Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin Die Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin unter Verwendung von Chlorotetracyclin lie fernden Species von Streptomyces.
Während der letzten Jahre wurden eine Anzahl von Produkten zumeist aus Boden proben isoliert, die das Wachstum von Bak terien und Pilzen hemmen und welche wert volle therapeutische Eigenschaften besitzen. Chlorotetracyclin, Oxytetracyclin und Tetra- eyelin sind wegen ihres breiten Wirkungs spektrums besonders wertvoll.
Von diesen dreien ist Tetracyclin besonders hervorzuheben, da dasselbe bessere Blutspiegel, weniger Nebenreaktionen und eine bessere Beständigkeit in alkalischem Medium auf weist.
Da durch die Organismen gleichzeitig Chlorotetracyclin, wie Tetracyclin gebildet wird (wobei das erstere oft überwiegt), ist die Isolierung und Reinigung des Produktes schwierig und teuer.
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Er findung zur Herstellung von Tetracyclin ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultur einer Chlorotetracyclin produzierenden Species von Mikroorganismen in einer wässrigen, Nähr stickstoff, Chlorionen und Kohlehydrat ent haltenden Nährlösung unter äroben Bedingun gen in Gegenwart eines die fermentative Chlorierung beeinträchtigenden Inhibitors ge- züchtet wird, bis die Lösung antibakterielle Aktivität aufweist,
worauf das so erzeugte Tetracyclin aus der Fermentationslösung ab getrennt wird.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird die Ausbeute an Tetracyclin auf Kosten der jenigen an Chlorotetracyclin, welches nor malerweise entsteht, verbessert. Es gelingt ferner, gemäss der Erfindung Brühen herzu stellen, die sozusagen ehlorotetracyclinfreies Tetracyclin enthalten.
Als Inhibitoren für die fermentative Chlo- rierung können z. B. Bromid-, Jodid- und Thioeyanationen verwendet werden. Vorzugs weise werden 0,01-5,0 Gewichtsprozent Bro- mid, bezogen auf das Volumen der Fermen tationslösung, verwendet.
Man kann für das erfindungsgemässe Ver fahren als Chlorotetracyelin produzierende Organismen z. B. verschiedene Species von Streptomyces, einschliesslich Streptomyces aureofaciens, (NRRL 2209) sowie eine bisher unbeschriebene Species, vorläufig Strepto- myces BL 567201 genannt, welch letztere aus einer Bodenprobe isoliert wurde, verwenden.
Streptomyces BL 567201 Species nova wächst gut auf Glycerin-, Asparagin-, Rind fleischextrakt bei 30 C. Auf diesem Medium bilden sich mausgraue, luftige Hyphae, wäh rend ein gelbgrünes Pigment im Agar abge schieden wird. Das Mycelium besteht aus ver- zweigten Hyphae, dessen jüngere Elemente grampositiv sind.
Auf den luftigen Hyphae wachsen Conidia. Eine Kultur des lebenden Mikroorganismus BL 567201, die aus einer Bodenprobe isoliert und als Streptomyces viridifaciens identifiziert worden war, wurde in der American Type Culture Collection, Washington D. C. deponiert und deren per manenten Sammlung von Mikroorganismen unter dem Zeichen ATCC 11989 einverleibt.
Andere Chlorotetracy clin und Tetracyclin produzierende Organismen, welche für das Verfahren der vorliegenden Erfindung ver wendet werden können, sind: Streptomyces BL 456782, 567197, 567203, 567270, 567714, 567762, 678033, 678035, 678036, 678040, 678046, 678079, 678110, 678379, 678414 und 678650.
Unter Chlorotetracyclin produzierenden Organismen sollen nicht nur die bisher ge nannten verstanden werden, sondern alle chlorotetracyclinproduzierenden Organismen, insbesondere auch diejenigen, welche aus den vorstehend genannten, durch Mutation, sei es durch Einwirkung von Röntgenstrahlen, UV- Strahlung usw. hervorgehen können.
Zur Bestimmung der Aktivität tetracyclin- haltiger Produkte dient die sog. Diffusions- Platten-Testmethode, welche zweckmässig wie folgt ausgeführt wird Kultur-TI edium Streptomycin-Test-Agar (mit Hefeextrakt) werden in 1 Liter destilliertem Wasser sus pendiert, so dass ein PH-Wert von 6,2 resultiert und eine Mischung von 1,5 g Fleischextrakt, 3 g Hefeextrakt, 6,0 g Pepton und 15 g Agar zugegeben. Die Suspension wird 5 Minuten stehen gelassen, zur gleichmässigen Verteilung durchgemischt und unter Rühren leicht er wärmt.
Anschliessend wird 1 oder 2 Minuten bzw. bis alles gelöst ist, zum Sieden erhitzt. Das Kulturmedium wird hierauf ausgebreitet und bei 121 C sterilisiert (etwa 1 atü Dampf druck, 15 Minuten).
Inoculunt Der Testorganismus ist Bacillus subtilis American Type Culture Collection 6633. Eine Sporenaufschlämmung, enthaltend 50000000 keimfähige Sporen pro ml wird der flüssigen (auf 53 C gekühlten) Agar-TAtlösung zu gegeben, so dass ein Inoculat von 2% entsteht.
Herstellung <I>der</I> Platten Je 21 ml der sterilen Agar-Testlösung wer den in einer Vielzahl flacher steriler Petriplat- ten eingebracht und erstarren gelassen. 4 ml des inoculierten Agars werden hierauf gleich mässig über die Oberfläche der Basisschicht verteilt. Hierauf werden Platten aus rost freiem Stahl, die je eine Serie von Löchern enthalten, auf das Agar-Medium aufgelegt, nachdem letzteres auf Zimmertemperatur aus gekühlt war, und die Proben in die Löcher eingebracht.
<I>Puffer</I> Für eine eventuelle Verdünnung der zu untersuchenden Proben wird ein Citrat Puffer vom pH 6,2 gebraucht. Er wird hergestellt, indem man 192,12 g wasserfreie Zitronensäure mit 106,3g Natriumhydroxyd in einem Liter destillierten Wasser löst und die Mischung auf <B>1110</B> der Konzentration mit destilliertem Was ser verdünnt. Der p11-Wert des Puffers muss potentiometrisch geprüft werden und wenn nötig, durch Zugabe von Zitronensäure oder Natriumhydroxyd, genau eingestellt werden.
Änderungen im PH oder in der Pufferkonzen tration beeinflussen die Grösse der Inhibitions- zone merklich. Sterilisation des Puffers ist unnötig. Die Stocklösung wird mit Chloro form oder Toluol abgedeckt, und frische Ge brauchslösungen werden täglich daraus her gestellt.
<I>Test</I> Unbekannte Proben werden, sofern sie andere p11-Werte aufweisen, mit dem PH 6,2 Citrat Puffer verdünnt. In drei Löcher jeder Platte wird eine einzelne Verdünnung der Probe ein gebracht. Nach Inkubation bei 32 C werden die Zonendurehmesser gemessen und ausgemit- telt.
Streptomyces BL 567201, wurde aus einem Stamm von Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) abgezweigt, welcher vom Northern Re gional Research Laboratory, Peoria, Illinois, erhalten wurde, wo er als authentischer aureomy einproduzierender Stamm aufbewahrt war.
Die Abzweigung' geschah auf Grund von Beobachtung der Wachstumscharakteristika auf Glycerin-Asparagin-Fleischextrakt-Agar und Czapek-Dox-Agar mit 1% Dextrin.
EMI0003.0005
<I>Glycerin-Asparagin-Fleischextrakt-Agar</I>
<tb> Glycerin <SEP> 1%
<tb> Asparagin <SEP> 0,05%
<tb> Fleischextrakt <SEP> 0,2%
<tb> K2HP04 <SEP> 0,05%
<tb> Agar <SEP> 1,5%
<tb> pA <SEP> 7,2
<tb> BL <SEP> 567201 <SEP> Streptomyces
<tb> aureofaciens
<tb> Wachstum <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Sporenbildung <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Diffundierendes <SEP> Pigment <SEP> gelbgrün <SEP> keines
<tb> Spiralbildung <SEP> reichlich,
<tb> lose <SEP> gewunden <SEP> keine
<tb> Luftige <SEP> Hyphae <SEP> mausgrau <SEP> rosagrau
<tb> Rückseite <SEP> braun <SEP> olive-lehmfarbig
<tb> <I>Dextrin-Czapek-Dox-Agar</I>
<tb> Dextrin <SEP> 1%
<tb> NaN03 <SEP> 0,2%
<tb> K2HP04 <SEP> 0,1%
<tb> MgS04 <SEP> 0,05<B>%</B>
<tb> KCl <SEP> 0,05%
<tb> FeS04 <SEP> Spuren
<tb> Agar <SEP> 1,5%
<tb> PH <SEP> 7,2
<tb> BL <SEP> 567201 <SEP> Streptomyces
<tb> aureofaciens
<tb> Wachstum <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> gut <SEP> mässig
<tb> Sporenbildung, <SEP> gut <SEP> spärlich
<tb> Diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> keines <SEP> keines
<tb> Spiralbildung <SEP> reichlich <SEP> lose <SEP> gewunden <SEP> dünn,
<SEP> sehr <SEP> lose <SEP> gewunden
<tb> Luftige <SEP> Hyphae <SEP> mausgrau <SEP> lederfarben <SEP> bis <SEP> grau
<tb> Rückseite <SEP> lichtbraun <SEP> lederfarben <SEP> biss <SEP> lohfarben Streptomyces BL 567201 zeichnet sich fer ner aus durch Bildung eines intensiv bläulich grünen Pigments, wenn es in untergetauch tem Zustand in einem Medium, enthaltend 1% Sucrose, 1% Soyabohnenmehl, 1% Soyapepton, 1,5% KII2P04 und 0,5% (NH4)2HP04 kulti- viert wird. Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) tut dies nicht.
Zur Ausführung der Erfindung wird z. B. eine Chlorotetracyclin produzierende Species von Streptomyces bei ungefähr 24-30 C im untergetauchten Zustand unter Bewegung und Luftzufuhr in Medien gezüchtet, die Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und wachstums fördernde Substanzen, ferner Mineralsalze, wie Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Na triumnitrat, eventuell eine Puffersubstanz,
wie Calciumcarbonat sowie den Inhibitor der fer- mentativen Chlorierung enthält. Solche Chlo- rierungsinhibitoren sind wie bereits erwähnt z. B. Bromid-, Jodid- und Thiocyanationen. Dieselben werden den Medien z. B. in Form von Verbindungen wie z. B. Alkalimetall oder Erdalkalimetallsalzen zugegeben.
Als bevor zugter Inhibitor wird das Bromidion verwen det, und zwar als Natrium-, Kalium-, Cal cium-, Ammoniumbromid oder als Brom wasserstoffsäure. Bei Verwendung von Na triumbromid liegen die bevorzugten Mengen zwischen 0,01-5,0%, bezogen auf die Medien, wobei vorteilhafterweise 0,1-2,0% verwendet werden.
Als Kohlenstofflieferanten im Nährmedium eignen sich z. B. die folgenden:
EMI0004.0020
gewöhnliche <SEP> Stärke <SEP> Xylose
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> Arabinose
<tb> Sucrose <SEP> Rhamnose
<tb> Glucose <SEP> Fructose
<tb> Maltose <SEP> Lactose
<tb> Dextrose <SEP> Inulin
<tb> Glycerin <SEP> Dextrine
<tb> Galactose Diese Substanzen werden dem Medium zweckmässig in gereinigter Form oder als Kon zentrate zugegeben. Ihre für die Antibiotika bildung optimale Menge variiert beträchtlich, von ungefähr<B>0,5-5%,</B> bezogen auf das Ge wicht der totalen Menge des Nährmediums.
Als für den Fermentationsprozess geeignete Stickstofflieferanten und zum Teil zugleich als Quellen waclLstumsfördernder Stoffe kom men zahlreiche Produkte in Betracht., wie z. B.:
EMI0004.0023
Aminosäuren <SEP> Peptone
<tb> Casein, <SEP> hydrolysiert <SEP> und <SEP> nichthydrolysiert <SEP> Abfälle
<tb> Fischmehl <SEP> Brauerhefe
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> Baumwollsamenmehl
<tb> Fleischextrakt <SEP> Milchalbumin
<tb> Leberkuchen <SEP> Tr <SEP> ypton
<tb> Harnstoff
<tb> Nitrate
<tb> Ammoniumverbindungen
<tb> Getreidepresssäfte
<tb> Molken <SEP> oder <SEP> Molkenkonzentrate
<tb> Säurehydrolysiertes <SEP> Maisgluten
<tb> SäurehydrolysiertesWeizengluten Die proteinhaltigen Substanzen brauchen nicht in hohem Reinheitsgrad angewandt zu werden;
auch weniger reines Material, nament lich solches, das noch Spuren von Waehstums- faktoren und beträchtliche Mengen von Mi neralnährsalzen enthält, ist geeignet. Wegen des Rohproduktcharakters mancher dieser Materialien ist es natürlich nicht möglich, genaue Angaben über die zugesetzten Men genverhältnisse der Stickstoffsubstanzen zu machen. Eine Menge von ungefähr 0,1 bis 5,0 Gew.%, gerechnet auf Trockensubstanz, umschreibt für die meisten Fälle den ge bräuchlichen Anteil der Stickstoffsubstanzen im Nährmedium.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums ist anfänglich vorteilhaft 6,0-6,2. Die Fer- mentationstemperatur liegt vorzugsweise bei ungefähr 26 bis 28 C. Die höchste Aus beute ergibt sich normalerweise in 1 bis 3 Tagen, wobei der Optimalwert mit der an gewandten Kutiviermethode der Streptomycien variiert.
In den folgenden Beispielen enthalten die Nährlösungen Chlorionen in einer Konzentra tion, wie sie üblicherweise in unbehandelten Medien vorhanden sind. <I>Beispiel I</I> Zur Herstellung von Tetracyclin wurde eine Fermentationslösung folgender Zusam mensetzung (Gew. %) angesetzt 1% Getreidekornpresssaft 1% Sucrose 0,5% (NH4)2HP04 1,5% KH2P04 0,2% MgS04. 7 1120 0,5% NaBr pH 6,2-6,4 2500 ml dieser Lösung wurden in eine 10-Liter-Flasche eingefüllt.
Sterilisation er folgte mit Dampf bei 118-120 C während einer Stunde. Nach Abkühlung wurde mit etwa 0,5 Vol. % einer trüben, wässrigen Spo- rensuspension von Streptomyces geimpft. Der Flascheninhalt wurde 48 Stunden lang bei 26-280C auf einer Schüttelmaschine der Inkubation unterworfen und sterile Luft über die Oberfläche der Flüssigkeit geblasen. Aus der Flasche wurde die streptomyceshaltige Nährlösung in den Fermentationstank unter völlig aseptischen Bedingungen übergeführt.
Die Lösung wurde nach der Fermentation wie unten angegeben aufgearbeitet und das Tetracyclin isoliert.
Streptomyces BL 567201, Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) und andern Tetra- cyclin liefernden Species von Streptomyces können zur Herstellung von Tetracyclin in grossem Massstab als Tiefkulturen gezüchtet werden. Hierfür sind stationäre Fermen tationsfässer ausgerüstet mit Rühren und Lüf tungsvorrichtungen besonders geeignet.
Man verwendet zweckmässig ein Nährmedium, das 56,8 Liter Kornpresssaft, 56,8 kg Sucrose, 28,4 kg (NH4)2HP04, 85,2 kg KH2P04, 11,3 kg M9804 . 7 H20, 28,4 kg NaBr und Wasser auf 6700 Liter enthält. Dieses Nähr medium wird zweckmässig in einem 9000 Liter fassenden, mit Glas ausgelegten Fermentations- gefäss, ausgerüstet mit einem Wassermantel zum Temperieren, einem Rührer aus rost freiem Stahl und einer Belüftungsvorrichtung verarbeitet. Das Nährmedium wird zweck mässig mit Dampf unter Druck sterilisiert und dann abgekühlt.
Nach dem Sterilisieren sollte der pH-Wert bei etwa 6,2 liegen. Die Nähr lösung wird mit 15 Vol. % einer wachsfähigen Kultur, die entweder in einem ähnlichen Fer- mentationsgefäss gezüchtet, oder in einem der oben beschriebenen Laboratoriumsansätze er halten wurde, inokuliert. Hierauf wird der Inhalt des 9000-Liter-Gefässes bei einer Tem peratur von 28 C während etwa 44 Stunden der Inkubation unterworfen. Dabei wird mit 90 U. p. M. gerührt und 3 m3 pro Minute sterile Luft in das Nährmedium eingeblasen.
Am Ende der Inkubationsperiode enthält die Kulturlösung normalerweise eine Menge an Tetracyclin, welche die Menge an vorhan denem Chlorotetracyclin überwiegt. Das Tetracyclin wird - wie weiter unten be schrieben - isoliert. Ein so vor der Um kristallisation erhaltener Festkörper enthielt wenigstens 19 Teile Tetracyclin pro Teil Chlorotetracyclin.
Die folgenden Fermentationslösungen er gaben bei einem Arbeiten analog Beispiel I ein Erzeugnis, welches nicht mehr als 1 Teil Chlorotetracyclin auf 2 Teile Tetracyclin ent hielt. <I>Beispiel</I> II 1% Weizengluten 1% Glycerin 0,05% lösliches Getreideextrakt 0,1% CaC03 <B>0,5%</B> NaBr Beispiel III 1% Baumwollsamenmehl 1% Glukose 0,05% lösliches Getreideextrakt 0,1% CaC03 0,
5% NaBr <I>Beispiel IV</I> 1% Kornpresssaft 1% Cerelose 0,1% CaC03 1% NaBr <I>Beispiel V</I> 1% Sojabohnenmehl 1% Cerelose 0,05% Hefeextrakt 0,1% CaC03 0,1% NaBr <I>Beispiel</I> VZ 3% Sojabohnenmehl 0,5% Getreidestärke 0,1% N-Z-Amin B (enzymatisches Zu setzungsprodukt von Casein) <B>0,3%</B> NaN03 0,5% CaC03 0,
5% KBr Beispiel VII 1 % N-Z-Amine B 1% Cerelose 0,5% Hefeextrakt 0,1% CaC03 0,5%4 CaBr2 <I>Beispiel</I> VIII 1%a Sucrose 0,5% (NH4)2HP04 1%a Sojabohnenmehl 1% Sojapeptone 0,5% NaBr 1,5% KH2P04 <I>Beispiel IX</I> Das Verfahren gemäss Beispiel I wurde mit und ohne 0,
5% NaBr unter sonst gleichen Bedingungen mit Streptomyces BL 567201 durchgeführt. In den erhaltenen Brühen wur den die Mengen an Tetracyclin und Chloro- tetracyclin mittels Papierstreifen auf chro- matographischem Wege oder durch verschie dene Bioteste mit pu 6,2- und 8,0-Agar be stimmt.
Die Brühe aus einem 550-Liter-Behälter, enthaltend 364 Liter Medium mit einem Ge halt von 0,5% Natriumbromid, enthielt nach 20-44 Stunden Fermentationsdauer wenig stens 19 Teile Tetracyclin pro Teil Chloro- tetracyclin. Gemäss dem Biotest enthielt die Brühe nach 20 Stunden 85 mcg/ml Tetra- cyelin und 3 mcg(ml Chlorotetracyclin.
Die Brühe eines 550-Liter-Behälters ent haltend 364 Liter Medium, ohne zugefügte Bromidionen, enthielt nach 44 Stunden Fer, mentationsdauer nicht mehr als 1-2 Teile Tetracyclin auf 8 Teile Chlorotetracyclin.
Die Brühe eines 2750-Liter-Behälters, ent haltend 1600 Liter Medium, ohne zugefügtes Bromidion, enthielt nach 45 Stunden Fermen tationsdauer nicht mehr als 1-2 Teile Tetra- cyclin auf 8 Teile Chlorotetracyclin.
Die Brühe eines 2750-Liter-Behälters, ent haltend 1370 Liter Medium, ohne zugefügte Bromidionen, enthielt nach 30 Stunden Fer- mentationsdauer nicht mehr als 1-2 Teile Tetracy clin auf 9 Teile Chlorotetracyclin. <I>Beispiel X</I> Je 200 ml Medium der unten angegebenen Zusammensetzungen wurden je in einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben eingefüllt, während 15 Minuten im Autoklav bei 15 Pfund Druck behandelt,
abgekühlt und mit je 1 ml eines 24 Stunden in einem Kornpresssaft vegetierten Inoculums von Streptomyces BL 567201 inoku- liert. Die so inokulierten Kolben wurden wäh rend 48 Stunden bei 28 C geschüttelt.
Die einzelnen gesammelten Brühen wurden zentrifugiert und mittels Streifenchromato- graphie getestet.
EMI0007.0001
<I>Medien <SEP> und <SEP> Testresultate</I>
<tb> Versuchsnummer
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Sucrose <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> KH2P04 <SEP> % <SEP> 1,5 <SEP> 1,5 <SEP> 1,5 <SEP> 1,5 <SEP> 1,5
<tb> (NH4) <SEP> 2HP04 <SEP> % <SEP> 0,5 <SEP> 0,5 <SEP> 0,5 <SEP> 0,5 <SEP> 0,5
<tb> M9S04 <SEP> % <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2
<tb> Kornpresssaft <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> NaBr <SEP> % <SEP> 0 <SEP> 0,5 <SEP> 0 <SEP> 0,5 <SEP> 1,0
<tb> PH <SEP> 5,4 <SEP> 5,
3 <SEP> - <SEP> - <SEP> Chlorotetracy <SEP> clin <SEP> % <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 95 <SEP> < <SEP> 5 <SEP> < <SEP> 5
<tb> Tetracy <SEP> clin <SEP> % <SEP> 0 <SEP> 90 <SEP> 5 <SEP> <B>>95 <SEP> >95</B> Versuch 2 ergab etwa 100 meg/ml Tetracyclin. <I>Beispiel XI</I> Wurde an Stelle von NaBr in Beispiel X KBr, CaBr2, NH"Br, KJ (weniger als 0,5<B>%</B>), oder NaSCN verwendet,
so zeigt sich eben falls eine vermehrte Ausbeute an Tetracyelin auf Kosten des Chlorotetracyelins. <I>Beispiel</I> XII Bei Verwendung von Streptomyces aureo- faciens (NRRL 2209) bewirkte die Zugabe von Brom-, Jod-, oder Thiocyanationen ebenfalls eine höhere Ausbeute an Tetracyclin auf Kosten des Chlorotetracyclins,
insbesondere wenn die günstigsten Bedingungen für die Zucht des Mikroorganismus und für die maxi male Ausbeute an Antibiotikum eingehalten wurden. (USA-Patent Nr. 2482055).
Nach Beendigung der Fermentation kann das Tetracyclin aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, z. B. indem man das Mycellium abfiltriert, die Brühe (vorzugsweise beim pH etwa 8,5) mit Butanol oder Methyl- isobutylketon umrührt, die Lösungsmittel schicht, welche das Tetracyclin enthält, ab trennt, sie auf ein kleines Volumen einengt, und sie hierauf mit einem niedrigen Kohlen wasserstoff, z.
B. mit Petroläther vom Siede intervall 85-100 C, versetzt, wobei das Tetra- cyclin als Base ausfällt, sofern die Brühe alkalisch war, oder als Hydrochlorid, sofern die Brühe vor der Extraktion mit Salzsäure angesäuert worden war. Das so abgetrennte Tetracyclin kann weiter gereinigt werden, indem man es in Ammoniaklösung einträgt oder auch durch Adsorption aus einer Lösung der freien Base an chromatographischen Ad- sorbentien (z. B. an Kieselsäure), gefolgt von Auswaschen (z.
B. mit Aceton oder Methanol) zur Entfernung von Verunreinigungen und Eluieren mit einer Säure. Das gereinigte Tetracyclin-Salz lässt sich aus dem Eluat durch Kristallisation, Fällung, Lyophilisation oder dergleichen gewinnen.
Durch Zugabe von Säuren zu Tetracyclin in Wasser, bis klare Lösung eintritt, können auf einfache Weise Additionsprodukte anor ganischer und organischer Säuren erhalten werden. Feste Salze können hergestellt wer den, indem man das pA einer solchen Lösung eines Tetracyclinsalzes auf einen Wert knapp unter den Punkt bringt, wo das Antibiotikum auszufallen beginnt. Die Lösung kann dann getrocknet werden, indem man sie in gefro renem Zustand unter Vakuum setzt.
Saure Salze des Tetracyclins werden erhalten, indem man eine Lösung des Salzes in Wasser bei niedrigerem PH verdampft. Mineralsäuren, die Salze ergeben, sind Salzsäure, Schwefel säure und Phosphorsäure. Organische Säu ren zur Salzbildung sind Zitronensäure, Wein säure, Gluconsäure usw. Da Tetracyclin amphoter reagiert, lassen sich Salze verschie dener metallischer Elemente mit dem Anti- biotikum bilden.
Insbesondere lassen sich die Alkalisalze des Tetracyclins herstellen, indem man eine wässrige Suspension des Antibioti kums mit Alkalihy droxyd behandelt. Die festen Metallsalze des Antibiotikums erhält man durch Verdampfen einer wässrigen Lö sung desselben bei geeignetem PH.
Das so hergestellte Tetracyclin kann ein deutig charakterisiert werden, selbst wenn es mit. ähnlichen organischen Substanzen verun reinigt ist, durch sein Aktivitäts -Spektrum (das heisst seine Rf-Werte) in verschiedenen Lösungsmitteln bei der Papierstreifen-Chro- matographie. Diese Methode ist verhältnis mässig neu, hat sich aber gut bewährt zur Iden tifikation organischer Verbindungen.
Wie die Maxima eines Infrarotspektrums ergeben die Rf-Werte in einer Serie von Lösungsmitteln eine eindeutige und reproduzierbare Charak teristik eines Chemikals und dienen als fingerprint .
Die fragliche Methode besteht in folgen dem: Streifen aschefreien, dichten und sehr saugfähigen Filterpapiers (z. B. Nr. 589, Blau band spezial von C. Schleicher und Schüll) etwa 12 mm breit und 58 cm lang, werden bei konstanter Raumtemperatur in einem ver schliessbaren Gefäss (z. B. einem grossen Glas gefäss) über den Rand einer Schale aufge hängt. Das obere Ende jedes Streifens befin det sieh in Kontakt mit einer Lieferquelle eines bestimmten Systems von Lösungsmitteln (ebenfalls Entwicklerphase genannt) in der Schale. Das untere Ende des Streifens hängt frei und steht nicht in Kontakt mit den unter den Streifen befindlichen Lösungsmitteln, welche den Luftraum im Gefäss mit ihren ent sprechenden Dämpfen sättigen.
Das zu prüfende Produkt (z. B. in einer Fermentationsbrühe befindlich, oder als iso lierte Substanz) wird auf eine markierte Stelle am obern, freihängenden Ende des Streifens aufgebracht. Falls es eine feste Sub stanz ist, wird diese zuvor in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst. Die angewandten Men gen werden so bemessen, dass geeignete Zonen grössen sieh ausbilden. Zum Beispiel eignen sich 5 Mikroliter (0,005 ml) einer Lösung von 1 mg Tetracyclin pro ml für einen nachfolgen den Test mit B. subtilis. Der Streifen wird getrocknet und dann mit seinem Ende in die Schale mit dem gewählten Lösungsmittel- systein. gegeben.
Die Lösung wandert ab wärts und entwickelt den Streifen, bis die Front der Lösungsmittel zu seinem untern Ende reicht. Dies erfordert etwa 15 Stunden. Die den Streifen umgebende Atmosphäre wird auf konstante Temperatur, frei von Luftzug und gesättigt. mit den Lösungsmitteldämpfen gehalten.
Die Streifen werden dann herausgenom men, an der Luft. getrocknet und auf eine Schicht Agar mit eingestelltem pH (hier 6,2), die mit einem Testorganismus (B. subtilis) inokuliert ist, aufgelegt. Nach Lagern im Kühlschrank über Nacht werden die Streifen weggenommen, die Agarschichten entspre chend markiert, letztere über Nacht der In kubation unterworfen und entweder direkt be obachtet oder photographiert, um ein bleiben des Dokument zu haben. Der Umriss des ganzen Streifens ist sicht bar. Die Lage jedes antibiotischen Agens auf dem Streifen zeichnet sich als klarer Bezirk ab, welcher mit den trüben Bezirken des Bak terienwachstums kontrastiert.
Das Streifen bild wird in Zonen eingeteilt, welche 5, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 und<B>15%</B> der Distanz, zwischen der Aufbringstelle der Probe und dem untern Streifenende ausmachen, und die sen Zonen werden die Rf-Werte von 1 bis und mit 10 zugeteilt. Ein schmaler Fleck exakt in der Mitte würde dementsprechend den Rf- Wert 6 erhalten, während ein grösserer Fleck, der sich über die anliegenden Zonen erstreckt, die Rf-Werte 5, 6 und 7 erhalten würde, da jeweils die ganze Zone gezählt wird.
Unter Anwendung dieser Technik ergibt sich folgendes Rf-Spektrum von Tetracyclin. Angewendet werden 5 Mikroliter einer 1-mg/ml- Lösung des Antibiotikums auf jedem Streifen im Test mit B. subtilis bei pH = 6,2 auf Agar, wobei die Streifen in 12 Lösungsmittelsyste- men entwickelt werden.
EMI0009.0001
Lösungs mittel- <SEP> A <SEP> B <SEP> C
<tb> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> I <SEP> J <SEP> g <SEP> L
<tb> System
<tb> Rf-Wert <SEP> <B>6,7 <SEP> 5,6</B>
<tb> 4,5 <SEP> 4, <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 8, <SEP> 9, <SEP> 10 <SEP> <B>6,7</B> <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> <B>9,10</B> <SEP> 6, <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 3, <SEP> 4, <SEP> 5 Die Zusammensetzung der Lösungsmittel systeme war folgende:
A Wasser, B 10 % Natriumzitrat in Wasser, C 40 % Natriumzitrat in Wasser, D wassergesättigtes Butanol, E trockenes Methyl-isobutylketon, F eine Mischung von 100 Teilen 80%igem Methanol und 10,5 Teilen Piperidin, mit Essigsäure auf pH 9,5 eingestellt, G eine Mischung von 80 Volumteilen Me thanol, 5 Volumteilen Eisessig und 15 Volumteilen Wasser, H Butanol gesättigt mit Wasser,
enthal tend 2% p-Toluolsulfosäure, I eine Mischung von 100 ml Butanol, ge sättigt mit Wasser und 5 ml Eisessig, .T wassergesättigtes Butanol mit 2% p- Toluolsulfosäure und 2% Piperidin, K 100 Teile wassergesättigtes Butanol, 2 g p-Toluolsulfosäure und 2 g Piperidin und 2 g Laurinsäure,
L eine Mischung von 2 Teilen Isoamyl- alkohol und 1 Teil Chloroform gesättigt mit 10<B>%</B> wässrigem Natriumcitrat. In diesem Falle wurde vor Aufbringen der Probe der Streifen mit 10%igem wäss- rigem Natriumcitrat, das mit Zitronen säure auf pn = 5,7 eingestellt worden war, gesättigt und dann getrocknet.
Die Eigenschaften von Tetracyclin sind im Journal der American Chemical Society Band 75, Seiten 4621-23, 1953 beschrieben. Man nimmt an, dass Tetracyclin (I), Oxytetra- cyclin (II) und Chlorotetracyclin (III) die folgenden Formeln besitzen
EMI0009.0046
Es wurde eine Probe Tetracyclin als freie Base nach Literaturangaben aus Chlorotetra- cyclin hergestellt.
Das so erhaltene Produkt schmolz bei 170-175 C und enthielt 0,71% Chlor, woraus auf eine Verunreinigung mit etwa 10<B>%</B> nicht umgesetztem Chlorotetracyclin geschlossen werden kann. Diese Probe erwies sich als im wesentlichen dieselbe Substanz, wie eine Probe von Tetracyciin, mittels Fermen tation hergestellt.
Alle darin enthaltenen Ver unreinigungen wurden durch Prüfung dieser Proben und Vergleich mit Proben von Chloro- tetracyclin und Oxytetracyclin sowohl in rei- ner Form als auch in Mischung durch Papier streifenchromatographie ermittelt (speziell unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme D und L).
Tetracyclin verlor in 48 Stunden bei 37 C in einem Puffer vom pA 8,0 etwa 0;7 mgIml seiner Aktivität (= 28%), Chlorotetracyclin verlor etwa<B>50%</B> seiner Aktivität in 14 Stun den und Oxytetracyclin <B>50%</B> in 26 Stunden unter den gleichen Bedingungen.
Ferner lässt sich Tetracyclin von Chloro- tetracyclin und Oxytetracyclin eindeutig durch den Plattentest auf Agar bei roA 8,0 und pH 6,2 unterscheiden, wobei Ohlorotetracyclin und Oxytetracyclin viel weniger aktiv erschei nen als Tetracyclin.
Tetracyclin lässt sich von verunreinigenden Mengen an Chlorotetracyclin oder Oxytetra- cyclin reinigen, indem man eine wässrige Lö sung auf einem PH von etwa 8,0 hält, bis sich alles Chlorotetracyclin oder Oxytetracyclin zersetzt hat. Diese Operation ist erträglich, da durch das Verfahren gemäss vorliegender Er findung die Menge an Chlorotetracyclin auf einem Minimum gehalten werden kann.
Im folgenden seien weitere Salze genannt, die sich als Inhibitoren für die fermentative Chlorierung eignen, sofern sie in genügenden Mengen angewandt werden, ohne dass sie toxisch wirken:
Natriumacetat, Natriumaluminat, Natriumaluminiumfluorid, 1\Tatriumaluminiumtrisilicat, Natriumaluminiumsulfat, Natriumammoniumphosphat, Natriumpyroantimonat, Natriumorthoarseniat, N atriumazid, Natriumbenzosulfonat, Natriumbenzoat, Natriummetaborat, Natriumtetraborat, Natriumperborat, Natriumbromat, Natriumbromaureat,
Natriumbromplatinat, Natriumcacodylat, Natriumcalciumsulfat, Natrium-d-camphorat, Natriumcarbonat, Natriumchromat, Natriumdichromat, Natriumcinnamat, Natriumcitrat, Natriumcuprocy anid, N atriumcyanat, Natriumcyanid, Natriumenanthat, Natriumäthylsulfat, Natriumferricyanid,
Natriumferrit, Natriumferrocyanid, Natriumfluorantimonat, Natriumfluorphosphat, Natriumfluorid, Natriumfluorsilicat, Natriumformiat, Natriummetagermanat, Natriumglycerophosphat, Natriumjodat, Natriummetaperjodat, Natriumeisenoxalat, Natriumisocyanat, Natriumlactat, Natriummagnesiumsulfat, Natriummanganat,
\Tatriumpermanganat, Natriummolybdat, Natriumnitrat, Natriumhyponitrit, Natriumnitrit, Natriumnitroprussiat, Natriumoleat, Natriumoxalat, Natriumhypophosphat, Natriumorthophosphat, Natriumpyrophosphat, Natriumhexametaphosphat, Natriumhypophosphit, Natriumorthophosphit, Natriumphthalat, Natriumpicrat,
Natriummetaplumbat, Natriumsalicylat, Natriumselenat, Natriumselenit, Natriummetasilicat, Natriumstannat, Natriumstearat, Natriumsuccinat, Natriumsulfanilat, Natriumsulfat, Natriumhydrosulfat, Natriumpyrosulfat, Natriummonosulfid, Natriumsulfid, Natriumhyposulfit, Natriumtellurat, Natriumtellurid,
Natriumthioantimoniat, Natriumthiocarbonat, Natriumdithionat, Natriumthiosulfat, Natriumxanthat, Natriumzinkuranylacetat, Natriumzirkonfluorid und andere Metallsalze dieser Anionen wie z. B. Kalium-, Calcium-, Barium-, Strontium-, Zink-, Eisen- und Ma gnesium- sowie Ammonium- und substituierte Ammoniumsalze sowie die entsprechenden freien Säuren.