitierend auf das Wachstum der Bakterien ist, wobei während der Kultivierung der pH in dem Medium im Bereich zwischen 6,0 und 8,2 gehalten wird.
Jeder Stamm von Azotobacter vinelandii kann beim erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden. Besonders wertvolle Stämme, welche besonders gute Ausbeuten an Polysaccharid ergeben, sind die, die jeweils in den beiden vorher genannten Patentschriften genannt worden sind und welche die Kultur-
Sammelnr. NCIB 9068 und NCIB 8789 und die Kultur-Sammelnr. NCIB 8660 tragen. Diese Stämme sind vom National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Schottland, erhältlich und werden in dem Sammlungskatalog beschrieben.
Die Menge der in dem Medium verwendeten Kohlenstoffquelle aus Monosaccharid oder Disaccharid hängt von der Zellkonzentration in der Fermentationsvorrichtung ab: Je höher die Zellkonzentration umso höher ist die Menge an Saccharid, welche limitierend ist. Es wurde beispielsweise gefunden, dass bei einem chemisch definierten Medium der Art, wie es in Beispiel 1 der GB-PS 1 331 771 beschrieben wird, eine Saccharosekonzentration von 24 mmol wirksam limitierend ist bei einer Zellkonzentration von etwa 1,3 g/l, wenn der Respirationsgrad annähernd 16 mmol Sauerstoff/g Zelle/h ist. In ähnlicher Weise ist eine Saccharosekonzentration von 24O mmol wirksam limitierend bei einer Zellkonzentration von etwa 13,6 g/l und einem Respirationsgrad von etwa 5 mmol Sauerstoff/ g Zelle/h. Diese Ergebnisse können bei Verdünnungsgraden von 0,15 bzw. 0,05 h erzielt werden.
In jedem speziellen Falle kann man erkennen, ob die Konzentration an Saccharose (oder eines anderen Mono- oder Disaccharide) tatsächlich limitierend ist, indem man die Saccharosekonzentration erhöht und die Auswirkung auf die Zellkonzentration beobachtet. Wird die Konzentration einer nicht limitierenden Komponente in dem Medium erhöht, so beobachtet man keine merkliche Veränderung der Zellkonzentration; wird jedoch die Konzentration der limitierenden Komponente erhöht, so reagiert die Zellkonzentration sehr schnell durch eine Erhöhung.
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Es wurde festgestellt, dass unter üblichen kontinuierlichen Kulturbedingungen, beispielsweise bei solchen, bei denen ein Chemostat verwendet wird (siehe Herbert Elswoth und Telling, 1956, Journal of General Microbiology, 14, 601), besonders vorteilhafte Saccharosemengen so hoch wie 240 mmol sein können, aber es kann keine obere Grenze für die Saccharosekonzen tration festgestellt werdenjaiit Ausnahme der, die durch praktische Überlegungen hinsichtlich der Beeinflussung des kontinuierlichen Fermentationsverfahrens diktiert wird.
Wie immer die Menge an Saccharose in dem Medium auch ist, vorausgesetzt, dass sie echt das Wachstum von A^ vinelandii limitiert, ergibt sich ein im wesentlichen von Restzucker freier Abfluss. Weiterhin wird die Zuckermenge in dem Kulturmedium selbst einfach bei einem stabilen Niveau kontrolliert, weil es tatsächlich der Mikroorganismus selbst ist, der hier als Kontrollraittel wirkt.
Von den verschiedenen Mono- und Disacchariden, die als Kohlenstoff quelle bei der Herstellung von Polysacchariden mittels Azotobacter vinelandii geeignet sind, wurde Saccharose als bevorzugte Verbindung erkannt. ,
Abgesehen von der Anwendung der limitierenden Bedingungen für die Kohlenstoffquelle aus dem Mono- oder Disaccharid, kann das Medium ansonsten jede der üblichen Komponenten enthalten, die bei der Herstellung von Polysacchariden aus Azotobacter vinelandii verwendet werden.
Es wurde jedoch festgestellt, dass die Menge an Sauerstoffzufuhr in bezug steht zu der Wirksamkeit, mit welcher die
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Kohlenstoffquelle aus dem Monosaccharid oder Disaccharid in ein Polysaccharid umgewandelt wird. Bei kontinuierlichen Kulturbedingungen ist es die Beziehung der Sauerstoffmenge zu der Zellkonzentration, welche kritisch ist und nicht die Sauerstoffkonzentration in dem Medium als solche. Hohe Sauerstoffmengen beschleunigen die Respiration des Mikroorganismus und verwandeln dadurch Saccharose (oder eine andere Kohlenstoffquelle) in Kohlendioxid. Andererseits beschränken Sauerstoff-limitierende Bedingungen die Bildung des Polysaccharide. Eine sorgfältige Einstellung der Sauerstoffzufuhr kann jedoch eine Saccharoseumwandlungszahl von etwa 30 % oder sogar über 40 % ergeben, wodurch sich eine viel bessere Verwertung der Kohlenstoffquelle ergibt. Typischerweise wird die Sauerstoffaufnahme auf 5 bis 20 mmol O2/h/g Zelle beschränkt.
Eine Veränderung der Sauerstoffzufuhr zu der Kultur kann auf verschiedene Weise erfolgen. Zunächst kann die Konzentration an Sauerstoff in dem Gas, gewöhnlich Luft, welches während der Fermentation durch die Kultur geleitet wird, verändert werden, indem man die Luft mit Stickstoff oder einen Inertgas verdünnt oder indem man die Luft mit Extrasauerstoff anreichert. Zweitens kann der Druck des durch die Kultur geleiteten Gases verändert werden, so dass der Auflösungsgrad vermindert wird. Drittens kann die Wirksamkeit, mit welcher der Sauerstoff in der Gasphase in die wässrige Phase überführt wird verändert werden, indem man die Gas-Flüssig-Mischeigenschaften verändert, was am einfachsten durch eine Veränderung der Rührgeschwindigkeit und Wirksamkeit des Rührers erfolgt. Eine Kombination von zwei oder mehr dieser Verfahren kann gleichfalls angewendet werden, um das richtige Gleichgewicht
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zwischen Stickstoff und Sauerstoff zu gewährleisten.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben.
Beispiel 1
Azotobacter vinelandii NCIV 9068 wurde kontinuierlich in einer kontinuierlichen Kultur des Chemostat-Types (Herbert Elsworth & Telling, 1956, Journal of General Microbiology, 14, 601) unter Verwendung von Azotobacter vinelandii NCIB 9068 in einer kontinuierlichen Kulturvorrichtung mit einem Kulturvolumen von 1,0 1, wobei die Menge an Phosphat in den angegebenen Konzentrationen abnahm, gezüchtet. Das Medium wurde zu der Kultur mit 15O ml/h gepumpt und die über ein Ablass-Standrohr überfliessende Kulturbrühe wurde in ein Aufnahmegefäss aufgenommen. Die Temperatur wurde auf 300C eingestellt. Der pH wurde durch automatische Zugabe von 1 M NaOH auf 7,4 kontrolliert. Luft wurde in die Fermetationsvorrichtung in einer Menge von 1 l/Min, durchperlen gelassen und die Rührgeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass die Sauerstoffaufnähme im Bereich von 10 bis 30 mmol/g Zelle/h lag. Täglich wurden Proben aus der Fermentiervorrichtung entnommen und die Proben wurden untersucht hinsichtlich der Konzentration der Zellmasse und des Polysaccharide. Zu jeder 4O ml Probe wurden 0,8 ml 0,5 M EDTA und O,8 ml 5 M NaCl gegeben. Die Proben wurden dann mit 25.000 g
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40 Minuten zentrifugiert. Die erhaltenen Zellkügelchen wur den in destilliertem Wasser wieder suspendiert, 40 Minuten mit 25.0OO g zentrifugiert und das überstehende wurde dekan tiert. In vorgewägten Röhrchen wurde das Sediment bei 105°C 12 Stunden getrocknet und dann gewägt. Das Polysaccharid wurde aus dem Uberfliessenden der ersten Zentrifugierung durch Zugabe von 3 Volumina Propan-2-ol ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, im Vakuum 24 Stunden bei 45°C getrocknet und dann gewägt.
Das Kulturmedium, dessen endgültige Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, wurde hergestellt und zu der Kultur in zwei Ansätzen gegeben. Ansatz (1) wurde 1 Stunde in zwei Teilen bei 1 kg/cm autoklavisiert und nach dem Kühlen asep tisch vereint. Ein Teil enthielt Saccharose, KH2PO. und K2HPO4 in 14 1, der andere Teil enthielt MgSO4, NaCl und Spurenelemente mit Ausnahme von Ca und Fe in 4 1. Ansatz (2) enthielt CaCl2 und FeCl2 in 2 1; das CaCl2 wurde in 1,9 1 autoklavisiert und das FeCl2 wurde filtersterilisiert und dann zu der Masse des Ansatzes (2) hinzugegeben. Ansätze
(1) und (2) wurden der Kultur durch getrennte Leitungen zugegeben, wobei (1) in einer Menge von 135 ml/h und (2) in einer Menge von 15 ml/h zugegeben wurden.
Die Kohlenstofflimitierung wurde gezeigt, indem man die Saccharosekonzentration in dem Medium auf 40 g/l erhöhte. innerhalb 5 Stunden stieg die Zellkonzentration um mehr als 10 % an. Die Menge an Saccharose wurde durch g.l.c. bestimmt.
Die Menge an gebildetem Polysaccharid pro g Zelle unter
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Kohlenstofflimitierung und die Menge an Restsaccharose werden in Tabelle 2 gezeigt. Die Restsaccharosemenge, die unter Üblichen Bedingungen erhalten wird, bei denen die Saccharose nicht der begrenzende Nährstoff ist, kann so hoch wie 10 mmol oder 15 mol sein, wie ein Vergleich zeigt.
Beispiel 2
Verwandet man das in Tabelle 1 gezeigte Medium, bewirkte •ine Zuckermenge die IO Mal der von Beispiel 1 entsprach, eine Wachstumsbegrenzung bei einem Verdünnungsgrad von 0,05 h . Die Restzuckermenge war zu vernachlässigen aber eine Polysaccharidkonzentration von 20 g/l wurde erhalten, entsprechend einer 25 %-igen Umwandlung.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung, wenn man die Sauerstoffaufnahme nicht begrenzt. Ein Respirationsgrad von 80 mmol O2/h/g Zelle (im Gegensatz zu 16 bzw. 5,2 mmol O2/h/g Zelle in den Beispielen 1 und 2) ergibt einen Abfall an Umwandlung um 14 %.
Dieses Beispiel zeigt jedoch, dass der bei der Belüftung zugafHhrte Stickstoff zumindest zum Teil durch eine fixierte Stickstoffquelle ersetzt werden kann.
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Tabelle 1
Kulturmedium
Bestandteil Zugegebene Menge (g/l Beispiel 2 Kulturmedium)
Saccharose Beispiel 1 80 Beispiel 3
8 (=24OmM) 4
KH2PO4 (=24mM) 0,096 (=12mM)
K2HPO4 0,064 0,375 0,032
MgSO4.7H2O 0,25 1/6 0,12
NaCl 1/6 1,6 0,2
Na2MoO4 1/6 0,008 0,2
CaCl2.2H2O 0,008 0,34 0,001
FeCl2-2H2O 0,34 0,25 0,043
H3BO4 0,017 23x1O~3 O,OO2
CoSO..7H00 23x1O~3 9x1O~3 2,9x10"3
4 ί
MnCl0.4Ho0		 9x1O~3 0,7x10"3 1,2x10"3
ZnSO-.7H0O O,7x1O~3 9x10"3 O,O9x1O~3
CuSO4.7H2O 9x1O~3 0,8x10"3 1,2x10"3
(NH4J2SO4 0,8x10"3 - 0,1x10~3
- 1/0
709849/0979
Tabelle 2
Alginatbildung unter kohlenstofflimitierten Bedingungen bei einer kontinuierlichen Kultur
Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3
Konzentration an li
mitierendem Substrat
im Kulturmedium (mM)		 24 240 12
Zellkonzentration
(g/l)		 1,3 13,6 0,9
Respirationsgrad
(mM O2/h/g Zelle)		 16 5,2 28
Polysaccharidkon-
zentration (g/l)		 2,2 20 0,56
Umwandlungswirksam
keit (%) (verwende
tes Substrat zu ge
bildetem Polysaccha-
rid)		 28 25 14
Restsaccharose im
Kulturmedium (mM)		 0,5 0 0
Polysaccharidausbeu-
te pro g Zelle (g)		 1,7 1,47 0,62
Verdünnungsgrad (h ) 0,15 0,05 0,15
Produktivität
■ Polysaccharidkonzen-
tration & Verdünnung
grad (g/l/h)		 0,33
[S-		 1,0
■/■
909849/0979
OWGUNAL INSPECTED

Claims (3)

  1. 29 360 o/wa
    TÄTE & LYLE LIMITED, LONDON/ENGLAND
    Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid 2
    PATENTANSPRÜCHE
    Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide aus einem partiell acetylierten variablen Block-Copolymeren von 1-4-verbundenen D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäure-Resten, bei dem ein Bakterium der Spezies Azotobacter vinelandii unter anaeroben Bedingungen kontinuierlich in einem wässrigen Kulturmedium kultiviert wird, wobei das wässrige Kulturmedium als wesentliche Bestandteile wenigstens eine Kohlenstoffquelle aus einem Monosaccharid oder Disaccharid enthält und Quellen von Phosphat, Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat, wobei das Medium eine fixierte Quelle an Stickstoff und/oder Stickstoff enthaltendem Belüftungsgas enthält und der pH des Mediums während der
    ORIGINAL INSPECTED
    Kultivierung im Bereich von 6,0 bis 8,2 gehalten wird, dadurch gekennzeichnet , dass die Konzentration der durch das Saccharid gegebenen Kohlenstoff quelle in dem Medium limitierend für das Wachstum der Bakterien ist.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Menge an zugeführtem Sauerstoff auf den Bereich beschränkt wird, welcher eine optimale Umwandlung in das Polysaccharid ergibt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass die Sauerstoffaufnahme zwischen 5 bis 20 mmol O2/h/g Zelle liegt.
    709849/0979
DE2723166A 1976-05-28 1977-05-23 Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide Expired DE2723166C3 (de)

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