DE2029768A1 - Anti Tumor Verbindung und ihre Her stellungsverfahren - Google Patents

Description

Die Beobachtung, daß wirksame Therapeutika als-Produkte aus der bakteriellen Fermentation erhalten werden konnten, hat das Arsenal von Iherapeutika, das zur Erhaltung der Gesundheit oder zur Aufhebung von Krankheitszustanden erforderlich ist, unmeßbar vergrößert. Zeugen dafür sind Penicillin, Streptomycin und auch bestimmte Anti-ÜJumor-Mittel, die man bei der MikrobenfermentationTerhält. Unglücklicherweise stellte man fest, daß infolge der weitverbreiteten Verwendung und manchmal auch des Mißbrauchs dieser wertvollen Substanzen bestimmte Stämme einiger Krankheitserreger eine Resistenz gegenüber einzelnen Chemotherapeutika entwickeln, was zur Folge hat, daß das ausgewählte Mittel gegenüber der-

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'11263 4 '

artigen resistenten Stämmen nicht mehr wirksam ist«, Dies, ^; in Verbindung mit der Tatsache, daß noch viele pathogene Organismen bekannt sind und es andere unbekannte Krankheitserreger gibt, für die man noch kein wirklich wirksames Mittel besitzt, stellt einen andauernden Anreiz dar, auf diesem Gebiet tätig zu sein.

Die Erfindung betrifft wertvolle neue Chemikalien und deren Herstellungsverfahren. Sie betrifft insbesondere eine neue basische Substanz und deren Säuresalze, die wertvolle antibakterielle und Anti-Tumor-Wirksamkeit besitzen. Die neue basische Substanz, die nachfolgend auch Verbindung 593A genannt· wird, erzeugt man durch Züchtung einer bisher unbekannten Species von Streptomyces griseoluteus in geeigneten Permentationsmedien.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung der Verbindung 593A und ihrer Säuresalze. Ein anderes Ziel ist die Schaffung von Verfahren zur Herstellung von Verbindung 593A durch Fermentation, von Verfahren zur Gewinnung dieser Substanz aus der Fermentationsbrühe und von Verfahren zur Herstellung von Säuresalzen der Verbindung ,593A. Andere Ziele und Gegenstände der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Einzelheiten der nachfolgenden Beschreibung.

Verbindung 593A, die neue Substanz der vorliegenden Erfindung, wird bei der Züchtung unter kontrollierten Bedingungen eines bisher unbekannten Mikroorganismenstammes erhalten. Der ursprüngliche Mikroorganismus, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die im Gebiet von' Eichmond ₉ Südafrikanische Union, eingesammelt worden war, wurde als 1A-124-1* in der Kultur Sammlung von MERCK & GOo₈ XNC ·, ..Rahway,. New Jersey, bezeichnet. Die Stammkultur MÄ-1241 wrde auch ' In der KulturSammlung der northern Utilisation Research and

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11263 J

Development Branch des U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter der Bezeichnung MRL 3412 zugänglich ist.

Die ursprünglich isolierte Kultur, welche die Verbindung 593A erzeugt, erhalten als Einzelkolonie aus Boden, wurde auf einer sterilisierten Agarplatte'der folgenden Zusammensetzung ausgebreitet:

Agar 20 g

Hefeextrakt 10 g

Glucose 10g

MgSO₄-7H₂O . 0,5 g

KH₂PO₄ 1,82 g

₂₄ t,90 g

destilliertes Wasser 1 Liter.

Nach dem Brüten bei 28⁰C wurde die entstandene Zucht verwendet, um eine 250 ml Schüttelflasche anzuimpfen, die 50 ml eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt: :

Fleischextrakt	3 g
N-Z Amin	10 g
Glucose	10 g
NaOl	. 5 g
destilliertes Wasser	1 Liter

pH 7,2 vor der Sterilisierung. .

Nach 48-stündigem Brüten auf einer Dreh-Schüttelvorrichtung bei 28⁰C wurde das vegetative Inokulum dazu benutzt, eine 250 ml Schüttelflasche anzuimpfen, die das folgende sterilisierte Medium enthielt: . '

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Glucose	10	g
Pepton	5	g
Hefeextrakt	3	g
NaCl	12,705	g .
KCl	0,72	S
PeSO4(NH4)2S04·6H2O	0,35	g
MgCl0·2Ηο0	5,32	g
CaCl2*2H2O	0,728	g
destilliertes Wasser	1	liter

" pH 7,4 vor der Sterilisierung eingestellt·

Nach weiterem 48-stündigem Brüten bei 28⁰C auf einer Schüttelvorrichtung wurde eine Probe der entstandenen filtrierten Brühe geprüft, sie besaß antibiotische und Anti-Tumor-Wirksamkeit. Trotz der vielen durchgeführten Tests konnte die isolierte Verbindung nicht mit einer bekannten Substanz identifiziert werden, sie wurde daher als Verbindung 593A bezeichnet.

Eine Probe der Stammkultur wurde durch Lyophilisierung aufbewahrt und in sterilisierten Röhrchen gelagert, um eine ) Quelle der Kultur für spätere Arbeiten sicherzustellen.

Klassifikation:

In dem Bemühen, den Organismus, der die Verbindung 593A erzeugt, zu klassifizieren, wurden Proben der stabilen, lyophilisierten Stammkultur gezüchtet und die morphologischen und physiologischen Charakteristika untersucht und mit bekannten Organismen verglichen. Bei dieser Untersuchung fand man, daß die Stammkultur am stärksten Streptomyces griseoluteus ähnelte, dementsprechend erhielten diese, die Verbindung 593A erzeugenden Kulturen, die

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Artbezeichnung Streptomyces griseoluteus.·

Die Kennzeichen der isolierten Stammkultur sind in TABEIIE I im Vergleich mit den beiden nächststehenden Organismen, Streptomyces griseoluteus und Streptomyces aureofaciens wiedergegeben. Die Beschreibungen der bekannten letzteren Organismen sind so wie sie in Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 7.Auflage (1957) und in Waksman's "The Actinomycetes", Band 2 (1961) angegeben sind. Alle Angaben in der Tabelle wurdennach dreiwöchigem Brüten bei 28⁰C ermittelt, falls nichts anderes angegeben ist, und der pH, der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien betrug etwa 6,8 bis 7»2. Die in der Beschreibung verwendeten Farbangaben entsprechen den Definitionen des "The Color Harmony Manual¹¹, 4»Auflage (1958).

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Kulturcharakteristika von MA-12¹!! (593A) und den beiden nächststehenden Organismen

Streptomyces griseoluteus

Streptomyces aureofaciens

(593A) .

Waksman

	Morphologie:	«Die Sporophoren	Sporophoren mit
		erscheinen als	monopodlalen
		gewundene Ket	und unregelmäs-
		ten, Haken und	sigen Verzwei
		Schleifen.	gungen, flexi
		Die Sporophoren	bel und haken
O		erscheinen oval	förmig.
to		bis zylindrisch	Sporen oval bis
OO		(95OX) in Ket	zylindrisch,
co		ten von 8-10	1,0 bis 1,2 χ
IO *		(Durchschnitt).	1,8 bis 2,2/u.
		Mittlere Größe
Ι2Π	-	1,2 χ 1,7/u.
	Czapek Dox	Mäßiges Wachs	Wachstum dünn,
	Agar	tum.	farblos bis
	(Saccharose	Vegetatives	cremefarben.
	Nitrat)	Wachstum farb	Rand federartig,
	Agar	los .	in das Medium
		Rückseite	eindringend.
		farblos.	Luftmycel pul
		Luftmycel	verig, gräulich
		spärlich, weiß.	weiß bis hell
		Kein lösliches	gelb-grau.
		Pigment.	Lösliches Pig
			ment fehlt oder
			gelblich-braun.

Bergey

Luftmycel: Hyphenverzwei· gung monopodial und unregelmäßig; coridla
ellipsoid bis zylindrisch, 1,0 bis 1,2 χ 1,8 bis 2,2/u.

Waksman

Sporophoren,
monopodiale Verzweigungen, gewunden, erzeugen offene Spiralen.

Sporen sphärisch bis oval,
glatt.

Bergey

Luftmycel: weiß, wird bräunlich-grau bis dunkelgraubraun in 5-10 Tagen,

Sporophoren gerade, gewunden; keine Spiralen. Sporen sphärisch bis ellipsoid, , längster Durch- ^ messer 1,5 A". Wachstum; * s.Anmerkung.

Nur das Substrat
wächst.

Gelegentlich wird
schwach bräunliches Pigment erzeugt .

PortSetzung der TABELLE:

Glycerin-Aspargin-Agar

ν* Synthetischer
° Agar

Glucose-Aspargin-Agar

Streptomyces griseoluteus

Streptömyces sureofaciens

(593A)

Wachstum mäßig. Vegetatives Wachstum hellbraun .

Rückseite hellbraun .

Luftmycel sehr spärlich, weißlich.

Sehr hellbraunes, lösliches Pigment .

Waksman

Wachstum faltig, cremefarben. Luftmycel dünn,

weiß. Pigment, rötlich-braun.

Bergey

tyaksman

Bergey

Dünner, farbloser bis cremefarbener Wuchs.

Rand gefiedert, in das Medium eindringend . · Luftmycel pulverig, gräulich weiß bis hellgelb-braun. Kein lösliches Pigment oder ein gelblich braunes Pigment .

Fortsetzung der TABELLE:

Streptomyces griseoluteus

Streptomyces aureofaciens

(593A)

Waksman

Bergey

Glucose-Aspargin- Fleischextrakt-Agar

K> OO

Glucose Agar

Faltiges, cremefarbenes Wachstum.

Luftmyeel dünn, weiß.

Rötlich-braunes Pigment.

Tomatenpaste-Hafermehl- Agar

Gutes Wachstum. Vegetatives Wachstum hellbraun. Rückseite hellbraun. Luftmycel spärlich, weiß. Mittelbraunes, lösliches Pigment.

Waksman

Wachstum glasig,
nach orange-gelb
oder rötlichbraun übergehend,
Luftmycel, falls
vorhanden, weiß
nach aschgrau
oder dunkelgrau
übergehend mit
gelb-brauner
Rückseite.
Schwach gelbliches lösliches
Pigment gelegentlich erkennbar.

Bergey

Wachstum glasig, nach orange-gelb übergehend. Reichlich vorhandenes Luftmycel, weiß, nach tiefgrau oder dunkelgrau übergehend mit gelbbrauner Rückseite. Schwach gelbliches Pigment,

CD «*J CD OO

Fortsetzung der TABELLE:

'Streptorayces griseoluteus

-Streptomyces aureofaciens

(593A)

Waksman

Bergey

■Waksman

Bergey

Emerson's Agar

Gutes Wachstum. Vegetatives Wachstum braun. Rückseite braun. Kein Luftmycel. Sehr hellbraunes, lösliches Pigment.

Agar

VO

Faltig, transparenter Wuchs. Luftmycel dünn, weiß, pulverig. Kein lösliches Pigment oder ein gelblich-braunes Pigment.

Gutes hellbraunes Wachstum.

Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment.

Nähragar

Wuchs faltig, transparent.
Luftmycel dünn, weiß, pulverig. Lösliches Pigment fehlt oder gelblich-braunes,

Wachstum gut, durchscheinend bis bräunlich. Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment.
Melanin-negativ.

Kalzlummalat-Agar

Wachstum schwach bis mäßig. Vegetatives Wachstum farblos. Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment.

ro "co

Fortsetzung der TABELLE:

Entrahmte
Milch-Agar

Pepton-Eisen
Hefeextraktgeneigte
Platte

Erzeugung von
H₂S

Tyrosin-Agar

ο
ι

Streptomyces griseoluteus

Streptomyces aureofaciens

(593A)

Vegetatives Wachstum schwach gelblich braun.
Luftmycel spärlich, weiß.

Kein lösliches Pigment.
Hydrolyse.

Gutes Wachstum. Vegetatives Wachstum schwach-braun. Kein Luftmycel. Melanin-negativ.

Mäßiges Wachstum. Vegetatives Wachstum farblos. Kein Luftmycel. Kein Braunwerden des Mediums.

•Waksman

Bergey

Waksman

Bergey

Negativ

Meist negativ

	-	(593A)	Streptomyces griseoluteus	Bergey	ro cn Streptomyces aureofaciens	* . ■	Bergey
	Kartoffel	Mäßiges Wachs	Waksman	Reichliches,	Waksman		Faltiges,
	pfropf	tum .	Reichliches	faltiges, creme	Wachstum liche-		orangegelbes
		Kolonien hell bis	Wachstum, fal	farbenes Wachs	noid, hellorange-		Wachstum.
		mittelbraun.	tig, creme	tum.	gelb bis braunrot		Farbe -des
		Kein Luftmycel.	farben.	Luftmycel stau	bis purpur röt		Pfropfens un
		Lösliches Pigment.	Luftmycel stau	big weiß, dünn.	lich.		verändert .
			big weiß, dünn.	Der Pfropfen	Kein Luftmycel.
O			Der Pfropfen	wird schwach	Farbe des Pfrop
co			wird schwach	bräunlich.	fens .unverändert
OO OO	Stärke-Agar	Wachstum gut.	bräunlich.	Stärke wird	V
^		Vegetatives	Hydrolyse.	hydrolysiert.
PO		Wachstum faltig,
PO		hellgelblich-
ro		braun .
O		Kein Luftmycel.
		Kein lösliches			■ ■ ■ . , ■ ■
		Pigment.
		Hydrolyse.
	Reduktion	Nitrite werden		Nitrite werden
	von	aus Nitraten er	Positiv.	aus Nitraten er
		zeugt.		zeugt.

PortSetzung der TABELLE:

Streptomyces grlseoluteus

Streptomyces aureofaciens

(593A)

Milch

Waksman

Oberflächenring cremefarben.
Luftmycel in
Form von weißen
Flecken.

Bergey

Cremefarbener Ring; weiße Oberfläche, Flecken.

O	Entrahmte	j,	Mikro-aero-	Kein sichtbares
O	Milch		phiies	Wachstum, Koagu
CD			Wachstum.	lation.
GO			Saure Reaktion
*y			(pH 5,0)
	Lackmus,		Kein sichtbares
rs*	Milch		Wachstum.
IO			Koagulation.
INJ O			Saure Reaktion.
	Temperatur		Gutes Wachstum
		bei 280C.
	Kein Wachstum
	bei 50°c.
	(Hefe-Extrakt-
	Dextrose-Stichkul
	tür.)
	Gutes Oberflächen
	wachstum und ent
	lang l/k der
	Stichlinie.

Waksman

Begrenztes Wachstum, gelblichbraune Oberfläche.
Koagulation und
Peptonisierung
schwankend (oft.
keine, gelegentlich doch).

Bergey

Begrenztes gelblich-braunes Wachstum. Keine Koagulation oder Peptonisierung,

CJ) OO

Portsetsung der TABELLE:

Gelatine
stich

Nährgela-

tine-Plat-

ten

Glukosebrühe

Streptomyces griseoluteus

Streptomyces aureofaciens

(593A)

Kein Wachstum beim ersten Test. Bei stärkerer Animpfung war die Verflüssigung nach 3 Wochen vollständig.

Nur Oberflächenwachstum. Kein lösliches Pigment.

Gutes Wachstum. Vegetatives Wachstum faltig, hellgelblich-braun. Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment...
Verflüssigung.

Waksman
Kein Wachstum.

Bergey

Waksman

Bergey

Kein Wachstum. Cremefarbener Keine Verflüs-

Oberflächenring. sigung. Verflüssigung keine bis begrenzte. Kein lösliches Pigment.

Cremefarbener bis
brauner Oberflächenring.

Luftmycel pulverig,
weiß.

Lösliches rötlichbraunes Pigment
schwach, erzeugt.

11263

fV

Kohlenhydrat-Verwertung Glucose

Fructose

Rhamnose

Xylose

Mannose

Arabinose

Inosit Mannit Lactose .Raffinose Saccharose + (hellbraunes, lösliches Pigment)

+ (mittelbraunes, lösliches Pigment)

+ (mittelbraunes, lösliches Pigment)

+ (mittelbraunes, lösliches Pigment)

+ (mittelbraunes, lösliches Pigment) ' ·

■ + (sehr schwach-braunes, lösliches Pigment)

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11263 fS

Die obigen Beschreibungen der Mikroorganismen, welche die Verbindung 593A erzeugen, dienen zur Veranschaulichung geeigneter Stämme von Streptomyces griseoluteus, die zur Herstellung von 593A verwendet werden können, es ist jedoch klar, daß die vorliegende Erfindung nicht auf Organismen beschränkt werden soll, welche diesen speziellen Schilderungen entsprechen· Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung anderer Stämme von Streptomyces griseoluteus, entweder aus der Natur isoliert oder durch Mutation dieser Organismen erhalten, wie diejenigen, die durch natürliche Auswahl erhalten wurden oder diejenigen, die durch mutierende Mittel erzeugt wurden.

Das neue Produkt der vorliegenden Erfindung kann entweder von Oberflächenkulturen oder submersen Kulturen erzeugt werden; vorliegend zieht man es jedoch vor, die Fermentation im submersen Zustand durchzuführen. Fermentationsansätze in kleinem Maßstab können gewöhnlich hergestellt werden, indem man geeignete Mengen Nährmedium in Kolben bringt, die Kolben und den Inhalt durch 20 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120⁰C sterilisiert, die Kolben mit vegetativen Kulturen eines 593A erzeugenden Stammes von Streptomyces griseoluteus animpft, die Kolben mit Baumwolle locker verschließt und die Fermentation 3 bis 5 Tage lang auf einer Schüttelvorrichtung in einem temperaturkonstanten Raum bei 28⁰C vonstatten gehen läßt. Größere Fermentationsansätze können hergestellt werden, indem man Behälter geeigneter Größe verwendet, die mit einem Rührer und Vorrichtungen zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgestattet sind. Bei diesem Verfahren werden das Medium und die das sterilisierte Medium enthaltenden Behälter mit einer vegetativen Kultur angeimpft. Man läßt die Fermentation 2 bis 4 Tage lang unter konstantem Rühren oder Belüften des Nährmediums bei konstanter Temperatur von etwa 28⁰C von-

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statten gehen. Bei der Durchführung der Fermentation nach diesem Verfahren kann es wünsehenswert sein, eine geringe Menge eines geeigneten Antischaummittels zuzufügen. Zu geeigneten Mitteln gehören Sojabohnenöl, Rizinusöl, 1 $iges Octadeoanol in Mineralöl oder ein polymerisiertes Propylenglykol, wie Polyglykol 2000. Diese Mittel beherrschen ein zu .starkes Schäumen, das während der Fermentation in der Fermentationsbrühe stattfinden kann.

Wäßrige Medien, wie sie für die Herstellung von Antibiotika ' verwendet werden, sind zur Herstellung der Verbindung 593A geeignet. Derartige Medien enthalten durch die Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze. Ausserdem enthalten die Fermentationsmedien Spuren von Metallen, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind und die gewöhnlich als Verunreinigungen bei der Zugabe anderer Bestandteile des Mediums zugeführt werden.

Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Glucose, Maltose, Fructose und dergleichen und Stärken, wie Getreide, wie z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, entweder allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff im Uährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der im Medium verwendeten Kohl en hydiat quelle oder -quellen richten sich zum Teil nach den anderen Bestandteilen des Mediums, man findet jedoch gewöhnlich, daß eine Menge von Kohlenhydrat zwischen etwa 1 und 6 Gew.-^ des Mediums zufriedenstellend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln benutzt werden oder es können mehrere derartige Kohlenstoffquellen im Medium vereinigt sein.

Zufriedenstellende Stickstoffquellen umfassen zahllose Pro-

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teinmaterialien, wie verschiedene Formen von Hydrolysaten
von Kasein, Sojabohnenmehl, Mais-Einweichwasser, löslichen
Brennereirückständen, Hefehydrolysatren und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen werden entweder allein oder . in Kombination in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 GßW. des wäßrigen Mediums verwendet.

Die Verbindung 593A kann aus der Brühe gewonnen werden, indem man filtriert und das Piltrat unter Vakuum bis auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens einengt und dann
die konzentrierten Brühen Extraktionsverfahren unterwirft.

Beispielsweise kann die Verbindung 593A aus der Brühe oder
einem ihrer Konzentrate durch Extraktion mit einem Lösungsmittel für das Produkt, welches mit Wasser nicht mischbar
ist, wie Butanol oder Chloroform, gewonnen werden. Wird die Brühe bei pH 7 extrahiert, so erhält man die freie Base.
Alternativ kann die Brühe bis zur Trockene eingedampft werden und mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem
niedrigen Alkanol, z.B. Methanol oder Äthanol, extrahiert
werden. ■

Reinere Formen der Verbindung 593A können durch wiederholte ümkristallisation aus heißem Methanol erhalten, werden. Ein
anderes ebenfalls anwendbares Verfahren betrifft die Absorption der Verbindung an Anionenaustauschharzen mit PoIyalkylamingruppen, die an ein Styrol-Divinylbenzol-Polymerisatgitter gebunden sind. Das absorbierte Antibiotikum
wird leicht aus dem Harz mit Wasser eluiert. Eindampfen
des Eluates zur {Trockene führt zur Verbindung 593A, die
durch fraktionierte Ümkristallisation aus Methanol weiter
gereinigt werden kann.

Alternativ kann die Verbindung 593A gereinigt werden, indem

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¹¹²⁶³ * 2Ü2Ö768

man an basischem Aluminiumoxyd oder Silikagel absorbiert und dann mit Äthylacetat oder Methanol eluiert.

Prüfung:

Die Verbindung 593A kann in bezug auf ihre Anti-Tumor-Wirksamkeit zweckdienlich unter Anwendung des.Systems Menschentumor-Wirtsei oder unter Verwendung des KB-Zellkultursystems geprüft werden. Bei der Prüfung der Verbindung 593A mit dem System Menschentumor-Wirtsei werden Tumorimplantate von menschlichen Adenokarcinomen (H.AD.1) auf die Chorioallanto-Membranen von Eiern mit 9-tägigen Embryonen gebracht. Die Eier werden 3 bis 4 Tage lang bebrütet und diejenigen, die positiv ein Angehen ("takes") zeigen, werden für den Test ausgewählt. Die Verbindung 593A wird dann in den Dottersack des Eies injiziert. 7 Tage nach der Injektion werden die Eier geöffnet und die Tumore und Embryonen der behandelten und nicht-behandelten Vergleichsgruppen gewogen und der Prozentsatz an Wachstumshemmung des Tumors und Embryos im behandelten Ei wird auf folgende Weise erhalten:

10 Eier mit implantiertem Tumor werden zum Zeitpunkt der Injektion mit Verbindung 593A geöffnet, um das Durchschnittsgewicht des Tumores zu bestimmen. Der erhaltene Wert wird dann vom Durchschnittsgewicht der behandelten und nicht-behandelten Vergleichstumore zum Zeitpunkt der Isolierung abgezogen, um die tatsächliche Gewichtszunahme der Tumore während der Behandlungsperiode zu bestimmen. Den. Prozentsatz Wachstumshemmung für die behandelten Eier er-> hält man durch Vergleich der Gewichtszunahme der behandel- · ten Tumore mit der Gewichtszunahme der nicht-behandelten Vergleichstumore unter Anwendung der Formel (100-T/C χ 100). Der Prozentsatz Wachstumshemmung für Embryonen wird auf gleiche Weise bestimmt.

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Beim Test der Verbindung 593A auf Anti-Tumor-Wirksamkeit, nach, dem KB-Zellenkultursystem werden "Eagle's"-KB-Zellen (menschliche Epidermoid-Kareinom-Zellen) auf Glas in Milchverdünnungsgefäßen gezüchtet, die jeweils 20 ml Eagle's Basalmedium plus 10 $ Kalbsserum enthalten. Jedes Gefäß

5
erhält 8 χ 10 Zellen. Das Medium wird am 3· und 6. Tag erneuert. Am 7.Tag werden die Zellen mit Hilfe von Trypsin isoliert, zentrifugiert und in Eagle's Medium plus 5 "/> Kalbsserum suspendiert. Das.Volumen des Mediums wird so eingestellt, daß jeweils 1 ml Suspension 1,5 x 10 Zellen enthält. Die Zeilsuspension wird in 2,0 ml Mengen in 16 χ 125 mm Teströhrchen verteilt, zu denen bis zu 0,2 ml Volumina Testsubstanz gegeben wurde. Auf. gleiche Weise werden Teströhrchen hergestellt, in denen die Testsubstanzen fehlen. Die Röhrchen werden in aufrechter Stellung in einer Atmosphäre aus 5 i<> COp und 95 i» Luft bei 37⁰C in den Brutschrank gestellt. Die entstandene Zellschicht, die sich am Boden des Röhrchens bildet, wird nach 5-tägigem Brüten mikroskopisch untersucht. Das Wachstum in dem behandelten Röhrchen wird mit dem Wachstum in den KontrollrÖhrchen verglichen und die cytotoxische ED₁-Q (Dosis die das Zellwachstum zu 50 i» inhibiert) wird für jede Testsubstanz ermittelt. ·"■■■■

Wenn man die Verbindung 593A gegenüber H.AD.1 bei verschiedenen Testkonzentrationen testete und die erhaltenen Hemmungsprozentwerte graphisch auftrug, betrug die Dosis, die das Tumorwachstum zu 60 $ inhibierte (SDg₀) 17/Ug/Ei. Dies ist im Vergleich zu anderen Anti-Tumor-Mitteln beim Test nach dem gleichen Verfahren sehr günstig. Die folgende Aufstellung veranschaulicht dies:

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11263

	2029768	ED60
Anti-Tumor-Mittel	17 /Ug/Ei
593Α	1000 /ug/Ei
Azaserin	3000-7000 /ug/Ei
Hadacidin	20 000 /ug/Ei
Hydroxyharnstoff	8000 /ug/Ei
6-Mercaptopurin	10-130 /ug/Ei
Methyl-mitomycin	250 /ug/Ei
Stickstofflost	3-4 /ug/Ei
Streptonigrin	150-420 /Ug/Ei
Natriumtenuazonat	3-12 /ug/Ei
Triäthylenmelamin

In Übereinstimmung mit der unten erwähnten äntibiotischen Wirksamkeit stellen die Verbindung. 593A und ihre Salze brauchbare Antimikrobenmittel dar. Beispielsweise können sie verwendet werden, um empfindliche Mikroorganismen aus pharmazeutischen Einrichtungen und dergleichen zu entfernen, oder um bestimmte Mikroorganismen aus Lösungen abzutrennen, die Gemische verschiedener Mikroorganismen enthalten.

Wie oben erwähnt, besitzen die Verbindung 593A und ihre Salze auch bedeutende Anti-Tumor-Wirksamkeit und sind geeignete Bezugsverbindungen zum Testen anderer Verbindungen auf diese Wirksamkeit.

Wenn man die Verbindung 593A gegenüber KB-Zellen testete, so fand man, daß die cytotoxische EDc₀ 0,03 bis 0,1 /ug/ml betrug.

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Neben der von der Verbindung 593A gezeigten Anti-Tumor-Aktivität besitzt 59 3A auch antibiotische Wirksamkeit beim lest gegenüber Proteus vulgaris MB 838, Vibrio percolans MB 1272, Pseudomonas stutzeria MB 1231 und Bruceila bronchiseptica MB 965.

Verwendet man Verbindung 593A zur Verringerung des Tumorwachstums so kann sie dem Wirt oral oder parenteral verabreicht werden. Wie bei den meisten Arzneimitteln mit ähnlicher Wirksamkeit kann die verabreichte Dosis nicht starr festgelegt werden. Dementsprechend bestimmt man am besten die Dosis dadurch, daß man die Behandlung auf einem niedrigen Niveau einleitet, wie mit etwa 0,5 bis 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag und die Dosis um 10 bis 50 °/o pro Tag oder jeden zweiten Tag erhöht, vorausgesetzt es wurden keine ungünstigen Reaktionen festgestellt. Die Prüfung vitaler Körperfunktionen und insbesondere Blutuntersuchungen sind daher bei der Pestsetzung der zu ver- \ abreichenden Gesamtdosis erforderlich.

Eigenschaften der Verbindung 593A: ·

Verbindung 593A ist eine basische Substanz, die Salze mit Säuren bildet. Die freie Base, die bei pH 7 aus der Brühe extrahiert werden kann, bildet daher bei Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren das entsprechende Säuresalz, wie das Hydrochlorid, Sulfat, Acetat, Propionat und dergleichen.

Es enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Chlor. Eine typische Analyse des Hydrochloridsalzes zeigte, daß es 40,23 $ Kohlenstoff, 5,85 1< > Wasserstoff, 12,76 fo Stickstoff, 8,50 % Sauerstoff und 32,82 # Chlor enthielt. Diese Analyse ergibt die Summenformel

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. Das Hydro chlor id salz schmilzt nicht unter

Das Infrarotspektrum des Hydrochloridsalzes der Verbindung 593A in Mineralöl (Nujol) ist in Jig. T dargestellt.

Wird Verbindung 593A (die freie Base) mit Acetanhydrid in Anwesenheit von Pyridin bei Temperaturen von O⁰C bis Raumtemperatur umgesetzt, so erhält man ein acetyliertes Derivat oder Acetat, das bei 228° bis 229⁰C unter Zersetzung schmilzt. Das Infrarotspektrum in Mineralöl (Hujol) dieses Acetates nach Kristallisation aus Methanol ist in Pig. 2 dargestellt.

Verbindung 593A ist löslich in Wasser, niedrigen Alkanolen, Wie Methanol, Äthanol und Butanol. und Chloroform. Die freie Base hat in Wasser bei pH 7 eine geringe Löslichkeit, löst sich aber beim Erhitzen. Das Produkt ist in wäßrig sauren Lösungen bei pH 2 löslich, wobei es das Salz mit der Säure bildet.

Die freie Base kann in ein Hydrochloridsalz überführt werden, indem man eine methanolische Lösung, welche die freie Base enthält, mit einer niedrigalkanolischen (vorzugsweise methanolischen) Lösung von Chlorwasserstoff ansäuert. Verbindung 593A ist bei Raumtemperatur 24 Stunden lang in wäßriger Lösung bei pH 2 und 10 stabil. Sie wird nach 3 bis 5.Minuten bei 100⁰C bei pH 7 in wäßriger Lösung labil. Man fand, daß bei 50 bis 6O⁰C der Zerfall langsam vonstatten geht, dabei ist etwas freie Base noch nach 3 Stunden feststellbar. Saure Hydrolyse (6n HCl, 16 Stunden bei 100⁰C) führt zum voll.- 'ndigen. Zerfall.

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Beispiel 1 . ■

Fermentation der Verbindung 593A

Eine lyopMlisierte Kultur der Verbindung 593A (Streptomyces griseoluteus NRRL 3412) wurde in 2 ml eines Mediums suspendiert, das aus Y.E.D. plus Salzen (I¹B) bestand und wurde dazu verwendet, Schrägkulturen anzuimpfen, die das gleiche Medium plus 2 $ Agar enthielten. Die Schrägkulturen wurden dann bei 28⁰C 5 Tage lang öder bis sie gut Sporen gebildet hatten, in den Brutschrank gestellt.

Zur sporenbesitzenden Schrägkultur gab man 10 ml eines Mediums mit einem pH von 7 bis 7»2, bestehend aus:

Dextrose 1 $

H-Z-Amin 1 <$, .

HaCl 0,5 % ■

Fleischextrakt 0,3% destilliertes Wasser q.s.ad

und das Wachstum auf der Schrägkultur wurde in die Suspension geschabt und zum Inokulieren eines 250 ml Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml des gleichen Mediums enthielt. " Der angeimpfte Kolben wurde dann auf eine Drehschüttervorrichtung gebracht und bei 28⁰C 72 Stunden lang oder bis ein gutes vegetatives Wachstum erreicht war, bebrütet.

Ein 10. ml Inokulum des erhaltenen vegetativen Wachsturns wurde dann verwendet, um einen 2 Liter Erlenmeyer-Kolben anzuimpfen, der 500 ml sterilisiertes Medium der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben angegeben ist, enthielt, und der inokulierte Kolben wurde dann auf eine Drehschüttervorrichtung gebracht'und 72 bis 96 Stunden lang bei 28⁰C, oder

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bis ein gutes vegetatives Wachstum erreicht war, bebrütet.

Die entstandene Fermentationsbrühe wurde verwendet, um ein 189 Ltr. (50 gallon) Permentationsgefäß aus rostfreiem Stahl anzuimpfen, das 160 Ltr. des Mediums der obigen Zusammensetzung enthielt. Das angeimpfte Medium wurde bei 28⁰C unter Rühren bei 150 Upm bebrütet, wobei man einen Luftdurchfluß von 85 l/min (3 c.f.m.) durch die Fermentationsbrühe beibehielt. Während der 72-bis 96-stündigen Fermentationsperiode gab man geringe Mengen eines Antischaummittels (Polyglycol 2000) hinzu, um die Schaumbildung des Ansatzes zu beherrschen.

8,3 i° der entstandenen Brühe wurde dann dazu verwendet, ein 757 ltr. Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl anzuimpfen, das 440 Ltr. eines Mediums mit einem pH von 7 bis 7,2 enthielt und die folgende Zusammensetzung besaß:

Dextrose	10,0	g/l
Pepton	" 5,0	g/l
NaCl	" 12,7	g/l
Hefeextrakt	3,0	g/l
KCL	0,72	g/l
FeSO4 (M4 )2S04· 6H2O	0,035	g/l
MgCl·6H2O	5,32	g/l
CaCl2'2H2O	0,728	g/l

destilliertes Wasser q.s.ad

Das Inokulum wurde 120 bis 160 Stunden lang unter Rühren bei 130 Upm bebrütet, wobei man einen Luftdurchfloß von 0,283 ογοίη (10 c.f.m.) durch die Brühe aufrechterhielt und gederlichenfalls einen Entschäumer zugab·

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B e i 3 ρ i e 1 2

Filtrierte Brühe (379 1; 100 gal.)» erhalten durch das in Beispiel 1 beschriebene Fermentationsverfahren, wurden filtriert und in Vakuum bis auf ungefähr 60,6 Ltr. (16 gal) eingeengt " und ein Anteil von 18,9 Ltr. (5 gallon) der konzentrierten Brühe wurde lyophilisiert.

Bei s ρ i e 1 2a

Gewinnung der Verbindung 593A aus der Brühe durch Extraktion mit n-Butanol bei pH 2

18,9 Ltr. (5 gal.) der oben erhaltenen konzentrierten Brühe. wurden mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt und fünfmal mit 11,4 Ltr. (3 gal,) nassem Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte wurden dann vereinigt und durch Einengen von Butanol befreit.

Der aus der obigen Butanolextraktion erhaltene saure wäßrige Rückstand wurde mit Uatriumhydroxyd auf pH 10 eingestellt und fünfmal mit 11,4 ltr. (3 gal.) Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte wurden dann vereinigt und im Vakuum durch Einengen von Butanol befreit. Die entstandene konzentrierte alkalische Lösung wurde dann auf einen pH von 7 eingestellt, lyophilisiert und auf ihre Anti-Tumor-Aktivität geprüft. Man stellte folgende Anti-Tumor-Aktivität fest: Die KB-cytotoxische ED₅₀ lag zwischen 3 bis 9 yug/ml. Beim Test gegenüber H.Ad.1 bei 10 mg und 5 mg Dosen pro Ei betrug die Inhibierung des Tumors 80 fo bzw. 60 $>.

V-- · -■■ ■■ ■

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Beispiel 2b

Gewinnung der Verbindung 593A durch. Extraktion mit Methanol

25 g der oben erhaltenen lyophilisierten Brühe wurden mit Methanol extrahiert, indem man die lyophilisierte Brühe in ^25 ml Methanol suspendierte und die Mischung filtrierte, Der erhaltene, Methanol unlösliche Rückstand wurde erneut in 125 ml Methanol suspendiert und filtriert, und die vereinigten Filtrate, die die methanollöslichen Extrakte enthielten, wurden im Vakuum zu einer wäßrigen Lösung einge-P engt und lyophilisiert. Bei der Prüfung dieser Fraktion gegenüber H.Ad.1 bei 15 mg; 7,5 mg und 3175 mg pro Ei wurde das Tumorwachstum zu 85 $, 58 ?έ bzw, 28 $ inhibiert. Die cytotoxische Kb-Zellen ED,-q war geringfügig größer als * 10 /ug/ml.

Beispiel 2c

Gewinnung der Verbindung 593A durch Extraktion mit Methanol Umwandlung in die freie Base - Hydrochlorid und Acetat

1 kg lyophilisierte, filtrierte Brühe, die einen lyophilisierten Anteil aus einer eingeengten §0,6 Istv. (16 gal.) Brühe (erhalten in Beispiel 2) darstellt^ wurde in 5 Ltr. absolutem Methanol suspendiert. Die Mischung wurde dann filtriert, um unlösliches Material zu entfernen und das Filtrat wurde anschließend zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Die eingeengte wäßrige Lösung wurde dann mit Wasser auf 1 Ltr. verdünnt und der pH mit Natriumhydroxyd auf 7 eingestellt. .100 ml (Ί/ΊΟ) dieser wässrigen Lösung wurden lyophilisiert und bei der Prüfung fand man, daß die EB-eytotoxische

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10 /ug/ml betrug; bei einem Gehalt von 5 mg/Ei wurde das H.Ad.i-Tumorwachstuin zu 78 # inhibiert und bei 1,7 mg/Ei zu 64 #. Die restlichen 900 ml der Lösung wurden mit 6 χ 900 ml Butanol extrahiert.

Der erste 900 ml Extrakt wurde in Vakuum bis auf das Wasser eingeengt und die entstandene kristalline Fraktion durch Filtration entfernt, mit Wasser verdünnt und lyophilisiert.. Prüfung der lyophilisierten Probe zeigte eine KB-cytotoxische EDn₀ von 0,1 bis 0,3 /Ug/ml. Das H.Ad.i-Tumorwachstum wurde zu 68 i» und 23 i» bei Dosen von 50 und 25 /Ug/Ei inhibiert.

Der unlösliche Rückstand aus der anfänglichen Äthanolextraktion wurde mit 2500 ml absolutem Äthanol extrahiert. Die äthanollösliche Fraktion wurde nach dem Filtrieren im Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt. Man stellte fest, daß eine kristalline Fraktion aussalzte, sie wurde durch Zentrifugieren entfernt, in Wasser suspendiert und lyophilisiert.

Eine geringe Menge der erhaltenen kristallinen Fraktion wurde mit etwa 5 ml Wasser und etwa 10 ml Methanol vermischt und zur Trockene eingeengt, nachdem man etwa 10 ml Methanol zweimal zugegeben hatte. Die schließlich erhaltenen Festsubstanzen wurden dann in 25 bis 35 ml absolutem Methanol gelöst und 12 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, wonach sich eine geringe Menge kristallines Material' abschied. Die Probe wurde dann 4 Tage lang auf 45⁰C gekühlt und die entstandene kristalline Fraktion durch Zentrifugieren entfernt und im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene kristalline Material zersetzte sich bei 33O⁰C, wobei einibrauner Rückstand zurückblieb·

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11263

Diese kristalline Praktion besaß einen cytotoxischen ₅₀ Wert von 0,01 bis 0,02/ug/ml und inhibierte das Wachstum des H.Ad.i-Tumors zu 84 1» bei 33/Ug/Ei und zu 82 fo bei 11 /ug/Ei. Die Mutterlaugen wurden auf ein geringes Volumen eingeengt, um eine zweite Praktion von Peststoffen mit einem KB-cytotoxischen ED,-Q-Wert von 0,03/ug/ml zu entfernen.

Eine kristalline 80 mg Probe wurde in n/10 Chlorwasserstoff säure gelöst, dann langsam mit n/10 Uatriumhydroxyd " neutralisiert, um sie in die freie Base zu überführen. Es bildete sich ein Niederschlag bei ungefähr pH 7. Er wurde in einem Zentrifugenrohr gesammelt und im Vakuum getrocknet, und ergab 54 ^g Verbindung 593A als freie Base.

Analyse C^H₁^N

	Cl	3
ber.:	20,	07
gef.:	19,

Die so erhaltene freie Base wurde in Methanol gelöst, eine Spur unlösliche Verunreinigung wurde abgetrennt und die Lösung durch Zugabe einer alkoholischen Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingedampft. Beim Stehen bildeten sich weiße Kristalle des Hydrochlorides. Die Kristalle wurden durch Kristallisation aus Methanol gereinigt und im Vakuum getrocknet. Unter 33O⁰C wurde kein Schmelzpunkt festgestellt.

Titration des kristallinen Hydrochlorides: Äquivalentgewicht 215, pH 1/2 =5»4«

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¹¹²⁶⁵

JJ

Analyse C₇H₁₂Ei₂OCl₂ (211):

	39	C	5	H	1	3	IT	7	0	Cl	5
ber.:	40	,8	5	,74	1	2	,25	8	,59	33,	82
gef.:	,23	,85		,76	,5	32,

Biologische Prüfung in Eiern gegenüber H.Ad.1-T,umor

Dosis	Todesfälle
(/Ug/Ei)
50	1/8
25	0/8
12,5	0/8 .
6,25	1/8

Wachstumshemmung

Embryo

12

- 3
-23

- 8

Tumor

102 83 46

-29

Aus den obigen Daten betrug die ermittelte EDgQ gegenüber H.Ad.1 17/Ug/Ei.

I.E.-Spektrum: s. Figur 1.

Das Acetat der Verbindung 593A wurde hergestellt, indem man 8 mg der freien Base mit 2 ml Acetanhydrid und 2 Tropfen Pyridin bei Raumtemperatur 5 Stunden lang behandelte. Das überschüssige Reagens wurde unter vermindertem Druck abgedampft und das Acetylderivat. wurde dann aus wäßrigem Methanol als kräftige Blättchen kristallisiert, die bei 228 bis 229⁰C unter Zersetzung schmelzen· '

\ - 29 -..'■■■ '■■■.'

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11263	9^15^2^	46	(235)	• •	30	H	1	N	8	Cl	\	1	2029768
Analyse· C		46	C			,46	1	1,	32	15,	50
	ber.:		,2	6	,65		2,		H,	Acetyl
	gef.:	,36	6						.18,3 #
						19,4 tf

IwR.-Spektrum: s. Mg. 2.

Beispiel

2d

Extraktion der Verbindung 593A mit Butanol bei pH 7

Eine 50 g Portion der oben erhaltenen lyophilisierten Brühe wurde in 250 ml Wasser bei pH 7 gelöst und_t fünfmal in 250 ml Butanol, wie in Beispiel 2a beschrieben, extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum bis zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, welche zentrifugiert wurde. Die sich abscheidende unlösliche fraktion wurde erneut in Wasser gelöst und lyophilisiert und besaß bei der Prüfung eine ™ gegenüber KB-Zellen von etwas weniger als 0,3/ug/ml.

Beispiel

Direkte Äthanolextraktion (freie Base) von 593Aaus der

Brühe

4685 g lyophilisierte Brühe, erhalten nach dem Verfahren des Beispiels 1, wurden mit absolutem Äthanol extrahiert, indem man das lyophilisierte Material in 30 Ltr. absolutem Äthanol suspendierte. Die äthanolische Mischung wurde dann filtriert, um unlösliches Material zu entfernen und das

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Filtrat auf ein geringes Volumen eingeengt· Eine im konzentrierten Pil trat auftretende kristalline', Fraktion wurde durch. Filtrieren abgetrennt und die erhaltenen Kristalle •wurden mit Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das erhaltene kristalline Material war gegenüber KB-Zellen bei 0,1 bis 0,3/ug/ml aktiv.

341 mg des erhaltenen kristallinen Materials wurden in 2,5 ml Wasser bei pH 2 gelöst und filtriert. Der saure, unlösliche Rückstand wurde verworfen und das erhaltene Filtrat mit Natriumbicarbonat auf pH'8,0 eingestellt. Die entstandene kristalline Fraktion wurde abfiltriert und die Kristalle wusch man mit Aceton und Äther und trocknete im Vakuum. Bei der Prüfung zeigte das kristalline Material (freie Base) einen KB EDcQ-Wert von 0,3/ug/ml und gegenüber. H. Ad. 1 wurde das lumorwachstum zu 71 und 84 i* durch Dosen von 50 bzw. 25 /ug/Ei inhibiert.

51,9 mg dieses kristallinen Materials wurden umkristallisiert, indem man es in 17 ml heißem Methanol löste und die entstandene Lösung auf 1,2 ml einengte. Die entstandene kristalline Fraktion wurde abfiltriert, mit Äthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Aktivitäten dieser Fraktion waren folgende:

a) Gegenüber KB-Zellen, ED^₀ von 0,03 bis 0,1/Ug/ml.

b) Gegenüber H.Ad.1, Wachstumsinhibierung 77 und 58 # durch Dosen von 50 bzw. 25/Ug/Ei.

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L K) L. O I 00

Beispiel 4 Chloroformextraktion der Verbindung 593A aus der Brühe

18 Ltr. filtrierte Brühe aus der Fermentation, hergestellt nach dem oben in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, wurden auf pH 3»5 eingestellt und dreimal mit 6 Ltr. Portionen Chloroform extrahiert.

. Insgesamt 5 kg Natriumchlorid wurden in der Extraktlösung * (die bei der obigen Chloroformextraktion erhaltene wäßrige Phase) gelöst. Der pH wurde mit Ammoniumhydroxyd· auf 10 eingestellt und mit 5x9 Ltr. Portionen Chloroform extrahiert. Die EDcQ-Aktivität eines jeden chloroformlösli- ' chen Extraktes gegenüber KB-Zellen betrug etwa 0-,3/ug/ml. Behandlung einer methanolischen Lösung des dritten Extraktes mit methanolischem Chlorwasserstoff ergab 140 mg ' weiße Kristalle (als Hydrochloridsalz), die' eine Aktivität (EDcq) von weniger als 0,03/ug/ml gegenüber KB-Zellen besaßen.

1 g des obigen zweiten Extraktes wurde in 5 ml Chloroform

gelöst, — mit 2 ml Äthylacetat

ψ verdünnt und diese Lösung wurde über eine 19»05 mm χ 13»97 cm (3/4 x 5 1/2 inch) Kolonne mit basischem Aluminiumoxyd nach Brockmann (aufgeschlämmt in Äthylacetat) geschickt. Beim Eluieren der Kolonne mit 250 ml Äthylacetat wurde aller Farbstoff entfernt und man erhielt 192 mg eines Harzes, das bei der Prüfung eine KB cytotoxische ED₅₀ von 0,3/ug/ml zeigte. Eluieren der Kolonne mit. 250 ml Methanol ergab 737 mg Harz, das eine KB cytotoxische ED^q zeigte die etwas unter 0,03/ug/ml lag. Bei der Überführung dieser Fraktion in das Hydrochlorid erhielt man 123 mg weiße Kristalle mit einer Aktivität gegenüber KB-Zellen im Bereich von 0,03 bis,0,1 /ug/ml.

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009882/2220"

JNSPECTED

1 g des Harzes aus dem ersten Chloroformextrakt wurde in 5 ml Chloroform gelöst, mit 2 ml Äthylacetat verdünnt,und über eine 19,05 mm χ 6,35 cm (3/4 * 2 1/2 inch) Silikagel-Kolonne (aufgeechlämmt in Xthylacetat) geschickt. Beim Eluieren der Kolonne mit 250 ml Ithylacetat erhielt man 245 mg Harz, das eine Aktivität von etwas weniger als ' 0,3/Ug/ml gegenüber KB-Zellen zeigte. Überführte man diese Fraktion in das Hydrochloridsalz, so erhielt man 193 mg weiße Kristalle, die eine Aktivität von 0,03/Ug/ml besaßen.

Die Verbindung 593A und ihre Salze k&inai/verwendet werden um die Anwesenheit von Jjysogenviren in Bakterienstammen festzustellen. Zu diesem Zwecke verursachen 10 bis 30 f/ml der Verbindung, die einer wachsenden Kultur der Bakterien zugesetzt worden sind, eine Lyse der Zellen, die die Lysogenviren enthalten.

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Claims (9)

l6. Juni 1970 11263 MERCK & CO., INC. PAiCENTACTSPRUCHE

1. Neue Zusammensetzung mit antibakterieller und AntiTumor-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie

a) eine'Base ist und Salze mit Säuren bildetj

b) die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Chlor in den Molekularproportionen C₇H₁₁N₂OCl enthält;

c) in Wasser, niedrigen Alkanolen und Chloroform löslich ist*,

d) ein Hydrochloridsalz mit dem in Pig. 1 gezeigten Infrarotabsorptionsspektrum bildet und

e) ein Acetatderivat bei der Umsetzung mit Acetanhydrid in Anwesenheit von Pyridin bei Raumtemperatur bildet, wobei das Acetat bei 228 bis 229⁰C schmilzt und das· in Pig. 2 gezeigte Infrarotspektrum besitzt sowie ihre

Säuresalze·

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11263

2. Verbindung 593A nach Anspruch 1.

3. Säuresalze der Verbindung 593A nach Anspruch 1.

4. Hydrochlorid der Verbindung 593A nach Anspruch

5. · Verfahren zur Herstellung der Verbindung 593A, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Verbindung 593A erzeugende Kultur von Streptomyces griseoluteus in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet wird, bis dem Medium wesentliche antimikrobielle Aktivität verliehen worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces griseoluteus NRRL 3412 verwendet wird ·

7. Verfahren zur Herstellung der Verbindung 593A, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Verbindung 593A erzeugende Kultur von Streptomyces griseoluteus in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet wird, bis das Medium eine. wesentliche antimikrobielle Aktivität besitzt und die Verbindung 593A aus der entstandenen Permentationsbrühe gewonnen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces griseoluteus NRRL 3412 verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt durch Extraktion mit einem Niedrigalkanol oder Chloroform gewonnen wird. ■

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