DE3132786C2 - Antibiotikum SF-2103A, Verfahren zu dessen Herstellung und antibiotisches Mittel, welches das Antibiotikum enthält - Google Patents
Antibiotikum SF-2103A, Verfahren zu dessen Herstellung und antibiotisches Mittel, welches das Antibiotikum enthältInfo
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- C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
- C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
- C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
- C07D477/20—Sulfur atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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-
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Abstract
Ein Antibiotikum SF-2103A oder ein Salz davon und ein Verfahren zur Herstellung desselben werden beschrieben, wobei das Verfahren darin besteht, daß man einen eine Antibiotikum SF-2103A-Substanz produzierenden Stamm in einem Nährmedium kultiviert und die gewünschte Substanz aus der Kulturbrühe gewinnt.
Description
gefunden (%) 23,62 2.44 3,00 42,16 13,81
14.97 (bestimmt durch Atomabsorptionsanalyse)
(5) Ultraviolcttabsorptionsspektrum mit einer maximalen Absorption in einem 0,02 M Phosphatpuffer
(pH 7,2) bei 266 bis 267 nm (Elä,= 126) und 230nm (DjI= 118);
(6) Infrarotabsorptionsspektrum, bestimmt durch die Kaliumbromid-Tablettcnmethode, mit Absorptionsbanden
bei 3450, 1755. 1610. 1390. 1220, 1080, 1040. 940, 900. 780 cm"1;
(7) kemmagnetisches Resonanzspektrum: das 100 MHz-kernmagnetische Resononzspektrum.
bestimmt in schwerem Wasser mit Tetramethylsilan als äußerer Standard, zeigt Signale bei
δ 1,55 (d, 3H), δ 2.99 (dd. IH), δ 3.44 (dd. IH).
63,94(dd,1H),64,48(m.1H)und64.94(m.1H);
(8) Dünnschichtchromatografie:
a) Rf-Werte auf einer dünnen Zellulose-Schicht (Zellulose F254) entwickelt bei 50C mit
folgendem Lösungsmittel:
| Lösungsmittel | R! |
| n-Butanol: Isobutanol: Wasser | |
| (7:7:6 Vol.) | 0,30 |
| 70 Vol.-%ige wäßrige | |
| n-Propanollösung | 0.52 |
| 70 Vol.-%ige wäßrige | |
| Ethanollösung | 0.62 |
| 80 Vol.-%ige wäßrige | |
| Acetonitrillösung | 0.37 |
Methanol, unlöslich in Ethylacrylat, Chloroform und Benzol;
(10) Farbreaktion: positiv für Lemieux- und Ehrlich-Reagenz
und negativ für Ninhydrin-Reagenz.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2103 A oder eines Salzes davon gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ATCC 31892 in einem Nährmedium kultiviert,
die Kulturbrühe von den Feststoffen abfiltriert, das Filtrat auf Aktivkohle adsorbiert, mit 50%iger
wäßriger Acetonlösung eluiert, Fraktionen, welche SF-2103 A enthalten, sammelt und konzentriert,
nach dem Abdestillieren des Acetons SF-2103 A mit
Dichlormethan, enthaltend ein quaternäres Ammoniumsalz, extrahiert, dann reextrahiert mit Natriumjedid
enthaltendem Wasser und gefriertrocknet und hierauf das so erhaltene rohe SF-2103 A chromatografisch
unter Verwendung von Anionenaustauscherharzen weiter reinigt.
3. Antibiotisches Mittel, enthaltend neben dem Antibiotikum SF-21O3A ein Penicillin- oder Cephalosporinantibiotikum.
Die Erfindung betrifft das Antibiotikum SF-21O3A der Formel
SOjH
COOH
b) nach Entwicklung auf DEAE-Zellulose
(Polygram CEL 300 DEAE) bei 50C mit einem 0.02M Phosphatpuffer (pH 7.2). enthaltend
0,1 M Natriumchlorid, unter Verwendung von MC 696-SY2-A-Substanz als
Kontrolle, wurden Rf-Werte von 0.31 festgestellt, wogegen die SF-2103-A-Substanz Rf-Werte
von 0.14 hat;
(9) Löslichkeit: gut löslich in Wasser, löslich in und dessen Salze mit den in Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2103A und dessen Salze (vgl. Anspruch 2), sowie ein antibiotisches Mittel.
(9) Löslichkeit: gut löslich in Wasser, löslich in und dessen Salze mit den in Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2103A und dessen Salze (vgl. Anspruch 2), sowie ein antibiotisches Mittel.
Fig. 1 bis 3 sind Ultraviolettabsorptionsspektren. Infrarotabsorptionsspektren bzw. kernmagnetische Resonanzspektren
der antibiotischen Substanz SF-21O3A (Natriumsalz).
Der Stamm, welcher SF-21O3A bildet, ist der Streptomyces
sp. SF-2103-Stamm. der aus Erde isoliert wurde, die in Katsuura, Wakayama Prefecture. Japan, gesammelt
wurde und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31892 hinterlegt wurde.
4 g der Erde wurden in 40 ml sterilisiertem Wasser in einem 100 ml Erlenmeyer-Kolben suspendiert. 10 Minuten
geschüttelt und dann 15 Minuten stehen gelassen. Danach wurden 4 ml der überstehenden Flüssigkeit auf
das lOOOOfache mit sterilisiertem Wasser verdünnt.
Dann wurden 0.5 ml der so verdünnten Flüssigkeit in eine zuvor sterilisierte Petrischale gegeben und vollständig
mit 20 ml eines Agarmediums zum Trennen, wie es nachfolgend beschrieben wird, vermischt, bei
45 bis 5O0C gehalten und dann verfestigt.
Die Petrischale wurde 10 Tage bei 28 C kultiviert und Kolonien aus dem SF-2103-Stamm. die auf dem
Agarmedium wuchsen, wurden zu einer Hefe-Stärkeagar-Schrägkultur
(Hefeextrakt: 0.2%. lösliche Stärke: 1.0%, Agar: 2.0%: pH 7.0) überführt.
b5 Die Zusammensetzung des Agarmediums zum Trennen
war die folgende: Hefeextrakt: 0.05%. lösliche Starke: 0.25%. Agar: 2.0%. Rest: Leitungswasser:
pH 7.0.
Die Eigenschaften des Actinomyces SF-2103-Stammes
sind die folgenden.
I Morphologische Eigenschaften
Mycele und Sporen werden auf Kulturmedien, wie Stärkeagar, Weizenmehlagar und Hefenulzagar, gebildet.
Die Verzweigungen der Luftmycele ist monopodial und quirlähnliche Verzweigungen werden nicht gefunden.
Am Ende der Luftmycele befinden sich fast gerade Sporenketten. Keine speziellen Strukturen, wie Sclerotium
und Sporangium, wurden festgestellt.
Mikroskopische Beobachtungen zeigen, daß Sporen mit einer glatten Oberfläche in ovaler oder eiförmiger
Form einer Größe von 0,7 bis 0,8 χ 1,0 bis 1,5 μπι vorliegen
und im allgemeinen eine Kette aus 10 oder mehr Sporen bilden.
Tabel'e 1
II Kultureigenschaften
Die Kultureigenschaften von SF-2103-Stamm auf verschiedenen
Kulturmedien werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Beobachtungen wurden nach einer 14- bis 29tägigen
Kultivierung bei 28 0C durchgeführt. Die in Tabelle 1 gezeigte Farbe wurde identifiziert gemäß dem Farbstandard des Color Harmony Manual, 4. Ausgabe, veröffentlicht
von Container Corporation if America, Chicago, Ul., USA (1958).
Die schwachrosa Farbe der Luftmycele auf Stärkeagar-,
Weizenmehlagar- und Hefemalzagarmedien verschwand mit zunehmender Sporenbildungsfähigkeit.
Weiterhin zeigten die Luftmycele eine stärkere Tendenz zum Schmelzen und Verschwinden bei Fortschreiten der
Kultivierung nach einer gewissen Zeit.
| Kulturmedium | Wachstum und Umkehrfärbung | Luftmycel | lösliches Pigment |
| Saccharose-Nitratagar | sehr geringes Wachstum, farblos | keines | keines |
| Glukose-Asparaginagar | geringes Wachstum, farblos | keines | keines |
| Glyzerin-Asparaginagar | geringes Wachstum, farblos | keines | keines |
| Stärkeagar | mäßiges Wachstum, hellbeige | mäßig hellrosa (5 cb) | etwas graurosa |
| Weizenmehlagar | mäßiges Wachstum, hellbeige | mäßig hellrosa (5 cb) | keines |
| Hefemalzagar | gutes Wachstum, hellbeige | mäßig hellrosa (5 cb) | keines |
| Tyrosinagar | schlechtes Wachstum, farblos | keines | keines |
| Nähragar | schlechtes Wachstum, farblos | keines | keines |
| Kalziummalatagar | schlechtes Wachstum, farblos | keines | keines |
| Bennefs Agar | gutes Wachstum, gerunzelt | keines | keines |
III Physiologische Eigenschaften
1. Wachstumstemperaturbereich: wächst auf Stärkeagar im Bereich von 15 bis 45 0C und die Optimaltemperatur
beträgt 25 bis 35 0C
2. Verflüssigung von Gelatine: positiv
3. Hydrolyse von Stärke: positiv
4. Koagulation von entrahmter Milch: negativ Peptonisierung
von entrahmter Milch: positiv
5. Reduktion von Nitrat: negativ
6. NaCl-Toleranz: Wachstum findet auf einem Kulturmedium,
dem 3% NaCl zugegeben wurden, statt. aber nicht auf einem solchen, dem 5 % NaCl zugegeben
wurden
7. Herstellung von Melanoidpigment: negativ
IV Verwendung von Kohlenstoffquellen
(Pridham & Gottlieb Agarmedium bei 28 "C)
1. verwertbar: D-Glukose, L-Rhamnose. D-Fruktose. D-Xylose, L-Arabinose. D-Mannit. Saccharose
2. nicht verwertbar: Raffinose, I-Inosit.
V Zusammensetzung der Zellwandung
Eine Analyse nach dem Verfahren gemäß Becker et al. in Applied Microbiology. Bd. 13. S. 236 (1965) zeigt,
daß die in der Zellwandzusammensetzung enthaltende Diaminopimelinsäure vom LL-Typ ist.
Faßt man die obigen Ergebnisse zusammen, so gehört to der SF-2103-Stamm zum Genus Streptomyces und das
obere Ende des Luftmycels ist gerade und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt.
Der Farbton in den gereiften Luftmycelen gehört zur Rotfarbserie von H. D. Tresner und E. J. Backus.
Applied Microbiology. Bd. 11. S. 335 (1963). und die Umkehrfarbe ist schwach beige. Es wird keine Bildung
von melanoidem Pigment festgestellt.
Vergleicht man die vorstehenden taxonomischen Eigenschaften
des SF-2103-Stammes mit solchen von bekannten Stämmen vom Genus Streptomyces, so kann
man den neuen SF-2103-Stamm identifizieren.
Es wurde festgestellt, daß kein Stamm bekannt war, der identisch hinsichtlich der Eigenschaften des SF-2103-Stammes
ist. Etwas ähnlich war Streptomyces alborubidus (International Journal of Systematic Bacteriology,
Bd. 22. S. 271-273(1972)).
Es wurden deshalb der Standardstamm von Streptomyces alborubidus. ISP Nr. 5464 (ISP: International
Streptomyces Project. International Journal of Systematic Bacteriology. Bd. 18. S. 69 (1968)) und der SF-2103-Stamm
verglichen.
Sie zeigten deutliche Unterschiede voneinander hinsichtlich des Wachstums auf verschiedenen Agarböden,
obwohl sie verhältnismäßig ähnlich in der Farbtönung der Luftmycele und in der Verarbeitung von Zucker
waren. Das heißt, daß das Wachstum von Streptomyces alborubidus auf Saccharosenitratagar und Glukoseapsaraginagarmedium
gut war und die Bildung von Luftmycelen gut war. wogegen das Wachstum des SF-2103-Stammes
auf den vorerwähnten Medien sehr gering war und keine Bildung von Luftmycelen beobachtet
wurde. Vielmehr wuchs der SF-2103-Stamm auf Weizenmehlagarmedium gut unter Bildung von Luftmycelen,
wogegen das Wachstum von Streptomyces alborubidus schlecht war. Weiterhin wurde häufig festgestellt, daß
die oberen Enden der Luftmycele von Streptomyces alborubidus eine Kreis- oder Hakenform hatten, wogegen
das obere Ende des SF-2103-Stammes immer geradkettig war. Darüber hinaus zeigte kein bekannter
Stamm die Farbtönung des Luftmycels, die Rotfarbserie, die geradkettige Luftmycelform und die glatte
Sporenoberfläche, wie man sie bei dem SF-2103-Slamm
fand.
Es wurde infolgedessen daraus geschlossen, daß der SF-2103-Stamm unterschiedlich von allen Spezies von
Genus Streptomyces ist und daß er neu ist und deshalb wurde der SF-2103-Stamm Streptomyces sulfonofaciens
sp. nov. genannt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der vorerwähnte Stamm in einem Medium, das von bekannten
Mikroorganismen assimilierbare Nährstoffe enthält, kultiviert. Solche Nährstoffe können die bekannten Stoffe
sein, wie sie üblicherweise zur Kultivierung von Actinomyces-Stämmen
verwendet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Glukose, Glyzerin, Stärke, Dextrin,
Maltosesirup, Melasse und Sojabohnenöl. Beispiele für Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl. Weizenkleie,
Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt. Pepton. Hefeextrakt, Maismaische, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat.
Gewünschtenfalls können anorganische Salze, wie Kalziumkarbonat, Natriumchlorid. Magnesiumsulfat,
Natriumsulfat, Kobaltchlorid, Ferrosulfat und Phosphate (insbesondere Natriumsulfat und Kobaltchlorid)
sowie auch solche organischen und anorganischen Stoffe, die das Mikrobenwachstum unterstützen
und die Produktion der gewünschten SF-2103 A-Substanz erhöhen, zugegeben werden. Weiterhin kann man gegebenenfalls
auch ein Entschäumungsmittel, z.B. ein Silikon, zugeben.
Für die Kultivierung von Streptomyces sp. SF-2103 sind Flüssigkulturen und insbesondere Tauchkulturen
unter Belüftung besonders geeignet. Eine für die Kultivierung geeignete Temperatur liegt bei 20 bis 35 °C.
In vielen Fällen ist es bevorzugt, die Kultivierung im Temperaturbereich von 23 bis 30 C vorzunehmen.
Die Produktion von SF-21O3A-Substanz erreicht ihr Maximum im allgemeinen in 1 bis 10 Tagen in einer
Schüttelkultur oder Tankkultur (Tauchkultur), wobei jedoch die optimalen Zeiten von der An des verwendeten
Mediums und der Kultivierungsmethode abhängig sind.
Die SF-2103A-Substanz kann man quantitativ bestimmen, indem man wie bei üblichen Antibiotika deren
aniibakterielie Aktivität durch eine Bioassay bestimmt,
unter Verwendung eines geeigneten Stammes als Testorganismus, denn diese Substanz hat antibakterielle Aktivität
gegen gram-positive und gram-negative Bakterien. Da jedoch die SF-2103 Α-Substanz dadurch charakterisiert
ist. daß sie eine starke ß-Laktamase-inhibierende Aktivität und eine antibakterielle Aktivität aufweist,
kann man eine neu entwickelte ß-Laktamase-Inhibierungsaktivitätsassay.
wie sie nachfolgend beschrieben wird, zur schnellen und genauen Bestimmung anwenden.
Gemäß der neuen. Untersuchungsmelhode wird Fndoß-laktamase,
das von Proteus vulgaris M-8243 gebildet wird, als ß-Laktamase verwendet. Die Endo-ß-laktamase
wird in einer 2% Kyokuto-Bouillon-Lösung (pH 7 vor der Sterilisierung) inokuliert und bei 32 °C inkubiert.
Unmittelbar nach Beginn der Inkubation und 2 Stunden und 4 Stunden nach Beginn der Inkubation wird ein
Benzylpenicillinkaliumsalz als ß-Laktamase-induzierende Substanz bis zu einer Konzentration von 250 μ£/πι1
zugegeben und die Inkubierung wird 7 bis 8 Stunden nach deren Beginn fortgesetzt. Dann wird die Inkubierung
abgestoppt und der Stamm durch Zentrifugenabtrennung gesammelt. Die Masse der so erhaltenen feuchten
Zellen wird in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), deren Volumen zweimal so groß ist wie das der Zellen,
suspendiert und dann in eine Zellmühle (z. B. eine französische Druckzelle) gegeben, wo die Zellen zerstört
werden. Die erhaltene Suspension wird einer Zentrifugenabtrennung (10000 Upm. 10 Minuten) unterworfen und
die ausgefallenen Zellfragmente werden entfernt. Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit wird über
Nacht mit 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) bei 50C dialysiert und die erhaltene Dialysatlösung stellt
eine rohe ß-Laktamase-Enzymlösung dar. Die Dialysatlösung hat eine ß-Laktamase-Aktivität von 5000 bis
6000 Einheiten (μ/ml), bestimmt nach der modifizierten Methode von Sergeant, zum Messen der Enzymaktivität,
wie sie nachfolgend noch beschrieben wird.
Die so erhaltene ß-Laktamase wird zur Herstellung einer Assayplatte verwendet. Eine 2,3%ige Lösung von
Nähragar (Difco) wird in einem Autoklaven sterilisiert und auf 45°C gekühlt. Zu 250 ml der Lösung gibt man
0,5 ml von Bacillus subtilis ATCC 6633, das zuvor für Saatzwecke kultiviert worden war. hinzu, sowie eine
Menge von 125 Einheiten der vorher erwähnten ß-Laktamase-Lösung und mischt beides. Das erhaltene
Gemisch wird auf 250 mm χ 320 mm große, glatte Platten gegossen und verfestigt darauf.
Zur Durchführung der Assay werden 20 μΐ einer zu
untersuchenden Lösung auf eine Papierscheibe (Durchmesser 8 mm) aufgebracht, aufweiche 20 μΐ einer 50 böigen
wäßrigen Aceionlösung von Cephalotinnatriumsalz in einer Konzentration von 50 μg/ml aufgetragen und
dann an der Luft getrocknet worden sind. Die so zubereitete Papierscheibe wird in die Assayschale gegeben
und nachdem sie dort 15 bis 17 Stunden bei 37 0C gehalten wurde, tritt eine Inhibierungszone in Abhängigkeil
von der Konzentration der SF-2103 A-Substanz auf.
Bei dieser Assay zeigen der Logarithmus der Konzentration der SF-2103 A-Substanz und der Durchmesser
der Inhibierungszone eine lineare Beziehung im Bereich von 0,03 μg/ml bis 1 μg/ml der Konzentration der
SF-21O3A-Substanz. Auf diese Weise kann man das Antibiotikum SF-2103A genau quantitativ bestimmen.
Die SF-210? A-Substanz akkumuliert hauptsächlich in
einem Kuiturbrühefiitrai. Die in der Kulturbrühc enthaltene
SF-2103 A-Substanz kann extrahiert und gereinigt werden, so daß sie dann die physikalischen und
chemischen Eigenschaften aufweist, die nachfolgend beschrieben wercen. Für eine solche Extraktion und Reinigung
wird folgendes Verfahren vorteilhaft angewendet:
Eine Kulturbrühe, enthaltend die gewünschten Substanzen,
wird von den Feststoffen abfiltriert und das Filtrat wird auf Aktivkohle adsorbiert und dann mit
50 %iger wäßriger Acetonlösung eluiert.
' Fraktionen, welche die gewünschten Substanzen enthalten, werden gesammelt und konzentriert. Nach dem Abdestillieren des Acetons werden die gewünschten Substanzen mit einem Haloalkan, z. B. Dichlormethan. enthaltend ein quaternäres Ammoniumsalz, wie Benzyldimethylcetylammoniumchlorid oder Benzyldimethyltetradecylammoniumchlorid, extrahiert und dann werden sie reextrahiert mit Natriumiodid enthaltendem Wasser und gefriergetrocknet, wobei man rohes Antibiotikum SF-2103 A erhält.
' Fraktionen, welche die gewünschten Substanzen enthalten, werden gesammelt und konzentriert. Nach dem Abdestillieren des Acetons werden die gewünschten Substanzen mit einem Haloalkan, z. B. Dichlormethan. enthaltend ein quaternäres Ammoniumsalz, wie Benzyldimethylcetylammoniumchlorid oder Benzyldimethyltetradecylammoniumchlorid, extrahiert und dann werden sie reextrahiert mit Natriumiodid enthaltendem Wasser und gefriergetrocknet, wobei man rohes Antibiotikum SF-2103 A erhält.
Die weitere Reinigung des rohen Antibiotikums SF-2103A kann durch Chromatografie unter Verwendung
von Anionenaustauschharzen erfolgen. Zusätzlich kann man Gelfiltermedien zur weiteren Reinigung des rohen
SF-2103 A Antibiotikums anwenden.
Eine Analyse des so gereinigten SF-2103A-Substanzpulvers durch Dünnschichtchromatografie unter Anwendung
von verschiedenen Lösungsmitteln, sowie andere Analysemethoden (z.B. Hochspannungspapierelektrophorese
und Hochgeschwindigkeits-Flüssigchro-
matografie) bestätigen, daß es sich um eine einzelne Substanz
handelt.
Das SF-2103A-Antibiotikum ist bei Temperaturen oberhalb Raumtemperatur oder im sauren oder alkalischen
Zustand, wie er nachfolgend noch erläutert wird, außerordentlich instabil. Beim Isolieren aus einer KuI-lurbrühe
muß man aufpassen, daß die Lösung nicht zu sauer oder zu alkalisch wird und alle Maßnahmen
sollten schnell bei niedrigen Temperaturen vorgenommen werden.
Weiterhin ist es schwierig, die SF-2103A-Substanz als freie Säure zu gewinnen, weil sie, wie vorher erwähnt,
im sauren Zustand sehr instabil ist. Man gewinnt die SF-2103A-Substanz deshalb als Salz in Form eines hellgelben
oder weißen amorphen Pulvers durch Gefriertrocknen einer wäßrigen neulraien Lösung. Die Reinheit
der SF-2103A-Substanz variiert in Abhängigkeit von der Stärke der Kulturbrühe.
Die Art des Salzes wird durch das bei der Reinigung verwendete Kation bestimmt. Wird die Reinigung beispielsweise
chromatographisch unter Verwendung von DEAE-Sephadex A-25 und von NaCl-Wasser als EIuierungsmittel
durchgeführt, so erhält man die SF-2103 A-Substanz als Natriumsalz. Andere pharmazeutisch annehmbare
Salze sind Alkalisalze (z.B. das Kaliumsalz), Erdalkalisalze (z. B. Kaliumsalze), anorganische Salze
Salze (z. B. Aluminiumsalze unter Ammoniumsalze) und organische Salze (z.B. substituierte Ammoniumsalze),
die in gleicher Weise wie bei der Herstellung des Natriumsalzes hergestellt werden können. Um das Natriumsalz
in ein anderes Salz zu überführen, kann man eine wäßrige Natriumsalzlösung durch ein Kationenaustauschharz
leiten. z.B. durch Dowex 5OW, in dem zuvor die für den Austausch gewünschten Kationen ausgetauscht
worden sind. Nachfolgend werden die physikaiischen und chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes
der SF-2103A-Substanz, von der man annimmt, daß sie die reinste Form des Produktes darstellt, beschrieben.
Es isi jedoch festzuhalten, daß die SF-21O3A-Substanz-Natriumsalz
Wasser oder andere Verunreinigungen enthalten kann, weil sie als gefriergetrocknetes
Pulver erhalten wird.
Die Eigenschaften der neuen antibiotischen SF-21O3A-Substanz
und deren Salze werden nachfolgend gezeigt. Die Eigenschaften des Natriumsalzes der SF-2103A-Substanz
sind die folgenden:
1. Farbe und Form: erhalten als weißes Pulver durch Gefriertrocknung,
2. Schmelzpunkt: kein klarer Schmelzpunkt. Verfärbung nach braun und Zersetzung unter Blasenbildung
bei 1680C.
3. Spezifische Drehung: Μέ°~ 16,3 (c 1, Wasser)
4. Elementaranalyse und Molekularformel (Probe wurde über Phosphorpentoxid bei Raumtemperatur
während 27 Stunden vakuumgetrocknet und dann untersucht):
| Berechnet % für | Gefunden % | |
| C9H8NO10S2Na3 · 2H2O | ||
| C | 23,53 | 23,62 |
| H | 2,61 | 2,44 |
| N | 3,05 | 3,00 |
| O | 41,83 | 42,16 |
| S | 13,94 | 13,81 |
| Na | 15,03 | 14,97 |
| (bestimmt durch | ||
| Atomabsorptions | ||
| spektroskopie) |
60
65 Das Molekulargewicht wird aufgrund der Werte der
Elementaranalyse und des kernmagnetischen Resonanzspektrums mit etwa 450 berechnet.
5. Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das Ultraviolettabsorptionsspektrum
wird in einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,2) bestimmt und zeigt maximale Absorptionen
bei 266 bis 267 nm (Ej^n, = 126) und 230 nm
(E[°^m= 118) wie in Fig. 1 gezeigt wird.
6. Infrarotabsorptionsspektrum: Das Infrarotabsorptionsspektrum, bestimmt durch die Kaliumbromid-Tablettenmethode,
wird in Fig. 2 gezeigt und zeigt Absorptionsbanden bei 3450, 1755, 1610, 1390, 1220.
1080,1040,940,900, 780 cm"1.
7. Kernmagnetisches Resonanzspektrum: Das 100 MHz kernmagnetische Resonanzspektrum wird in schwerem
Wasser mit Teiramethyisiian ais äußerer Standard bestimmt und wird in Fig. 3 gezeigt und zeigt die Signale
bei δ 1,55 (d, 3H), δ 2,99 (dd, 1 H), δ 3,44 (dd, 1 H), δ 3,94
(dd. IH), δ 4,48 (m, IH) und δ 4,94 (m, IH).
8. Dünnschichtchromatografie:
a) Rf-Werte, bestimmt auf einer dünnen Zelluloseschicht (Zellulose F254, hergestellt von Mercj und
Co) mit den nachfolgend gezeigten Lösungsmitteln bei 5 °C sind folgende:
| Lösungsmittel | Rf-Wert |
| n-Butanol: Isopropanol: Wasser | |
| (7:7:6 VoI) | 0,30 |
| 70 Vol.-%ige wäßrige | |
| n-Propanollösung | 0,52 |
| 70 Vol.-%ige wäßrige | |
| Ethanollösung | 0,62 |
| 80 Vol.-%ige wäßrige | |
| Acetonitrillösung | 0.37 |
b) Bestimmt auf DEAE-Zellulose (Polygram CEL 300
DEAE der Mercherry Nagel Corp.) mit einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 0,1 M
Natriumchlorid bei 5 "C und unter Verwendung vuii MC 696-SY2-A-Substanz als Kontrolle (die
Substanz wird in Journal of Antibiotics, Bd. 30, S. 770 (1970) beschrieben und ist die gleiche wie
MM 4550-Substanz (beschrieben in The Journal of Antibiotics. Bd. 32, S. 295 (1979) ergibt Rf-Werte
von 0,31, wogegen die Rf-Werte von SF-2103 A-Substanz der vorliegenden Erfindung 0,14
sind.
9. Hochspannungspapierelektrophorose: Bei Durchführung der Elektrophorese auf einem Filterpapier,
Toyo Filter Paper Nr. 51 einer Breite von 15 cm mit dem
nachfolgend beschriebenen Puffer bei einer konstanten Spannung von 2800V während 15 Minuten in einer
Hochspannungspapiereiektrophorese-Vorrichtung (beschrieben in der japanischen Offenlegungsschrift 14594/
79) findet Wanderung zur Anodenseite bei 9,3 cm statt, während SF-2103A-Substanz gemäß der Erfindung zur
Anodenseite bei 15,3 cm wandert. Die Pufferlösung wird hergestellt, indem man Wasser zu 200 ml Pyridin
und 8 ml Essigsäure gibt bis zu einem Gesamtvolumen von 3 1, wobei der pH 6,4 beträgt.
10. Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie: Unter
den nachfolgend angegebenen Bedingungen für eine Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie beträgt die
Verweilzeit von MC 696-SY2-A (wie vorher erwähnt) 5 Minuten und 40 Sekunden, während die erfindungsgemäße
SF-2103 Α-Substanz eine Verweilzeit von etwa 20 Minuten hat.
Bedingungen: Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie,
Vorrichtung: ALC/GPC Modell 244 (hergestellt von Waters Corp.),
Säule: ZIPAX SAX (hergestellt von Du Pont Co., Innendurchmesser 7,9 mm, Länge 50 cm),
Eluierungsmittel: hergestellt durch Auflösen von Natriumnitrat in einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) in einer Konzentration von 0,05 M,
Fließrate: 3 ml/min
Eluierungsmittel: hergestellt durch Auflösen von Natriumnitrat in einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) in einer Konzentration von 0,05 M,
Fließrate: 3 ml/min
Ultraviolettabsorptions-Nachweiswellenlänge: 3313 nm
und 254 nm.
Temperatur: Raumtemperatur (etwa 20°C).
Temperatur: Raumtemperatur (etwa 20°C).
11. Löslichkeit: Gut löslich in Wasser, löslich in Methanol
und unlöslich in Ethylacetat, Chloroform und Benzol.
12. Farbreaktion: Positiv zu Lemieux- und Ehrlich-Reagcii,
negativ zu Ninhydrinrcagcnz.
Aufgrund der vorher angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften hat man geschlossen, daß die
Substanz (als Trinatriumsalz) die folgende Strukturformel hat:
CH3CH
NaO3SO
NaO3SO
Das SF-2103A Antibiotikum wirkt in Kombination
mit Penicillin- und Cephalosporinantibiotika, die nicht gegenüber laktamasebildenden Bakterien beständig sind,
synergistisch, weil es eine ß-Laktamase-Inhibierungsaktivhät
hat und außerdem auch eine antibakterielle Aktivität aufweist.
In den nachfolgenden Beispielen bedeuten Prozente immer Gewichtsprozent, wenn nicht anders angegeben.
Ein flüssiges Medium, enthaltend 1 % Glukose. 1 % Stärke, 2% Sojabohnenpuiver, 0,5% Bdumwoüsamenkuchen,
0,2% Natriumsulfat, 0.2% Kalziumkarbonat und 0,0001 % Kobaltchlorid, wurde auf pH 7 eingestellt.
Dann wurden 80 ml-Anteile des flüssigen Mediums getrennt in einhundert 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingefüllt,
die jeweils mit einem Baumwollpropfen verschlossen und bei 120°C unter Druck 10 Minuten sterilisiert
wurden. Der Stamm Streptomyces sp. ATCC 31892 wurde in einem Vorkultivierungsmedium, enthaltend
1 % Glukose, 1 % Stärke, 0.2 % Sojabohnenpulver. 0.5% Pepton. 0,3% Hefeextrakt, 0,2% Fleischextrakt
und 0,2 % Kalziumkarbonat, zur Herstellung einer Saatkultur vollständig wachsen gelassen. Dann wurden 1.5 %-Aiiieile
dei so hergesiellien Saatkultur jeweils in das
flüssige Medium inokuliert und in einem Schüttler 3 Tage bei 28 0C inkubiert, wobei man 7 1 eines Mediums,
enthaltend 3^g/ml des SF-2103 A Antibiotikums erhielt.
Ein flüssiges Medium mit einem Gehalt an 1 % Glukose, 1% löslicher Stärke, 0,2% Sojabohnenpulver,
0.5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,2% Fleischextrakt und 0,2% Kalziumkarbonat wurde hergestellt und auf
pH 7,0 eingestellt. Dann wurden 80 ml-Anteile des flüssigen Mediums getrennt in drei 500 ml-Erlenmeyer-Kolben
eingefüllt, die jeweils mit einem Baumwollpropfen verstopft und 15 Minuten in einem Autoklaven
bei 120°C sterilisiert wurden. Mit einem Platindraht
wurde jeweils eine geringe Menge Streptomyces sp.
ATCC 31892 in jedes der flüssigen Medien inokuliert und dann 2 Tage auf einem Schüttler inkubiert unter
Erhalt einer Saatkultur. Anschließend wurden 600 ml-Anteile des gleichen Mediums wie oben getrennt in drei
5 1-Erlenmeyer-Kolben gegeben, die jeweils mit einem
Baumwollpfropfen verschlossen und in einem Autoklaven sterilisiert wurden. Jede der in einem 500 ml-Kolben
hergestellten Saatkulturen wurde in jedem der 5 1-Kolben inokuliert. Nach der Inkubierung auf einem
Schüttler bei 28 0C während 2 Tagen wurde ein ausreichendes
Wachstum festgestellt.
Dann wurden 200 1 eines Kulturmediums, enthaltend 2,0% Stärkesirup, 1,2% Sojabohnenpulver, 1,2% Weizenkeime,
0,3% Sojabohnenöl, 0.02% Natriumsulfat.
0,0005 % Gerrosulfat. 0,00005 % Kobaltchlorid und 0.1 %
Kalziumkarbonat in einem 300 1 Fermentationstank (pH vor der Sterilisierung 7,0) hergestellt und unter
Druck 30 Minuten bei 120T sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wurde die oben hergestellte
Kultur (alle drei 5 1-Erlenmeyer-Kolben) in das Kulturmedium inokuliert und die Kultivierung wurde
unter Belüftung und Rühren bei 28°C durchgeführt. Dabei wurde mit 100 U pm zu Beginn und nach 40 Stunden
mit 150 Upm gerührt. Die Belüftung betrug 200 l/min während der gesamten Kultivierungszeit. Nach 68 Stunden
wurde die Kultivierung abgebrochen und eine Kultur erhalten, die 4.1 μg ml SF-2103 A enthielt.
1. Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde wiederholt unter Verwendung von drei 300 1-Fermentationstanks.
wobei man 450 I eines Kulturfiltrats des SF-2103 Antibiotikums erhielt. Der durchschnittliche
Gehalt an SF-2103 A Antibiotikum war 2.1 ug ml.
2. Das SF-2103 A Antibiotikum wurde wie folgt isoliert: Nach Einstellung von 425 I des wie oben erhaltenen
Kulturfiltrats auf pH 5,0 mit 6 N Chlorwasserstoffsäure
wurden 12.7 kg Aktivkohle zugegeben und 30 Minuten in einem Rührtank gerührt, um die wirksamen Bestandteile
darauf zu absorbieren. Die Aktivkohle wurde abfiltriert und nach Waschen mit 50 1 Wasser wurden
1001 50%iges wäßriges Aceton zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde mit 5N Natriumhydroxidlösung auf
pH 8.0 eingestellt und 30 Minuten gerührt, um die Bestandteile wirksam zu eluieren. Nach der Abtrennung
der Aktivkohle wurden 100 1 der so eluierten Lösung durch Abdestillieren des Acetons auf 45 1 konzentriert.
Dann wurden 30 1 Dichlormethan. enthaltend 0.2 % (W/V) Benzyldimethylcetylammoniumchlorid zu der
konzentrierten Lösung gegeben und verrührt, um die wirksamen Bestandteile zu extrahieren. Zu dem so erhaltenen
Extrakt wurden 41 einer wäßrigen Lösung, enthaltend 1 % (W/V) Natriumiodid, gegeben, um die
wirksamen Bestandteile in die wäßrige Schicht zu überführen. Die wäßrige Schicht wurde durch eine Säule
laufen gelassen, die mit 1,5 1 DEAE-Sephadex A-25 gefüllt war und die mit einem Phosphatpuffer mit einem
pH von 7,4 gepuffert war, um eine Absorption der
wirksamen Bestandteile darauf zu bewirken. Nach einem ersten Wachsen mit 15 1 einer 0,1M wäßrigen NaCl-Lösung,
gelöst in 20 mMol Phosphatpuffer (pH 7,4) wurden die wirksamen Bestandteile mit 0,2M einer
wäßrigen NaCl-Lösung. gelöst im gleichen Puffer wie oben, eluiert. Das Eluat wurde in 100 ml Fraktionen
aufgeteilt und die Fraktionen 108 bis 132 waren die aktiven Fraktionen. Dann wurden 241 der aktiven
Fraktionen durch eine Säule geschickt, die mit 240 ml
Aktivkohle gefüllt war, um die wirksamen Bestandteile auf der Aktivkohle zu adsorbieren. Nach dem Waschen
der Säule mit 400 ml Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 1 1 einer 50% igen wäßrigen Acetonlösung
eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Beim Gefriertrocknen der konzentrierten
Flüssigkeit erhielt man 709 mg eines Pulvers aus roher SF-21O3A-Substanz (Reinheit: etwa 24%).
3. Das gleiche Verfahren wie in (1) wurde wiederholt unter Verwendung von zwei 300 1-Fermentationstanks,
woHei man 285 1 (2,6 μg/ml) eines Kulturfiltrats erhielt.
Das Kulturfiltrat wurde mit 6N Chlorwasserstoffsäure
auf pH 6,2 eingestellt. Zu diesem Filtrat wurden 95 1 Dichlormethan, enthaltend 0,2% (W/V) Benzyldimethyltelradecylammoniumchlorid
gegeben und das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, um die wirksamen
Betsandteile zu extrahieren. Zu dem so erhaltenen Extrakt wurden 8.5 leinerO.7 % (W/V) wäßrigen Natriumjodidlösung
gegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten gerührt um die wirksamen Bestandteile in die wäßrige
Schicht zu überführen. Die wäßrige Schicht wurde unter vermindertem Druck durch Abdestillieren von Dichlormethan
konzentriert. Die so konzentrierte Flüssigkeit wurde durch eine mit 400 ml Aktivkohle gefüllten Säule,
die mit Wasser beladen war. geschickt und die Aktivkohle wurde mit 300 ml Wasser gewaschen. Die Flüssigkeit
und das Waschwasser, welches durch die Aktivkohle lief, wurden vereint und 8,3 1 der vereinten Flüssigkeit
wurden durch eine Säule geschickt, die mit 1 I DEAE-Sephadcx A-25 gefüllt war und zuvor mit einem
Phosphatpuffer mit einem pH von 7.4 gepuffert worden war, wobei die wirksamen Bestandteile absorbiert wurden.
Nach einem erstmaligen Waschen mit 10 1 einer 0.2M wäßrigen NaCl-Lösung, gelöst in einem 20 mMol
Phosphatpuffer (pH 7.4). wurden die wirksamen Bestandteile mit 0.3M einer wäßrigen NaCl-Lösung, die
in dem gleichen Puffer wie oben gelöst war, eluiert. Das Eluat wurde in 150 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei
die Fraktionen 17 bis 53 als aktiv bestätigt wurden. Diese
aktiven Fraktionen wurden vereint und 5,5 1 der vereinten aktiven Fraktionen wurden durch eine Säule
geschickt, welche mit 1.21 Aktivkohle gefüllt war und
die zuvor mit Wasser beladen worden war. wobei die aktiven Bestandteile adsorbierten. Nach dem Waschen
der Säule mit 2,3 1 Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 5,5 1 50%igem wäßrigen Aceton eluiert.
Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Beim Gefriertrocknen der konzentrierten Flüssigkeit
wurden 540 mg eines Pulvers aus roher SF-2103 Α-Substanz (Reinheit etwa 40%) erhalten.
4. Das in einer Menge von 540 mg gemäß (3) erhaltene Pulver der rohen SF-2103 Α-Substanz wurde in 40 ml
Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine mit 100 ml DEAE-Sephadex A-25 gefüllte Säule, die zuvor mit
einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,2 gepuffert worden war, laufen gelassen, wobei die wirksamen Bestandteile
adsorbierten. Nach dem Waschen mit 200 ml eines 20 mMol Phosphatpuffers (pH 7,2) wurden die
wirksamen Bestandteile mit einer 0,2M wäßrigen NaCl-Lösung, gelöst in dem gleichen Puffer wie oben, eluiert.
Das Eluat wurde in 20 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei bestätigt wurde, daß die Fraktionen 110 bis 165
aktiv waren. Diese aktiven Fraktionen wurden vereint und durch eine Säule, die mit 175 ml Aktivkohle gefüllt
war laufen gelassen, um die wirksamen Bestandteile zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Aktivkohle mit
300 ml Wasser wurden die wirksamen Bestandteile mit 800 ml 50 %igem wäßrigen Aceton eluiert.
Nach dem Konzentrieren unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen wurde das Natriumsalz der SF-2103
A-Substanz in einer Menge von 206 mg (Reinheit etwa 64 %) als hellgelbes Pulver erhalten.
Dann wurden 200 mg des Pulvers in 2 ml Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule geschickt,
die mit 200 ml eines D^aion HP-20AG-Harzes gefüllt war. Nach dem Entwickeln mit Wasser wurde
das Eluat in 7 ml-Fraktionen aufgeteilt, wobei die
ίο Fraktionen 18 bis 26 die wirksamen Bestandteile enthielten.
Von diesen aktiven Fraktionen wurden die Fraktionen 22 bis 24 ausgewählt und kombiniert, unter
vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 60 mg des Natriumsalzes der SF-2103 Αι
5 Substanz (Reinheit etwa 77%) als hellgelbes Pulver erhielt.
5. in i mi Wasser wurden 60 mg des gemäß (4) erhaltenen hellgelben Pulvers gelöst. Die Lösung wurde durch
eine Säule geschickt, die mit 200 ml Sephadex G-10 gefüllt war, und mit Wasser entwickelt. Das Eluat wurde
in 7 ml-Fraktionen aufgeteilt und die Fraktionen 11 bis
16 als aktive Fraktionen bestätigt. Die Fraktionen 12 und
13 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 32 mg eines
Natriumsalzes von reinem SF-2103 A Antibiotikum als weißes Pulver erhielt.
Die Verfahrensweisen gemäß (2) bis (5) wurden unter
Niedrigtemperaturbedingungen (etwa 4 0C) durchgeführt.
Zum Nachweis der Aktivitäten der SF-2103 A-Substanz
wurden die nachfolgenden Versuche durchgeführt:
Die antibakterielle Aktivität des SF-21O3A-Natriumsalzes
wurde bestimmt durch Agarverdünnungsmethode nach der von der Japanese Chemotherapy Association
(siehe Chemotherapy, Bd. 22. S. 1126-1128 (1974)) angegebenen Standardmethode, und die Ergebnisse werden
in Tabelle 2 gezeigt.
| Teslorganismus | Minimale Inhibie- |
| rungskonzentration (μ$Ιτη\) |
|
| Staphylococcus aureus 209 P | 25 |
| Staphylococcus aureus Smith | 25 |
| Bacillus subtilis ATCC 6633 | 50 |
| Escherichia coli Nr. 29 | 3.13 |
| Escherichia coli NIHJ JC-2 | 12,5 |
| Klebsiella pneumoniae PCI 602 | 50 |
| Proteus mirabilis GV 310 | 50 |
| Proteus vulgaris GN 76/C-l | 25 |
| Proteus niora2nii iCono | 25 |
| Shigella dysenteriae Shigae | 3,13 |
| Citrobacter freundii GN 346 | 6,25 |
| Serratia marcescens Nr. 1 | 50 |
| Pseudomonas aeruginosa E-2 | >100 |
Bei dieser Bestimmung wurde Herzinfusionsagar als Medium verwendet.
Die Bestimmung von ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität
von SF-2103A Antibiotikum durch Sargent's Methode (siehe M. G. Sargent, Journal of Bacteriology,
Bd. 95, S. 1493 (1968)). hat die starke ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität bestätigt.
Assay von ß-Laktamase-Aktivität nach der Sargerit-Methode:
Die Sargent-Methode wurde etwas wie folgt modifiziert.
Reagentien
Reagenz A: Enzymlösung, die mit 0,1M Phosphatpuffer
(pH 7,0) verdünnt ist, bis sie eine optische Dichte von 0,6 des Jodverbrauchs bei
490 nm zeigt, gemessen unter den nachfolgenden Bedingungen.
Reagenz B: Wäßrige Lösung eines l,3%igen Penicillinkaliumsalzes für Penicillinaseassay. Wäßrige
Lösung von 1,3% Cephalotin-Natriumsalz für Cephalosporinaseassay (ß-Laktamase
von Proteus vulgaris M-8243 oder Citrobacter freundii GN 346).
Reagenz C: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0).
Reagenz D: Jodacetat-Pufferlösung, hergestellt durch
Zugabe von 5 ml einer Vorratsjodlösung (Vorratsjodlösung enthält O,32N Jod und
1,2M Kaliumiodid, hergestellt durch Auflösen von 20,3 g Jod und 100 g Kaliumjodid
in 500 ml destilliertem Wasser) zu 95 ml pH 4,0 Acetatpuffer (80 g wasserfreies Natriumacetat,
eingestellt auf pH 4,0 mit Essigsäure und aufgefüllt mit 2 1 destilliertem Wasser.
Assay?
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 0,5 ml Reagenz B und 2 ml Reagenz C wird 5 Minuten bei 30°C vorinkubiert
und dazu werden 0,5 ml Reagenz A gegeben und das Ganze wird 30 Minuten bei 30°C gehalten. Nach
Beendigung der Umsetzung gibt man unter schnellem Mischen 5 ml Reagenz D hinzu und hält 10 Minuten
bei 3O0C und dann mißt man die optische Dichte bei 490 nm.
Bei einer Blindprobe wird ein Inkubierungsgemisch, enthaltend 0,5 ml Reagenz B und 2 ml Reagenz C 30 Minuten
bei 300C gehalten und danch gibt man 5 ml Reagenz D und 0,5 ml Reagenz A zu. Dann wird die
optische Dichte in gleicher Weise gemessen.
Assay von ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität
Die Bestimmung der ß-Laktamase-Inhibierungsaktivität
wird in gleicher Weise wie die vorerwähnte Bestimmung der ß-Laktamase-Aktivität bestimmt, mit
der Ausnahme, daß man als Reagenz C eine Lösung verwendet, die hergestellt wurde durch Verdünnen einer
Inhibierungssubstanz mit dem Reagenz C.
Die Blindprobe wird in gleicher Weise wie bei der Assay der ß-Laktamase-Aktivität durchgeführt unter
Verwendung des Inhibor enthaltenden Reagenz C. Auf diese Weise wird die Konzentration an SF-21O3A-Substanz,
die erforderlich ist, um 50%ige Inhibierung von Penicillinase zu bewirken, bestimmt.
Um die Inhibierungsaktivität der antibiotischen SF-2103A-Substanz
gegen andere ß-Laktamase. d.h. ein Enzym das von Proteus vulgaris M-8243 gebildet wird,
und ein Enzym, das von Citrobacter freundii GN 346 gebildet wird (beide wurden in der vorerwähnten Weise
hergestellt) wurde das gleiche Verfahren wie bei der Penicillinase durchgeführt mit der Ausnahme, daß die
beiden erwähnten ß-Laktamasen anstelle von Penicillinase im Reagenz A und ein Cephaiotinnairiumsaiz
anstelle des Penicillin-G-Kaliumsalzes in Lösung B ver-
wendet wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
Eine Einheit an ß-Laktamaseaktivität nach der hier angewendeten Sargent-Methode ist definiert als die
Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 μηιοί
eines Penicillin-G-Kaliumsalzes oder von Cephalotinnatriumsalz pro 60 Minuten unter den Bedingungen der
vorliegenden Bestimmungsmethode zu zersetzen.
ic Tabelle 3
B-Laktamase-Inhibierungsaktivität von SF-2103A-Substanz
ß-Laktamase
Substrat
Inhibierungsverhältnis
Penicillinase Penicillin-G-
Proteus vulgaris Kaliumsalz
M-8243 Cephalotin-
M-8243 Cephalotin-
natriumsalz
Citrobacter Cephalotin-
freundii GN 346 natriumsalz
50%igeInhibie-
rungskcnzentra-
tion
(I50): 0,013 nglml
50%ige Inhibie-
rungskonzentra-
tion
(I50) :0.18 Mg/ml
Die Wirkung der SF-21O3A-Substanz als ein ß-Laktamase-Inhibitor
gegen ß-laktamasebildende Bakterienstamme
wurde untersucht gegenüber Ampicillin, Carbenicillin, Cephalotin, Cephaloridin. Als ß-laktamasebildende
Stämme wurden Proteus vulgaris M-8243 (der einen weiten Bereich an Cephalosporinase produziert).
Proteus rettgeri GN 624 (der eine typische Cephalosporinase produziert) und Citrobacter freundii GN 346
(der typische Cephalosporinase produziert) verwendet. Assayagarplatten, die mit diesen Stämmen inokuliert
waren, wurden in üblicher Weise hergestellt. Jeweils 10 μg Ampicillin, 2 ug Carbenicillin, 2 μg Cephalotin
und 5 μg Cephaloridin wurden auf eine Papierscheibe
mit einem Durchmesser von 8 mm gegeben und dazu wurde das SF-2103A Antibiotikum in einer Menge von
1 μg, 0,2 \xg und 0,04 μg gegeben, wie dies in Tabelle 4
gezeigt wird.
Diese Papierscheiben wurden auf die Agarplatten mil den ß-laktamasebildenden Stämmen gegeben und die
Inkubierung wurde 16 Stunden bei 370C durchgeführt
um die Anwesenheit einer Inhibierungszone zu untersuchen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
Synergistische Wirkung von SF-2103A in Kombinatior mit ß-Laktam-Antibiotika
Antibiotikum
Durchmesser der Inhibierungszone
(mm)
Proteus Proteus Citrobacter
vulgaris rettgeri freundii
M-8243 GN 624 GN 346
| Ampicillin (10μg) | 0 | 0 | 0 |
| Ampicillin+ SF-21O3A | |||
| dMg) | 20,9 | 14,6 | 19.7 |
| Ampicillin+ SF-2103A | |||
| 65 (0,2 μβ) | 20,0 | 10,0 | 11.3 |
| Ampicillin+ SF-2103A | |||
| (0,04 με) | 18,0 | 0 | 0 |
| Carbenicillin (2 Qg) | 0 | 0 | 0 |
(mm)
vulgaris rettgeri freundii
M-8243 GN 624 GN 346
| Carbenicillin | 15,2 | 16,7 | 13.6 |
| + SF-2103A(^g) | |||
| Carbenicillin | 13,3 | 11,1 | 11,7 |
| + SF-2103A(O^g) | |||
| Carbenicillin | 12,1 | 0 | 10,0 |
| + SF-2103A (0,04 μg) | 0 | 0 | 0 |
| Cefalotin (2 μg) | |||
| Cefalotin + SF-2103A | 15,3 | 11,5 | 16,6 |
| (1 μg) | |||
| Cefalotin+ SF-2103A | 14,8 | 0 | 11,0 |
| (0,2 μ8) | |||
| Cefalotin+ SF-2103A | 14,1 | 0 | 9.0 |
| (0,04 μδ) | 0 | 0 | 0 |
| Cefaloridin (5 μg) | |||
| Cefaloridin+SF-2103A | 16,2 | 14,3 | 17,3 |
| (i ng) | |||
| Cefaloridin+ SF-2103A | 16,2 | 9,0 | 12,0 |
| (0.2 μβ) | |||
| Cefaloridin+SF-2103 A | 14,2 | 0 | 0 |
| (0.04 μg) | 0 | 0 | 0 |
| SF-2103 (Ιμε) | |||
Bei den Papierscheiben, die kein SF-2103A Antibiotikum
enthielten, wurde keine Inhibierungszone festgestellt,
wogegen bei den Papierscheiben, die die SF-2103A-Substanz
in Kombination mit den ß-Laktamantibiotika enthielten. Inhibierungszonen festgestellt wurden
und zwar unterschiedlich, je nach der Konzentration von SF-2103A-Substanz. Dies zeigt an, daß die
SF-21O3A-Substanz, die von den Testorganismen produzierte
ß-Laktamase inhibiert und als Ergebnis kann das ß-Laktam-Antibiotikum die antibakterielle Wirkung
zeigen. Bei alleiniger Verwendung von SF-2tO3A Antibiotikum
wird keine Inhibierungszone bei den Testorganismen gezeig! und zwar auch dann, wenn eine
maximale Konzentration (1 μg) vorliegt.
Daraus geht hervor, daß die SF-21O3A-Substanz eine antibakterielle Aktivität und gleichzeitig eine synergistische
Wirkung in Kombination mit ß-Laktam-Antibiotika aufweist.
Die antibakterielle Aktivität von SF-21O3A-Substanz
wurde an Mäusen im Mäuseschutztest. wie er nachfolgend beschrieben wird, untersucht und es wurde festgestellt,
daß die SF-21O3A-Substanz ein Antibiotikum ist. das eine ausreichend? Wirksamkeit bei der praktischen
Anwendung als Heilmittel gegen Infektionen aufweist und zwar entweder allein oder in Kombination
mit jeweils anderen geeigneten antimikrobiellen Mitteln (z.B. ß-Laktam-Antibiotika).
Vier Wochen alte männliche Mäuse vom ICR-JCL-Stamm (Durchgeschnittsgewicht 20.6 g) wurden in Gruppen
von jeweils 5 verwendet.
Escherichia coli GN 206 oder Proteus vulgaris GN 76 C-I wurden auf Platten von Herzinfusionsagar inokuliert
und 20 Stunden bei 37CC kultiviert. Die gebildeten
Zellen wurden gesammelt und in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert unter Erhalt einer
Zellsuspension, enthaltend eine vorbestimmte Anzahl der Zellen. Gleiche Volumina der Zellsuspensionen und
eine 5 %ige Mucinlösung wurden vermischt unter Erhalt einer Zellösung mit einer Zellkonzentration von 7,1 χ ΙΟ7
CFU/ml (CFU = koloniebildende Einheit).
Dann wurden mit 0,5 ml der wie oben hergestellten Zellösung intraperitoneal Mäuse infiziert. Einmal nach
1 Stunde oder zweimal nach 1 oder 2 Stunden nach der Infizierung wurde das Testantibiotikum subkutan verabreicht,
anschließend wurden die Mäuse 7 Tage beobachtet.
Versuch 1
Escherichia coli GN 206 wurde als Infektionsbakterium verwendet und eine Dosis von 2 mg/Maus der
SF-2103A-Substanz, gelöst in 1/75M Phosphatpuffer (pH 7,0, enthaltend 0,85 % Natriumchlorid) wurde einmal
1 Stunde nach der Infizierung mit den Bakterien verabreicht und eine Dosis von 1 mg/Maus von SF-2103 A-Substanz
wurde zweimal 1 und auch 2 Stunden nach der Infektion verabreicht. Im ersteren Fall überlebten
2 von 5 Mäusen, während im zweiten Fall 4 von den 5 Mäusen überlebten. Bei der Kontrollgruppe, bei der
nur 0,2 ml des Phosphatpuffers verabreicht worden waren, überlebten keine Mäuse.
Versuch 2
Proteus vulgaris GN76/C-1 wurde als Infektionsbakterium
verwendet und ein 1:1 Mischarzneimittel aus SF-2103 Α-Substanz und Cephalotin wurde verabreicht.
Das Mischarzneimittel wurde zweimal (nach 1 und nach 2 Stunden nach der Infektion mit den Bakterien) jeweils
in einer Dosis von 0,5 mg/Maus oder zweimal (nach 1 und nach 2 Stunden nach der Injektion) jeweils in
einer Dosis von 1 mg/Maus verabreicht. Im ersteren Fall überlebten 3 von 5 Mäusen und im letzteren Fall
alle 5 Mäuse. Bei einer Kontrollgruppe, die nur mit
der Phosphatpufferlösung behandelt worden war, überlebte keine Maus.
Die Toxizität des SF-2103 A Natriumsalz wurde durch orale Verabreichung, intramuskuläre I njektion oder intravenöse
Injektion bei Mäusen oder Ratten untersucht.
Die LD5q-Werte bei oraler Verabreichung, intramuskuläre
Injektion und intravenöse Injektion waren alle höher als 2000 mg/kg.
Die SF-2103 Α-Substanz ist ein wertvolles Antibiotikum das nicht nur antimikrobielle Aktivität gegenüber
verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien zeigt, sondern auch wirksam ist gegen resistente
Bakterien, die ß-Laktamase produzieren. Daher kann es als Arzneimittel für Menschen und Haustiere verwendet
werden und außerdem auch als Sterilisierungsmittel für beispielsweise medizinische Instrumente oder
Apparaturen.
Das SF-2103A Antibiotikum und dessen Salze können oral, topisch oder parenteral in Form von Zubereitungen
verabreicht werden, z.B. in Form von Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupen, Suspensionen, flüssigen Zubereitungen,
Pulvern oder Injektionen oder Injektionen, die sterilisierbar sind.
Obwohl man das SF-2103A Antibiotikum alleine verwenden kann, kann man es wegen des dadurch erzielten
synergistischen Effektes sehr wirkungsvoll in Kombination mit anderen Antibiotika, insbesondere ß-Laktam-Antibiotika.
verwenden.
Wird das SF-2103 A Antibiotikum oder ein Salz davon
in Kombination mit ß-Laktam-Antibiotika verwendet, so kann das Gewichtsverhältnis von SF-2O13A oder
eines Salzes davon zu den ß-Laktam-Antibiotika im Bereich von etwa 20:1 bis etwa 1 :12 und vorzugsweise
10:1 bis 1 :10, insbesondere aber 3:1 bis 1 :3, liegen.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentansprüche:
1. Antibiotikum SF-2103 A der FormelSO3HCOOHHO3SOberechnet (%) C 23,53 H 2,61 N 3,05 O 41,83 S 13,94 Na 15,03 oder ein Salz davon, wobei das Trinatriumsalz folgende Eigenschaften hat:(1) Farbe und Aussehen: erhalten als weißes Pulver durch Gefriertrocknen;(2) Schmelzpunkt: zeigt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt und wird braun und versetzt sich unter Blasenbildung bei 168°C;(3) spezifische Drehung: Mi0- 16.3° (el, Wasser);(4) Elementaranalyse für C9H8NO10S2Na3 · 2H2O
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| JP11299680A JPS5736989A (ja) | 1980-08-19 | 1980-08-19 | Shinkoseibutsushitsusf 2103abutsushitsunoseizoho |
| JP55157631A JPS5781498A (en) | 1980-11-11 | 1980-11-11 | New antibiotic sf-2103a substance and its preparation |
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| DE3132786A1 DE3132786A1 (de) | 1982-05-13 |
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