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Verfahren zur biosynthetischen Erzeugung von
Vitaminen der B12 - Gruppe
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biosynthetischen Erzeugung von Vitaminen der B12-Gruppe, das darin besteht, dass auf Ätiocobalamin (Vitamin B.-'Faktor I) und Benzimidazol oder einem der folgenden als Precursor wirkenden Stoffe wie 5-Methylbenzimidazol, 5, 6-Dimethylbenz- imidazol, 4, 6-Dimethylbenzimidazol, 5, 6-Diäthylbenzimidazol, 5-Chlor-6-Methylbenzimidazol, Benzimidazol-5-Carbonsäureamid, 1, 2-Diamino-4, 5-Dimethylbenzol, o-Phenylendiamin bzw. einem analogen Substitutionsprodukt, in Anwesenheit von Phosphaten Bakterien der Coli-aerogenes-Gruppe zur Einwirkung gelangen.
Wohl ist bereits der Hinweis bekannt, dass die Bildung von Vitamin B. mit Hilfe eines Streptomyces- Stammes durch einen Zusatz von 5, 6-Dimethyl-benzimidazol erhöht werden soll, doch ist der hiefür vorgesehene Konzentrationsbereich für technische Zwecke völlig ungeeignet. Ausserdem kann aus theoretischen Überlegungen vermutet werden, dass Derivate des o-Phenylendiamins biologische Vorstufen vonBenz- imidazolderivaten larstellen.
Das erfindungsgemässe Grundverfahren lässt sich in Form folgender drei Modifikationen durchführen :
1. Man lässt die Mikroorganismen in Gegenwart von Ätiocobalamin und einem der genannten, als Precursor wirkenden Stoffe wachsen.
2. Man gewinnt eine Mikroorganismenmasse (ruhende Zellen) und lässt sie auf eine Lösung von Ätiocobalamin und einem der genannten, als Precursor wirkenden Stoffe einwirken.
3. Man lässt Mikroorganismen, die selbst Ätiocobalamin zu bilden vermögen, in Gegenwart eines der genannten als Precursor wirkenden Stoffe wachsen oder gären.
Bei allen drei Modifikationen muss das biosynthetische Medium Phosphat enthalten, ausserdem kann man zu dem Medium noch d-Ribose zusetzen. In den Modifikationen 1 und 2 des Verfahrens wird Ätiocobalamin in isoliertem Zustand oder in Form einer rohen Lösung zugesetzt. Im Fall 3 kann man auf einen Zusatz von Ätiocobalamin. verzichten.
Die Gärung erfolgt mittels Bakterien der Coli-aerogenes-Gruppe. In den Fällen 1 und 3 muss ein Nährmedium angewendet werden, das eine gute Entwicklung oder Gärung des Mikroorganismus ermöglicht, während im Fall 2 das Medium, in dem die Biosynthese stattfindet, lediglich Ätiocobalamin, den Precursor, Phosphat und evtl. noch etwas d-Ribose enthalten muss.
Die Durchführung des Verfahrens nach der ersten Modifikation gestaltet sich im Prinzip folgender- massen : Man lässt einen geeigneten Mikroorganismus, wie z. B. E. Coli, in üblicher Weise in einem Medium wachsen, das eine Kohlenstoffquelle, wie z. B. Glukose, und die erforderlichen Nährsalze enthält. Ausserdem versetzt man die Nährlösung mit Ätiocobalamin in biologischen Konzentrationen, also in einer Menge von etwa 0, 1-0, 3 y je cm, entsprechend 10-30 y/0/0 und mit einem Precursor der Benzimidazol- reihe oder einer Vorstufe desselben in drei- bis zehnfachemmolaren Überschuss unter Berücksichtigung
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Das Ätiocobalamin kann aber auch z. B. in alkoholischer Lösung zugesetzt werden. In diesem Fall ist dessen Sterilisierung durch Hitze überflüssig. Ebenso können die erwähnten Benzimidazol-Derivate oder deren Vorstufen in alkoholischer Lösung zugefügt werden.
Bei Verwendung von E. Coli kann aber auch unter anaeroben bzw. fakultativ-anaeroben Bedingungen gearbeitet werden, da dieser Organismus auch unter diesen Bedingungen zu wachsen vermag. Sinngemäss sind stets solche Bedingungen zu wählen, die den Mikroorganismen angemessen sind.
Nach 8 bis 24 Stunden - je nach der Zuckerkonzentration, den Züchwngsoedingungen und nach der Art des verwendeten Mikroorganismus - ist der Prozess beendet. Nun wird die Fermentationsbrühe in an sich bekannter Weise aufgearbeitet, wobei man die jeweiligen biosynthetisch gebildeten Benzimidazolcobalamine erhält.
Bei der Durchführung des Verfahrens nach der zweiten Mcdifikation geht man grundsätzlich in der Weise vor, da) ? die Mikroorganismen zunächst in einem üblichen Nährmedium, das der Art der betreffenden Mikroorganismen angemessen ist, also ein gutes Wachstum ermöglicht, ohne weitere Zusätze vorgezüchtet und z. B. durch Zentrifugieren isoliert werden. Sodann lässt man in einem zweiten Prozess die so gewonnenen ruhenden Zellen auf eine Lösung von Ätiocobalamin und dem betreffenden Precursor in Phosphatpuffer bei z. B. 37 etwa 10 - 20 Stunden, z. B. unter Schütteln oder Rühren, einwirken.
Bei dieser Arbeitsweise können die umzusetzenden Stoffe in einer beträchtlich höheren Konzentration eingesetzt werden, da auch die Bakterienmasse in viel höherer Konzentration angewendet werden kann. In diesem Fall brauchen daher bei der Isolierung der biosynthetisch entstandenen Vitamin B12 -Fakt, mm nicht so grosse Flüssigkeitsmengen verarbeitet werden, wie bei der ersten Modifikation. Ferner hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei einer derartigen Arbeitsweise dem Medium d-Ribose zuzusetzen, die als Precursor bei der Biosynthese des Nucleotid-Anteiles der biosynthetischen Vitamin B -Faktoren wirkt, wodurch die Ausbeute an diesen noch gesteigert werden kann.
Bei der dritten Modifikation des Verfahrens geht man so vor, da man zu einer Fermentation von Mikroorganismen, die selbst Ätiocobalamin zu bilden vermögen, lediglich einen geeigneten Precursor der Benzimidazolreihe in einer Konzentration von z. B. 50-100 y/% zusetzt und im übrigen die Gärung in der üblichen Weise durchführt.
Das Verfahren nach den Modifikationen 1 und 3 kann auch in der Weise durchgeführt werden, dass das Wachstum und die Fermentation der Mikroorganismen kontinuierlich durchgeführt wird, indem man zur Züchtung der die Biosynthese vollziehenden Mikroorganismen ein Fermentationsgerät verwendet, das mit kontinuierlichem Zu- und Ablauf versehen ist. So kann man z. B. die kontinuierliche Züchtung von E. Coli mit einem Durchsatz von etwa 4 bis 5 Stunden bewerkstelligen, d. h. der Fermenterinhalt erneuert sich immer wieder innerhalb dieser Zeitspanne. Die kontinuierlich anfallende Gärbrühe kann dann fortlaufend verarbeitet werden.
Ferner kann man bei der Schlammausfaulung durch Methangärung einem kontinuierlich verlaufenden Prozess fcrtlaufend Precursor der Benzimidazolreihe zum Frischschlamm zusetzen und so das dabei entstehende Ätiocobalamin in Benzimidazolcobalamine umwandeln.
Ferner ist es auch möglich, durch solche Zusätze die Art der entstehenden Cobalamine wunschgemäss zu beeinflussen, also die Biosynthese der kompletten Cobalarrine so zu lenken, dass dabei die gewünschten Produkte entstehen.
Ferner kann man auch so vorgehen, dass man bei den Modifikationen l und 2 das Ätiocobalamin nicht in reiner Form, sondern in unreinem Zustand, also als Rohprodukt, oder in Mischung mit andern Cobalaminen neben sonstigen Verunreinigungen anwendet.
Die Gewinnung der nach dem geschilderten biosynthetischen Verfahren entstandenen BenzimidazolCobalamine erfolgt in prinzipiell bekannter Weise. Die Trennung des schliesslich vorliegenden Gemisches der fast reinen Vitamine der B12 -Gruppe erfolgt am besten durch Chromatographie an Cellulose (im Prinzip nach W. Friedrich und K. Bernhauer, Z. Naturforschg. lOb, 6,1955). In manchen Fällen empfiehlt sich eine nochmalige Chromatographie unter Verwendung von Aluminiumoxyd.
Zur Unterscheidung der verschiedenen biosynthetischen Vitamin -Faktoren können grunsätzlich die R-Werte, Rf-Werte und Verteilungskoeffizienten in bestimmten Lösungsmitteln ystemen herangezogen werden. Alterdings sind die R-Werte und Rf -Werte nicht immer ausreichend. Wohl aber sind ihre Verteilungskoeffizienten im System Wasser/p-Chlorphenol und Trichloräthylen und vor allem im System n-Butanol/Ammonsulfat und Wasser zumeist so stark verschieden, dass sie sich zur Unterscheidung und Charakterisierung der biosynthetischen Vitamin Zarten eignen.
Die Umwandlungsrate von Ätiocobalamin in Vitamine der B-Gruppe (Benzimidazol-CobaIamine) ist bei Verwendung von 5,6-Dimethylbenzimidazol besonders gut und kann z. B. bei der zweiten Modifikation des Verfahrens 80-90 % betragen. Ansonsten hängt die Umwandlungsrate des Ätiocobalamins
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von der Art des verwendeten Mikroorganismus, der Art der Versuchsdurchführung und von der angebotenen Benzimidazol-Art ab und ist daher, wie die Tabelle zeigt, lecht unterschiedlich. Ferner enthält die Tabelle die Merkmale zur Charakterisierung und Unterscheidung der auf biosynthetischem Weg gewonnenen neuartigen Vitamin -Faktoren.
Die biologische Aktivität der neuen Vitamin B12 -Arten ist sehr beträchtlich. Sie sind gegenüber L. Leichmannii und Ochromonas malhamensis wirksam, d. h. sie ermöglichen das Wachstum dieser Testorganismen. Als Beispiel wird in Fig. 1 die Wirksamkeit von Benzimidazol-cobalamin und 5-Methylbenzimidazol-cobalamin gegenüber Ochromonas malhamensis im Vergleich zu Vitamin B gezeigt. Die hohe antiperniziöse Wirkung, z. B. von 5-Methyl-benzimidazl-cobalamin wird in Fig. 2 veranschaulicht.
Das beschriebene Verfahren bietet die Möglichkeit, das bei der Gewinnung von kompletten Vita-
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Fermentationsprozessen entstehende Ätiocobalamin durch Zusatz von Benzimidazolen unmittelbar zu verwerten, ohne es erst zu isolieren, und es auf diese Weise in komplette Benzimidazol-cobalamine umzuwandeln.
Die Durchführung des neuen Verfahrens wird durch folgende Beispiele näher erläutert.
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1 : 51benzimidazol, werden 20 Minuten lang bei 1000 sterilisiert und anschliessend mit insgesamt 125 opt. E. Ätiocobalamin (in 70%figer alkoholischer Lösung) versetzt. Nach dem Beimpfen mit 5% einer Kultur der
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bei sich das Bakterium kräftig vermehrt.
Die gesamte Fermentationsbrühe wird sodann vereinigt und in an sich bekannter Weise weiter verarbeitet. Die Ausbeute an Vitamin B. beträgt gemäss der Ausmessung im Beckman-Spektrophotometer Modell DU 5, 76 opt. E. bzw. 4, 6%.
Beispiel 2 : 2, 5 l des gleichen Mediums wie im Beispiel 1, das jedoch insgesamt 15, 6 opt. E. an Ätiocobalamin und 10 y'% an 5, 6-Dimethyl-benzimidazol enthält, werden mit 5% einer Kultur des E. coli-Stammes I beimpft. Alle andern Versuchsbedingungen, wie Medium der Impfkultur, Art der Be- brütung und Dauer der Bebrütung sind die gleichen wie im Beispiel l. Die Analyse ergibt 2, 75 opt. E. an
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B12'daher20 γ/% Benzimidazol, werden 20 Minuten lang bei 1000 sterilisiert und anschliessend mit 83 opt. E. an Ätiocobalamin (in 70% i. ger alkoholischer Lösung) versetzt.
Nach dem Beimpfen mit 5% einer Kultur des E. coli-Stammes I in Pepton-Fleischextrakt-NaCl-Medium (15 Stunden lang bei 370 bebrütet) wird in einem kleinen Fermenter unter gleichzeitigem Rühren mit Hilfe eines Vibrationsmischers und Belüften (3 l Luft/Min.) die Züchtung 12 Stunden lang bei 370 vorgenommen. Nach der Verarbeitung der Fermentationsbrühe und chromatographischer Isolation des neuen Vitamin B.-Faktors liegt dieser in wässeriger Lösung in einer Menge von 23 opt. E., entsprechend einer Ausbeute von 27, 8%. vor.
Beispiel 4 : 20 l des gleichen Mediums wie im Beispiel 3, enthaltend 20 yl% 5-Methyl-benzimidazol werden wie üblich sterilisiert und mit 89, 2 opt. E. Ätiocobalamin (in 70tiger alkoholischer Lösung) versetzt. Die Impfkultur, die Art der Beimpfung und der Gärverlauf sind ebenso, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Analyse ergibt 25 opt. E. an 5-Methyl-benzimidazol-cobalamin, das entspricht einer Ausbeute von 28%.
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in der Coli wie zuvor zur Entwicklung gebracht. In gleicher Weise wird die Entwicklung sodann in 1 l und schliesslich in 5 l des gleichen Mediums vorgenommen. Im letzten Stadium wird die Vermehrung in einem kleinen Vorfermenter unter Belüftung durchgeführt.
Mit diesen 51 Coli-Kultur werden sodann 150 I eines Mediums beimpft, das 0, 5% techn. Glukose und die gleichen Salze wie im Beispiel 1, gelöst in enthärte-
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scher Lösung) und 20 y/% 5-Methyl-benzimidazol. In diesem Medium wird die Colt-Kultur unter Belüften (18 l Luft/Min.) und Rühren 12 Stunden lang bei 370C wachsen gelassen. Während die Ausgangs- brühe eineVitaminB -Aktivität von 0, 14 y je cm im Coli-Test zeigt und keine Aktivität gegenüber L. Leichmannii, besitzt die fermentierte Brühe eine Aktivität von 0, 09 -γ/cm3 im Test mit L. Leich- mannii.
Nach der Velarbeitung der Fermentationsbrühe ergeben sich 230 opt. E. des neuen Vitamin B Faktors. Er zeigt die in Tabelle 1 angeführten Merkmale, durch die er sich von andern Vitamin B-Arten unterscheidet. Bei der Prüfung des kristallisierten Produktes in einigen schweren Fällen von perniziöser Anämie zeigte er einen ausgezeichneten therapeutischen Effekt.
Beispiel 6 : 91 des modifizierten Da vis-Mediums von PH 6,9 der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 werden 30 Minuten bei 1000C sterilisiert und wie im Beispiel l mit 5% einer Vorkultur des E. coli-Stammes I beimpft. Die Vorkultur wird durch 8-stündige Bebrütung des Coli- Stammes bei 37 C
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bestehend(2 1 Luft je Minute) bei 370C 8 Stunden lang bebrütet, wobei lebhaftes Bakteriumwachstum stattfindet.
Dann wird die Bakterienmasse steril zentrifugiert, wobei 30 g Bakterienfeuchtnnasse mit einem Trockensubstanzgehalt von 39% erhalten wird.
Diese gewonnene Bakterienfeuchtmasse wirdin 1,5 1 sterilem Phosphatpuffer vom pH 7(1,05% K2HPO4 + 0, 45% KH PO) mit Hilfe eines Vibrators gut homogenisiert. Dann werden zu dieser Suspension insgesamt 48 opt. E.. Atiocobalamin (in 70% figer alkoholischer Lösung), 100 γ/% 5,6-Dimethylbenzimida zol und 200)'/0/0 d-Ribose zugesetzt. Die Suspension wird nun zu je 100 cm in 15 Stück 300 cm3 Erlenmayer- kolben verteilt. Anschliessend wird unter Schütteln 24 Stunden bei 370C bebrütet.
Die Analyse der nach Aufarbeitung der Fermentationsbrühe schliesslich erhaltenen wässerigen Fraktionen ergibt 19,4 opt. E. an Vitamin B12 und 3,86 opt. E. an unverbrauchtem Ätiocobalamin, entsprechend einerAusbeute von 40% an Vitamin B. Bezogen auf die Gesamtmenge an isolierten Cobalaminen liegen daher 83% in Form von Vitamin B (5,6-Dimethyl-benzimidazol-cobalamin) und 17% als unverbrauchtes Ätiocobalarrin vor.
Beispiel 7 : Es wird Bakterienmasse des gleichen E. coli-Stammes in der gleichen Menge wie im Beispiel 6 erzeugt und in derselben Weise wie im Beispiel 6 in sterilen Phosphatpuffer übergeführt. Nach Zusatz von 42 opt. E. Ätiocobalamin in 70% figer äthanolischer Lösung, 3 mg d-Ribose und 1, 5 mg 4, 6-Di-
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belle ersichtlich.
Beispiel 8 : Die Züchtung der Bakterienmasse und Überführung in sterilen Phosphatpuffer erfolgt in der gleichen Weise, wie im Beispiel 6 beschrieben. Nach Zusatz von 42 opt. E. Ätiocobalamin, 3 mg d-Ribose und 1, 5 mg 5,6-Diäthyl-benzimida zol wird 24 Stunden bei 37 C, wie zuvor beschrieben, be-
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5 opt. E.Beispiel 9 : Züchtung der Bakterienmasse und Überführung in sterilen Phosphatpuffer erfolgt wie im Beispiel 6 beschrieben. Nach Zusatz von 42 opt. E. Ätiocobalamin, 3 mg d-Ribose und 1,5 mg 5-Chlor- 6-methylbenzimidazol wird, wie zuvor beschrieben, 24 Stunden bei 370C behandelt. Ergebnis : 3,2 opt. E. an neuem Vitamin B12-Faktor (5-Chlor-6-methylbenzimidazol-cobalamin). Die Eigenschaften des neuen Faktors sind aus der Tabelle ersichtlich.
Beispiel 10 : Züchtung der Bakterienmasse und Überführung in sterilen Phosphatpuffer, wie im Beispiel 3 beschrieben. Nach Zusatz von 42 opt. E. Ätiocobalamin, 3 mg d-Ribose und 1, 5 mg Benzi- midazol-5-carbonsäureamid wird, wie zuvor beschrieben, 24 Stunden bei 370C behandelt. Als Ergebnis liegt der neue Vitamin B12-Faktor(Benzimidazol-5-carbonsäureamid-cobalamin)in reiner Form in wässeriger Lösung in einer Gesamtmenge von 9 opt. E. vor. Die Merkmale des neuen Faktors sind aus der Tabelle zu ersehen.
Beispiel 11: Züchtng der Bakterienmasse und Überführung in sterilen Phosphatpuffer, wie im Beispiel 6 beschrieben. Nach Zusatz von 42 opt. E. Ätiocobalamin, 3 mg d-Ribose und 1,5 mg 1, 2-Diamino-4, 5-dimethylbenzol wird, wie zuvor beschrieben, weitergearbeitet. Ergebnis : 9, 5 opt. E. an Vitamin B12'\, Merkmale s. Tabelle.
Beispiel 12: Eine grössere Menge Bakterienmasse des E. coli-Stammes I wird in folgender Weise erzeugt : In analoger Weise wie in Beispiel 5 wird eine Kultur des E. coli-Stammes 1 schrittweise vermehrt.
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dieser Impfkultur werden 5 l des gleichen Mediums beimpft und in einem kleinen Vorfermenter unter Belüftung 8 Stunden bei 370C bebrütet. Die so erhaltene Kultur dient zur Beimpfung von 150 1 Medium, bestehend aus 2% techs. Glukose, 5,1% NaH2PO4, 0,075% Na-citrat, 0,15% Ammonsulfat nd 0,015% Magnesiumsulfat (pH-Wert eingestellt auf 6,8). In diesem Medium wird die Coli-Kultur 8 Stunden lang bei 370C unter Belüftung (18 l Luft/Min.) zur Entwicklung gebracht. Dann wird die Bakterienmasse steril zentrifugiert.
Man erhält 1300 g Feuchtprodukt mit 30% Trockensubstanzgehalt.
800 g der so gewonnenen Bakterienfeuchtmasse werden in einer 20 1 Flasche zu 15 l sterilem Phosphatpuffer der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 6 hinzugefügt. Ausserdem setzt man 100 y/%
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bebrütet. Nach Reinigung der Fermentationsbrühe sowie Adsorption an Bentonit, erster Extraktion mit Phenol, Zinkfällung, zweiter Extraktion mit Phenol, p-Chlorphenol-Fällung, Chromatographie an Zellulose und Chromatographie an Aluminiumoxyd ergibt sich eine Ausbeute an 5,6-Diäthyl-benzimidazolcobalamin von etwa 5 mg.
Beispiel 13: 750 g einer in gleicher Weise, wie in Beispiel 12 beschrieben, gewonnenen Bakterienmasse des E. coli-Stammes I mit einem Trockensubstanzgehalt von 2950 werden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 12, in 15 l Phosphatpuffer suspendiert, der 100 γ/% Benzimidazol-5-carbonsäure- amid, 200 y/% d-Ribose und 420 opt. E. an Ätiocobalamin enthält. Unter Belüftung und Rühren mittels eines Vibrationsmischers wird, wie in Beispiel 12,24 Stunden bei 370C bebrütet. Bei der im Verlauf der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe durchgeführten zweiten Chromatographie an Zellulose entstehen 2 rote Banden. Die erste hat einen R-Wert von 0,11 (24 opt. E., 13% der Gesamtausbeute), die zweite einen R-Wert von 0, 06-0, 07 (13 opt.
E., 7% der Ausbeute). Nach nochmaliger Chromatographie an Aluminiumoxyd und Kristallisation ergibt sich, dass die Substanz, die in der Zellulosesäule einen R-Wert von 0, 11 hat, in dünnen spitzen Nadeln und die Substanz mit dem R-Wert 0,06 in etwas dickeren kurzen Nadeln kristallisiert.
Tabelle
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<tb> ! <SEP> osvnfhese <SEP> von <SEP> VitaminB-FaktorenAusbeute <SEP> in <SEP> opt. <SEP> Einheiten <SEP> Biosynthetische <SEP> Vitamin <SEP> B12-Faktoren
<tb> Ätiocobal- <SEP> biosynth. <SEP> sonstige <SEP> R-Wert <SEP> mit <SEP> Rf- <SEP> Verteilungskoeff. <SEP> 1 <SEP> im <SEP> System
<tb> Precursor <SEP> amin <SEP> komplette <SEP> B12- <SEP> Wert
<tb> unverbraucht <SEP> B.-Fakt. <SEP> Faktoren <SEP> a <SEP> b <SEP> c <SEP> A <SEP> B
<tb> % <SEP> p-Chlorphenol <SEP> %Ammonsulfat
<tb> 5, <SEP> 6-Dimethyl- <SEP>
<tb> benzimidazol <SEP> 3, <SEP> 86 <SEP> 19, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 24, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 5-Methylbenzimidazol <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0 <SEP> ;
<SEP> 19 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 28, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Benzimidazol <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 31, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 6-Dimethyl- <SEP>
<tb> benzimidazol <SEP> 28, <SEP> 9 <SEP> 10, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 29 <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 6-Diäthyl- <SEP>
<tb> benzimidazol <SEP> 220, <SEP> 0 <SEP> 118, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP> 17, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 5-Chlor-6methylbenzimidazol <SEP> 19,0 <SEP> 3,64 <SEP> 0,46 <SEP> 0,28 <SEP> 7,9 <SEP> 22,5
<tb> 5, <SEP> 6-Dichlor- <SEP>
<tb> benzimidazol <SEP> 0,53
<tb> Benzimidazol-
<tb> 5-carbon- <SEP> 138,0 <SEP> 24,0 <SEP> 0,11
<tb> säureamid <SEP> 138, <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 12, <SEP> 7 <SEP> 43,
<SEP> 5 <SEP>
<tb>
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<tb> Ausbeute <SEP> in <SEP> opt. <SEP> Einheiten* <SEP> Biosynthetische <SEP> Vitamin <SEP> B-Faktoren
<tb> Ätiocobal- <SEP> biosynth. <SEP> sonstige <SEP> R-Wert <SEP> mit <SEP> Rf- <SEP> Verteilungskoeff. <SEP> 1 <SEP> im <SEP> System
<tb> Precursor <SEP> amin <SEP> komplette <SEP> B@- <SEP> Wert
<tb> unverbraucht <SEP> B-Fakt.
<SEP> Faktoren <SEP> a <SEP> b <SEP> c <SEP> A <SEP> B
<tb> To <SEP> p-Chlorphenol <SEP> % <SEP> Ammonsulfat
<tb> 2-Oxymethylbenzimidazol <SEP> 0, <SEP> 20
<tb> Benzimidazol-
<tb> 2-carbon- <SEP> 0,19 <SEP> 0,18
<tb> säure
<tb> Benzimidazol-
<tb> 2-carbon- <SEP> 0,19 <SEP> 0,19
<tb> säureamid
<tb> 5-Methyl-2oxymethyl- <SEP> 0,23
<tb> benzimidazol
<tb> 5-Methylbenzimidazol-2- <SEP> 0,20 <SEP> 0,23
<tb> carbonsäure
<tb> 5-Methylbenzimidazol-2-0, <SEP> 20
<tb> carbonsäureamid
<tb> 5,6-Dimethyl-
<tb> 2-oxymethyl- <SEP> 0,27
<tb> benzimidazol
<tb> 5,6-Dimethylbenzimidazol- <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> 0,28
<tb> 2-carbonsäure
<tb> 5, <SEP> 6-Dimethylbenzimidazol-0, <SEP> 25 <SEP> 0,27
<tb> 2-carbonsäureamid
<tb> 5-Methylbenzimidazol-0, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 2,6-dicarbonsäure
<tb> 1,2-Diamino-
<tb> 4, <SEP> 5-dimethylbenzol <SEP> 11,2 <SEP> 11,0 <SEP> 0,25 <SEP> 0,27 <SEP> 0,25 <SEP> 7,
8 <SEP> 21,0
<tb> 1, <SEP> 2-Diamino-
<tb> 3,4-dimethylbenzol <SEP> 0, <SEP> 27
<tb>
Anmerkungen : a = n Butanol, gesättigt mit Wasser + 0,005 % HCN b = sec. Butanol mit 23 % Nasser, gesättigt mit Kaliumperchlorat + 0,01% HCN c = sec. Butanol, gesättigt mit Wasser + 0,01 % HCN
A = p-Chlorphenol in Trichloräthylen/Wasser
B = n Butanol/Wasser + Ammonsulfat * = nach der chromatographischen Trennung, ausgedruckt in optischen Einheiten, gemessen bei 361 mg (komplette B -Faktoren) bzw. 367 mu (inkomplette
B-Faktoren).