DE3132786C2 - Antibiotikum SF-2103A, Verfahren zu dessen Herstellung und antibiotisches Mittel, welches das Antibiotikum enthält - Google Patents

Abstract

Ein Antibiotikum SF-2103A oder ein Salz davon und ein Verfahren zur Herstellung desselben werden beschrieben, wobei das Verfahren darin besteht, daß man einen eine Antibiotikum SF-2103A-Substanz produzierenden Stamm in einem Nährmedium kultiviert und die gewünschte Substanz aus der Kulturbrühe gewinnt.

Description

gefunden (%) 23,62 2.44 3,00 42,16 13,81

14.97 (bestimmt durch Atomabsorptionsanalyse)

(5) Ultraviolcttabsorptionsspektrum mit einer maximalen Absorption in einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,2) bei 266 bis 267 nm (Elä,= 126) und 230nm (DjI= 118);

(6) Infrarotabsorptionsspektrum, bestimmt durch die Kaliumbromid-Tablettcnmethode, mit Absorptionsbanden bei 3450, 1755. 1610. 1390. 1220, 1080, 1040. 940, 900. 780 cm"¹;

(7) kemmagnetisches Resonanzspektrum: das 100 MHz-kernmagnetische Resononzspektrum. bestimmt in schwerem Wasser mit Tetramethylsilan als äußerer Standard, zeigt Signale bei δ 1,55 (d, 3H), δ 2.99 (dd. IH), δ 3.44 (dd. IH). 63,94(dd,1H),64,48(m.1H)und64.94(m.1H);

(8) Dünnschichtchromatografie:

a) Rf-Werte auf einer dünnen Zellulose-Schicht (Zellulose F₂₅₄) entwickelt bei 5⁰C mit folgendem Lösungsmittel:

Lösungsmittel	R!
n-Butanol: Isobutanol: Wasser
(7:7:6 Vol.)	0,30
70 Vol.-%ige wäßrige
n-Propanollösung	0.52
70 Vol.-%ige wäßrige
Ethanollösung	0.62
80 Vol.-%ige wäßrige
Acetonitrillösung	0.37

Methanol, unlöslich in Ethylacrylat, Chloroform und Benzol;

(10) Farbreaktion: positiv für Lemieux- und Ehrlich-Reagenz und negativ für Ninhydrin-Reagenz.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2103 A oder eines Salzes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ATCC 31892 in einem Nährmedium kultiviert, die Kulturbrühe von den Feststoffen abfiltriert, das Filtrat auf Aktivkohle adsorbiert, mit 50%iger wäßriger Acetonlösung eluiert, Fraktionen, welche SF-2103 A enthalten, sammelt und konzentriert, nach dem Abdestillieren des Acetons SF-2103 A mit Dichlormethan, enthaltend ein quaternäres Ammoniumsalz, extrahiert, dann reextrahiert mit Natriumjedid enthaltendem Wasser und gefriertrocknet und hierauf das so erhaltene rohe SF-2103 A chromatografisch unter Verwendung von Anionenaustauscherharzen weiter reinigt.

3. Antibiotisches Mittel, enthaltend neben dem Antibiotikum SF-21O3A ein Penicillin- oder Cephalosporinantibiotikum.

Die Erfindung betrifft das Antibiotikum SF-21O3A der Formel

SOjH

COOH

b) nach Entwicklung auf DEAE-Zellulose (Polygram CEL 300 DEAE) bei 5⁰C mit einem 0.02M Phosphatpuffer (pH 7.2). enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, unter Verwendung von MC 696-SY2-A-Substanz als Kontrolle, wurden Rf-Werte von 0.31 festgestellt, wogegen die SF-2103-A-Substanz Rf-Werte von 0.14 hat;
(9) Löslichkeit: gut löslich in Wasser, löslich in und dessen Salze mit den in Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2103A und dessen Salze (vgl. Anspruch 2), sowie ein antibiotisches Mittel.

Fig. 1 bis 3 sind Ultraviolettabsorptionsspektren. Infrarotabsorptionsspektren bzw. kernmagnetische Resonanzspektren der antibiotischen Substanz SF-21O3A (Natriumsalz).

Der Stamm, welcher SF-21O3A bildet, ist der Streptomyces sp. SF-2103-Stamm. der aus Erde isoliert wurde, die in Katsuura, Wakayama Prefecture. Japan, gesammelt wurde und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31892 hinterlegt wurde.

4 g der Erde wurden in 40 ml sterilisiertem Wasser in einem 100 ml Erlenmeyer-Kolben suspendiert. 10 Minuten geschüttelt und dann 15 Minuten stehen gelassen. Danach wurden 4 ml der überstehenden Flüssigkeit auf das lOOOOfache mit sterilisiertem Wasser verdünnt.

Dann wurden 0.5 ml der so verdünnten Flüssigkeit in eine zuvor sterilisierte Petrischale gegeben und vollständig mit 20 ml eines Agarmediums zum Trennen, wie es nachfolgend beschrieben wird, vermischt, bei 45 bis 5O⁰C gehalten und dann verfestigt.

Die Petrischale wurde 10 Tage bei 28 C kultiviert und Kolonien aus dem SF-2103-Stamm. die auf dem Agarmedium wuchsen, wurden zu einer Hefe-Stärkeagar-Schrägkultur (Hefeextrakt: 0.2%. lösliche Stärke: 1.0%, Agar: 2.0%: pH 7.0) überführt.

b5 Die Zusammensetzung des Agarmediums zum Trennen war die folgende: Hefeextrakt: 0.05%. lösliche Starke: 0.25%. Agar: 2.0%. Rest: Leitungswasser: pH 7.0.

Die Eigenschaften des Actinomyces SF-2103-Stammes sind die folgenden.

I Morphologische Eigenschaften

Mycele und Sporen werden auf Kulturmedien, wie Stärkeagar, Weizenmehlagar und Hefenulzagar, gebildet. Die Verzweigungen der Luftmycele ist monopodial und quirlähnliche Verzweigungen werden nicht gefunden. Am Ende der Luftmycele befinden sich fast gerade Sporenketten. Keine speziellen Strukturen, wie Sclerotium und Sporangium, wurden festgestellt.

Mikroskopische Beobachtungen zeigen, daß Sporen mit einer glatten Oberfläche in ovaler oder eiförmiger Form einer Größe von 0,7 bis 0,8 χ 1,0 bis 1,5 μπι vorliegen und im allgemeinen eine Kette aus 10 oder mehr Sporen bilden.

Tabel'e 1

II Kultureigenschaften

Die Kultureigenschaften von SF-2103-Stamm auf verschiedenen Kulturmedien werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Beobachtungen wurden nach einer 14- bis 29tägigen Kultivierung bei 28 ⁰C durchgeführt. Die in Tabelle 1 gezeigte Farbe wurde identifiziert gemäß dem Farbstandard des Color Harmony Manual, 4. Ausgabe, veröffentlicht von Container Corporation if America, Chicago, Ul., USA (1958).

Die schwachrosa Farbe der Luftmycele auf Stärkeagar-, Weizenmehlagar- und Hefemalzagarmedien verschwand mit zunehmender Sporenbildungsfähigkeit. Weiterhin zeigten die Luftmycele eine stärkere Tendenz zum Schmelzen und Verschwinden bei Fortschreiten der Kultivierung nach einer gewissen Zeit.

Kulturmedium	Wachstum und Umkehrfärbung	Luftmycel	lösliches Pigment
Saccharose-Nitratagar	sehr geringes Wachstum, farblos	keines	keines
Glukose-Asparaginagar	geringes Wachstum, farblos	keines	keines
Glyzerin-Asparaginagar	geringes Wachstum, farblos	keines	keines
Stärkeagar	mäßiges Wachstum, hellbeige	mäßig hellrosa (5 cb)	etwas graurosa
Weizenmehlagar	mäßiges Wachstum, hellbeige	mäßig hellrosa (5 cb)	keines
Hefemalzagar	gutes Wachstum, hellbeige	mäßig hellrosa (5 cb)	keines
Tyrosinagar	schlechtes Wachstum, farblos	keines	keines
Nähragar	schlechtes Wachstum, farblos	keines	keines
Kalziummalatagar	schlechtes Wachstum, farblos	keines	keines
Bennefs Agar	gutes Wachstum, gerunzelt	keines	keines

III Physiologische Eigenschaften

1. Wachstumstemperaturbereich: wächst auf Stärkeagar im Bereich von 15 bis 45 ⁰C und die Optimaltemperatur beträgt 25 bis 35 ⁰C

2. Verflüssigung von Gelatine: positiv

3. Hydrolyse von Stärke: positiv

4. Koagulation von entrahmter Milch: negativ Peptonisierung von entrahmter Milch: positiv

5. Reduktion von Nitrat: negativ

6. NaCl-Toleranz: Wachstum findet auf einem Kulturmedium, dem 3% NaCl zugegeben wurden, statt. aber nicht auf einem solchen, dem 5 % NaCl zugegeben wurden

7. Herstellung von Melanoidpigment: negativ

IV Verwendung von Kohlenstoffquellen

(Pridham & Gottlieb Agarmedium bei 28 "C)

1. verwertbar: D-Glukose, L-Rhamnose. D-Fruktose. D-Xylose, L-Arabinose. D-Mannit. Saccharose

2. nicht verwertbar: Raffinose, I-Inosit.

V Zusammensetzung der Zellwandung

Eine Analyse nach dem Verfahren gemäß Becker et al. in Applied Microbiology. Bd. 13. S. 236 (1965) zeigt, daß die in der Zellwandzusammensetzung enthaltende Diaminopimelinsäure vom LL-Typ ist.

Faßt man die obigen Ergebnisse zusammen, so gehört to der SF-2103-Stamm zum Genus Streptomyces und das obere Ende des Luftmycels ist gerade und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt.

Der Farbton in den gereiften Luftmycelen gehört zur Rotfarbserie von H. D. Tresner und E. J. Backus. Applied Microbiology. Bd. 11. S. 335 (1963). und die Umkehrfarbe ist schwach beige. Es wird keine Bildung von melanoidem Pigment festgestellt.

Vergleicht man die vorstehenden taxonomischen Eigenschaften des SF-2103-Stammes mit solchen von bekannten Stämmen vom Genus Streptomyces, so kann man den neuen SF-2103-Stamm identifizieren.

Es wurde festgestellt, daß kein Stamm bekannt war, der identisch hinsichtlich der Eigenschaften des SF-2103-Stammes ist. Etwas ähnlich war Streptomyces alborubidus (International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 22. S. 271-273(1972)).

Es wurden deshalb der Standardstamm von Streptomyces alborubidus. ISP Nr. 5464 (ISP: International Streptomyces Project. International Journal of Systematic Bacteriology. Bd. 18. S. 69 (1968)) und der SF-2103-Stamm verglichen.

Sie zeigten deutliche Unterschiede voneinander hinsichtlich des Wachstums auf verschiedenen Agarböden, obwohl sie verhältnismäßig ähnlich in der Farbtönung der Luftmycele und in der Verarbeitung von Zucker waren. Das heißt, daß das Wachstum von Streptomyces alborubidus auf Saccharosenitratagar und Glukoseapsaraginagarmedium gut war und die Bildung von Luftmycelen gut war. wogegen das Wachstum des SF-2103-Stammes auf den vorerwähnten Medien sehr gering war und keine Bildung von Luftmycelen beobachtet wurde. Vielmehr wuchs der SF-2103-Stamm auf Weizenmehlagarmedium gut unter Bildung von Luftmycelen, wogegen das Wachstum von Streptomyces alborubidus schlecht war. Weiterhin wurde häufig festgestellt, daß die oberen Enden der Luftmycele von Streptomyces alborubidus eine Kreis- oder Hakenform hatten, wogegen das obere Ende des SF-2103-Stammes immer geradkettig war. Darüber hinaus zeigte kein bekannter Stamm die Farbtönung des Luftmycels, die Rotfarbserie, die geradkettige Luftmycelform und die glatte Sporenoberfläche, wie man sie bei dem SF-2103-Slamm fand.

Es wurde infolgedessen daraus geschlossen, daß der SF-2103-Stamm unterschiedlich von allen Spezies von Genus Streptomyces ist und daß er neu ist und deshalb wurde der SF-2103-Stamm Streptomyces sulfonofaciens sp. nov. genannt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der vorerwähnte Stamm in einem Medium, das von bekannten Mikroorganismen assimilierbare Nährstoffe enthält, kultiviert. Solche Nährstoffe können die bekannten Stoffe sein, wie sie üblicherweise zur Kultivierung von Actinomyces-Stämmen verwendet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Glukose, Glyzerin, Stärke, Dextrin, Maltosesirup, Melasse und Sojabohnenöl. Beispiele für Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl. Weizenkleie, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt. Pepton. Hefeextrakt, Maismaische, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Gewünschtenfalls können anorganische Salze, wie Kalziumkarbonat, Natriumchlorid. Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Kobaltchlorid, Ferrosulfat und Phosphate (insbesondere Natriumsulfat und Kobaltchlorid) sowie auch solche organischen und anorganischen Stoffe, die das Mikrobenwachstum unterstützen und die Produktion der gewünschten SF-2103 A-Substanz erhöhen, zugegeben werden. Weiterhin kann man gegebenenfalls auch ein Entschäumungsmittel, z.B. ein Silikon, zugeben.

Für die Kultivierung von Streptomyces sp. SF-2103 sind Flüssigkulturen und insbesondere Tauchkulturen unter Belüftung besonders geeignet. Eine für die Kultivierung geeignete Temperatur liegt bei 20 bis 35 °C. In vielen Fällen ist es bevorzugt, die Kultivierung im Temperaturbereich von 23 bis 30 C vorzunehmen. Die Produktion von SF-21O3A-Substanz erreicht ihr Maximum im allgemeinen in 1 bis 10 Tagen in einer Schüttelkultur oder Tankkultur (Tauchkultur), wobei jedoch die optimalen Zeiten von der An des verwendeten Mediums und der Kultivierungsmethode abhängig sind.

Die SF-2103A-Substanz kann man quantitativ bestimmen, indem man wie bei üblichen Antibiotika deren aniibakterielie Aktivität durch eine Bioassay bestimmt, unter Verwendung eines geeigneten Stammes als Testorganismus, denn diese Substanz hat antibakterielle Aktivität gegen gram-positive und gram-negative Bakterien. Da jedoch die SF-2103 Α-Substanz dadurch charakterisiert ist. daß sie eine starke ß-Laktamase-inhibierende Aktivität und eine antibakterielle Aktivität aufweist, kann man eine neu entwickelte ß-Laktamase-Inhibierungsaktivitätsassay. wie sie nachfolgend beschrieben wird, zur schnellen und genauen Bestimmung anwenden.

Gemäß der neuen. Untersuchungsmelhode wird Fndoß-laktamase, das von Proteus vulgaris M-8243 gebildet wird, als ß-Laktamase verwendet. Die Endo-ß-laktamase wird in einer 2% Kyokuto-Bouillon-Lösung (pH 7 vor der Sterilisierung) inokuliert und bei 32 °C inkubiert. Unmittelbar nach Beginn der Inkubation und 2 Stunden und 4 Stunden nach Beginn der Inkubation wird ein Benzylpenicillinkaliumsalz als ß-Laktamase-induzierende Substanz bis zu einer Konzentration von 250 μ£/πι1 zugegeben und die Inkubierung wird 7 bis 8 Stunden nach deren Beginn fortgesetzt. Dann wird die Inkubierung abgestoppt und der Stamm durch Zentrifugenabtrennung gesammelt. Die Masse der so erhaltenen feuchten Zellen wird in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), deren Volumen zweimal so groß ist wie das der Zellen, suspendiert und dann in eine Zellmühle (z. B. eine französische Druckzelle) gegeben, wo die Zellen zerstört werden. Die erhaltene Suspension wird einer Zentrifugenabtrennung (10000 Upm. 10 Minuten) unterworfen und die ausgefallenen Zellfragmente werden entfernt. Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit wird über Nacht mit 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) bei 5⁰C dialysiert und die erhaltene Dialysatlösung stellt eine rohe ß-Laktamase-Enzymlösung dar. Die Dialysatlösung hat eine ß-Laktamase-Aktivität von 5000 bis 6000 Einheiten (μ/ml), bestimmt nach der modifizierten Methode von Sergeant, zum Messen der Enzymaktivität, wie sie nachfolgend noch beschrieben wird.

Die so erhaltene ß-Laktamase wird zur Herstellung einer Assayplatte verwendet. Eine 2,3%ige Lösung von Nähragar (Difco) wird in einem Autoklaven sterilisiert und auf 45°C gekühlt. Zu 250 ml der Lösung gibt man 0,5 ml von Bacillus subtilis ATCC 6633, das zuvor für Saatzwecke kultiviert worden war. hinzu, sowie eine Menge von 125 Einheiten der vorher erwähnten ß-Laktamase-Lösung und mischt beides. Das erhaltene Gemisch wird auf 250 mm χ 320 mm große, glatte Platten gegossen und verfestigt darauf.

Zur Durchführung der Assay werden 20 μΐ einer zu untersuchenden Lösung auf eine Papierscheibe (Durchmesser 8 mm) aufgebracht, aufweiche 20 μΐ einer 50 böigen wäßrigen Aceionlösung von Cephalotinnatriumsalz in einer Konzentration von 50 μg/ml aufgetragen und dann an der Luft getrocknet worden sind. Die so zubereitete Papierscheibe wird in die Assayschale gegeben und nachdem sie dort 15 bis 17 Stunden bei 37 ⁰C gehalten wurde, tritt eine Inhibierungszone in Abhängigkeil von der Konzentration der SF-2103 A-Substanz auf.

Bei dieser Assay zeigen der Logarithmus der Konzentration der SF-2103 A-Substanz und der Durchmesser der Inhibierungszone eine lineare Beziehung im Bereich von 0,03 μg/ml bis 1 μg/ml der Konzentration der SF-21O3A-Substanz. Auf diese Weise kann man das Antibiotikum SF-2103A genau quantitativ bestimmen.

Die SF-210? A-Substanz akkumuliert hauptsächlich in

einem Kuiturbrühefiitrai. Die in der Kulturbrühc enthaltene SF-2103 A-Substanz kann extrahiert und gereinigt werden, so daß sie dann die physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist, die nachfolgend beschrieben wercen. Für eine solche Extraktion und Reinigung wird folgendes Verfahren vorteilhaft angewendet:

Eine Kulturbrühe, enthaltend die gewünschten Substanzen, wird von den Feststoffen abfiltriert und das Filtrat wird auf Aktivkohle adsorbiert und dann mit 50 %iger wäßriger Acetonlösung eluiert.
' Fraktionen, welche die gewünschten Substanzen enthalten, werden gesammelt und konzentriert. Nach dem Abdestillieren des Acetons werden die gewünschten Substanzen mit einem Haloalkan, z. B. Dichlormethan. enthaltend ein quaternäres Ammoniumsalz, wie Benzyldimethylcetylammoniumchlorid oder Benzyldimethyltetradecylammoniumchlorid, extrahiert und dann werden sie reextrahiert mit Natriumiodid enthaltendem Wasser und gefriergetrocknet, wobei man rohes Antibiotikum SF-2103 A erhält.

Die weitere Reinigung des rohen Antibiotikums SF-2103A kann durch Chromatografie unter Verwendung von Anionenaustauschharzen erfolgen. Zusätzlich kann man Gelfiltermedien zur weiteren Reinigung des rohen SF-2103 A Antibiotikums anwenden.

Eine Analyse des so gereinigten SF-2103A-Substanzpulvers durch Dünnschichtchromatografie unter Anwendung von verschiedenen Lösungsmitteln, sowie andere Analysemethoden (z.B. Hochspannungspapierelektrophorese und Hochgeschwindigkeits-Flüssigchro-

matografie) bestätigen, daß es sich um eine einzelne Substanz handelt.

Das SF-2103A-Antibiotikum ist bei Temperaturen oberhalb Raumtemperatur oder im sauren oder alkalischen Zustand, wie er nachfolgend noch erläutert wird, außerordentlich instabil. Beim Isolieren aus einer KuI-lurbrühe muß man aufpassen, daß die Lösung nicht zu sauer oder zu alkalisch wird und alle Maßnahmen sollten schnell bei niedrigen Temperaturen vorgenommen werden.

Weiterhin ist es schwierig, die SF-2103A-Substanz als freie Säure zu gewinnen, weil sie, wie vorher erwähnt, im sauren Zustand sehr instabil ist. Man gewinnt die SF-2103A-Substanz deshalb als Salz in Form eines hellgelben oder weißen amorphen Pulvers durch Gefriertrocknen einer wäßrigen neulraien Lösung. Die Reinheit der SF-2103A-Substanz variiert in Abhängigkeit von der Stärke der Kulturbrühe.

Die Art des Salzes wird durch das bei der Reinigung verwendete Kation bestimmt. Wird die Reinigung beispielsweise chromatographisch unter Verwendung von DEAE-Sephadex A-25 und von NaCl-Wasser als EIuierungsmittel durchgeführt, so erhält man die SF-2103 A-Substanz als Natriumsalz. Andere pharmazeutisch annehmbare Salze sind Alkalisalze (z.B. das Kaliumsalz), Erdalkalisalze (z. B. Kaliumsalze), anorganische Salze Salze (z. B. Aluminiumsalze unter Ammoniumsalze) und organische Salze (z.B. substituierte Ammoniumsalze), die in gleicher Weise wie bei der Herstellung des Natriumsalzes hergestellt werden können. Um das Natriumsalz in ein anderes Salz zu überführen, kann man eine wäßrige Natriumsalzlösung durch ein Kationenaustauschharz leiten. z.B. durch Dowex 5OW, in dem zuvor die für den Austausch gewünschten Kationen ausgetauscht worden sind. Nachfolgend werden die physikaiischen und chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes der SF-2103A-Substanz, von der man annimmt, daß sie die reinste Form des Produktes darstellt, beschrieben. Es isi jedoch festzuhalten, daß die SF-21O3A-Substanz-Natriumsalz Wasser oder andere Verunreinigungen enthalten kann, weil sie als gefriergetrocknetes Pulver erhalten wird.

Die Eigenschaften der neuen antibiotischen SF-21O3A-Substanz und deren Salze werden nachfolgend gezeigt. Die Eigenschaften des Natriumsalzes der SF-2103A-Substanz sind die folgenden:

1. Farbe und Form: erhalten als weißes Pulver durch Gefriertrocknung,

2. Schmelzpunkt: kein klarer Schmelzpunkt. Verfärbung nach braun und Zersetzung unter Blasenbildung bei 168⁰C.

3. Spezifische Drehung: Μέ°~ 16,3 (c 1, Wasser)

4. Elementaranalyse und Molekularformel (Probe wurde über Phosphorpentoxid bei Raumtemperatur während 27 Stunden vakuumgetrocknet und dann untersucht):

	Berechnet % für	Gefunden %
	C9H8NO10S2Na3 · 2H2O
C	23,53	23,62
H	2,61	2,44
N	3,05	3,00
O	41,83	42,16
S	13,94	13,81
Na	15,03	14,97
		(bestimmt durch
		Atomabsorptions
		spektroskopie)

60

65 Das Molekulargewicht wird aufgrund der Werte der Elementaranalyse und des kernmagnetischen Resonanzspektrums mit etwa 450 berechnet.

5. Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das Ultraviolettabsorptionsspektrum wird in einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,2) bestimmt und zeigt maximale Absorptionen bei 266 bis 267 nm (Ej^_n, = 126) und 230 nm (E[°^_m= 118) wie in Fig. 1 gezeigt wird.

6. Infrarotabsorptionsspektrum: Das Infrarotabsorptionsspektrum, bestimmt durch die Kaliumbromid-Tablettenmethode, wird in Fig. 2 gezeigt und zeigt Absorptionsbanden bei 3450, 1755, 1610, 1390, 1220. 1080,1040,940,900, 780 cm"¹.

7. Kernmagnetisches Resonanzspektrum: Das 100 MHz kernmagnetische Resonanzspektrum wird in schwerem Wasser mit Teiramethyisiian ais äußerer Standard bestimmt und wird in Fig. 3 gezeigt und zeigt die Signale bei δ 1,55 (d, 3H), δ 2,99 (dd, 1 H), δ 3,44 (dd, 1 H), δ 3,94 (dd. IH), δ 4,48 (m, IH) und δ 4,94 (m, IH).

8. Dünnschichtchromatografie:

a) Rf-Werte, bestimmt auf einer dünnen Zelluloseschicht (Zellulose F₂₅₄, hergestellt von Mercj und Co) mit den nachfolgend gezeigten Lösungsmitteln bei 5 °C sind folgende:

Lösungsmittel	Rf-Wert
n-Butanol: Isopropanol: Wasser
(7:7:6 VoI)	0,30
70 Vol.-%ige wäßrige
n-Propanollösung	0,52
70 Vol.-%ige wäßrige
Ethanollösung	0,62
80 Vol.-%ige wäßrige
Acetonitrillösung	0.37

b) Bestimmt auf DEAE-Zellulose (Polygram CEL 300 DEAE der Mercherry Nagel Corp.) mit einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid bei 5 "C und unter Verwendung vuii MC 696-SY2-A-Substanz als Kontrolle (die Substanz wird in Journal of Antibiotics, Bd. 30, S. 770 (1970) beschrieben und ist die gleiche wie MM 4550-Substanz (beschrieben in The Journal of Antibiotics. Bd. 32, S. 295 (1979) ergibt Rf-Werte von 0,31, wogegen die Rf-Werte von SF-2103 A-Substanz der vorliegenden Erfindung 0,14 sind.

9. Hochspannungspapierelektrophorose: Bei Durchführung der Elektrophorese auf einem Filterpapier, Toyo Filter Paper Nr. 51 einer Breite von 15 cm mit dem nachfolgend beschriebenen Puffer bei einer konstanten Spannung von 2800V während 15 Minuten in einer Hochspannungspapiereiektrophorese-Vorrichtung (beschrieben in der japanischen Offenlegungsschrift 14594/ 79) findet Wanderung zur Anodenseite bei 9,3 cm statt, während SF-2103A-Substanz gemäß der Erfindung zur Anodenseite bei 15,3 cm wandert. Die Pufferlösung wird hergestellt, indem man Wasser zu 200 ml Pyridin und 8 ml Essigsäure gibt bis zu einem Gesamtvolumen von 3 1, wobei der pH 6,4 beträgt.

10. Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie: Unter den nachfolgend angegebenen Bedingungen für eine Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie beträgt die Verweilzeit von MC 696-SY2-A (wie vorher erwähnt) 5 Minuten und 40 Sekunden, während die erfindungsgemäße SF-2103 Α-Substanz eine Verweilzeit von etwa 20 Minuten hat.

Bedingungen: Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie,

Vorrichtung: ALC/GPC Modell 244 (hergestellt von Waters Corp.),

Säule: ZIPAX SAX (hergestellt von Du Pont Co., Innendurchmesser 7,9 mm, Länge 50 cm),
Eluierungsmittel: hergestellt durch Auflösen von Natriumnitrat in einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) in einer Konzentration von 0,05 M,
Fließrate: 3 ml/min

Ultraviolettabsorptions-Nachweiswellenlänge: 3313 nm und 254 nm.
Temperatur: Raumtemperatur (etwa 20°C).

11. Löslichkeit: Gut löslich in Wasser, löslich in Methanol und unlöslich in Ethylacetat, Chloroform und Benzol.

12. Farbreaktion: Positiv zu Lemieux- und Ehrlich-Reagcii, negativ zu Ninhydrinrcagcnz.

Aufgrund der vorher angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften hat man geschlossen, daß die Substanz (als Trinatriumsalz) die folgende Strukturformel hat:

CH₃CH
NaO₃SO

Das SF-2103A Antibiotikum wirkt in Kombination mit Penicillin- und Cephalosporinantibiotika, die nicht gegenüber laktamasebildenden Bakterien beständig sind, synergistisch, weil es eine ß-Laktamase-Inhibierungsaktivhät hat und außerdem auch eine antibakterielle Aktivität aufweist.

In den nachfolgenden Beispielen bedeuten Prozente immer Gewichtsprozent, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Ein flüssiges Medium, enthaltend 1 % Glukose. 1 % Stärke, 2% Sojabohnenpuiver, 0,5% Bdumwoüsamenkuchen, 0,2% Natriumsulfat, 0.2% Kalziumkarbonat und 0,0001 % Kobaltchlorid, wurde auf pH 7 eingestellt. Dann wurden 80 ml-Anteile des flüssigen Mediums getrennt in einhundert 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingefüllt, die jeweils mit einem Baumwollpropfen verschlossen und bei 120°C unter Druck 10 Minuten sterilisiert wurden. Der Stamm Streptomyces sp. ATCC 31892 wurde in einem Vorkultivierungsmedium, enthaltend 1 % Glukose, 1 % Stärke, 0.2 % Sojabohnenpulver. 0.5% Pepton. 0,3% Hefeextrakt, 0,2% Fleischextrakt und 0,2 % Kalziumkarbonat, zur Herstellung einer Saatkultur vollständig wachsen gelassen. Dann wurden 1.5 %-Aiiieile dei so hergesiellien Saatkultur jeweils in das flüssige Medium inokuliert und in einem Schüttler 3 Tage bei 28 ⁰C inkubiert, wobei man 7 1 eines Mediums, enthaltend 3^g/ml des SF-2103 A Antibiotikums erhielt.

Beispiel 2

Ein flüssiges Medium mit einem Gehalt an 1 % Glukose, 1% löslicher Stärke, 0,2% Sojabohnenpulver, 0.5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,2% Fleischextrakt und 0,2% Kalziumkarbonat wurde hergestellt und auf pH 7,0 eingestellt. Dann wurden 80 ml-Anteile des flüssigen Mediums getrennt in drei 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingefüllt, die jeweils mit einem Baumwollpropfen verstopft und 15 Minuten in einem Autoklaven bei 120°C sterilisiert wurden. Mit einem Platindraht wurde jeweils eine geringe Menge Streptomyces sp.

ATCC 31892 in jedes der flüssigen Medien inokuliert und dann 2 Tage auf einem Schüttler inkubiert unter Erhalt einer Saatkultur. Anschließend wurden 600 ml-Anteile des gleichen Mediums wie oben getrennt in drei 5 1-Erlenmeyer-Kolben gegeben, die jeweils mit einem Baumwollpfropfen verschlossen und in einem Autoklaven sterilisiert wurden. Jede der in einem 500 ml-Kolben hergestellten Saatkulturen wurde in jedem der 5 1-Kolben inokuliert. Nach der Inkubierung auf einem Schüttler bei 28 ⁰C während 2 Tagen wurde ein ausreichendes Wachstum festgestellt.

Dann wurden 200 1 eines Kulturmediums, enthaltend 2,0% Stärkesirup, 1,2% Sojabohnenpulver, 1,2% Weizenkeime, 0,3% Sojabohnenöl, 0.02% Natriumsulfat.

0,0005 % Gerrosulfat. 0,00005 % Kobaltchlorid und 0.1 % Kalziumkarbonat in einem 300 1 Fermentationstank (pH vor der Sterilisierung 7,0) hergestellt und unter Druck 30 Minuten bei 120T sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde die oben hergestellte Kultur (alle drei 5 1-Erlenmeyer-Kolben) in das Kulturmedium inokuliert und die Kultivierung wurde unter Belüftung und Rühren bei 28°C durchgeführt. Dabei wurde mit 100 U pm zu Beginn und nach 40 Stunden mit 150 Upm gerührt. Die Belüftung betrug 200 l/min während der gesamten Kultivierungszeit. Nach 68 Stunden wurde die Kultivierung abgebrochen und eine Kultur erhalten, die 4.1 μg ml SF-2103 A enthielt.

Beispiel 3

1. Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde wiederholt unter Verwendung von drei 300 1-Fermentationstanks. wobei man 450 I eines Kulturfiltrats des SF-2103 Antibiotikums erhielt. Der durchschnittliche Gehalt an SF-2103 A Antibiotikum war 2.1 ug ml.

2. Das SF-2103 A Antibiotikum wurde wie folgt isoliert: Nach Einstellung von 425 I des wie oben erhaltenen Kulturfiltrats auf pH 5,0 mit 6 N Chlorwasserstoffsäure wurden 12.7 kg Aktivkohle zugegeben und 30 Minuten in einem Rührtank gerührt, um die wirksamen Bestandteile darauf zu absorbieren. Die Aktivkohle wurde abfiltriert und nach Waschen mit 50 1 Wasser wurden 1001 50%iges wäßriges Aceton zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde mit 5N Natriumhydroxidlösung auf pH 8.0 eingestellt und 30 Minuten gerührt, um die Bestandteile wirksam zu eluieren. Nach der Abtrennung der Aktivkohle wurden 100 1 der so eluierten Lösung durch Abdestillieren des Acetons auf 45 1 konzentriert. Dann wurden 30 1 Dichlormethan. enthaltend 0.2 % (W/V) Benzyldimethylcetylammoniumchlorid zu der konzentrierten Lösung gegeben und verrührt, um die wirksamen Bestandteile zu extrahieren. Zu dem so erhaltenen Extrakt wurden 41 einer wäßrigen Lösung, enthaltend 1 % (W/V) Natriumiodid, gegeben, um die wirksamen Bestandteile in die wäßrige Schicht zu überführen. Die wäßrige Schicht wurde durch eine Säule laufen gelassen, die mit 1,5 1 DEAE-Sephadex A-25 gefüllt war und die mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,4 gepuffert war, um eine Absorption der

wirksamen Bestandteile darauf zu bewirken. Nach einem ersten Wachsen mit 15 1 einer 0,1M wäßrigen NaCl-Lösung, gelöst in 20 mMol Phosphatpuffer (pH 7,4) wurden die wirksamen Bestandteile mit 0,2M einer wäßrigen NaCl-Lösung. gelöst im gleichen Puffer wie oben, eluiert. Das Eluat wurde in 100 ml Fraktionen aufgeteilt und die Fraktionen 108 bis 132 waren die aktiven Fraktionen. Dann wurden 241 der aktiven Fraktionen durch eine Säule geschickt, die mit 240 ml

Aktivkohle gefüllt war, um die wirksamen Bestandteile auf der Aktivkohle zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit 400 ml Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 1 1 einer 50% igen wäßrigen Acetonlösung eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Beim Gefriertrocknen der konzentrierten Flüssigkeit erhielt man 709 mg eines Pulvers aus roher SF-21O3A-Substanz (Reinheit: etwa 24%).

3. Das gleiche Verfahren wie in (1) wurde wiederholt unter Verwendung von zwei 300 1-Fermentationstanks, woHei man 285 1 (2,6 μg/ml) eines Kulturfiltrats erhielt. Das Kulturfiltrat wurde mit 6N Chlorwasserstoffsäure auf pH 6,2 eingestellt. Zu diesem Filtrat wurden 95 1 Dichlormethan, enthaltend 0,2% (W/V) Benzyldimethyltelradecylammoniumchlorid gegeben und das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, um die wirksamen Betsandteile zu extrahieren. Zu dem so erhaltenen Extrakt wurden 8.5 leinerO.7 % (W/V) wäßrigen Natriumjodidlösung gegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten gerührt um die wirksamen Bestandteile in die wäßrige Schicht zu überführen. Die wäßrige Schicht wurde unter vermindertem Druck durch Abdestillieren von Dichlormethan konzentriert. Die so konzentrierte Flüssigkeit wurde durch eine mit 400 ml Aktivkohle gefüllten Säule, die mit Wasser beladen war. geschickt und die Aktivkohle wurde mit 300 ml Wasser gewaschen. Die Flüssigkeit und das Waschwasser, welches durch die Aktivkohle lief, wurden vereint und 8,3 1 der vereinten Flüssigkeit wurden durch eine Säule geschickt, die mit 1 I DEAE-Sephadcx A-25 gefüllt war und zuvor mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7.4 gepuffert worden war, wobei die wirksamen Bestandteile absorbiert wurden. Nach einem erstmaligen Waschen mit 10 1 einer 0.2M wäßrigen NaCl-Lösung, gelöst in einem 20 mMol Phosphatpuffer (pH 7.4). wurden die wirksamen Bestandteile mit 0.3M einer wäßrigen NaCl-Lösung, die in dem gleichen Puffer wie oben gelöst war, eluiert. Das Eluat wurde in 150 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei die Fraktionen 17 bis 53 als aktiv bestätigt wurden. Diese aktiven Fraktionen wurden vereint und 5,5 1 der vereinten aktiven Fraktionen wurden durch eine Säule geschickt, welche mit 1.21 Aktivkohle gefüllt war und die zuvor mit Wasser beladen worden war. wobei die aktiven Bestandteile adsorbierten. Nach dem Waschen der Säule mit 2,3 1 Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 5,5 1 50%igem wäßrigen Aceton eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Beim Gefriertrocknen der konzentrierten Flüssigkeit wurden 540 mg eines Pulvers aus roher SF-2103 Α-Substanz (Reinheit etwa 40%) erhalten.

4. Das in einer Menge von 540 mg gemäß (3) erhaltene Pulver der rohen SF-2103 Α-Substanz wurde in 40 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine mit 100 ml DEAE-Sephadex A-25 gefüllte Säule, die zuvor mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,2 gepuffert worden war, laufen gelassen, wobei die wirksamen Bestandteile adsorbierten. Nach dem Waschen mit 200 ml eines 20 mMol Phosphatpuffers (pH 7,2) wurden die wirksamen Bestandteile mit einer 0,2M wäßrigen NaCl-Lösung, gelöst in dem gleichen Puffer wie oben, eluiert.

Das Eluat wurde in 20 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei bestätigt wurde, daß die Fraktionen 110 bis 165 aktiv waren. Diese aktiven Fraktionen wurden vereint und durch eine Säule, die mit 175 ml Aktivkohle gefüllt war laufen gelassen, um die wirksamen Bestandteile zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Aktivkohle mit 300 ml Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 800 ml 50 %igem wäßrigen Aceton eluiert.

Nach dem Konzentrieren unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen wurde das Natriumsalz der SF-2103 A-Substanz in einer Menge von 206 mg (Reinheit etwa 64 %) als hellgelbes Pulver erhalten.

Dann wurden 200 mg des Pulvers in 2 ml Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule geschickt, die mit 200 ml eines D^aion HP-20AG-Harzes gefüllt war. Nach dem Entwickeln mit Wasser wurde das Eluat in 7 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei die

ίο Fraktionen 18 bis 26 die wirksamen Bestandteile enthielten. Von diesen aktiven Fraktionen wurden die Fraktionen 22 bis 24 ausgewählt und kombiniert, unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 60 mg des Natriumsalzes der SF-2103 Αι 5 Substanz (Reinheit etwa 77%) als hellgelbes Pulver erhielt.

5. in i mi Wasser wurden 60 mg des gemäß (4) erhaltenen hellgelben Pulvers gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule geschickt, die mit 200 ml Sephadex G-10 gefüllt war, und mit Wasser entwickelt. Das Eluat wurde in 7 ml-Fraktionen aufgeteilt und die Fraktionen 11 bis 16 als aktive Fraktionen bestätigt. Die Fraktionen 12 und 13 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 32 mg eines Natriumsalzes von reinem SF-2103 A Antibiotikum als weißes Pulver erhielt.

Die Verfahrensweisen gemäß (2) bis (5) wurden unter

Niedrigtemperaturbedingungen (etwa 4 ⁰C) durchgeführt.

Zum Nachweis der Aktivitäten der SF-2103 A-Substanz wurden die nachfolgenden Versuche durchgeführt:

Die antibakterielle Aktivität des SF-21O3A-Natriumsalzes wurde bestimmt durch Agarverdünnungsmethode nach der von der Japanese Chemotherapy Association (siehe Chemotherapy, Bd. 22. S. 1126-1128 (1974)) angegebenen Standardmethode, und die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Teslorganismus	Minimale Inhibie-
	rungskonzentration (μ$Ιτη\)
Staphylococcus aureus 209 P	25
Staphylococcus aureus Smith	25
Bacillus subtilis ATCC 6633	50
Escherichia coli Nr. 29	3.13
Escherichia coli NIHJ JC-2	12,5
Klebsiella pneumoniae PCI 602	50
Proteus mirabilis GV 310	50
Proteus vulgaris GN 76/C-l	25
Proteus niora2nii iCono	25
Shigella dysenteriae Shigae	3,13
Citrobacter freundii GN 346	6,25
Serratia marcescens Nr. 1	50
Pseudomonas aeruginosa E-2	>100

Bei dieser Bestimmung wurde Herzinfusionsagar als Medium verwendet.

Die Bestimmung von ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität von SF-2103A Antibiotikum durch Sargent's Methode (siehe M. G. Sargent, Journal of Bacteriology, Bd. 95, S. 1493 (1968)). hat die starke ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität bestätigt.

Assay von ß-Laktamase-Aktivität nach der Sargerit-Methode:

Die Sargent-Methode wurde etwas wie folgt modifiziert.

Reagentien

Reagenz A: Enzymlösung, die mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) verdünnt ist, bis sie eine optische Dichte von 0,6 des Jodverbrauchs bei 490 nm zeigt, gemessen unter den nachfolgenden Bedingungen.

Reagenz B: Wäßrige Lösung eines l,3%igen Penicillinkaliumsalzes für Penicillinaseassay. Wäßrige Lösung von 1,3% Cephalotin-Natriumsalz für Cephalosporinaseassay (ß-Laktamase von Proteus vulgaris M-8243 oder Citrobacter freundii GN 346).

Reagenz C: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0).

Reagenz D: Jodacetat-Pufferlösung, hergestellt durch Zugabe von 5 ml einer Vorratsjodlösung (Vorratsjodlösung enthält O,32N Jod und 1,2M Kaliumiodid, hergestellt durch Auflösen von 20,3 g Jod und 100 g Kaliumjodid in 500 ml destilliertem Wasser) zu 95 ml pH 4,0 Acetatpuffer (80 g wasserfreies Natriumacetat, eingestellt auf pH 4,0 mit Essigsäure und aufgefüllt mit 2 1 destilliertem Wasser.

Assay?

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 0,5 ml Reagenz B und 2 ml Reagenz C wird 5 Minuten bei 30°C vorinkubiert und dazu werden 0,5 ml Reagenz A gegeben und das Ganze wird 30 Minuten bei 30°C gehalten. Nach Beendigung der Umsetzung gibt man unter schnellem Mischen 5 ml Reagenz D hinzu und hält 10 Minuten bei 3O⁰C und dann mißt man die optische Dichte bei 490 nm.

Bei einer Blindprobe wird ein Inkubierungsgemisch, enthaltend 0,5 ml Reagenz B und 2 ml Reagenz C 30 Minuten bei 30⁰C gehalten und danch gibt man 5 ml Reagenz D und 0,5 ml Reagenz A zu. Dann wird die optische Dichte in gleicher Weise gemessen.

Assay von ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität

Die Bestimmung der ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität wird in gleicher Weise wie die vorerwähnte Bestimmung der ß-Laktamase-Aktivität bestimmt, mit der Ausnahme, daß man als Reagenz C eine Lösung verwendet, die hergestellt wurde durch Verdünnen einer Inhibierungssubstanz mit dem Reagenz C.

Die Blindprobe wird in gleicher Weise wie bei der Assay der ß-Laktamase-Aktivität durchgeführt unter Verwendung des Inhibor enthaltenden Reagenz C. Auf diese Weise wird die Konzentration an SF-21O3A-Substanz, die erforderlich ist, um 50%ige Inhibierung von Penicillinase zu bewirken, bestimmt.

Um die Inhibierungsaktivität der antibiotischen SF-2103A-Substanz gegen andere ß-Laktamase. d.h. ein Enzym das von Proteus vulgaris M-8243 gebildet wird, und ein Enzym, das von Citrobacter freundii GN 346 gebildet wird (beide wurden in der vorerwähnten Weise hergestellt) wurde das gleiche Verfahren wie bei der Penicillinase durchgeführt mit der Ausnahme, daß die beiden erwähnten ß-Laktamasen anstelle von Penicillinase im Reagenz A und ein Cephaiotinnairiumsaiz anstelle des Penicillin-G-Kaliumsalzes in Lösung B ver-

wendet wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Eine Einheit an ß-Laktamaseaktivität nach der hier angewendeten Sargent-Methode ist definiert als die Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 μηιοί eines Penicillin-G-Kaliumsalzes oder von Cephalotinnatriumsalz pro 60 Minuten unter den Bedingungen der vorliegenden Bestimmungsmethode zu zersetzen.

ic Tabelle 3

B-Laktamase-Inhibierungsaktivität von SF-2103A-Substanz

ß-Laktamase

Substrat

Inhibierungsverhältnis

Penicillinase Penicillin-G-

Proteus vulgaris Kaliumsalz
M-8243 Cephalotin-

natriumsalz

Citrobacter Cephalotin-

freundii GN 346 natriumsalz

50%igeInhibie-

rungskcnzentra-

tion

(I₅₀): 0,013 nglml

50%ige Inhibie-

rungskonzentra-

tion

(I₅₀) :0.18 Mg/ml

Die Wirkung der SF-21O3A-Substanz als ein ß-Laktamase-Inhibitor gegen ß-laktamasebildende Bakterienstamme wurde untersucht gegenüber Ampicillin, Carbenicillin, Cephalotin, Cephaloridin. Als ß-laktamasebildende Stämme wurden Proteus vulgaris M-8243 (der einen weiten Bereich an Cephalosporinase produziert). Proteus rettgeri GN 624 (der eine typische Cephalosporinase produziert) und Citrobacter freundii GN 346 (der typische Cephalosporinase produziert) verwendet. Assayagarplatten, die mit diesen Stämmen inokuliert waren, wurden in üblicher Weise hergestellt. Jeweils 10 μg Ampicillin, 2 ug Carbenicillin, 2 μg Cephalotin und 5 μg Cephaloridin wurden auf eine Papierscheibe mit einem Durchmesser von 8 mm gegeben und dazu wurde das SF-2103A Antibiotikum in einer Menge von 1 μg, 0,2 \xg und 0,04 μg gegeben, wie dies in Tabelle 4 gezeigt wird.

Diese Papierscheiben wurden auf die Agarplatten mil den ß-laktamasebildenden Stämmen gegeben und die Inkubierung wurde 16 Stunden bei 37⁰C durchgeführt um die Anwesenheit einer Inhibierungszone zu untersuchen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Synergistische Wirkung von SF-2103A in Kombinatior mit ß-Laktam-Antibiotika

Antibiotikum

Durchmesser der Inhibierungszone

(mm)

Proteus Proteus Citrobacter

vulgaris rettgeri freundii

M-8243 GN 624 GN 346

Ampicillin (10μg)	0	0	0
Ampicillin+ SF-21O3A
dMg)	20,9	14,6	19.7
Ampicillin+ SF-2103A
65 (0,2 μβ)	20,0	10,0	11.3
Ampicillin+ SF-2103A
(0,04 με)	18,0	0	0
Carbenicillin (2 Qg)	0	0	0

Tabelle 4 Antibiotikum Durchmesser der Inhibierungszone

(mm)

Proteus Proteus Citrobacter

vulgaris rettgeri freundii

M-8243 GN 624 GN 346

Carbenicillin	15,2	16,7	13.6
+ SF-2103A(^g)
Carbenicillin	13,3	11,1	11,7
+ SF-2103A(O^g)
Carbenicillin	12,1	0	10,0
+ SF-2103A (0,04 μg)	0	0	0
Cefalotin (2 μg)
Cefalotin + SF-2103A	15,3	11,5	16,6
(1 μg)
Cefalotin+ SF-2103A	14,8	0	11,0
(0,2 μ8)
Cefalotin+ SF-2103A	14,1	0	9.0
(0,04 μδ)	0	0	0
Cefaloridin (5 μg)
Cefaloridin+SF-2103A	16,2	14,3	17,3
(i ng)
Cefaloridin+ SF-2103A	16,2	9,0	12,0
(0.2 μβ)
Cefaloridin+SF-2103 A	14,2	0	0
(0.04 μg)	0	0	0
SF-2103 (Ιμε)

Bei den Papierscheiben, die kein SF-2103A Antibiotikum enthielten, wurde keine Inhibierungszone festgestellt, wogegen bei den Papierscheiben, die die SF-2103A-Substanz in Kombination mit den ß-Laktamantibiotika enthielten. Inhibierungszonen festgestellt wurden und zwar unterschiedlich, je nach der Konzentration von SF-2103A-Substanz. Dies zeigt an, daß die SF-21O3A-Substanz, die von den Testorganismen produzierte ß-Laktamase inhibiert und als Ergebnis kann das ß-Laktam-Antibiotikum die antibakterielle Wirkung zeigen. Bei alleiniger Verwendung von SF-2tO3A Antibiotikum wird keine Inhibierungszone bei den Testorganismen gezeig! und zwar auch dann, wenn eine maximale Konzentration (1 μg) vorliegt.

Daraus geht hervor, daß die SF-21O3A-Substanz eine antibakterielle Aktivität und gleichzeitig eine synergistische Wirkung in Kombination mit ß-Laktam-Antibiotika aufweist.

Die antibakterielle Aktivität von SF-21O3A-Substanz wurde an Mäusen im Mäuseschutztest. wie er nachfolgend beschrieben wird, untersucht und es wurde festgestellt, daß die SF-21O3A-Substanz ein Antibiotikum ist. das eine ausreichend? Wirksamkeit bei der praktischen Anwendung als Heilmittel gegen Infektionen aufweist und zwar entweder allein oder in Kombination mit jeweils anderen geeigneten antimikrobiellen Mitteln (z.B. ß-Laktam-Antibiotika).

Vier Wochen alte männliche Mäuse vom ICR-JCL-Stamm (Durchgeschnittsgewicht 20.6 g) wurden in Gruppen von jeweils 5 verwendet.

Escherichia coli GN 206 oder Proteus vulgaris GN 76 C-I wurden auf Platten von Herzinfusionsagar inokuliert und 20 Stunden bei 37^CC kultiviert. Die gebildeten Zellen wurden gesammelt und in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert unter Erhalt einer Zellsuspension, enthaltend eine vorbestimmte Anzahl der Zellen. Gleiche Volumina der Zellsuspensionen und eine 5 %ige Mucinlösung wurden vermischt unter Erhalt einer Zellösung mit einer Zellkonzentration von 7,1 χ ΙΟ⁷ CFU/ml (CFU = koloniebildende Einheit).

Dann wurden mit 0,5 ml der wie oben hergestellten Zellösung intraperitoneal Mäuse infiziert. Einmal nach 1 Stunde oder zweimal nach 1 oder 2 Stunden nach der Infizierung wurde das Testantibiotikum subkutan verabreicht, anschließend wurden die Mäuse 7 Tage beobachtet.

Versuch 1

Escherichia coli GN 206 wurde als Infektionsbakterium verwendet und eine Dosis von 2 mg/Maus der SF-2103A-Substanz, gelöst in 1/75M Phosphatpuffer (pH 7,0, enthaltend 0,85 % Natriumchlorid) wurde einmal 1 Stunde nach der Infizierung mit den Bakterien verabreicht und eine Dosis von 1 mg/Maus von SF-2103 A-Substanz wurde zweimal 1 und auch 2 Stunden nach der Infektion verabreicht. Im ersteren Fall überlebten 2 von 5 Mäusen, während im zweiten Fall 4 von den 5 Mäusen überlebten. Bei der Kontrollgruppe, bei der nur 0,2 ml des Phosphatpuffers verabreicht worden waren, überlebten keine Mäuse.

Versuch 2

Proteus vulgaris GN76/C-1 wurde als Infektionsbakterium verwendet und ein 1:1 Mischarzneimittel aus SF-2103 Α-Substanz und Cephalotin wurde verabreicht. Das Mischarzneimittel wurde zweimal (nach 1 und nach 2 Stunden nach der Infektion mit den Bakterien) jeweils

in einer Dosis von 0,5 mg/Maus oder zweimal (nach 1 und nach 2 Stunden nach der Injektion) jeweils in einer Dosis von 1 mg/Maus verabreicht. Im ersteren Fall überlebten 3 von 5 Mäusen und im letzteren Fall alle 5 Mäuse. Bei einer Kontrollgruppe, die nur mit

der Phosphatpufferlösung behandelt worden war, überlebte keine Maus.

Die Toxizität des SF-2103 A Natriumsalz wurde durch orale Verabreichung, intramuskuläre I njektion oder intravenöse Injektion bei Mäusen oder Ratten untersucht.

Die LD₅q-Werte bei oraler Verabreichung, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion waren alle höher als 2000 mg/kg.

Die SF-2103 Α-Substanz ist ein wertvolles Antibiotikum das nicht nur antimikrobielle Aktivität gegenüber verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien zeigt, sondern auch wirksam ist gegen resistente Bakterien, die ß-Laktamase produzieren. Daher kann es als Arzneimittel für Menschen und Haustiere verwendet werden und außerdem auch als Sterilisierungsmittel für beispielsweise medizinische Instrumente oder Apparaturen.

Das SF-2103A Antibiotikum und dessen Salze können oral, topisch oder parenteral in Form von Zubereitungen verabreicht werden, z.B. in Form von Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupen, Suspensionen, flüssigen Zubereitungen, Pulvern oder Injektionen oder Injektionen, die sterilisierbar sind.

Obwohl man das SF-2103A Antibiotikum alleine verwenden kann, kann man es wegen des dadurch erzielten synergistischen Effektes sehr wirkungsvoll in Kombination mit anderen Antibiotika, insbesondere ß-Laktam-Antibiotika. verwenden.

Wird das SF-2103 A Antibiotikum oder ein Salz davon in Kombination mit ß-Laktam-Antibiotika verwendet, so kann das Gewichtsverhältnis von SF-2O13A oder eines Salzes davon zu den ß-Laktam-Antibiotika im Bereich von etwa 20:1 bis etwa 1 :12 und vorzugsweise 10:1 bis 1 :10, insbesondere aber 3:1 bis 1 :3, liegen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:
   1. Antibiotikum SF-2103 A der Formel

   SO₃H

   COOH

   HO₃SO

   berechnet (%) C 23,53 H 2,61 N 3,05 O 41,83 S 13,94 Na 15,03

   oder ein Salz davon, wobei das Trinatriumsalz folgende Eigenschaften hat:

   (1) Farbe und Aussehen: erhalten als weißes Pulver durch Gefriertrocknen;

   (2) Schmelzpunkt: zeigt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt und wird braun und versetzt sich unter Blasenbildung bei 168°C;

   (3) spezifische Drehung: Mi⁰- 16.3° (el, Wasser);

   (4) Elementaranalyse für C₉H₈NO₁₀S₂Na₃ · 2H₂O