DE2950980A1 - Antibiotikum bn-183b, verfahren zu dessen herstellung und arzneimittel, welche dieses enthalten - Google Patents

Antibiotikum bn-183b, verfahren zu dessen herstellung und arzneimittel, welche dieses enthalten

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DE2950980A1
DE2950980A1 DE19792950980 DE2950980A DE2950980A1 DE 2950980 A1 DE2950980 A1 DE 2950980A1 DE 19792950980 DE19792950980 DE 19792950980 DE 2950980 A DE2950980 A DE 2950980A DE 2950980 A1 DE2950980 A1 DE 2950980A1
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Description

PAt Jibi VAN Vv ALT Ii OR. ING. L. HOTFMANN (1V30-W6) · 0 IPl.. I NG. W. C ITlE · Ü R. Rl R. HAT. K. H O FFMAN N · Ü I PL.-ING. V.'. ICH N
DIi1L.-ING. K. FUCHSU · DR RER. NAT. B. HANSEN ARABEUASTRASSE 4 (STERNHAUS) · 0-800OMONCHINIiI · TELEFON (089) 911007 · TE IEX 05-?9619 (ΓΑΤΜ 1=)
32 870 o/fi
MEIJI SEIKA KAISHA, Ltd. Tokyo / Japan
Antibiotikum BN-183B, Verfahren zu dessen Herstellung und Arzneimittel, welche dieses enthalten
Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Sie betrifft insbesondere ein neues Antibiotikum BN-183B , das als Kultivierungsprodukt eines spezifischen Stammes vom Genus ι Pseudomonas existiert und das eine starke Wachstumsin-
hibierung gegenüber Gram-positiven und Gram-negativen
j Bakterien aufweist und eine Antikrebs- und Antivirusaktivität hat. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums.
Erfindungsgemäß wird ein neues Antibiotikum, BN-183B, gezeigt, dessen Hydrochlorid folgende Eigenschaften aufweist:
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(1) Elementaranalyse:
C 39,84 %, H 5,25 %, N 6,43 %, Cl 22,90 %
(2) Molekuargcwicht: 383
(3) Molekularformel: C1 4Ii2oN206Cl2*HC1
(4) Schmelzpunkt: Wird bei 1 9O°C braun und schäumt
und zersetzt sich bei 214°C.
(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum : Gemäß Fig. 1
(6) Infrarotabsorptionsspektrum:
Absorptionsbanden bei 3400,3020, 1680, 1620, 1570, 1520, 1400, 1360, 1330, 1270, 1240, 1180, 1160, 1130, 1090, 1080, 1020, 930, 880, 850, 83O, 800, 740, 700 cm"1 und Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2.
(7) Spezifische Drehung: (tfC )" - 9° (c=1, Wasser)
(8) Löslichkeit: Sehr löslich in Wasser, etwas löslich
in Methanol, und kaum löslich in Azeton., Chloroform und A'thylacetat.
(9) Farbreaktionen:
Positiv: Ferrichlorid, Ninhydrin und Fehling1 sehe Lösung
Negativ: Molisch und Biuret
(10) Unterscheidung durch Neutralität, Acidität und Basizität: Verhält sich bei Filterpapier-Elektrophorese als basische Substanz
(11) Aussehen: Weißes bis schwach-gelbliches Pulver
(12) Rf-Werte bei Dünnschichtchroniatographie :
Butanol/Essicjsäure/Wasser (2:1:1) 0,66 Äthylacetat/Essigsäure/
Wasser (60:17:17) 0,34
Butanol/Pyridin/Essigsäure/
Wasser (6:4:1:3) 0,65
030027/0783 " 6 "
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der BN-183B-Substanz, indem man BN-183B produzierenden Stamm vom Genus Pseudomonas kultiviert und aus der Kulturbrühe die BN-183B-Substanz abtrennt und gewinnt.
Fig. 1 zeigt das UV-Absorptionsspektrum des Hydrochloride der BN-183B-Substanz, wobei die Messungen bei einer Konzentration von 10 mcg/ml in destilliertem Wasser (I), O,1n Schwefelsäure (II) und O,1n NaOH (III) vorgenommen wurden, und
Fig. 2 zeigt das IR-Absorptionsspektrum des Hydrochloride der BN-183B-Substanz, gemessen nach KBr-Tablettenmethode.
Ein Beispiel eines BN-183B-Substanz produzierenden Stammes ist Pseudomona sp. BN-183-Stamm (BN-183 Stamm), der aus der Erde in Tokaimura, Ibaragi Prefecture, Japan, isoliert wurde. Der BN-183-Stamm ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan unter der Nummer FERM-P Nr. 3332 und in the American Type Culture Collection (ATCC) under ATCC Nr. 31571 (deponiert am 26. September 1979) deponiert worden.
Die bakteriologischen Eigenschaften des BN-183-Stammes werden in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 105292/77 (veröffentlicht am 3. September 1977)beschrieben (der Ausdruck "OPI" bezieht sich auf eine "veröffentlichte, nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung").
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_ 7 —
(A) Morphologische Eigenschaften
Die auf einem Bouillon-Agar-Medium kultivierten Zellen sind stäbschenförmig, mit einer Größe von 0,5 bis 0,7 χ 0,7 bis 2,0 um und man kann eine Bewegung durch polare Geißeln beobachten. Es bilden sich keine Sporen, noch zeigt sich ein Polymorphismus. Gram-Färbung ist negativ.
(B) Kultureigenschaften
(1) Bouillon-Agar-Medium:
Die schwachbraunen Zellen wuchern. Die Kolonien zeigen kein ausgeprägtes rundliches Wachstum, Dickflüssigkeit und Motalität. Keine Ausbildung von diffundierbaren Pigmenten.
(2) Bouillon-Medium:
Das gesamte Medium ist trüb und es bildet sich eine dünne Haut auf der Flüssigkeitsoberfläche.
(3) Bouillon-Gelatine-Stabkulturmedium: Verflüssigt.
(4) Lakmusmilch-Kultur:
Vollständige Verflüssigung bei zweiwöchiger Kultivierung bei 28°C, wobei eine schwache Alkalinität auftritt.
(C) Physiologische Eigenschaften:
(1) Reduktion von Nitrat: Negativ
(2) Denitrifizierungsreaktion: Negativ
(3) MR-Test: Positiv
(4) VP-Test: Negativ
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(5) Bildung von Indol: Negativ
(6) Bildung von Schwefelwasserstoff: Negativ nach
der Bleipapiermethode
(7) Stärkehydrolyse: Positiv
(8) Verwendung von Zitronensäure: Positiv nach der
Simmons und Christensen-Methode
(9) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen: Als einzige N-Quelle kann ein Ammoniumsalz verwendet werden.
(10) Bildung von Pigmenten: Es wird keine ausgeprägte
Bildung von Pigmenten in King A- und B-Medien festgestellt.
(11) Oxidase: Positiv
(12) Wächst nicht unterhalb 5°C und oberhalb 410C.
(13) Kein Bedarf an Vitaminen oder Aminosäuren.
(14) OF-Test (Heuleifson's Methode): O-Type
(15) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen
(16) Verwendung von Kohlenstoffquellen:
Glucose, Maltose, Xylose, Lactose, D-Arabinose, Cellubiosc, L-Threoain, L-Ornithln und Saccharat.
Der BN-183-Stamm mit den obigen bakteriologischen Eigenschaften wurde mit Stämmen verglichen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974, beschrieben werden und es wurde dabei folgendes festgestellt:
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1. Dieser Stamm gehört zum Genus Pseudomonas, weil er ein Gram-negatives, stäbchenförmiges Bakterium ist, das keine Sporen bildet, mit polaren Geiseln sich bewegt und vollkommen aerob ist.
2. Aus der charakteristischen Fähigkeit, eine große Anzahl von Kohlenstoffquellen zu verwenden, kann man schließen, daß dieser Stamm ein Verwandter von Pseudomonas cepacia ist.
Eine Reihe von Medien, wie sie in üblichen Mikrofermentationsverfahren angewendet werden, kann zum Kultivieron von BN-183B-Substanz produzierenden Stämmen und zur Bildung und Ansammlung der BN-183B-Substanz verwendet werden. Zum Beispiel kann man Glucose, Glyzerin, Dextrin und Hirse-Gelee als Kohlenstoffquelle verwenden. Verwendbare Stickstof fquellen schließen z.B. Pepton, Fleischextrakt, Bouillonpulver, Mais-Maische, Sojabobnenkuchen, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid ein. Anorganische Salze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat werden zusätzlich verwendet, sofern sie benötigt werden. Gewünschtenfalls kann man einen Antischaumbildner zugeben.
Die Kultivierung kann in einem flüssigen Kulturmedium, z.B. nach der Schüttelkulturmethode oder nach der Belüftungskulturmethode durchgeführt werden. Die Kulti Vierungstemperatur liegt optimal im Bereich von etwa 20 bis etwa 35°C und geeignete Kultierungszeiten liegen zwischen 1 und 3 Tagen.
Die BN-183B-Substanz wird hauptsächlich extrazellular in der Kultivierungsflüssigkeit angesammelt. Bei der Untersuchung der BN-183B-Substanz wird deren antibcikte-
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rielle Aktivität genutzt ,und als zu bekämpf ender Stanun Bacillus subtiljij; ATCC 6633. Eine Mischung aus 2 % Mycin-Assay-Agar (Produkt der Kyoei Seiyaku K.K.) und 0,5 % Bacto--Agar (Produkte von Difco) wird als Untersuchungskulturmedium verwendet. Wird die BN-183B-Substanz (Reinprodukt) unter den obigen Bedingungen untersucht, so ist die Beziehung zwischen dem Logarithmus der Konzentration im Bereich von 20 bis 500 mcg/rol und dem Durchmesser der Inhibierungszone linear, wobei die Inhibierungszone einen Durchmesser von 16 bis 29 nm entsprechend dem obigen Konzentrationsbereich hat (Papierscheibenmethode).
Die BN-183B-Substanz kann in der nachfolgenden Weise extrahiert und gereinigt werden, so daß sie dann die physikalischen und chemischen Eigenschaften der vorher angegebenen Art zeigt. Die nachfolgend angegebene Methode ist sehr befriedigend. Hierzu wird die Permentationsbrühe mit dem aktiven Bestandteil filtriert, um Feststoffe abzutrennen. Zum Filtrat wird ein Adsorbent, wie Aktivkohle (z.B. Aktivkohle für chromatographische Zwecke) oder ein sehr poröses Harz (z.B. Diaion HP-20 (Kandelsprodukt der Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan) gegeben und anschließend wird gerührt, wobei die aktive Substanz auf dem Adsorbent adsorbiert wird. Dann wird die aktive Substanz mit einer wäßrigen Acetonlösung oder wäßriger Methanollösung eluiert und die Lösung wird bis zur Trockne konzentriert, wobei man die rohe BN-183B--Substaa erhält. Das Rohprodukt wird dann durch eine geeignete Kombination von Säure-Chromatographie unter Verwendung von CM Sephadex C-25 (ein Produkt der Pharmacia Co., Schweden), einer Gelfiltration, einer Säulen Chromatographie unter Verwendung vom Amberlite IRC-50 und CG-50 (Uandelsprodukt der Rohm und Haas Co. , USA) u-nd dergleichen gereinigt, wobei man ein weißes Pulver aus BN-183B-Substanz erhält.
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-Μ-
Die Trennung zwischen der erfindungsgemäßen BN-183B-Substanz und der BN-183-Substanz gemäß der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 105292/77 kann z.B. durch Dünnschichtchromntographie unter Verwendung von Kieselgel und Äthylacetat/Essigsäure/Wasser (60:17:17 v/v) als Entwicklungsini ttel erfolgen. Die erfindungsgernäße BN-183B-Substanz erhält man, indem man die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,34 bei der oben erwähnten Dünnschichtchromatographie sammelt, während man die BN-183--Substanz der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 105292/77 erhält, indem man Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,55 bei der obigen Dünnechichtchromatographie sammelt und auf diese Weise kann man die erfindungsgemäße BN-183B-Substanz von der bekannten BN-183-Substanz gemäß der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 105292/77 trennen.
Beim Chromatographieren des erhaltenen Pulvers über einer dünnen Schicht von Kieselgel unter Verwendung verschiedener Lösungsmittelsysteme, z.B. Butanol/Escigsäure/Wasser, Äthylacetat/Essigsäure/Wasser, Butanol/Pyridin/Essigsäure/ Wasser und dergleichen, bildet sich bei allen verwendeten Systemen ein einziger Spot. Dies bedeutet, daß das erhaltene Pulverprodukt von BN-183B in reiner Form vorliegt.
Die physikochemischen Eigenschaften der BN-183B-Substanz, als Hydrochlorid, sind die folgenden:
(1) Elementaranalyse:
C 39,84 %, H 5,25 %, N 6,43 %, Cl 22,90 %
(2)Molekuargewicht: 383
(3) Molekularformel: C14H2
(4) Schmelzpunkt: Wird bei 190°C braun und schäumt
und zersetzt sich bei 214°C.
(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum : Gemäß Fig. 1
030027/0783 " 12 "
(6) Infrarotabsorptionsspektrum:
Absorptionsbanden bei 3400, 3O2O, 168O, 162O, 1570, 1520, 1400, 1360, 1330, 127O, 1240, 1180, 116G, 1130, 1090, 1080, 1020, 930, 880, 850, 830, 800, 740, 700 cm"1 und Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2.
(7) Spezifische Drehung: {(h> ) - 9 (c=1 , Wasser)
(8) Löslichkeit: Sehr löslich in Wasser, etwas löslich
in Methanol, und kaum löslich in Azeton, Chloroform und fithylacetat.
(9) Farbreaktionen:
Positiv: Ferrichlorid, Ninhydrin und Fehling1 sehe Lösung
Negativ: Molisch und Biuret
(10) Unterscheidung durch Neutralität, Acidität und Basizität: Verhält sich bei Filterpapier-Elektrophorese als basische Substanz
(11) Aussehen: Weißes bis schwach-gelbliches Pulver
(12) Rf-Werte bei Dünnschichtchromatographie :
Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1) 0,66 Äthylacetat/Essigsäure/
Wasser (60:17:17) O,34
Butanol/Pyridin/Essigsäure/
Wasser (6:4:1:3) " 0,65
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Tabelle 1 zeigt: die minimale Wachstumsinhibierungskonzentration der BN-183B-Substanz gegenüber verschiedenen Mikroorganismen. Es wird die starke Inhibierungsaktivität gegenüber Gram-positive und Gram-negative Bakterien gezeigt und damit die Eignung für medizinische und veterinärmedizinische, sowie für Desinfektionszwecke.
TABELLE
Mikroorganismen
Staphylococcus aureus 2O9P JC-1 Staphylococcus aureus Smith S-424 Staphylococcus epidermidis ATCCl4990 Staphylococcus faecalis ATCC8O4 Escherichia coli NIHJ JC-2 Escherichia coli K-12 IAM 1264 Proteus vulgaris 0X19
Minimale Wachstums-
inhibierungskon-
zentration
(mcg/inl)
0,20 0,20 0,20 0,39 1,56 0,78 6,25
Als Kulturmedium wurde ein Nähragar (Produkt von Difco) verwendet.
Die LD- -Werte der erfindungsgemäßen Substanz bei Mäusen wird in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE
Verabre ichungsweg
Oral
Intravenös
Intramuskulär
Intraperi tonea1
Subkutan
(mg/kg)
50
4,1
4,1
4,3
6,0
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Die BN"183B-Substanz weist auch Antikrebnaktivität auf, und eine diese Substanz enthaltende Zusammensetzung ist ein wirksames /vntikrebsmittel. Lymphocytische Leukämie P-388 oder lymphoide Leukämie L-1210-Zellen wurden intraperitoneal in einer Menge von 1 χ 10 pro Maus auf CDF1 Mäuse oder DDF1 Mäuse (etwa 5 Wochen alt, Körpergewicht 20 - 1 g), transplantiert, wobei jeweils 5 Mäuse in einer Gruppe waren. 24 Stunden nach der Tumortransplantation wurde eine Lösung aus BN-183B~Subctanz in destilliertem Wasser für Injektionszwecke intraperitoneal den Mäusen einmal täglich während 3 aufeinanderfolgender Tage verabreicht. Der Prozentsatz der Erhöhung der Lebensdauer (d.h. ILS) wurde gemessen, dann wurde die Durchschnittsanzahl der Uberlebenstage bei jeder behandelten Gruppe mit der einer Kontrollgruppe, welcher BN-183B-Substanz nicht verabreicht worden war, verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
TABELLE : Dosis pro
Verabreichung		 3 Prozenterhöhung
der Überlebenszeit		 P-388 L-121O
(mg/kg) (%) 66,0 59,5
79,2 45,9
4 54,7 32,4
2 41,5 35,1
1 32,1 10,8
0,5
0,25
- 15 -
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Din Antivirusaktivität wurde mittels eines Gewebekulturtest gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 4 gezeigt werden. Diese zeigen eine sehr starke Aktivität gegenüber DNA-Typ-und RNA-Typ-Viren an. I3ei Tierversuchen unter Verwendung von Mäusen wurde die Anti-Herpes-Virusaktivitüt gemessen, wobei die Anzahl der Tage festgestellt wurde, bei der 50 % überlebten (ET50). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Testmethode wurde wie folgt durchgeführt:
ICR-SlC-Mäuse (männlich, 4 Wochen alt, Körpergewicht 20 * 0,5 g) wurden in Gruppen von jeweils 10 Mäusen verwendet. Herpes simplex -Virustyp II 196 wurde den Mäusen in einer Menge von 10·^ pfu/Maus intraperitoneal verabreicht. 24 Stunden später wurde die BN-I83B-Substanz oder 5-Iodo-2'-deoxy-uridin (IUDR) als Kontrolle intraperitoneal den Mäusen verabreicht. Die Mäuse wurden 2 Wochen beobachtet. Aus Tabelle 5 wird ersichtlich, daß die gleiche Wirkung wie bei der Gruppe, der 100 mg/kg IUDR verabreicht worden war, bei der Gruppe festgestellt wurde, welcher 1,25 mg/kg BN-183B-Substanz verabreicht worden war.
TABELLE
Verwendeter Virus
Influenza Virus AO/PR-8
Newcastle-Krankheit Virus Miyadera
Vaccinia Virus Lister Herpes Virus Typ II 196
Infektiöser pankreatischer Necrosis (IPN) Virus der Regenbogenforelle
Infektiöser hämatopischer Necrosis (IHN) Virus der Regenbogenforelle
Dosis Differenz zwischen
Log TCID1- /ml und
der Kontrolle
(mcg/m)
3,9
3,y
3,9
3,9
2,50
6,OO
3,00
3,83
0,5 0,5
6,801
3,000
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- 16 -
TABELLE
Cumulative Mortalität (%) nach der angegebenen Anzahl Tagen ab Inokulierung des Virus
Arzneimittel Dosis 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 E T50
BN-183B 2,5 0 10 20 70 80 100 (1
7,		 •age)
65
Il 1,25 0 20 20 60 70 70 80 90 90 90 8, 38
IUDR 100 0 0 30 40 60 70 70 70 70 70 8, 50
Kein Arznei
mittel wurde
verabreicht		 0 10 40 90 100 7, 61
Hinsichtlich der Neuheit der vorliegenden Substanz BN-183B mit den vorerwähnten physiologischen und bakteriologischen Eigenschaften wurden japanischen Patentanmeldungen, japanische Patentveröffentlichungen, die japanische Ausgabe von Antiobiotics, Band 1 und 2 und Ergänzungsbände I und II (geschrieben von Yusuke Sumiki),der Index of Antibiotics von Actinomycetes (geschrieben von Hamao Umezawa) und Chemical Abstracts durchgearbeitet. Dabei wurde keine Sub stanz festgestellt, die der BN-183B-Substanz entspricht.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung beschrieben. Es versteht sich, daß eine Reihe von Modifizierungen möglich sind, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
BEISPIEL
15 1 eines Kulturmediums, enthaltend 1,5 % Glyzerin, 1 % Dextrin, 2 % entfettetes Sojabohnenmehl, 0,5 % Kaliumchlorid, 0,2 % Calciumcarbonat und 0,03 % eines Silikonöls als Antischaummittel wurden in einen 30 1 Fermentationstank vorgelegt, 10 Minuten bei 120°C sterilisiert und gekühlt. Pseudomonas sp. BN-183 (FERM-P Nr. 3332), Saatgut, das 2 Tage im gleichen Medium wie vorher erwähnt in
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zwei Sakaguchi-Kolbcn vorkultivierL worden war, wurde aseptisch in dem Fermentationstank inokuliert. Die Saatkultur wurde unter Rühren und Belüften bei 2Ü°C (Fiießgeschwindigke.it der der Luft. 15 l/Min.; Rührgeschwindicjkeit 200 Umdrehungen) kultiviert. Nach zweitägiger Kultivierung erhielt man 13 1 einer Kulturbrühe (130 mcg/ml). Zu der Kulturbrühe wurden 40 g Aktivkohle für chromatographische Zwecke (ein Produkt der Wako Purechemical Industries, Ltd.) gegeben und die Mischung wurde gerührt und die Aktivkohle durch Dekantieren abgetrennt. Die Aktivkohle wurde in eine Säule gepackt. Die Säule wurde mit einem Liter einer 50 %-igen wäßriqen Acetonlösung gewaschen und mit einer 80 %- igen wäßrigen Lösung von Aceton mit einem pH von 2 eluiert, wobei man die aktiven Fraktionen erhielt. Das Aceton in den aktiven Fraktionen wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand auf eine Säule aus 300 ml CM Sephadex C-25 (ein Produkt der Pharmacia Co., Schweden) gegeben, wobei die aktiven Bestandteile darauf adsorbiert wurden. Die Sephadex-Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 0,1m einer wäßrigen liatriumchloridlösung eluiert, wobei man aktive Fraktionen erhielt. Die aktiven Fraktionen wurden auf eine Säule (150 ml) von Diaion HP-20 (Handelsname für ein Produkt der Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) gegeben, wobei der aktive Bestandteil adsorbiert wurde. Die Säule wurde zur Entfernung von Natriumsalz mit Wasser gewaschen und der aktive Bestandteil wurde mit 80 %-iger wäßriger Methanollösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei man 230 mg der BN-l83B-Sub- stanz in Form eines gelben Pulvers mit einer Reinheit von etwa 70 % erhielt.
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BEISPIEL 2
350 1 eines 2 % Glyzerin, 1 % Dextrin, 3 % entfettetes Sojabohnenrr.ehl, 0,5 % Kaliumchlorid, 0,3 % Calciumcarbonat und 0,03 % Silikonöl als Antischaummittel enthaltenden Kulturmediums wurden in einem 570 1 Fermentationstank vorgelegt und 20 Minuten bei. 120C sterilisiert und dann gekühlt. 20 1 von Pseudomonas sp. BN-183 (FERM-P Nr. 3332) Saatgut, vorkultiviert während 24 Stunden im gleichen Fermentationstank wie im Beispiel 1, wurden in den Fermentationstank aseptisch inokuliert. Die Saatkultur wurde unter Rühren und Belüften 2 Tage bei 28 C (Luft-Fließgeschwindigkeit 200 l/Min.; Rührgeschwindigkeit 100 Umdrehungen pro Minute) kultiviert, wobei man 320 1 einer Kulturbrühe (200 mcg/inl) erhielt. Die Feststoffe wurden abfiltriert, wobei man 300 1 FiItrat erhielt.
Zum Filtrat wurden 30 1 Diaion HP-20 gegeben und die Mischung wurde gerührt, wobei der aktive Bestandteil auf dem Harz adsorbiert wurde. Das Harz wurde mit 60 1 einer 50 %-igen wäßrigen Methanollösung gewaschen und dreimal mit 60 1 einer 80 %-igen wäßrigen Methanollösung eluiert, wobei man den aktiven Bestandteil erhielt. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und die wäßrige Lösung wurde auf 50 1 mit Wasser verdünnt. Die verdünnte wäßrige Lösung wurde auf eine 9 1 Säule von CM Sephadex C-25, das zuvor mit Wasser angequollen worden war, gegeben, wobei der aktive Bestandteil adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 12 1 Wasser gewaschen und mit. O. 1 m einer wäßrigpn Nähriumrhloridlösung eluiert. Die aktiven Fraktionen (16 1) wurden auf eine 10 1 Säule Diaion HP-20 gegeben, wobei die aktiven Bestandteile adsorbiert wurden. Das Harz wurde mit Wasser zur Entfernung von Natriumchlorid gewaschen und dann mit einer 50 %-igen wäßrigen Methanollösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck konzentriert, wobei man 8,3 g der BN-183B-Substanz als gelbes Pulver mit einer
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Reinhe.i.'; von etwa 90 % erhielt.
Das Pulver wurde in 300 ml Methanol gelöst. Die unlöslichen Bestandteile wurden entfernt und die Lösung wurde durch eine Säule aus 200 ml Aktivkohle, gefüllt mit Methanol geschickt und mit Methanol entwickelt. Die aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei man 6,7 g der BN-183B-Substanz als reines Produkt erhielt.
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Claims (5)

  1. HOFFMANN · j;vj:Wi ,V PAR'II^U
    Cn. IiJU. f.. MOI I'V.ANN (iviO-lWö) · [) I Pl.-! I! C. VV. E ITl C · DR. Rt K. ΝΛΤ. K. H OF ΓΜΑΝ Ν · Ol PI.· IKG. W. IEII N
    DIPL.-ING. K. FOCMSIE · DR. RE B. Ν/,Τ. I). H A rl S E N /UABEIIASIRA-SSLJ(STiRNHAUS) ■ D-COOO MONCHCN 81 · Tf.i.L f ON (ΟΓ-V) »11087 · TElEX 05-i7ilS (PATH C)
    32 870 o/f.i.
    MEIJI SElKA KAISMA, Ltd. Tokyo / Japan
    Antibiotikum BN-183B, Verfahren zu dessen Herstellung unc' Arzneimittel, -welche dieses enthalten
    Patentansprüche :
    '. Antibiotikum EN-183B und pharmaseutisch annehmbare Salze davon, wobei das Hydrochloric folgende charakteristische Daten hat:
    (1) Elementaranalyse:
    C 39,84 %, H 5,25 %, N 6,43 %, Cl 22,90 %
    (2) Molokuargewicht: 383
    (3) Molekularformel: C14H7 N2O-Xl0 -HCl
    (4) Schmelzpunkt: Wild bei 190°C braun und schäumt
    und zersetzt sich bei 214°C.
    (5) Ultraviolettabsorptionsspektrum : Gemäß Fig. 1
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    ORlGtNALJNSPECTED
    (6) Infrarotabsorptionsspektrum:
    Absorptionsbanden bei 3400, 3020, !68O, 1G20, 1570, 1520, 1400, 1360, 1330, 1270, 1240, 1180, 1160, 1130, 1090, 1080, 1020, 930, 880, 850, 830, 800, 740, 700 cm"1 und Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2.
    (7) Spezifische Drehung: ((L ^ - 9° (c=1, Wasser)
    (8) Löslichkeit: Sehr löslich in Wasser, etwas löslich
    in Methanol, und kaum löslich in Azeton, Chloroform und Äthylacetat.
    (9) Farbreaktionen:
    Positiv: Ferrich.lorid, Ninhydrin und Fehling1 sehe Lösung
    Negativ: Molisch und Biuret
    (10) Unterscheidung durch Neutralität, Acidität und Basizität: Verhält sich bei Fiiterpcipier-filekt.ro--
    phorese als basische Substanz
    (11) Aussehen: Weißes bis schwach-gelbliches Pulver
    (12) Rf-Werte bei Dünnschichtchromatographie :
    Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1) 0,66 Äthylacetat/Eεsigsäure/
    Wasser (60:17:17) 0,34
    Butanol/Pyridin/Essigsäure/
    Wasser (6:4:1:3) 0,65
  2. 2. Verfahren zur Herstellung des neuen /Antibiotikums BN-183B, dadurch gekennzeichnet, daß man einen BN-183B produzierenden Stamm vom Genus Psoudomonas kultiviert und die Substanz BN-183B anreichern läßt und daß man die EN-183B-Substanz aus der Kulturbrühe gewinnt.
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  3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die BN--183B produzierende Substanz Pseudomonas sp. BK-183 (FERM-P Nr. 3332, ATCC Nr. 31571) ist.
  4. 4. Pharniaceutische Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung von von Tumoren oder Krebs befallenen Lebewesen , dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil die Substanz BN-183B gemäß Anspruch 1 zusammen mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthält.
  5. 5. Pharmazeutische Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung von Lebewesen, die von einem Virus befallen sind, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil die Substanz BN-183B gemäß Anspruch 1 zusammen mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthält.
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IL58964A (en) 1982-09-30
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GB2039881A (en) 1980-08-20
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