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Verfahren zur Biosynthese von Cobalaminen Die Erfindung bezieht sieh
auf ein Verfahren zur Biosynthese von Cobalaminen durch Vergärung.
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Unter dem Ausdruck »Cobalamine« wird die Verbindung Cyancobalamin
(Vitamin B12) und ähnliche Verbindungen, z. B. Hydroxocobalamin (Vitamin B12b),
die durch Einwirkung von Cyanidionen in Cyä-ncobalamin umgewandelt werden, verstanden.
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Es ist bekannt, daß Cyancobalamin durch Vergärung mit verschiedenen
Mikroorganismen einschließlich Arten des Stammes Propionibacterium (vgl. Manual
of Determinative Bacteriology, 6. Ausgabe, Waverley Press, Baltimore) gebildet wird.
Auch die Biosynthese von Cobalamin durch Arten dieses Organismus unter anaeroben,
mikroaeroben oder aeroben Bedingungen ist beschrieben worden (siehe z. B. Ind. and
Eng. Chemistry, 1952, S. 2651 bis 2655), wobei die gewählten Bedingungen während
der gesamten Vergärung unverändert bleiben. Die Ausbeuten an Cobalamin aus solchen
Vergärungen sind sehr gering, d. h. in der Größenordnung von nur 1 oder 2 Mikrogramm/ccm.
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Ziel der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Biosynthese
von Cobalaminen durch Vergärung. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Biosynthese
von Cobalaminen durch Kultur einer Cobalamin bildenden Art des Stammes Propionibacterium
in einem flüssigen Nährmedium ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur
unter anaeroben Bedingungen hält, bis wenigstens etwa 10°/o des normalerweise auftretenden
Zellenwachstums erreicht ist, worauf man die Kultur unter aeroben Bedingungen fortsetzt.
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Unter dem Ausdruck »ein geeignetes flüssiges Nährmedium« wird ein
flüssiges Nährmedium verstanden, das das Wachstum der Cobalamin liefernden Arten
von Propionibacterium und die Herstellung von Cobalaminen durch diese Organismen
unterstützt. Solche Medien müssen neben assimilierbarem Stickstoff und Kohlenstoff
eine Quelle für assimilierbares Kobalt enthalten, da die Cohalamine dieses Element
enthalten. Eine Quelle des assimilierbaren Kobalts muß der Vergärung zugefügt werden,
wenn in den anderen Bestandteilen des Mediums nur ungenügend enthalten ist. Geeignete
Kobaltqüellen sind wasserlösliche anorganische Salze des Kobalts, -wie das Chlorid
und Nitrat, und diese können dem Nährmedium bis zu einer Kobaltkonzentration im
Medium zwischen etwa 2,5 und 5 Teilen/Million Teile des Mediums oder gegebenenfalls
höher zugefügt werden.
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Als besonders geeignete Medien im erfindungsgemäßen Verfahren wurden
solche gefunden, die Getreideweichflüssigkeit als Stickstoffquelle in einer Konzentration
von über etwa 140 -mg Stickstoff/ 100 ccm des Mediums und Glucose oder Lactose in
einer Konzentration von über etwa 5 % Gew./Vol. als Kohlenstoffquelle enthalten.
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Es wird bevorzugt, daß die Konzentration der Getreideweichflüssigkeit
im Medium zwischen etwa 200 und 400 mg Stickstoff/100 ccm Medium und die Konzentration
von Glucose oder Lactose zwischen etwa 8 und 121/o Gew./Vol. des Mediums beträgt.
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Die Stickstoff- und Kohlenstoffquellen können bereits alle zu Anfang
der Vergärung anwesend sein oder während der Vergärungsdauer zugesetzt werden; die
oben angegebenen Konzentrationen beziehen sieh auf die Gesamtmenge an Getreideweichflüssigkeit,
Stickstoff und Glucose oder Lactose, die dein Vergärungsmediurn zugesetzt werden.
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Neben dem als Getreideweichflüssigkeit zugegebenem Stickstoff können
andere Stickstoffquellen anwesend sein; so wurde z. B. als wünschenswert gefunden,
den pH-Wert des Mediums während der Vergärung durch Zugabe von Ammoniak, vorzugsweise
als wäßrige Lösung, zu regeln.
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Wird Glucose als KohlenStoffquelle verwendet, So wird sie vorzugsweise
als solche dem Vergärungsmedium zugefügt; sie kann jedoch gegebenenfalls in irgendeiner
anderen Form, z. $. als Rohrzucker, zugegeben werden. Wird jedoch dieses Material
verwendet, so kann es notwendig sein, dieses durch Einstellen
des
p$ Wertes des Mediums und durch Erhitzen oder durch Enzymeinwirkung zu invertieren,
bevor die im Rohrzucker enthaltene Glucose dem Organismus zugänglich ist. Es soll
genügend Material zugefügt werden, daß eine Glucosekonzentration von mindestens
5% Gew./VOl. des Mediums, vorzugsweise eine Konzentration von 8 bis 12°/o, vorliegt.
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Auch Lactose kann in irgendeiner Form zugesetzt werden, vorausgesetzt,
daß dieses Kohlehydrat dem Organismus zugänglich ist.
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Es ist wünschenswert, daß die Kohlenstoffquelle getrennt sterilisiert
wird, da das Erhitzen von Kohlehydraten in Anwesenheit anderer Bestandteile des
Mediums leicht ein Medium ergibt, das niedrigere Ausbeuten liefert als eines, in
welchem das Kohlehydrat getrennt sterilisiert und dann aseptisch zu den anderen
sterilisierten Bestandteilen des Mediums zugefügt wird.
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Es ist wesentlich, daß eine so ausreichende Kohlenstoffquelle zugefügt
wird, daß sichergestellt ist, daß nicht assimilierter Kohlenstoff, z. B. Glucose
oder Lactose, anwesend ist, wenn das Medium mit Sauerstoff in Berührung gebracht
wird. Vorzugsweise wird so viel zugefügt, daß auch nach Beendigung der Vergärung
sicherlich noch nicht assimilierter Kohlenstoff übrig ist, da dadurch die höchsten
Ausbeuten an Cobalaminen erhalten werden. Um dies sicherzustellen, kann dem Medium
zum Zeitpunkt der Berührung mit Sauerstoff gegebenenfalls weiteres Kohlehydrat zugefügt
werden.
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Es wird bevorzugt, daß Glucose die einzige Quelle des assimilierbaren
Kohlehydrates und Getreideweichflüssigkeit - mindestens anfänglich - die einzige
Stickstoffquelle ist.
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Unter dem Ausdruck »mg Stickstoff/100 ccm Medium« <werden mg elementarer
Stickstoff pro 100 ccm Medium verstanden, wie z. B. durch das Kjeldahl-Verfahren
bestimmt.
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Das erfindungsgemäße Vergärungsverfahren wird vorzugsweise bei etwa
30° C durchgeführt, obgleich , gegebenenfalls auch niedrigere oder höhere Temperaturen,
wie z. B. zwischen etwa 25 und 35° C, angewendet werden können.
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Der pH-Wert des Mediums wird während der Vergärungzeit vorzugsweise
auf etwa 7 gehalten. Es wurde gefunden, daß dies am besten dadurch erreicht wird,
daß dem Medium die erforderliche Menge an Ammoniak zugefügt wird. -Unter dem Ausdruck
»eine Cobalamin liefernde Art des Stammes Propionibacterium« wird die Art oder ein
Stamm des Organismus verstanden, der mindestens etwa 2 Mikrogramm Cobalamine (durch
Ochromonas malhamensis bestimmt) pro ccm Medium liefert, wenn er unter günstigen
Vergärungsbedingungen, z. B. in oben beschriebenen Medien und unter mikroaeroben
Bedingungen während der Vergärung, gezüchtet wird.
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Die als im erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet gefundenen
Arten von Propionibacterium sind Propionibacterium freudenreichii, Propioni:bacterium
shermanii und Propionibacterium technicum, da diese hohe Ausbeuten an Cobalaminen
liefern. Auch Propionibacterium intermedium ist geeignet, obgleich dieser Organismus
etwas niedrigere Ausbeuten liefert.
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Die anaeroben Bedingungen im Vergärungsmedium können erzielt werden,
indem ein nicht oxydierendes Gas, wie z. B. Stickstoff oder Kohlendioxyd, durch
das Medium hindurchgeleitet und/oder eine Atmosphäre eines solchen Gases oberhalb
des Mediums aufrechterhalten wird. Unter diesen-Bedingungen kann das Medium gerührt
werden, ohne daß die Gefahr besteht, daß Sauerstoff in das Medium eindringt. Das
Medium kann auch unter einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre ohne oder nur mit minimalem
Rühren gehalten werden, um zu vermeiden, daß Sauerstoff in das Medium hineingezogen
wird. Das letztere Verfahren ist besonders geeignet, wenn die Vergärung einmal begonnen
hat, da von Organismus gewöhnlich Kohlendioxyd gebildet wird und dieser zur Aufrechterhaltung
der anaeroben Bedingungen im Medium beiträgt.
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Das bevorzugte Verfahren besteht darin, daß ein nicht oxydierendes
Gas, wie z. B. Stickstoff oder Kohlendioxyd, durch das Medium hindurchgeleitet und
oberhalb des Mediums eine Atmosphäre dieses Gases mindestens während des Anfanges
der anaeroben Vergärungszeit aufrechterhalten wird.
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Wenn auch die Ausbeute an Cobalaminen gesteigert wird, wenn das Medium
mit Sauerstoff in Berührung gebracht wird, wenn etwa 10% des bei der vollständigen
Vergärung auftretenden Zellenwachstums unter anaeroben Wachstumsbedingungen stattgefunden
hat, so wird es bevorzugt, das Medium erst mit Sauerstoff in Berührung zu bringen,
wenn etwa 80 bis 100% des gesamten, bei der Vergärung auftretenden Zellenwachstums
stattgefunden hat, worauf die Vergärung dann fortgesetzt wird, bis die maximale
Ausbeute an Cobalaminen erhalten ist.
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Die Geschwindigkeit des Zellenwachstums kann bestimmt werden, indem
aufeinanderfolgende Zählungen der lebenden Zellen bei Vergärungen unter ähnlichen
Bedingungen durchgeführt werden. Die erforderliche Zeit zur Erzielung des gewünschten
Zellenwachstums variiert in gewissem Maß mit den Vergärungsbedingungen, wie z. B.
der Zusammensetzung des Mediums, Alter und Größe des Inoculums, Temperatur, px-Wert
und Stamm des Organismus. Bei einer Vergärung in einem Nährmedium der oben beschriebenen
Art bei etwa 30° C unter normalen Vergärungsbedingungen kann jedoch nach etwa 120
Stunden eine Erhöhung der Ausbeute an Cobalaminen erzielt werden, indem das Medium
nach etwa 24 bis 50 Stunden, wenn etwa 10% des gesamten Zellenwachstums stattgefunden
hat, bis zum Ende der Vergärung mit Sauerstoff in Berührung gebracht wird, obgleich
eine spätere Berührung mit Sauerstoff, z. B. nach 70 bis 100 Stunden, wenn 80 bis
100% des Zellenwachstums aufgetreten ist, meist höhere Ausbeuten liefert.
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Gewöhnlich sollen die anaeroben Bedingungen vorzugsweise für etwas
mehr als die Hälfte der gesamten Vergärungsdauer aufrechterhalten werden, bevor
das Medium mit Sauerstoff in Berührung gebracht wird.
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Wenn das Medium mit Sauerstoff oder einem sauerstoffhaltigen Gas in
Berührung gebracht wird, so werden vorzugsweise lieber mikroaerobe als aerobe Bedingungen
im Medium aufrechterhalten, da eine übermäßige Berührung mit Sauerstoff leicht die
Ausbeute an Cobalaminen verringern kann.
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Die gewünschten Bedingungen können erzielt werden, indem ein sauerstoffhaltiges
Gas, wie z. B. Luft, mit sehr geringer Geschwindigkeit durch das Medium hindurchgeleitet
wird, wenn eine wirksame Belüftungsvorrichtung, z. B. ein Diaphragma oder eine gesinterte
Platte großen Durchmessers, verwendet wird, oder mit etwas größerer Geschwindigkeit,
wenn eine weniger wirksame Belüftungsvorrichtung, z. B. ein offenes Rohr oder ein
Sprenkler, verwendet wird. Wird das Medium gerührt, so kann eine geringere Geschwindigkeit
der Sauerstoffzufuhr genügen. So wurde z. B. gefunden, d'aß im Vergleich mit einer
Vergärung,
die ausschließlich unter mikroaeroben Bedingungen durchgeführt
worden ist, eine ausgezeichnete Erhöhung der Ausbeute an Cobalaminen erzielt wird,
wenn man einen ungerührten, gärenden Ansatz von etwa 400001 belüftete, indem man
nach einer Vergärungszeit von etwa 80 Stunden 0,01 bis etwa 0,1 Vol. Luft/Vol. Medium/Minute
mittels eines Sprenklers hindurchleitete.
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Die beste Geschwindigkeit für die Sauerstoffzufuhr hängt mindestens
teilweise von der Art der Vorrichtung ab, durch welche der Sauerstoff oder das sauerstoffhaltige
Gas in das Medium eingeleitet wird, und ob das Medium gerührt wird. Dies kann leicht
bestimmt werden, indem man den Cobalamingehalt von vergorenen Produkten, die in
ähnlichen Vergärungen mittels anderer Belüftungsgeschwindigkeiten erhalten wurden,
untersucht.
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In einem anderen Verfahren wird das Medium mit Sauerstoff in Berührung
gebracht, indem dieses unter einer Atmosphäre eines sauerstoffhaltigen Gases heftig
gerührt wird. Durch das Rühren wird das Gas in das Medium hineingezogen und darin
gut verteilt. Das Maß der Belüftung hängt von der Geschwindigkeit des Rührens und
der Anbringung der Flächen des Rührers ab, die nach Wunsch geregelt werden können.
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Die Cobalamine, z. B. Cyäncobalamin, können nach Beendigung der Vergärung
gewonnen werden, indem die Bakterienzellen von der vergorenen Flüssigkeit abgetrennt,
die abgetrennten Zellen zur Freisetzung der Cobalamine mit einer wäßrigen Säure
behandelt und dann die Cobalamine durch abwechselnde Extraktionen mit organischen
und wäßrigen Lösungen gereinigt werden. Werden die festen Cobalamine gewünscht,
so können sie durch Ausfällen aus einer wäßrigen Lösung durch Zugabe eines nicht
lösenden Mittels, z. B. Aceton, erhalten werden.
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Werden nur ungereinigte Cobalamine gewünscht, z. B. als Tierfutterzusätze,
so kann das vergorene Produkt getrocknet und in dieser Form verwendet werden.
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Die folgenden Beispiele veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren.
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Beispiel 1 Drei Vergärungsgefäße A, B und C wurden mit dem folgenden
Nährmedium beschickt: Getreideweichflüssigkeit - 315 mg Stickstoff/ 100 ccm Medium
Glucose (wasserfrei, getrennt sterilisiert) = 10% Gew./Vol. Kobalt (als Co C12 *
6 H2 O) = 2,7 Teile/Million Teile Medium Das Medium in den Gefäßen wurde mit P.
freudenreichii beimpft und die Vergärung unter den unten beschriebenen Belüftungsbedingungen
bei einer Temperatur von 30° C durchgeführt, wobei das Medium in den Gefäßen unter
einer Atmosphäre von Luft gelialten und nur mit solch einer Geschwindigkeit gerührt
wurde, daß die Feststoffe gleichmäßig suspendiert waren, wodurch im Medium praktisch
anaerobe Bedingungen vorliegen. Während der Vergärung wurde durch Zugabe des erforderlichen
wäßrigen Ammoniaks der pH-Wert des Mediums auf etwa 7 gehalten.
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Gefäß A wurde 120 Stunden ohne Belüftung während der gesamten Vergärungszeit
gären gelassen. Gefäß B wurde nach 70 Stunden bis zum Ende der Vergärung nach etwa
120 Stunden durch ein offenes Rohr mit einem inneren Durchmesser von einem Zweihundertstel
des Vergärungsgefäßes mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 Vol./Vol. Medium/Minute
belüftet.
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Gefäß C wurde nach 70 Stunden bis zum Ende der Vergärung mit reinem
Sauerstoff durch eine ähnliche Vorrichtung wie bei Gefäß B mit einer Geschwindig=
keit von 0,1 Völ. Sauerstoff/Vol. Medium/Minute belüftet.
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Nach Beendigung der Vergärung wurde der Cobalamingehalt der Vergärungen
unter Verwendung von Ochromonas malhamensis als Testorganismus untersucht.
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Gefäß A lieferte 4,6 Mikrogramm Cobalamin/ccIn Medium, Gefäß B lieferte
11,0 Mikrogramm Cobalamin/ccm Medium, und Gefäß C lieferte 19,1 Mikrogramm Cobalamin/ccm
Medium.
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Beispiel 2 Zwei Vergärungsgefäße A und B wurden mit folgendem Nährmedium
beschickt: Getreideweichflüssigkeit - 315 mg Stickstoff/ 100 ccm Medium Glucose
(wasserfrei, getrennt sterilisiert) = 10°/o Gew./Vol. Kobalt (als Co C12 -6 H20)
- 5Teile/Million Teile Medium Das Medium in den Gefäßen wurde mit einer Kultur P.
freudenreichii beimpft und die Vergärung, wie unten beschrieben, bei 30° C durchgeführt.
Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zugabe des erforderlichen wäßrigen Ammoniaks
auf etwa 7 gehalten.
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Gefäß A. Das Medium wurde während der Vergärungszeit von 120 Stunden
unter einer Atmosphäre von Luft (jedoch ohne andere Belüftung) heftig gerührt, um
mikroaerobe Bedingungen im Medium zu schaffen.
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Gefäß B. Oberhalb des Mediums wurde Stickstoff eingeführt und ein
leichter positiver Druck dieses Gases 82 Stunden oberhalb dieses Mediums aufrechterhalten.
Das Medium wurde in Abständen langsam gerührt.
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Nach 82 Stunden Vergärungszeit wurde das Medium fortlaufend gerührt
und mit Sauerstoff in Berührung gebracht, indem Luft durch ein offenes Rohr hindurchgeleitet
wurde. Diese Bedingungen wurden bis zum Ende der Vergärung nach 120 Stunden aufrechterhalten.
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Die Untersuchung des vergorenen Produktes ergab eine maximale Ausbeute
von Cobalaminen für Gefäß A von 8,5 Mikrogramm/ccm Medium und für Gefäß B von 13,3
Mikrogramm/ccm.
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Beispiel 3 Drei Vergärungsgefäße A, B und C wurden mit etwa 340 1
des folgenden Mediums beschickt Getreideweichflüssigkeit - 315 mg Stickstoff/ 100
ccm Medium Glucose (wasserfrei, getrennt sterilisiert) = 10% Gew./Vol. Kobalt (als
Co C12 .61120) = 5 Teile/Million Teile Medium Es wurde beimpft: Gefäß A mit einer
Kultur P. shermanii, Gefäß B mit einer Kultur P. technicum und Gefäß C mit einer
Kultur P. freudenreichii.
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Das Medium in allen Gefäßen wurde während der ersten 80 Stunden Vergärungszeit
nicht gerührt und
unter einer Stickstoffatmosphäre bei einem leichten
positiven Druck gehalten (0,14 kg/qcm).
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Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zugabe des erforderlichen wäßrigen
Ammoniaks ständig auf etwa 7 gehalten.
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Nach 70 Stunden Vergärungszeit wurde das Medium in den Gefäßen gerührt
und Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Vol./Vol. Medium/Minute bis zur Beendigung
der Vergärung nach 168 hindurchgeleitet.
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Der Cobalamingehalt des vorgorenen Produktes wurde mikrobiologisch
unter Verwendung von Ochromonas malhamensis und chemisch durch das Verfahren von
R u d k i n und T a y 1 o r untersucht.
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Die Ergebnisse waren wie folgt: Gefäß A (P. shermanii) ....
23 Mikrogramm Cobalamine/ccm Medium Gefäß B (P. technicum) .... 22 @lilzrogramm
Cobalamine/ccm Medium Gefäß C (P. freudenreichii) 21 Mikrogramm Cobalamine/ccm Medium
Vergleichsweise wurde ein ähnliches Medium in drei Vergärungsgefäßen mit denselben
Organismen beimpft und dann die Vergärung unter den gleichen Bedingungen andauern
gelassen mit der Ausnahme, daß das :Medium nicht belüftet und gerührt wurde, wodurch
während der gesamten Vergärungsdauer im Medium anaerobe Bedingungen vorlagen.
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Die maximalen Ausbeuten an Cobalaminen betrugen P. shermanii
.... 1,8.Milcrogramm/ecm :Medium P. technicum .... 2,6 Mikrogramm/ccm
Medium P. freudenreichii 2,7 Mikrogramm/ccm Medium Beispiel 4 In einem Vergärungsgefäß
wurden etwa 22501 eines im Beispiel 3 beschriebenen Mediums angesetzt und mit einer
Kultur von P. freudenreichii beimpft.
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Die Vergärung wurde 90 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre bei
einem geringen positiven Druck unter langsamem Rühren des Mediums (33 Umdr./ Min.),
wodurch im Medium anaerobe Bedingungen geschaffen wurden, durchgeführt, wonach 80
bis 900/0 des gesamten Zellenwachstums erfolgt war.
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Nach 90 Stunden Vergärungszeit wurden weitere 2% Gew./Vol. Glucose
zugegeben und das Medium belüftet, indem Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,05
Vol./Vol. Medium/Minute hindurchgeleitet wurde. Die Rührgeschwindigkeit blieb unverändert.
und die Vergärung dauerte weitere 78 Stunden, wonach das vergorene Produkt mikrobiologisch
unter Verwendung des Organismus Ochromonas malhamensis und chemisch durch die Methode
von Rudkin und T ay 1 o r untersucht wurde.
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Der Cobalamingehalt betrug 20 Mikrogramm/ccm Medium.
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Beispiel 5 In einem Vergärungsgefäß wurden etwa 3401 des folgenden
Mediums angesetzt: Getreideweichflüssigkeit - 78 mg Stickstoff/ 100 ccrn Medium
Getrocknete autolysierte Hefe = 237 mg Stickstoff/ 100 ccm Medium Glucose (wasserfrei,
getrennt sterilisiert) _ -10% Gew./Vol. tsobalt (als Co C12 ' 6 H20) = 5 Teile/Million
Teile Medium Das Medium wurde mit einer Kultur P. shermanii beimpft und die Vergärung
unter einer Luftatmosphäre, jedoch ohne Rühren andauern gelassen, um 24 Stunden
lang praktisch anaerobe Bedingungen zu schaffen, worauf das Medium schnell (195
Umdr./ Min.) gerührt und so weitere 120 Stunden mit Luft in Berührung gebracht wurde.
Der pH-Wert des Mediums wurde durch Ammoniakzugabe auf etwa 7 gehalten. Das vergorene
Produkt wurde dann mikrobiologisch und chemisch untersucht und enthielt 10 Mikrogramm
Cobalamine pro ccm Medium, was - obgleich es niedriger als die Ausbeute dieses Organismus
unter den Bedingungen gemäß Beispiel 3 ist -dennoch größer ist, als wenn die Vergärung
ausschließlich unter mikroaeroben Bedingungen durchgeführt würde.
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Beispiel 6 Zwei Vergärungsgefäße A und B wurden mit 7 1 des folgenden
Nährmediums beschickt: Gefäß A Fleischextrakt - 630 mg Stickstoff/ 100 cctn Medium
Glucose (wasserfrei, getrennt sterilisiert) = 10% Gew./Vol. Kobalt (als Co C12 *
6 Hz O) = 2,75 Teile/Million Teile Medium Gefäß B Autolysiertes Penicilliummycel
(etwa 2 Tage bei 37° C autolvsiert und filtriert; das Filtrat wurde verwendet) -
315 mg Stickstoff; 100 ccm Medium Glucose (wasserfrei, getrennt sterilisiert) =
10% Gew./Vol. Kobalt (als Co Cl, - 6 H20) = 2,75 Teile/Million Teile Medium Die
Medien wurden mit einem Stamm P. freudenreichii beimpft und die Vergärung unter
anaeroben Bedingungen 80 Stunden fortdauern gelassen, wonach etwa 80% des gesamten,
in der Vergärung auftretenden Zellenwachstums stattgefunden hatte; dann wurde Luft
mit einer Geschwindigkeit von 3,51/Min. bis zum Ende der Vergärungszeit von 118
Stunden durch das Medium hindurchgeleitet.
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Der px-Wert des Mediums wurde durch Zugabe des erforderlichen wäßrigen
Ammoniaks auf etwa 7 gehalten.
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Die maximalen Ausbeuten an Cobalaminen pro ccm Medium betrugen in
Gefäß A . . . . . . . . . . . . . . . . : . . 7,4 Mikrogramm -Gefäß B . . . . .
. . . . . . . . . . .... 11,4 Mikrogramm Vergleichsweise wurden -gleichzeitig
ähnliche Vergärungen durchgeführt, wobei unter einer Luftatmosphäre gerührt wurde;
um während der gesamten Vergärungszeit mikroaerobe Bedingungen zu schaffen. Die
maximalen Cobalaminausbeuten aus diesen Vergärungen -betrügen 4,0 im Fall des Fleischextraktmediums
und 6,6 Mikrogramm/ccm Medium im Fall des das Penicilliummycelautolvsat enthaltenden
Mediums.
Beispiel 7 In einem Vergärungsgefäß wurde das folgende
Nährmedium angesetzt: Getreideweichflüssigkeit = 315 mg Stickstoff/ 100 ccm Medium
Lactose (wasserfrei, getrennt sterilisiert) = 10% Gew./Vol. Medium Kobalt (als C0C12
- 6H20) = 2,75 Teile/Million Teile Medium Das Medium wurde mit einem Stamm P. shermanii
beimpft und die Vergärung unter Stickstoff bei einem leichten positiven Druck 82
Stunden bei 30° C andauern gelassen. In der ersten Stunde der Vergärungszeit wurde
außerdem Stickstoff mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Vol./Vol. Medium/Minute durch
das Medium hindurchgeleitet.
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Nach 82 Stunden Vergärungszeit wurde Luft mit einer Geschwindigkeit
von etwa 0,5 Vol./Vol. Medium Minute bis zum Ende der Vergärung nach 142 Stunden
durch das Medium hindurchgeleitet.
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Während der gesamten Vergärung wurde der p$-Wert durch Zugabe des
erforderlichen wäßrigen Ammoniaks auf etwa 7 gehalten.
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Nach Untersuchung mittels Ochromonas malhamensis betrug die maximale
Ausbeute an Cobalaminen 13 Mikrogramm/ccm Medium.
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Vergleichsweise wurde eine ähnliche Vergärung durchgeführt, bei welcher
während der gesamten Vergärungszeit durch heftiges Rühren des Mediums unter einer
Luftatmosphäre mikroaerobe Bedingungen aufrechterhalten wurden.
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Die maximale Ausbeute an Cobalaminen in dieser Vergärung betrug 5,8
Mikrogramm/ccm Medium. Beispiel 8 In einem Vergärungsgefäß wurden 71 des folgenden
Nährmediums angesetzt: Getreideweichflüssigkeit - 315 mg Stickstoff/ 100 ccm Medium
Invertierter Rohrzucker (getrennt sterilisiert) = 10°/o Gew./Vol. Kobalt (als Co
C12 - 6 H2 O) = 2,75 Teile/Million Teile Medium Das Medium wurde mit einem Stamm
von P. freudenreichii beimpft und die Vergärung 82 Stunden bei 30° C unter anaeroben
Bedingungen fortgesetzt, worauf Luft mit einer Geschwindigkeit von 3,5 1/Min. bis
zum Ende der Vergärung nach 118 Stunden durch das Medium hindurchgeleitet wurde.
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Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zugabe des erforderlichen wäßrigen
Ammoniaks auf etwa 7 gehalten.
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Die maximale Ausbeute an Cobalaminen betrug 16,7 Mikrogramm/ccm Medium.
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Vergleichsweise wurde eine ähnliche Vergärung unter heftigem Rühren
unter einer Luftatmosphäre durchgeführt, um während der gesamten Vergärungsdauer
mikroaerobe Bedingungen zu schaffen; die maximale Ausbeute betrug dabei 7,2 Mikrogramm
Cobalamine/ccm Medium. Beispiel 9 Ein Vergärungsgefäß wurde mit etwa 43 0001 eines
Nährmediums der folgenden Zusammensetzung beschickt: Getreideweichflüssigkeit -
41/z % Gew./Vol. Medium 315 mg Stickstoff/ 100 ccm Medium Glucose (wasserfrei, getrennt
sterilisiert) = 10% Gew./Vol. Medium Kobalt (als Co C12 « 6 H2 O) = 5 Teile/Million
Teile Medium Das Medium wurde mit einer Kultur P. freudenreichii beimpft und mit
Stickstoff durchgespült, indem dieses Gas mittels einer ringförmigen Vorrichtung
(Sprenkler) durch das Medium hindurchgeleitet wurde. Die Vergärung wurde etwa 82
Stunden bei 30° C unter einer Stickstoffatmosphäre mit einem leichten positiven
Druck fortgesetzt.
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Während der Vergärung wurde der p11-Wert des Mediums durch Zugabe
des erforderlichen Ammoniaks auf etwa 7 gehalten.
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Nach 82 Stunden Vergärungszeit wurde das Medium belüftet, indem Luft
einer ringförmigen Vorrichtung (Sprenkler) mit einer Geschwindigkeit von 0,05 Vol./Vol.
Medium/Minute bis zur Beendigung der Vergärung nach 140 Stunden hindurchgeleitet
wurde.
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Das vergorene Medium wurde auf Cobalamine durch biologische Untersuchung
mittels Ochromonas malhamensis und chemisch mittels des Verfahrens von R u d k i
n und T a y 1 o r untersucht und enthielt 24,3 Mikrogramm Cobalamin/ccm Medium.
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Beispiel 10 Zwei Vergärungsgefäße A und B wurden mit 7 1 eines Nährmediums
der folgenden Zusammensetzung beschickt Getreideweichflüssigkeit - 315 mg Stickstoff/
100 ccm Medium Glucose (wasserfrei, getrennt sterilisiert) = 10% Gew./Vol. Kobalt
(als Co C12 * 6 H2 O) = 2,75 Teile/Million Teile Medium Das Medium in jedem Gefäß
wurde mit einem Stamm von P. freudenreichii beimpft und die Vergärung bei 30° C
unter den folgenden Bedingungen fortgesetzt. Der p11-Wert des Mediums wurde durch
Zugabe des erforderlichen wäßrigen Ammoniaks auf etwa 7 gehalten.
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Gefäß A. Die Vergärung wurde unter Luft durchgeführt und das Medium
während der gesamten Vergärungszeit von 118 Stunden heftig gerührt, damit zur Erzielung
mikroaerober Bedingungen Luft vom Medium aufgenommen wurde.
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Gefäß B. Die Vergärung wurde wie in Gefäß A ebenfalls 70 Stunden unter
Luft und heftigem Rühren durchgeführt; als etwa 80% des gesamten Zellenwachstums
aufgetreten waren, wurde Luft durch eine einzige Düse mit einer Geschwindigkeit
von 3,5 1/Min. durch das Medium hindurchgeleitet und dies fortgesetzt bis zum Ende
der Vergärungsdauer von 118 Stunden.
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Die maximale Ausbeute an Cobalaminen in Gefäß A betrug 7,7 Medium
und in Gefäß B
7,7 Mikrogramm/ccm Medium, was anzeigt, daß die Belüftung
nach 70 Stunden bei Aufrechterhaltung mikroaerober Bedingungen im Medium die Ausbeute
an Cobalaminen im Vergleich mit Vergärungen unter nur mikroaeroben Bedingungen nicht
erhöht.
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Beispiel 11 In einem Vergärungsgefäß wurden 71 des im vorangehenden
Beispiel beschriebenen Nährmediums angesetzt und mit einem Stamm von P. freudenreichii
beimpft. Die Vergärung wurde 46 Stunden bei 30° C unter anaeroben Bedingungen fortgesetzt,
bis etwa 10% des gesamten Zellenwachstums aufgetreten waren, worauf durch ein offenes
Rohr bis zum Ende der Vergärungszeit von 118 Stunden Luft mit einer Geschwindigkeit
von 3,5 1/Min. durch -das Medium hindurchgeleitet wurde. Der p11-Wert des
Mediums wurde während der gesamten Zeit durch Zugabe des erforderlichen wäßrigen
Ammoniaks auf etwa 7 gehalten.
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Die maximale Ausbeute an Cobalaminen betrug 11,6 Mikrogramm/ccm Medium.
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Vergleichsweise wurden ähnliche Vergärungen unter anaeroben und mikroaeroben
Bedingungen während der gesamten Vergärungszeit durchgeführt und lieferten maximale
Ausbeuten an Cobalaminen von 4,8 Mikrogramm/ccm Medium bzw. 6,8 Mikrogramm ccm Medium.
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Beispiel 12 Vier Vergärungsgefäße A, B, C und D wurden mit 71 eines
Mediums aus Glucose in einer Konzentration von 100% Gew./Vol. Medium und Kobalt
(als Co C12 - 6 H2 O) in einer Konzentration von 5 Teilen/ Million Teile Medium
und Getreideweichflüssigkeit der folgenden Konzentrationen beschickt: Gefäß A -
140 mg Stickstoff/100 ccm Medium Gefäß B - 175 mg Stickstoff/100 ccm Medium Gefäß
C = 245 mg Stickstoff/100 ccm Medium Gefäß D - 385 mg Stickstoff/100 ccm Medium
Die Medien in den Gefäßen wurden dann mit einer Kultur P. freudenreichii beimpft
und die Vergärung bei 30° C ohne Belüftung und unter Stickstoff bei einem leichten
pösitiven Druck 82 Stunden fortgesetzt, worauf etwa 80 bis 90% des gesamten Zellenwachstums
aufgetreten war. Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zugabe des erforderlichen wäßrigen
Ammoniaks auf etwa 7 gehalten. Nach 82 Stunden Vergärungszeit wurde Luft mit einer
Geschwindigkeit von 3,51/Min. durch das Medium hindurchgeleitet und dies bis zum
Ende der Vergärung nach 142 Stunden fortgesetzt.
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Nach Untersuchung mit den Organismen Ochromonals malhamensis enthielten
die Medien die folgenden maximalen Ausbeuten an Cobalaminen Gefäß A ......
11,3 Mikrogramm/ccm Medium Gefäß B ...... 13,1 Mikrogramm/ccm Medium Gefäß
C ....... 14,1 Mikrogramm/ccm Medium Gefäß D ...... 15,6 Mikrogramm/ccm
Medium