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Verfahren zur Herstellung von 5, 6-Dimethylbenzimidazolcobalamin
Der Ausdruck "Cobalamin" ist eine gebräuchliche Bezeichnung für eine Gruppe von Verbindungen, die Vitamin B12 und dessen Verwandte umfasst. Diese Bezeichnung wird gewöhnlich ergänzt durch Voranstellung des Namens derjenigen Base, deren Radikal im Nucleotidanteil des Moleküls enthalten ist ; so nennt man Vitamin-B12 z.B. 5,6-Dimethylbenzimidazol-cobalamin, weil im Vitamin-Bu-Molekül die
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sonst in ihrer Struktur vom Vitamin B12 nicht unterscheiden. Diese Purin-cobalamine werden auch als "Purin-Faktoren der Vitamin-B12-Gruppe" bezeichnet. Die wichtigsten dieser Vitamin-B ; Analoga sind :
Adenin-cobalamin (Pseudovitamin Bl,)
2-Methyladenin-cobalamin (Faktor A) 2-Methylmercaptoadenin-cobalamin.
DurchDesaminierungdieserFaktoren kann man die NH2-Gruppe des Purinanteils durch eine OH-Gruppe ersetzen, wodurch man drei weitere Purin-cobalamine erhält, deren Vorhandensein als Naturstoffe aber noch nicht sichergestellt ist. Es gibt weitere Vitamin-Bu-Analoga, die in ihrem Nucleotidanteil an Stelle von 5, 6-Dimethylbenzimidazol, wie im Vitamin B12, andere Benzimidazolbasen enthalten, Man nennt sie"Benzimidazol-cobalamine" (auch als "Benzimidazol-Faktoren der Vitamin-B,. Gruppe" bezeichnet).
Das wichtigste derartige in der Natur vorkommende Benzimidazol-cobalamin ist der Faktor III, der als Base 5-Hydroxy-benzimidazol enthält.
Die Purin-cobalamine besitzen nur eine begrenzte biologische Wirksamkeit, indem sie wohl gegen- über gewissen Mikroorganismen, wie E. coli 113-3, L. leichmannü 313, L. lactis Domer etc. aktiv sind, nicht aber oder in nur geringem Mass gegenüber Ochrom. malhamensis. Gegenüber dem tierischen Organismus sind sie inaktiv, d. h. sie vermögen nicht, das Wachstum von Küken oder andern Tieren aufrecht zu erhalten, wie dies für Vitamin Bu und in geringerem Mass auch für andere Vitamine der Bu-Gruppe zutrifft, soweit sie als Base ihres Nucleotidanteils ein Benzimidazolderivat enthalten. Ferner haben sich die genannten Purin-cobalamine - soweit bisher geprüft-bei der perniciösen Anämie als unwirksam erwiesen.
Sie wurden daher auch als "Pseudovitamin-B12-Faktoren" oder "Pseudo-Faktoren der Vitamin-B- -Gruppe" Gruppe" bezeichnet. Diese Purin-cobalamine sind in der Natur recht weit verbreitet. Sie entstehen, soweit bisher bekannt, vor allem bei anaeroben Gärprozessen, so besonders im Verdauungstrakt (Darm, Pansen) und bei der Abwasserreinigung durch Ausfaulung von Klärschlamm, also einem Prozess, der überall in grösstem Ausmass durchgeführt wird. Bei der Gewinnung von Vitamin B12 aus Faulschlamm fallen diese Purin-cobalamine daher stets in erheblichen Mengen als Nebenprodukte an. Infolge ihrer begrenzten biologischen Aktivität konnten sie bisher noch nicht nutzbringend verwertet werden.
Von den in der Natur vorkommenden Benzimidazol-cobalaminen findet sich das wichtigste, nämlich Faktor III, neben Vitamin Bu. des Purinfaktoren und andern Vitamin-B12-ähnlichen Stoffen reichlich im Faulschlamm, aus dem es auch erstmalig gewonnen worden ist. (W. Friedrich und K. Bernhäuer, Angew.
Chemie 65, [ 1953], S. 627). Faktor III ist neben Vitamin B12 selbst das einzige, bisher in der Natur aufgefundene Vitamin-Bu -Analogon, das in qualitativer Hinsicht das gleiche Wirkungsspektrum besitzt wie Vitamin Bu'So ist es auch z. B. bei der perniciösen Anämie hoch aktiv (K. Bernhauer, Kj. Blumberger, P.
Pertrides, Arzneimittelforschung 5, [1955], S. 442), im Kükentest ist es jedoch schwächer wirksam als Vitamin B,
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Es wurde nun gefunden, dass man mit Hilfe von Mikroorganismen überraschenderweise eine direkte Umwandlung von nukleotidhaltigen Cobalaminen, deren Nukleotidanteil eine von 5, 6-Dimethylbenzimid- - azol verschiedene Base aufweist, in 5, 6-Dimethylbenzimidazol-cobalamin (Vitamin B.) bewerkstelligen kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von 5, 6-Dimethylbenzimidazol-cobalamin ist dadurch gekennzeichnet, dass man in Wachstum begriffene Arten von Propionibacterium oder Streptomyces in einem Kulturmedium auf ein nukleotidhaltiges Cobalamin, dessen Nucleotidanteil eine von 5, 6-Dimethylbenzimidazol verschiedene Base aufweist, insbesondere auf ein Purin-oder Benzimidazolcobalamin in Gegenwart von 5, 6-Dimethylbenzimidazol einwirken lässt.
Zweckmässig wird das erfindungsgemässe Verfahren in der Weise durchgeführt, dass man die genannten Mikroorganismen, besonders Propionsäurebakterien, in einem üblichen Nährmedium wachsen und gären lässt, wobei man das umzuwandelnde nukleotidhaltige Cobalamin und 5, 6-Dimethylbenzimidazol zusetzt. Die betreffenden Stoffe werden durch die Bakterienzellen, in denen die Umwandlung vor sich geht, aufgenommen. Die Umwandlung besteht darin, dass die betreffende von 5, 6-Dimethylbenzimidazol verschiedene Base beseitigt und durch die zugesetzte 5, 6-Dimethylbenzimidazolbase ersetzt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die folgende :
In einem Medium, das die erforderlichen Nährstoffe, wie vor allem Zucker, ein Aminosäurengemisch, Phosphate und andere Nährsalze, enthält, lässt man z. B. eine Kultur von Propionibacterium shermanii wachsen. Nach etwa 2-tätiger Bebrütung bei 28-30 C setzt man dem Gärmedium das umzuwandelnde nukleotidhaltige Cobalamin (z. B. einen Purinfaktor, Faktor III oder ein Gemisch solcher Faktoren) - auch in rohem, also ungereinigtem Zustand - sowie 5, 6-Dimethylbenzimidazol zu. Die Konzen-
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5-20 mg, die an 5, 6-Dimethylbenzimidazol etwa 20-40 mg/l. Durch weiteren Zusatz von Glukose zum Nährmedium und Regelung des PH-Wertes auf etwa 6, 5 hält man den Gärprozess einige Tage in Gang.
Nach Beendigung des Gärprozesses wird die Gärbrühe zentrifugiert, wobei man erforderlichenfalls auf einen PH-Wert von etwa 4-4, 5 einstellt. Die abgeschleuderte und gegebenenfalls mit Wasser gewaschene Bakterienmasse wird in der Hitze (z. B. bei 80-110 C) mit Wasser extrahiert. Man erhält dabei einen bereits orangerot gefärbten Extrakt. Dieser wird mit Aktivkohle behandelt. Das Kohleadsorbat wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert und in üblicher Weise, z. B. mit einem wässerigen Alkohol, eluiert.
Das so erhaltene Eluat hat bereits die typische, rein rote Farbe des Vitamins B Man kann aus demselben sehr leicht in üblicher Weise kristallisiertes Vitamin B12 gewinnen.
Wenn die umzuwandelnden nukleotidhaltigen Cobalamine dem Kulturmedium in zu hoher Menge zugesetzt werden, kann es vorkommen, dass sie bei der Gärung nicht vollständig in der gewünschten Weise umgewandelt werden. Dies erkennt man daran, dass im Kulturfiltrat nach Abtrennung der Bakterienmasse eine resiliche"B-Aktivität"verbleibt (z. B. ermittelt durch den Testmit E. coli oder L. leichmanii).
Diese Aktivität ist auf das Vorhandensein von Resten von Purin-bzw. Benzimidazol-cobalaminen, wie Faktor III, zurückzuführen, die also von den Bakterien nicht aufgenommen wurden, wogegen die von den Zellen assimilierten Anteile praktisch quantitativ umgewandelt werden. Man kann nun die im Kulturfiltrat verbliebenen Mengen an Purin- bzw. Benzimidazol-cobalaminen dadurch völlig verwerten, dass man das Kulturfiltrat nach weiterem Zusatz von Zucker einer erneuten Gärung mit den gleichen Bakterien unterwirft, wobei man im Prinzip ebenso vorgeht, wie bereits beschrieben wurde.
Zur technischen Verwirklichung des erfindungsgemässen Verfahrens kann besonders von der Vitamin-
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Form eines Bentonit- oder Kohleeluates, her, das z. B. neben den Purin-cobalaminen auch Vitamin B selbst und andere Benzimidazol-cobalamine enthält. In einem solchen Fall kann man das vorliegende Verfahren besonders erfolgreich anwenden, da durch den Gärprc zess in Gegenwart von 5, 6-Dimethylbenz- imidazol sowohl die Purin-cobalamine als auch sämtliche Benzimidazol-cobalamine in 5, 6-Dimethylbenzimidazol-cobalamin (Vitamin Bl.) umgewandelt werden. Dadurch wird nicht nur dessen Ausbeute erhöht, sondern es liegt nun ein einheitliches Material vor, dessen chromatographische Trennung sich er- übrigt.
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Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt ferner noch folgenden sehr willkommenen technischen Vorteil : Die nukleotidhaltigen Cobalamine werden von den Bakterienzellen aufgenommen und in diesen in Gegenwart von 5, 6-Dimethylbenzimidazol in Vitamin B12 umgewandelt, das in den Zellen gespeichert wird. Dies ermöglicht eine einfache Gewinnung von Vitamin B, indem man die Bakterienzellen abschleudert und aus ihnen das Vitamin B., isoliert.
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man dieselbe nur zu trocknen. Das so erhältliche Trockenprodukt besitzt einen relativ sehr hohen Gehalt an Vitamin B12'nämlich in der Regel weit über 100 mg je kg. Man kann es daher mit andern geeigneten Futtermitteln, wie Sojamehl, Kleie, usw., vermischen und so auf den gewünschten Vitamin-Bu-Gehalt einstellen.
Selbstverständlich ist ein nach den vorliegenden Verfahren erzeugtes Zusatzfuttermittel weitaus wertvoller als ein solches, das noch die Purin-cobalamine enthält.
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aus Faulschlamm anfallenden nukleotidhaltigen Cobalamine, die eine von 5, 6-Dimethylbenzimidazol verschiedene Base enthalten und für die man bisher entweder noch keine direkte Verwendung gefunden hat oder welche für gewisse Verwendungszwecke weniger geeignet sind als Vitamin But2, nunmehr unmittelbar in Vitamin B. umwandeln und so nutzbringend verwerten kann.
Einzelheiten über die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind aus nachfolgenden Ausführungsbeispielen ersichtlich, in welchen alle Temperaturen in Celsiusgraden angegeben sind.
Beispiel 1 : Man sterilisiert in üblicher Weise (30min bei 120 ) 101 eines Mediums, das pro l folgende Bestandteile enthält und auf PH 6,7 eingestellt ist :
Säurehydrolysiertes Kasein, entsprechend 1, 1 g Stickstoff
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gMgClz. 6HzO 0, 4 g
FeSO,. 7H20 10 mg
Ca-Pantothenat 4 mg
Biotin 0, 3 mg
Technische Glukose 10 g
Sodann beimpft man mit 1 1 einer Vorkultur von Propionibacterium shermanii im gleichen Medium, das aber noch 5 cm3 Hefeextrakt je 1 enthält, und bebrütet unter anaeroben Bedingungen bei 28-300.
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Lösung Voncobalamin) und 200 mg 5, 6-Dimethylbenzimidazol zu.
Während des Gärprozesses fügt man von Zeit zu Zeit sterile Glukoselösung zu, um die Gärung in Gang zu halten, und regelt durch Zugabe von gesättigter Natriumcarbonatlösung den pH-Wert auf 6, 6. Nach einer Gärdauer von 6 Tagen ist der Gärprozess beendet. Man säuert durch Zusatz von Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4, 0 an, wodurch die Bakterien zum Sedimentieren gebracht werden. Durch Abschleudern erhält man 250 g Bakterienmasse mit einem Trockensubstanzgehalt von 3rP/o. Die feuchte Bakterienmasse wird mehrmals unter Druck bei 1100 mit Wasser extrahiert, wobei man insgesamt 2, 5 1 orangeroten wässerigen Extrakt erhält.
Diesem setzt man nach dem Erkalten unter Rühren 25 g Aktivkohle zu, saugt diese über Kieselgur ab und eluiert das Kohleadsorbat wiederholt bei Siedetemperatur mit einer Mischung aus 70 Volumteilen Isopropanol, 25 Teilen Wasser und 5 Teilen Benzol so lange, bis das Eluat praktisch farblos ist. Man erhält so 11 eines rein rot gefärbten Eluates, das im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt wird. Man gewinnt daraus in üblicher Weise 41 mg kristallisiertes Vitamin B,.
Beispiel 2: Man geht in gleicher Weise vor wie im Beispiel 1 beschrieben, nur mit dem Unterschied, dass als Purin-cobalamin 75 mg Faktor A verwendet und 300 mg 5, 6-Dimethylbenzimidazol zugesetzt werden. Nach 7-tägiger Gärdauer, bei sonst gleichartigem Gärverlauf, gewinnt man in derselben Weise 65 mg kristallisiertes Vitamin Bol2.
Beispiel 3 : Man verfährt ebenso wie im Beispiel 1, nur mit dem Unterschied, dass man 1/10 des dort angeführten Volumens verwendet und als Purin-cobalamin 4 mg des 2-Methylmercaptoadenin-cobalamin-Analogons zusetzt. An 5, 6-Dimethylbenzimidazol verwendet man 20 mg. Die Gärung wird gleich wie im Beispiel 1 in Gang gehalten. Nach 6-tägiger Bebrütung gewinnt man bei der Aufarbeitung der Bakterienmasse eine gereinigte Lösung, die gemäss der papierchromatographischen Prüfung und spektrophotometrischen Ausmessung 3, 2 mg an Vitamin B12 enthält.
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Beispiel 4 : Aus einem bei der Ausfaulung von Hefeabwässem anfallenden Faulschlamm gewinnt man in üblicher Weise durch Erhitzen und Beseitigung der Feststoffe durch Abzentrifugieren einen wässe- rigen Extrakt. Zu 100 1 dieses Extraktes, der beim Test mit E. coli eine Vitamin-B -Aktivität von 4,2 mg/1 und beim Test mit Ochromonas malhamensis eine solche von 1, 6 mg/l zeigt, gibt man 1 kg Glukose und sterilisiert in üblicher Weise.
Sodann beimpft man mit 101 einer Vorkultur von Propionibacterium shermanii, die in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium gezüchtet worden ist, und bebrütet unter anaeroben Bedingungen bei 28-30 . Nach 2-tägiger Gärung setzt man der G rf1üssigkeit eine sterile Lösung von 2 g 5, 6-Dimethylbenzimidazol zu und hält den Gärprozess durch zeitweisen Zusatz von steri- ler Glukoselösung und Regelung des PH-Wertes auf 6, 6 durch Zugabe von konzentrierter Sodalösung 6 Tage lang in Gang.
Die Ermittlung der Vitamin-Bl1-Aktivität im Test mit Ochromonas malhamensis ergibt nun einen Wert von 3, 8 mg/l. Dies ist ein Zeichen dafür, dass die ursprünglich vorhandenen Purin-cobalamine (die wohl gegenüber E. coli, nicht aber gegenüber Ochromonas malhamensis aktiv sind) praktisch verschwunden und in Vitamin B12 übergeführt sind. Auch die nähere chemische Untersuchung zeigt, dass bei der papierchromatographischen und elektrophoretischen Prüfung einer aus einer Probe in reiner Form isolierten Bu-Fraktion praktisch keine Purin-cobalamine mehr nachgewiesen werden können.
Die weitere Aufarbeitung der Garflüssigkeit erfolgt in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise. Man setzt der Gärflüssigkeit Schwefelsäure zu, bis ein pH-Wert von 4, 0 erreicht ist. Die hiebei ausgeflockten Bakterien werden durch Abzentrifugieren abgetrennt. Man erhält so 2, 6 kg Bakterienmasse mit einem Trockensubstanzgehalt von 30%. Aus der feuchten Bakterienmasse gewinnt man, wie im Beispiel 1 beschrieben, 30 1 wässerigen Extrakt, den man mit 300 g Aktivkohle behandelt. Das durch Abzentrifugieren gewonnene Kohlenadsorbat eluiert man bei Siedetemperatur erschöpfend mit einer Mischung aus 70 Volumenteilen Isopropanol, 25 Teilen Wasser und 5 Teilen o-Dichlorbenzol.
Aus den vereinigten, rein rot gefärbten Eluaten (15 l) gewinnt man in üblicher Weise Vitamin B12'
Beispiel5 :MansterilisiertinüblicherWeise(30minbei120 )101einesMediums,dasje1folgende Bestandteile enthält und auf PH 6, 7 eingestellt ist : Säurehydrolysiertes Kasein, entsprechend 1, g Stickstoff
Mittels Trypsin verdautes Kasein, entsprechend 1, 6 g Stickstoff NaHPO4 1, 76 g
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gMgC. 6H20 0, 4 g FeS04'7Hp 10 mg
Hefeextrakt 3 g.
Technische Glukose 10 g
Sodann beimpft man mit 11 einer Vorkultur von Propionibacterium shermanii im gleichen Medium und bebrütet unter anaeroben Bedingungen bei 28-300. Nach 2-tägiger Gärung setzt man eine sterile Lösung von 50 mg Faktor III und 200 mg 5,6-Dimethylbenzimidazol zu. Während des Gärprozesses fügt man von Zeit zu Zeit sterile Glukoselösung zu, um die Gärung in Gang zu halten, und regelt durch Zugabe von gesättigter Natriumcarbonatlösung den PH-Wert auf 6, 6. Nach weiteren 2 Tagen setzt man nochmals 200 mg 5, 6-Dimethylbenzimidazol zu. Nach einer Gärdauer von 6 Tagen ist der Gärprozess beendet. Man säuert durch Zusatz von Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4, 0 an, wodurch die Bakterien zum Sedimentieren gebracht werden.
Durch Abschleudern erhält man 275 g Bakterienmasse mit einem Trockensubstanzgehalt von 300/0. Die feuchte Bakterienmasse wird mehrmals unter Druck je 10 min bei 1100 mit Wasser extrahiert, wobei man insgesamt 2, 6l orangeroten wässerigen Extrakt erhält. Diesen versetzt man nach demErkalten unter Rühren mit 26 g Aktivkohle, saugt diese über Kieselgur ab und eluiert das Kohleadsorbat wiederholt bei Siedetemperatur mit einer Mischung aus 70 Vol. -Teilen Isopropanol, 25 Teilen Wasser und 5 Teilen Benzol so lange, bis das Eluat praktisch farblos ist. Man erhält so 11 eines rein rot gefärbten Eluates, das im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt wird. Man gewinnt daraus in üblicher Weise 32 mg kristallisiertes Vitamin B12.
Es wurde durch Ermittlung seiner Eigenschaften, besonders des elektrophoretischen Verhaltens bei PH 11 identifiziert, also unter Bedingungen, unter denen Vitamin B neutral ist, während Faktor III anodisch wandert (s. dazu W. Friedrich und K. Bemhauser : Chem. Ber. 90, [ 1957), S. 154). Ferner wurde seine Identität auch papierchromatographisch unter Benutzung der üblichen Entwicklungssysteme bestätigt.
Beispiel 6 : 100 1 einer wässerigen Lösung, die man durch Erhitzen von Faulschlamm und Beseitigung der Feststoffe durch Abzentrifugieren in üblicher Weise erhält und die im Test mit E. coli eine Vi- tamin-B -Aktivität von 3, 8 mg/l zeigt und eine Mischung von Faktor III sowie Purin-cobalaminen enthält, werden mit. 1 kg Glukose versetzt und in üblicher Weise sterilisiert. Sodann beimpft man mit 10 1
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einer Vorkultur von Propionibacterium W. 10, die in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium gezüchtet worden ist. Man bebrütet unter anaeroben Bedingungen bei 28-300.
Nach 2-tägiger Gärung versetzt man mit einer sterilen Lösung von 2 g 5,6-Dimethylbenzimidazol und hält den Gärprozess durch zeitweisen Zusatz von steriler Glukoselösung und Regelung des PH-Wertes auf 6, 6 durch Zugabe von konzentrierter Sodalösung 6 Tage lang in Gang. Am viertenGärungstage setzt man nochmals 1 g 5, 6-Dimethylbenzimid- azol zu.
Die Aufarbeitung der Gärbrühe erfolgt in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise. Man versetzt die Gärbrühe mit Schwefelsäure, bis ein pH-Wert von 4, 0 erreicht ist. Die hiebei ausgeflockten Bakterien werden durch Abzentrifugieren abgetrennt. Man erhält so 2, 7 kg Bakterienmasse mit einem Trockensubstanzgehalt von 30%. Aus der feuchten Bakterienmasse gewinnt man, wie im Beispiel 1 beschrieben, 32 1 wässerigen Extrakt, den man mit 320 g Aktivkohle behandelt. Das durch Abzentrifugieren gewonnene
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gewinnt man in üblicher Weise Vitamin Bl.. Wie die nähere Untersuchung zeigt, ist der im ursprünglichen Medium enthaltene Faktor III nun verschwunden und in Vitamin bis umgewandelt.
Das gleiche gilt für die in dem Ausgangsmedium enthaltenen Purin-cobalamine.
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chlorid und 0, 1% Hefeextrakt enthält, werden in üblicher Weise sterilisiert und mit 2, 5% einer 48 Stunden alten Vorkultur des Streptomyces spec. ATCC 11072 im gleichen Medium beimpft. Sodann bebrütet man unter aeroben Bedingungen 5 Tage lang bei 280, wobei man 24 Stunden nach der Beimpfung 5 mg Faktor A und 40 mg 5, 6-Dimethylbenzimidazol zusetzt. Der PH-Wert. der vor der Beimpfung auf 7, 2 eingestellt worden war, beträgt bei Beendigung der Gärung 7, 4. Der Gäransatz wird dann mit so viel Cyanidlösung versetzt, dass die Konzentration an Cyanid 0, 05% beträgt, und 10 min auf 1100 erhitzt.
Das nach dem Abfiltrieren und Auspressen des Mycels erhaltene Filtrat wird 1/2 Stunde mit 1% Aktivkohle verrührt.
Die Abtrennung und Elution des Kohleadsorbates wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Nach Einengung des Eluates im Vakuum erhält man ein Eluatkonzentrat, das in bekannter Weise durch Phenolextraktion weiter gereinigt wird. Das so erhaltene, gereinigte Gemisch von Bu- Faktoren gibt bei der elektrophoretischen
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mit 2, 5% einer 48 Stunden alten Vorkultur des Streptomyces spec. ATCC 11072 im gleichen Medium. Sodann bebrütet man unter aeroben Bedingungen 5 Tage lang bei 280, wobei man 24 Stunden nach der Beimpfung 5 mg Faktor III und 40 mg 5, 6-Dimethylbenzimidazol zusetzt. Der PH-Wert, der vor der Beimpfung auf 7, 2 eingestellt worden ist, beträgt bei Beendigung der Gärung 7, 4.
Der Gäransatz wird dann mit so viel Cyanidlösung versetzt, dass er 0, 05% an Cyanid enthält, und 10 min auf 1100 erhitzt. Das nach dem Abfiltrieren und Auspressen des Mycels erhaltene Filtrat verrührt man während 1/2 Stunde mit 1% Aktivkohle. Das nach dem Absaugen über Kieselgur gewonnene Kohleadsorbat wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, erschöpfend eluiert. Nach Einengen im Vakuum wird das gewonnene Eluatkonzentrat in bekannter Weise durch Phenolextraktion weiter gereinigt. Das so gewonnene Gemisch von Viramin-B12-Faktoren ergibt bei der elektrophoretischen Trennung 33% an Vitamin B und 67% an unverändertem Faktor III.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von 5, 6-Dimethylbenzimidazolcobalamin, dadurch gekennzeichnet, dass man in Wachstum begriffene Arten von Propionibacterium oder Streptomyces in einem Kulturmedium auf ein nukleotidhaltiges Cobalamin, dessen Nukleotidanteil eine von 5, 6-Dimethylbenzimidazol verschiedene Base aufweist, in Gegenwart von 5, 6-Dimethylbenzimidazol einwirken lässt.