DE2805701A1 - Das antibiotikum desacetyl 890a tief 10 - Google Patents

Description

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF 3 DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER Patentanwälte

München,

10. FDiaUAS 1378

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Pienzenauerstraße 28

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MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Das Antibiotikum Desacetyl 890A_1Q

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Die Erfindung betrifft das neue Antibiotikum Desacetyl 890A₁₀, das sowohl gegenüber grampositiven als auch gramnegativen Bakterien aktiv ist und das durch -Behandlung von 89OA₁₀ mit einer N-Acetyl-890A,.Q-ainidohydrolase gebildet wird, die durch Bodenmikroorganismen erzeugt wird, wobei die Bodenmikroorganismen durch Anreiclierungsverfahren isoliert werden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, gemäß dem 89OA₁₀ enzymatisch deacetyliert wird.

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotisehen Eigenschaften von Penicillin hat ein großes Interesse auf diesem Gebiet stimuliert, durch das viele andere, wertvolle, antibiotische Verbindungen gefunden wurden, wie andere Penicilline, Streptomycin, Bacitracin, Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycine und ähnliche Verbindungen. Im allgemeinen umfaßt die antibakterielle Aktivität jedes dieser Antibiotika nicht bestimmte, klinisch wichtige, pathogene Bakterien. Beispielsweise sind einige nur hauptsächlich aktiv gegenüber grampositiven Arten von Bakterien. Die erlangte Resistenz im Verlauf der weitverbreiteten Verwendung der vorhandenen Antibiotika bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen hat bewirkt, daß ein ernstes Resistenzproblem entstanden ist.

Die Nachteile der bekannten Antibiotika haben daher eine weitere Forschung stimuliert mit dem Ziel, andere antibiotische Substanzen zu finden, die gegenüber einem breiteren Bereich von Pathogenen wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroorganismen aktiv sind.

Die Erfindung betrifft ein neues antibiotiscb.es Mittel. Die Erfindung betrifft insbesondere eine neue antibiotische Verbindung, die in der vorliegenden Anmeldung als "Desacetyl 890A₁₀" bezeichnet wird. Die Erfindung umfaßt das Antibiotikum in verdünnten Formenj als Rohkonzentrate und in reinen Formen.

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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues und nützliches Antibiotikum zur Verfügung zu stellen, das hochwirksam bei der Inhibierung des Wachstums verschiedener gramnegativer und grampositiver Mikroorganismen ist. Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen antibiotischen Substanz durch enzymatische Deacetylierung der Verbindung 890A^₀ zur Verfügung gestellt werden.

Die erfindungsgemäße neue antibiotische Verbindung wird durch Hydrolyse der N-Acetylgruppe von 890A^₀ unter Verwendung einer Amidohydrolase, die die N-Acetylgruppe hydrolysieren kann, hergestellt. Eine geeignete Quelle für eine Amidohydrolase mit dieser Fähigkeit sind Amidohydrolase liefernde Stämme des Mikroorganismus Protaminobacter ruber. Das besondere, von Protaminobacter ruber gebildete Enzym ist N-Acetyl-890A>₀-amidohydrolase, ein Glied der Subgruppe von Enzymen, die als E.C.3.5.1 entsprechend der empfohlenen Enzym-Nomenklatur von

International Union of Pure and Applied Chemistry und Inter- ■ national Union of Biochemistry bezeichnet werden.

Der Mikroorganismus, mit dem das Deacetylierungsverfahren durchgeführt werden kann, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, und aufgrund taxonomischer Untersuchungen wurde er als zu der Species Protaminobacter ruber gehörig identifiziert und mit MB-3528 in der Hinterlegungsstelle von MERCK & Co., Inc., Rahway, New Jersey, bezeichnet. Eine seiner Kulturen wurde unbeschränkt in der Culture Collection of the Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt. Ihr wurde die Hinterlegungsnummer NRRL B-8143 zugeordnet.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Protaminobacter ruber NRRL B-8143 wie auch seine Kohlenstoff- und Stickstoffausnutzung bzw. -verwendung und biochemischen Reaktionen sind wie folgt:

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Morphologie

Die Zellen sind stabförmig mit abgerundeten Enden, 0,9 bis 1,2 χ 2,3 bis 4,6 Mikron, und treten einzeln oder in Paaren auf. 2A-und 48 Stunden-Zellen verfärben sich gramnegativ mit körnigem , Aussehen. Die Körnchen, insbesondere die polaren Körnchen, verfärben sich mit Sudan Black B schwarz. Die Zellen sind bei 28⁰C bewegungsfähig, die Motilität ist jedoch bei 37°C fraglich.

Kultureigenschaften

Nähragarkolonien sind zuerst dünn, punktförmig (punctiform), semi-transparent und farblos. Sie werden dann etwas konvex, opak, glatt, am Rand unbeschädigt, etwas trocken in der Konsistenz und sind rosa bis rosarot pigmentiert.

Die Nährbrühenkulturen sind einheitlich trübe ohne Häutchen.

Die Pigmentproduktion hängt nicht vom Licht oder den geprüften Temperaturen (28 und 37°C) ab. Das Pigment ist in Aceton löslich, jedoch in Wasser oder Chloroform unlöslich.

Das Wachstum auf Nähragar und Gehirn-Herz-Infusionsagar bei aeroben Bedingungen ist etwas langsam, aber gut bei 28°C. Das Wachstum ist mäßig bis gut, aber langsamer bei 37°C. Bei 50⁰C findet kein Wachstum statt.

Verwendung von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen

Unter Verwendung von Grundsalzmedien mit Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle ist das Wachstum gut mit Arabinose; mäßig mit Xylose und schlecht mit Dextrose, Fructose, Mannose, Rhamnose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Cellulose, Inosit und Mannit.

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N-Acetyläthanolamin kann als einzige Kohlenstoff- und Stickstoff quelle ausgenutzt werden.

Aus Dextrose oder Lactose wird in OF Basal Medium (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) bei aeroben oder anaeroben Bedingungen keine Säure oder Gas gebildet.

Biochemische Reaktionen

Die biochemischen Reaktionen beruhen auf Standardverfahren, wie sie in Manual of Microbiological Methods, herausgegeben von der Society of American Bacteriologists, McGraw Hill Book Co., New York, 1957, beschrieben werden.

Catalase - positiv

Oxidase - negativ

Stärke wird nicht hydrolysiert

Casein wird nicht hydrolysiert

Gelatine wird nicht verflüssigt

Lackmusmilch verbleibt unverändert in ihrer Konsistenz, wird jedoch nach 7 Tagen etwas alkalisch

Indol- negativ

H₂S - negativ

Nitrate werden nicht reduziert

Urease - positiv

Lysin und Ornithindecarboxylase - negativ.

₀ ist die Bezeichnung, die dem Antibiotikum der Struktur

-S-CH₂-CH₂NH-C-CH₃

COOH ;

zugeordnet wird.

890A₁₀, seine Beschreibung und Verfahren zu seiner Herstellung werden in der DT-OS 27 51 303-7 vom 16. November 1977 (ent-

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sprechend der US-Serial Nr. 742 958, eingereicht am 17. November 1976) beschrieben.

Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum Desacetyl 890A₁₀ besitzt die Strukturformel

CH₃-CS

-CH₂-CH₃-NH₂ :

:ooh

und wird durch enzymatische Hydrolyse von 89OA₁₀ unter Verwendung von Amidohydrolase, die in Species des Genus Protaminobacter vorhanden ist, hergestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Spaltung der N-Acetylgruppe der Verbindung der Struktur

CH-

-CH₂-CH₂

-NH-C-CH-

■ef

:ooh

und wird durchgeführt, indem man die Verbindung mit einer Amidohydrolase, die die N-Acetylgruppe hydrolysieren kann, innigst in Kontakt bringt bzw. damit behandelt. Insbesondere besteht das erfindungsgemäße Verfahren für die N-Deacetylierung von 890A₁₀ darin, daß man diese Verbindung mit der Amidohydrolase, N-Acetyl-890A₁₀-amidohydrolase, innigst behandelt.

Eine unerwartete Homologie zwischen N-Acetyläthanolamin und 890A₁₀ zeigt sich, wobei Extrakte von Mikroorganismen mit dem Enzym, N-Acetyläthanolamin-amidohydrolase, in vielen Fällen fähig sind, 890A₁₀ zu hydrolysieren.

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Die Verbindung 890A₁₀ wird durch Fermentation von Brühe mit dem Mikroorganismus Streptomyces flavigriseus hergestellt.

Aufgrund ausgedehnter, taxonomischer Untersuchungen wurde der Stamm ./der Mikroorganismen, der "bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, als zu der Species Streptomyces flavogriseus gehörig identifiziert und als MA-4638 "bei der Hinterlegungsstelle von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., bezeichnet. Eine seiner Kulturen wurde permanent ohne Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit in der Culture Collection of the Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt und ist öffentlich zugänglich unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11 020.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 erzeugt Antibiotikum das in im wesentlichen reiner Form aus der Fermentationsbrühe isoliert wird.

Die morphologischen und KuItüreigenschaften von Streptomyces flavogriseus MA-4638 werden in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Morphologie

Sporenträger verzweigen sich, geradkettige bis gewundene Ketten von Sporen, die Büschel bilden. Die Ketten sind länger als Sporen. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9/u χ 1,2 λχ (97Ox).

Kultureigenschaften

Hafermehlagar (ISP Medium 3)

vegetatives Viachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun, gekräuselt

Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Mittelgrau lösliches Pigment - keins

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Czapek Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar) vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun gesäumt mit Dunkelbraun Luftmycelium - mittelgrau, samtartig lösliches Pigment - leichtes Braunv/erden des Mediums

Eialbuminagar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun

Luftmycelium - Mittelgrau, vermischt mit gelblichem Grau(2dc) und gräulichem Gelb (2db)

lösliches Pigment - hellgäblich-dunkelgelb Glycerin-Asp aragin-Agar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun Luftmycelium - samtartig, hellgrau mit gelblichem Ton(2dc)

lösliches Pigment - helles Dunkelgelb Anorganische ι Salze-Stärke-Agar (ISP Medium 4) vegetatives Wachstum - umgekehrt-grünlich-gelblich-dunkelgelb Luftmycelium - samtartig, mittelgrau mit Gelbton (j5fe)

lösliches Pigment - sehr helles Dunkelgelb Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun Luftmycelium - dunkelgrau, gemischt mit einem helleren Grau

lösliches Pigment - keins Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Medium 2) vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun

Luftmycelium - samtartig, dunkelgrau gesäumt mit einem helleren Grau

lösliches Pigment - keines Magermilch-Agar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb Luftmycelium - spärlich, weißlich lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums

Hydrolyse von Casein - gut Lackmusmilch

vegetatives Wachstum - mäßiger Wachstumsring, dunkelgelb Luftmycelium - keins

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Farbe - purpur

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung, Alkalischwerden

Magermilch

vegetatives Wachstum - mäßiger Wachsturnsring, dunkelgelb Luftmycelium - keins lösliches Pigment - hellbraun

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung, Alkalischwerden

Nährtyrosin-Agar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun Luftmycelium - dunkelgrau gesäumt mit gräulichem Weiß lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums

Zersetzung von Tyrosin - positiv Pepton-Ei s en-Hefeextrakt-Agar vegetatives Wachstum - dunkelgelb Luftmycelium - weißlich, mäßig lösliches Pigment - keins Melanin - keins

ILjS-Bildung - negativ Nähragar

vegetatives Wachstum - umgekehrt-hellgräulich braun Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Dunkelgrau

lösliches Pigment - keins Nährstärke-Agar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau Luftmycelium - mittelgrau lösliches Pigment - keins

Stärkehydrolyse - gut Nährgelatine-Agar

vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau Luftmycelium- gräulich-weiß lösliches Pigment - keins Verflüssigung von Gelatine - gut

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Kartoffelzapfen

vegetatives Wachstum - dunkelgelb

Luftmycelium - mittel- "bis dunkelgrau

lösliches Pigment - keins
Loefflers Blutserum

vegetatives Wachstum - creme-gefärbt Luftniycelium - keins

lösliches Pigment - keins

Verflüssigung - keine
Gelatinestich

vegetatives Wachstum - dunkelgelb

Luftmycelium - keins

lösliches Pigment - keins

Verflüssigung von Gelatine - vollständig.

Alle obigen Ablesungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubation bei 28⁰C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der Medien, die bei diesen Untersuchungen verwendet wurden, war etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen erfolgen gemäß den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Edition (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 wird ebenfalls auf seine Fähigkeit geprüft, verschiedene Kohlenhydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wird der Mikroorganismus auf einem synthetischen Grundmedium (Pridham and Gottlieb), das 190 Kohlenhydrat enthält, bei 28⁰C 3 Wochen lang gezüchtet. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist; etwa neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Verwendung dieser Kohlenhydratquellen durch Streptomyces flavogriseus MA-4638 aufgeführt, wobei + Wachstum, + schlechtes oder fragliches Wachstum und - kein Wachstum anzeigt, verglichen mit der negativen Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle).

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Tabelle I

Glucose + Maltose +

Arabinose + Mannit +

Cellulose - Mannose +

Fructose + Raffinose

Inosit - Rhamnose +

Lactose + Saccharose +

Xylose +

Die Menge des Wachstums mit Änderungen in der Temperatur und des Sauerstoffbedarfs des Mikroorganismus sind wie folgt:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar) 28°C - gutes vegetatives und Luftwachstum 37°C - gutes vegetatives Wachstum, keine Lufthyphen 50⁰C - kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar)

aerob.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Organismen beschränkt, die vollständig die obigen Wachstum- und mikroskopischen Eigenschaften, die zur Erläuterung gegeben wurden, erfüllen. Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Mutanten, die aus den beschriebenen Organismen durch verschiedene Mittel bzw. Maßnahmen, wie Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Bakteriophageneinv/irkung u.a., gebildet werden.

₁Q wird während der aeroben Fermentation bei kontrollierten Bedingungen geeigneter, wäßriger Nährmedien, die mit einem Stamm des Organismus Streptomyces flavogriseus inokuliert sind, gebildet. Wäßrige Medien, wie solche, die für die Bildung anderer Antibiotika verwendet werden, sind für die Erzeugung von 890A₁₀ geeignet. Solche Medien enthalten Quellen

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für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind.

Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit u.a., und Stärken, wie Dextrin oder wie Getreide bzw. Körner, wie z.B. Weizen, Roggen, Maisstärke, Maismehl u.a., entweder allein oder zusammen als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die Menge an Kohlenhydrat variiert normalerweise zwischen etwa 1 und 6 Gew.96 des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in dem Medium vermischt werden. Im allgemeinen können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen z. B. Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Mais-' quellwasser, Schlempen bzw. lösliche Stoffe der Branntweinherstellung o.a. Die bevorzugte Quelle sind Schlempen bzw. lösliche Stoffe der Branntweinherstellung. Die Quellen für Stickstoff, entweder allein oder zusammen, werden in Mengen verwendet, die im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.% des wäßrigen Mediums liegen.

Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingearbeitet werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben. Ebenfalls umfaßt werden Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele aus einer großen Vielzahl von Medien, die verwendet werden können, und dies soll keine Beschränkung sein.

Die fermentation erfolgt bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37°C, für optimale Ergebnisse ist es jedoch bevorzugt,

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die Fermentation bei Temperaturen von etwa 23 bis 28°C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Wert der für das Züchten der Stämme von Streptomyces flavogriseus-Kultur und Erzeugung des Antibiotikums 890A₁₀ geeigneten Nährmedien kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.

Obgleich das Antibiotikum 89OA^₀ sowohl durch Oberflächenais auch bei eingetauchten Kulturen erzeugt wird, ist es bevorzugt, die Fermentation in eingetauchtem Zustand durchzuführen.

Eine Fermentation des Antibiotikums in kleinem Maßstab wird zweckdienlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der Antibiotikum erzeugenden Kultur inokuliert und nach der Übertragung in ein Produktionsmedium die Fermentation bei * einer konstanten Temperatur von etwa 24⁰C auf einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage ablaufen läßt.

Die Fermentation wird in einem sterilisierten Kolben des Nährmediums über eine oder mehrer Stufen der Keimentwicklung initiiert. Das Nährmedium für die Keimstufe kann irgendeine geeignete Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur bei etwa 28°C während eines Tages geschüttelt oder bis das Wachstum zufriedenstellend ist, und ein Teil des entstehenden Wachstums wird zur Inokulierung von Impfmaterial der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Impfkolben der Zwischenstufen werden, wenn sie verwendet werden, im wesentlichen auf gleiche Weise entwickelt, d.h. ein Teil der Kolbeninhalte von der letzten Impfstufe werden zur Inokulierung des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und gegen JEnde der Inkubationszeit wird der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert.

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Für das Arbeiten im großen Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzufuhren, die mit einer Rühr- bzw. Bewegungsvorrichtung und einer Einrichtung zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium in dem Tank zubereitet und durch Erhitzen bei Temperaturen bis zu etwa 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impf- bzw. Keimmaterial der produzierenden Kultur inokuliert, und die Fermentation kann während einer Zeit, wie z.B. 1 bis 6 Tage, unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Aufrechterhalten der Temperatur bei etwa 22 bis 26°C ablaufen. Dieses Verfahren zur Erzeugung des Antibiotikums 890A₁₀ ist besonders für die Herstellung großer Mengen des Antibiotikums geeignet.

Physikalische und chemische Eigenschaften des Antibiotikums

Das Antibiotikum ,890A₁₀ ist eine saure Verbindung, die in Richtung auf den positiven Pol bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert wandert. Bei einem Gradienten von 50 V/cm in 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, wandert das Antibiotikum 8,0 cm in 30 Minuten, verglichen mit einer Wanderung von 4,0 cm für 890A₁- Das Dinatriumsalz ist ein weißes oder hellgelbes Pulver nach der Lyophilisierung aus wäßriger Lösung. Bei sauren Bedingungen in wäßriger Lösung ist das Antibiotikum instabil und die freie Säureform wurde noch nicht isoliert.

Das Dinatriumsalz des Antibiotikums 890A₁₀ besitzt ein Absorptionsmaximum bei 299 mn und ein Minimum bei 243 nm bei neutralem pH-Wert in Wasser. Die E% bei 300 nm der am meisten gereinigten Zubereitung des Dinatriumsalzes beträgt 214. Das Verhältnis A,₀₀/A₂c₀ beträgt 3,33 für die reinste Probe, und das Verhältnis ^A3qO^^A22O '^be'^fcräS"^{fc 2}>°5· Das Vorhandensein geringer Verunreinigungen in dieser Probe legt nahe, daß die ent-

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sprechenden Verhältnisse für eine Probe höchster Reinheit etwas höher sind. Mehr als 9k% der Absorption bei 300 mn können durch Umsetzung mit Hydroxylamin bei neutralem pH-Wert ausgelöscht werden. Die Absorption bei 250 nm nimmt ebenfalls bei der Umsetzung mit Hydroxylamin ab, und das Verhältnis der Absorptionsabnahme bei 250 nm zu der Abnahme bei 300 nm beträgt etwa 0,16. Die Reaktion mit Hydroxylamin, verfolgt durch die A₃₀₀-Abnahme bei den in dem Teil "Hydoxylamin-Reaktion" beschriebenen Bedingungen ist offensichtlich erster Ordnung bei einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur von 23 bis 60 Sekunden.

Gemessen gegenüber einem Standard des Antibiotikums 890A₁, besitzt das Antibiotikum 890A₁₀ 174 Bioassayeinheiten (Bioanalyseneinheiten) /HAEA,₀Q-Einheit. HAEA-^₀₀ wird in dem Abschnitt "Hydroxylamin-Reaktion" beschrieben.

In Tabelle II sind die 100 MHz-kernmagnetischen Resonanzspektralsignale von 890A₁₀ in D₂O bei 32°C aufgeführt. Die chemischen Verlagerungen werden in ppm, bezogen auf HOD, bei 4,70 ο und 32°C und die Kupplungskonstanten in Hertz aufgeführt.

Tabelle II

CH₃CH 1,55 (3H, D, 6,5 Hz)

CH₃CO 2,02 (3H, S)

^C(6)"^{H 3}'^{89 (1H}' ^D»D,J₆_₅=5,4 Hz, J_5-8=9,2 Hz)

C₍₅₎-H -^4,34 (1H, D,T,J₅_₆=5,5 Hz, J_5-1=9,5 Hz)

4,8 (teilweise bedeckt durch die HOD-Linie)

,14 (1H, D,D,-7"9,2 + -^18 Hz)

3,33 (1H, D,D,^10 + 18 Hz)

-CH₂NH 3,43 (2H, T, 7 Hz)

-CH₂-S- 3,03 (2H, M)

Das Massenspektrum von TMSi-890A_1Q wird durch die Fragmente charakterisiert, die in Tabelle III aufgeführt sind.

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Tabelle III
m/e 86

227,0224 C₅H₁₅SO₄Si₂, berechnet 227,0230

241

300/1

339,1325 C₁₅H₂₅NO₄Si₂, berechnet 339,1322

342,1444 C₁₅H₂₆N₂O₃S Si, berechnet 342,1433

368

440

458

Physikalische und chemische Eigenschaften von Desacetyl

In Tabelle IV ist das antibakterielle Spektrumprofil von Desacetyl 89OA₁₀ aufgeführt.

Tabelle IV

ASP Organismus, MB//(ATCC φ/) Durchmesser der Hemm Nr. zone, mm

1 Bacillus sp. 633 28

2 Proteus vulgaris 1012 5

3 Pseudomonas aeruginosa 979 O

4 Serratia marcescens 252 (990) 9

5 Staphylococcus aureus 108 (6538 P) 23

6 Bacillus subtilis 964 (6633) 31

7 Sarcina lutea 1101 21

8 Staphylococcus aureus 698 20

9 Streptococcus faecalis 753 0

10 Brucella bronchiseptica 965 (4617) 0

11 Vibrio percolans 1272 (8461) 27

12 Proteus vulgaris 838 (21100) 14

13 Escherichia coli 1418 12

14 Pseudomonas stutzeri 1231 (II607) 16

15 Klebsiella pneumoniae 1264 8

16 Aerobacter aerogenes 835 9

17 Erwinia atroseptica 1159 (4446) 11

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Tabelle IV (Fortsetzung)

18 Pseudomonas aeruginosa 2824 14H

19 Corynebacterium pseudodiph 261(9742) 14

20 Escherichia coli 60 (9637) 10

21 Streptococcus faecium 2820 0

22 Streptococcus agalactiae 2875 23

23 Proteus vulgaris 2112 (Episom) 15

24 Proteus mirabilis 3126 0

25 Vibrio percolans 1272 + 2 χ 10⁵/u/ml

Penicillinase ' 10

26 V.percolans 1272 + Lactamase von

Enterobacter MB2646 28

27 Micrococcus flavus 369 (10240) 17

In Tabelle V sind die 300 MHz kernmagnetischen Resonanz(NMR)-Spektrumsignale von deacetyliertem 890A₁₀, bestimmt relativ zu dem Innenstandard DSS (Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat) in D₂O (24°C), aufgeführt.

CH₂S CHoN

Tabelle V	1,51	(6,	2)	b
3,14
3,43
3,07 3,43	(18 (18	,0 ,0	, 8,5) , 9,0)
3,88	(5,	6,	8,9)
4,36
4,7 -	4,	9	(geschätzt)

^H6 ^H5 ^H8

^a Verschiebungen, relativ zu der kalkulierten Lage des inneren DSS

die Werte in Klammern sind die Kupplungskonstanten.

Die Mobilität des deacetylierten 890A₁₀ wird an Dowex-1 bestimmt. Etwa 100/Ug Desacetyl 890A₁₀ werden auf eine Säule

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(0,7 x 15 cm) aus Dowex-1 x 2 (Cl"), 0,074 bis 0,037 mm (200 "bis 400 mesh), in einer Ionenstärke unter 0,01 M aufgebracht und mit einer Lösung eluiert, die 0,10 M NaCl + 0,011 M NH₄Cl + 0,0001 M NH, bei pH 7,2 in entionisiertem Wasser enthält. Der Hauptpeak von Desacetyl 890A₁₀ tritt zwischen den eluierten Volumen 65 ml und 124 ml mit einem Maximum bei einem eluierten Volumen von 109 ml auf.

Desacetyl 890A-.₀ besitzt eine maximale Absorption im Ultraviolettspektrum bei 296 nm.

Die Mobilität von Desacetyl 890A₁₀ wird mit Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese bestimmt.

Bei der Dünnschichtchromatographie von Desacetyl 890A₁₀ an Eastman Chromagram 6064 Celluloseblättern bei 23°C in 66^igem (Vol/Vol) Äthanol zeigt das Antibiotikum einen Wert von 0,68, bestimmt durch Bioautographie.

Bei der Elektrophorese von Desacetyl 890A₁₀ an Whatman Chromatographiepapier unter Verwendung eines Puffers, der 35,2 g KH₂PO₄ + 57,2 g Na₂HP0₄/l enthält, bei 47 V/cm während 50 min bewegt das Antibiotikum Desacetyl 890A₁₀ sich 65 mm in Richtung auf die positive Elektrode. Bei den gleichen Bedingungen bewegt sich das Antibiotikum 890A_1Q 118 mm in Richtung auf die positive Elektrode. Die Mobilitäten werden durch Bioautographie unter Verwendung von Chloramphenicol als Vergleichsmarkierung gemessen, dessen Mobilität als Null angenommen wird.

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Desacetyl 89OA₁₀, die erfindungsgemäße Verbindung, ist ein wertvolles Antibiotikum, das gegenüber verschiedenen grampositiven und gramnegativen 'Bakterien aktiv ist. Es findet dementsprechend bei der Human- und Veterinärmedizin Verwendung. Die erfindungsgemäße Verbindung kann als antibakterielles Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch grampositive oder gramnegative Bakterien verursacht werden, z.B. gegenüber empfindlichen Stämmen von Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsieila pneumoniae, Enterobacter cloacae und Pseudomonas aeruginosa. Das erfindungsgemäße antibakterielle Material kann weiterhin als Zusatzstoff für Tierfutter bzw. Tierfutterzusätze, für die Konservierung von Nahrungsmitteln bzw. Futter und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Beispielsweise kann es in wäßriger Zubereitung in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in

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Konzentrationen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung zur Zerstörung und Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Vorrichtungen bzw. Einrichtungen und als Bakterizid bei industriellen Anwendungen, z.B. bei Anstrichmitteln auf Wassergrundlage und in weißem Wasser von Papiermühlen zur Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien, verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum kann in irgendeiner einer Vielzahl von pharmazeutischen Zubereitungen als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen entweder mit einem oder mehreren anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Verbindungen verwendet werden. Als Beispiel des ersteren kann ein Aminocyclit-Antibiotikum, wie Gentamicin, gleichzeitig mitverabreicht werden, so daß irgendeine Chance, das resistente Organismen erhaltenbleiben, minimal gehalten wird. Als Beispiel des letzteren können Diphenoxylat und Atropin in Dosisformen kombiniert werden, die für die Therapie der Gastroenteritis bestimmt sind. Das Antibiotikum kann in Kapselform oder als Tabletten, Pulver oder in Form flüssiger Lösungen oder als Suspensionen oder Elixiere verwendet werden. Es kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in Dosiseinheitsformen vorliegen, und sie können übliche Arzneimittelträgerstoffe bzw. -verdünnungsmittel, wie Bindemittel, z.B. Sirup, Akaziengummi, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, z.B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Schmiermittel, z.B. Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Desintegrationsmittel, z.B. Kartoffelstärke, oder annehmbare Benetzungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Die Tabletten können nach an sich gut bekannten Ver-

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fahren "beschichtet bzw. überzogen werden. Orale, flüssige Präparationen können in Form wäßriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups, Elixieren usw. vorliegen oder sie können als Trockenprodukt für die Rekonstitütion mit Wasser oder anderen geeigneten Trägern vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Präparationen können an sich bekannte Zusatzstoffe, wie Suspensionsmittel, z.B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte, genießbare Fette; Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Akaziengummi;nichtwäßrige Trägerstoffe, die genießbare Öle umfassen können, z.B. Mandelöl, fraktioniertes Cocosnußöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol; Konservierungsmittel, z.B. Methyl- oder Propyl-phydroxybenzoate oder Sorbinsäure, enthalten. Die Suppositorien werden übliche Suppositoryen-Grundstoffe, z.B. Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.

Zusammensetzungen für die Injektion können in Dosiseinheitsform in Ampullen oder in Behältern für mehrfache > Dosen mit zugegebenem Konservierungsstoff vorliegen. Die Zusammensetzungen können in Form von Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen und können Formulierungshilfsmittel, wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel, enthalten. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform für die Rekonstitütion mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen.

Die Zusammensetzungen können ebenfalls in geeigneten Formen für die Absorption durch die Schleimhautmembranen der Nase und des Rachens oder der Bronchialgewebe vorliegen und können zweckdienlich in Form von Pulvern oder flüssigen Sprays oder Inhalationsmitteln, Lutschbonbons, Anstrichmitteln für den Hals bzw. Rachen, usw. zubereitet sein. Für die Medikation der Augen oder

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der Ohren können die Zubereitungen als einzelne Kapseln, in flüssiger oder semi-fester Form, vorliegen oder sie können als Tropfen usw. verwendet werden. Topische Anwendungen können in hydrophoben oder hydrophilen Grundmaterialien als Salben, Cremes, Lotionen, Anstrichmittel, Pulver usw. zubereitet werden.

Zusätzlich zu einem Träger können die erfindungsgemäßen Zubereitungen bzw. Zusammensetzungen andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Mittel zur Viskositätseinstellung oder Geschmacksmittel bzw. Aromastoffe.u.ä., enthalten.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Geflügel bzw. Küken, Kühen, Schafen, Schweinen u.a., können die Zubereitungen z.B. als intramammare Zubereitungen in entweder langwirkenden oder schnell abgebenden Grundstoffen zubereitet werden.

Die zu verabreichende Dosis hängt in starkem Ausmaß von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Frequenz der Verabreichung ab. Der parenterale Weg ist für generalisierte Infektionen und der orale Weg für intestinale Infektionen bevorzugt .

Bei der Behandlung von Bakterieninfektionen beim Menschen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oral oder parenteral nach an sich bekannten Verfahren für die antibiotische Verabreichung in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag und bevorzugt etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag in bevorzugt unterteilten Dosen, z.B. drei- bis viermal täglich, verabreicht. Die erfindungsgemäße Verbindung kann in Dosiseinheiten verabreicht werden, z.B. 25, 250, 330, 400 oder 1000 mg aktiver Bestandteil mit geeigneten physiologisch annehmbaren Trägern oder

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Verdünnungsmitteln. Die Dosiseinheiten liegen in Form flüssiger Präparationen, wie Lösungen oder Suspensionen, oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die optimale Dosis wird bei einem gegebenen Fall von der Art und der Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen, und kleinere Dosen werden für Säuglingszwecke verwendet. Alle diese Einstellungen sind dem Fachmann geläufig.

Analysen- bzw. Assayverfahren für Antibiotikum 890A₁₀ I. Bioassay (Bioanalyse)

Ein Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890A₁ wird als Standard verwendet. Antibiotikum 890A₁ wird entsprechend dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt.

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml eines sterilisierten Mediums suspendiert, das 8 g/l Difco Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält, "Nährbrühe-Hefeextrakt "(im folgenden als NBYE bezeichnet) . Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert. Diese Kultur wird zur Inokulation der Oberfläche von Schrägkulturen verwendet, die 1,5% Agar in NBYE enthalten, und die inokulierten Schrägkulturen werden über Nacht
Kühlschrank aufbewahrt.

türen werden über Nacht bei 28°C inkubiert und dann in einem

Die im Kühlschrank aufbewahrten Schrägkulturen, die aus einer einzigen, lyophilisdecten Kultur erzeugt werden, werden bis zu 4 Wochen von ihrer Herstellung wie folgt verwendet: Eine Öse von Inokulum aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, das in

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15 975 2 Ö O 5 7 O 1

einem 250 ml Erlenmeyerkolben enthalten ist, dispergiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28° C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 5O?6ige Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt. Ein 33,2 ml-Teil dieser verdünntai Kultur wird zu 1 1 NBYE zugegeben, der 15 g Agar enthält und bei 46⁰C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 χ 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 5 ml/Schale, gegossen, gekühlt und bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung aufbewahrt.

Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm werden in die zu analysierende Lösung eingetaucht und auf das Agar gestellt. Alternativ können die Scheiben durch Aufpipettieren von 1/1O ml Lösung auf eine trockene Scheibe beschickt werden, und dann kann die Scheibe auf das Agar gesetzt werden. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach der geeigneten Inkubation (12 bis 24 h bei 25°C) bestimmt. Gegebenenfalls werden Verdünnungen der zu analysierenden Lösungen in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 "Kaliumphosphatpuffer " (im folgenden als KPB) bezeichnet),oder in entionisiertem Wasser durchgeführt.

Die "Berechnungen der Wirksamkeit bzw. Potenzen erfolgen wie folgt: Eine Neigung wird bestimmt, indem man die Zonendurchmesser einer Lösung des Antibiotikums 89OA^₀ und einer 4fachen Verdünnung (in KPB) dieser Lösung bestimmt. Zwei Scheiben jeder Konzentration werden auf einer einzigen Platte analysiert, und die durchschnittliche Zonengröße wird bei jeder Konzentration bestimmt. Die Neigung ist gleich der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrößen. Die Potenzen bzw. Wirksamkeiten werden dann gemäß der folgenden Formel berechnet:

Potenz (Einheiten/ml) =

[D-D₃] log 2

. ν ν Neigung

(Potenz des Standards; χ Verdünnung χ 10

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Darin bedeuten: D den durchschnittlichen Durchmesser der durch die unbekannte Substanz gebildeten Zonen, D_ den durchschnittlichen Durchmesser der Standardzonen und "Verdünnung" den Grad, gemäß dem die unbekannte Probe vor der Analyse verdünnt wurde. Wird kein Standard verwendet, wird D„ als 25 mm angenommen und (Potenz des Standards) wird als 1 Einheit/ml angenommen, wenn gegenüber Vibrio percolans ATCC 8461 gemessen wird. Reines 89OA₁ wird so definiert, daß es eine Potenz von 250 Einheiten/Hydroxylamin auslöschbare Absorptionseinheit bei 300 nm besitzt, wenn es als Standard verwendet wird.

II. Analysenverfahren zur Bestimmung der "890 Assay-Einheiten"

Ein übliches Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als Standard verwendet. Die Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltenden Platten werden wie folgt hergestellt. Eine Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in einem Nährbrühe-Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert und dann auf eine Dichte von 60%iger Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2 ml-Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 Medium gegeben, das ein Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthält und bei 46°C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 χ 15 mm. · Kunststoff-Petrischalen, 10 ml/Schale, gegossen, gekühlt und bei 2 bis 4?G bis zu 5 Tagen vor der Vervrendung gehalten.

Die Konzentration an Cephaloridin, die äquivalent zu 1 Einheit/ml 890 A₁ ist, wird durch Analyse auf Platten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, die jedoch 5 ml inokuliertes Medium/Platte enthalten, wie folgt bestimmt. Vier Konzentrationen von Cephaloridin ergeben den Standard - 3,12, 6,25, 12,5 und 25 mcg/ml, wobei 12,5 mcg/ml als Vergleichs-

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lösung dient. Die Zonendurchmesser auf einer 5 ml-Platte für den Standard sind wie folgt.

Konzentration (mcg/ml) Zonendurchmesser (mm)

3,12 16,8

6,25 22,3

12,5 25,0

25 29,6

Eine Einheit wird als die Menge an Antibiotikum pro ml definiert, die eine 25 mm Hemmzone auf einer 5 ml-Platte ergibt, wie in Teil I, oben, beschrieben. Bei diesem Assay wird daher eine Konzentration von 12,5 mcg/ml Cephaloridin als äquivalent zu 1 Einheit 890A₁ZmI angesehen. Da die Neigung für die Linie für Cephaloridin 4,0 beträgt, werden die Berechnungen der Potenz der Probe unter Verwendving einer Neigung von 4,0 vorgenommen.

III. Hydroxylamin-Reaktion

Antibiotikum 890A₁₀ reagiert mit Hydroxylamin und ergibt eine Substanz, bei der die Absorption bei 300nm merklich verringert ist. Dies ermöglicht eine Grundlage für die quantitative Analyse des Antibiotikums 89OA..Q.

Die zu analysierende Lösung wird zu 0,05 M Kaliumphosphat, pH 7,4, gegeben, indem man 1/20 Volumen einer Lösung zugibt, die 0,8 M K₂HPO^ und 0,2 M KH₂PO₄ enthält. Dann wird I/IOO Volumen 1 M Hydr oxylamin-hydro Chlorid zugegeben, und die Absorption bei 300 nm wird in Intervallen von 1/2 bis 2 min gemessen. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Man nimmt kinetische Werte erster Ordnung an und die Halbwertszeit wird aus der Absorptionsabnahme während der ersten 10 min bestimmt. Aus dieser Halbwertszeit wird die Zeit berechnet, nach der keine weitere Absorptionsabnehme beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen werden über diese Zeit

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hinaus weitergeführt. Beobachtet man nach dieser Zeit keine weitere Abnahme, dann wird die Gesamtabsorptionsabnahme (wobei für den Verdünnungseffekt und die Absorption von Hydroxylamin korrigiert wird) als die "Hydroxylamin auslöschbare Absorption bei 300 nm (HAEA-Q₀)" genommen. Beobachtet man nach dieser Zeit eine Absorptionsabnahme, so wird die Rate der Hintergrundabsorptionsabnahme berechnet, und die zu diesem Zeitpunkt beobachtete Abnahme wird für die Hintergrundsabnahme korrigiert, wobei angenommen wird, daß die Hintergrundsabnähme linear mit der Zeit verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als HAEA^₀₀ aufgezeichnet.

Die Zahl der HAEA^₀₀-Einheiten ist gleich der HAEA₃₀₀, multipliziert mit dem Volumen in ml.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und insbesondere Verfahren, nach denen die erfindungsgemäßen Produkte hergestellt werden.

Beispiel 1

Verfahren zur Isolierung von N-Acetyl-890A₁₀-amidohydrolase bildenden Organismen

Eine 1!&Lge (Gew./Vol.) Suspension von fruchtbarem Rasenboden wird hergestellt, indem 1 g Rasenboden in 100 ml steriler Phosphatpuffer-Salzlösung suspendiert wird, wobei die Phosphatpuffer-Salzlösung die folgende Zusammensetzung besitzt:

Phosphatpuffer-Salzlösung

NaCl 8,8 g

1 M Phosphatpuffer, pH 7,5⁺ 10 ml
destilliertes Wasser 1000 ml

⁺1 M Phosphatpuffer, pH 7,5: 16 ml 1 M KH₂PO₄ werden mit 84 ml 1 M K₂HPO₄ vermischt. Der pH-Wert des Phosphatpuffers wird

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durch Zugabe geringer Mengen von entweder 1 M KHpPO₄ oder 1 M K₂HPO₄ auf 7,5 eingestellt.

Aliquote Teile dieser 1%igen Stock- bzw. Vorratsbodensuspension werden zur Herstellung von 10-, 100- und lOOOfachen Verdünnungen verwendet.

1 ml-Teile der Stocksuspension oder 1 ral-Teile der 10-, 100- und lOOOfachen Verdünnungen v/erden zu 2 ml-Teilen steriler 1,Obiger Agarlösungen bei 48°C gegeben. Die Gemische werden schnell über die Oberfläche steriler Petrischalen mit einem Durchmesser von 85 mm, die 20 ml Medium A, enthalten, gegossen. Medium A besitzt die folgende Zusammensetzung.

Medium A

KH₂PO₄ 3,0 g

K₂HPO₄ 7,0 g

MgSO₄ 0,1 g

destilliertes Wasser 1000 ml

N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird 1Ofach in Wasser verdünnt und mit einer Membran sterilisiert. Diese Lösung wird nach Behandlung im Autoklaven zugegeben.

Für feste Medien; 20 g Agar werden zugegeben.

Die Petrischalen werden 18 Tage bei 28⁰C inkubiert. Gut isolierte Kolonien v/erden herausgenommen und auf Medium B ausgestrichen. Medium B besitzt die folgende Zusammensetzung.

Medium B

Tomatenpaste bzw. -mark 40 g
gemahlenes Weizenmehl 15 g
destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird unter Verwendung von NaOH auf 6 eingestellt.

Für feste Medien; 20 g Agar werden zugegeben.

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Einzelne Klone werden ausgewählt und während 2 Tagen bei 28°C auf Schrägkulturen des Mediums B gezüchtet.

Ein Teil des Wachstums der Schrägkulturen wird zur Inokulation eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml Medium A enthält, eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml ergänztes Medium B enthält (ergänzt nach der Behandlung im Autoklaven mit 0,4 ml einer membran-sterilisierten Lösung aus N-Acetyläthanolamin, verdünnt auf das 10fache mit Wasser) und eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml Medium C enthält, verwendet. Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Destrose	20 g
Pharmamedia	8 g
Maisquellwasser "" "';·"
(auf nasser Basis)	5 g
destilliertes Wasser	1000 ml

pH-Wert mit NaOH oder HCl
auf 7 eingestellt

N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

⁺ N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird auf das 10fache mit Wasser verdünnt und gegenüber einer Membran sterilisiert. Diese Lösung wird nach der Behandlung im Autoklaven zugegeben.

Die Kolben werden 4 Tage bei 28°C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm = 2" Schwingungsamplitude) geschüttelt. Ein 30 ml Teil aus jedem Kolben wird 15 min bei 8000 ü/min zentrifugiert. Der überstehende Teil wird entfernt, wobei nur so viel zurückgelassen wird, daß eine dicke Suspension aus Zellen und Medienfeststoffen erhalten wird. Die Hälfte der Suspension wird der Ultraschallzerschlagung unter Verwendung eines Branson Instrument Modell LS-75 Sonifiers mit einer 1,27 cm (1/2 Inch) Sonde unterworfen. Die Eingangsleistung wird in die Stellung Nr. 4 gestellt und vier aufeinanderfolgen-

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de 15 sec-Zyklen an Bestrahlung werden verwendet, während die Suspension in Eis-Wasser während und zwischen der Zerschlagung gekühlt wird. Zur Prüfung der Anwesenheit von

N-Acetyl-890A₁ Q-amidohydrolase-Aktivität wird ein 10/ul-Teil des Sonikats mit 25 /ul einer 890A₁₀-Losung, die 500 /Ug/ml enthält, vermischt. Kontrollproben, die Antibiotikum und Puffer allein enthalten, und mit Ultraschall behandelte Zellen und Puffer ohne Antibiotikum werden ebenfalls geprüft. Nach der Inkubation über Nacht bei 28° C werden 10 /Ul-Mengen auf Schleicher und Schuell Nr. 2O43-B-Papier angewendet. Unter Verwendung von 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, wird ein Spannungsgradient von 50 V/cm während 30 min angelegt. Das Papier wird auf eine Staphylococcus aureus ATCC 6538P-Platte gelegt und 18 h bei 37°C inkubiert.

Die Assayplatten werden wie folgt hergestellt: Ein Übernacht-Wachstum des Assayorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in Nährbrühe plus 0,2% Hefe extrakt wird mit Nährbrühe plus 0,2Jo Hefeextrakt auf eine Suspension mit einer Durchlässigkeit von 60% bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt. Diese Suspension wird zu Difco Nähragar, das mit 2,0 g/l Difco Hefeextrakt ergänzt wurde, bei 47 bis 48°C zugegeben, so daß man eine Zusammensetzung erhält, die 33,2 ml der Suspension/l Agar enthält. 40 ml dieser Suspension werden in 22,5 cm χ 22,5 cm Petrischalen gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zu ihrer Verwendung bei 4°C gehalten (maximal 5 Tage).

Der /Xinveränderte bioaktive 890A_1Q-Fleck migriert 8 cm in Richtung auf den positiven Pol. Ein neuer bioaktiver Fleck, bedingt durch Desacetyl 890A₁₀, wird festgestellt und er migriert 4 cm in Richtung auf den positiven Pol. Kontroll-Inkubationsgemische aus Antibiotikum plus Puffer und Zellsonikat plus Riffer ergeben kein bioaktives Material, das 4 cm in Richtung auf den positiven Pol migriert.

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Beispiel 2

20	g
8	g
5	g
1000	ml

Deacetylierung von ₁₀

Ein Teil des Wachstums einer Schrägkultur von Protaminobacter ruber MB-3528 wird zur Inokulation eines 250 ml Erlenmeyerkolbens, der 50 ml Medium C enthält, verwendet. Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung:

Medium C
Dextrose
Pharmamedia

Maisquellwasser bzw.-einweichwasser (auf nasser
Basis)

destilliertes Wasser

pH-Wert mit NaOH oder HCl
auf 7 eingestellt

N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

⁺N-Acetyläthanolaminlösung: N-Acetyläthanolamin wird in Wasser auf das 10fache verdünnt und gegenüber einer Membran sterilisiert. Diese Lösung wird nach der Behandlung im Autoklaven zugegeben.

Der Kolben wird 4 Tage bei 28°C auf einer 220 U/min-Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt. Ein 25 ml-Teil aus dem Kolben wird 15 min bei 8000 U/min zentrifugiert. Das überstehende Material wird entfernt und die Zellen auf der Oberfläche der Medienfeststoffe werden in 0,5 ml 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, abgekratzt. Die entstehende Suspension wird der Ultraschallzerschlagung unter Verwendung eines Branson Instrument Modell LS-75 Sonifiers mit einer 1,27 cm Sonde bei der Einstellung 4 während vier 15 sec-Intervallen unterworfen, während die Suspension in Eis-Wasser während und zwischen der Zerschlagung gekühlt wird. Ein 10/ul-Teil des Sonikats wird mit 25/ul einer 890A_1Q-Lösung, die 500 /ug/ml enthält, vermischt. Kontrollproben, die Antibiotikum

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und Puffer allein enthalten, und mit Ultraschall behandelte Zellen und Puffer ohne Antibiotikum werden ebenfalls geprüft. Nach der Inkubation über Nacht bei 28⁰C werden 10/Ul-Mengen auf Schleicher & Schuell Nr. 2043-B-Papier aufgebracht. Unter Verwendung von 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, wird ein Spannungsgradient von 50 V/cm während 30 min angelegt. Das Papier wird auf eine Staphylococcus aureus ATCC 6538P Assay-Platte gelegt und 18 h bei 37°C inkubiert.

Die Assayplatten werden folgendermaßen hergestellt: Ein Übernacht !-Wachstum des Assayorganismus, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, in Nährbrühe plus 0,2?£ Hefeextrakt wird mit Nährbrühe plus 0,2Jo Hefeextrakt zu einer Suspension mit einer Durchlässigkeit von 60?£ bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar, ergänzt mit 2,0 g/l Difco Hefeextrakt, bei 47 bis 48°C gegeben unter Erzeugung einer Zusammensetzung, die 33,2 ml Suspension/1 Agar enthält. 40 ml dieser Suspension wird in 22,5 cm χ 22,5 cm Petrischalen gegossen, und diese Platten werden abgekühlt und bei 4⁰C bis zu ihrer Verwendung (maximal 5 Tage) gehalten.

Zusätzlich zu dem nichtveränderten bioaktiven ₁₀, der 8 cm in Richtung auf den positiven Pol wandert, wird ein neuer bioaktiver Fleck, bedingt durch Desacetyl 890A^₀, festgestellt, der 4 cm in Richtung auf den positiven Pol wandert. Kontrollinkubationsgemische aus Antibiotikum plus Puffer und Zellsonikat plus Puffer ergeben kein bioaktives Material, das 4 cm in Richtung auf den positiven Pol wandert.

Beispiel 3

Herstellung des Antibiotikums 890A₁₀

Zwei gefrorene Ampullen, die je 2 ml MA-4638-Inokulum enthalten, werden langsam aufgetaut, und der Inhalt wird aseptisch in zwei Impfkolben übertragen, die je 500 ml Medium C enthalten.

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Die Impfkolben, 2 1 Schüttelkolben mit dreifachen Umlenkorganen, sind mit einem Seitenarm ausgerüstet, der mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen wird.

Medium C

autolysierte Hefe (Ardamine ) 10,Og

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml

der pH-Wert wird vor der Sterilisierung mit NaOH auf 6,5 eingestellt

+ Ardamine: Yeast Products, Inc. ++ Phosphatpufferlösung:

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,Og

destill.Wasser 1000 ml

Die inokulierten Impfkolben werden 24 bis 30 h bei 28+1⁰C auf einer 210 U/min Kreiselschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt.

Das Wachstum von den Impfkolben wird zur Inokulation von zwei 14 1 Glasfermentationsvorrichtung, die 10 1 Produktionsmedium enthalten (Medium D plus 0,15% Sojabohnenöl, Vol/Vol), verwendet.

Medium D

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g lösliche Stoffe von der Branntweinherstellung 7,0 g Hefeextrakt 5,0 g

CoCl₂.6H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH vor der Sterilisierung auf 7,3 eingestellt

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Die Fermentationsvorrichtungen werden bei 24⁰C unter Verwendung einer Rührrate von 640 U/min (etwa Kd 5,5) und einer Luftströmung von 0,5 WM während 72 h betrieben. Entsehäumungsmittel, Hodag-MF (Hodag Chemical Corp.), wird je nach Bedarf verwendet, aber nicht mehr als 0,1%.

Die Inhalte der beiden Fermentationsvorrichtungen werden nach dem Fermentat'ionsversuch vereinigt; man erhält etwa 20 1.

200 ml-Teile des Ansatzes werden in einer Servall RC-2B Zentrifuge bei 9000 U/min 20 min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird durch eine 1 cm Schicht aus Hyflo Super-Cel in einem 33,02 cm (13 inch) Lapp-Trichter mit Baumvrall- bzw. Watterfilter filtriert. Das Filtrat besitzt eine Bioaktivität von 20 Einheiten/ml.

Die filtrierte Brühe (18 l) wird auf eine Säule (8,2 χ 29 cm) aus Dowex-1x2(Cl") 0,297 bis 0,149 mm (50-100 mesh), bei 150 ml/min angewendet. Die Säule wird dann mit 1 1 deionisiertem Wasser und anschließend mit 15 1 0,15 M NaCl +0,01 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25/UM neutrale EDTA in 50% MeOH bei 150 ml/min gewaschen.

Das Antibiotikum 890A₁₀ wird dann mit 3,2% NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 /UM neutrale EDTA in 80% MeOH mit 100 ml/min eluiert. Fraktionen v/erden wie folgt gesammelt: eine Fraktion von 11, vier Fraktionen von je 500 ml und 12 Fraktionen von je 1 1. Die Bioaktivität und die Absorption bei 220 nm werden von jeder Fraktion bestimmt, und die. ■ Fraktionen, die Bioaktivität/Ap2o"^Veriläl"^{tnisse ütier} °»6 Einheiten/Appo"·^^·¹^¹®^"^ e^rgeb^en und die ebenfalls mehr als 10% der gesamten, gewonnenen Aktivität pro Fraktion enthalten, werden für die weitere Reinigung vereinigt. Es werden so die Fraktionen 4 bis 8 vereinigt, die insgesamt 11% der angewandten Bioaktivität enthalten.

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Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 190 ml konzentriert, das ausgefallene Salz wird mit entionisiertem Wasser gewaschen, und das Waschwasser wird zu der überstehenden Flüssigkeit gegeben, wobei das Endvolumen auf 220 ml gebracht wird. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit HCl auf 6,5 eingestellt, und das Konzentrat wird auf eine Säule (6,0 χ 59 cm) aus Amberlite XAD-2, die zuvor mit 8 1 60%igem wäßrigem Aceton und anschließend 16 1 entionisiertem Wasser gewaschen wurde, aufgebracht. Nachdem die Anwendung vollständig ist, wird die Säule mit 5 x 10 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült, und die Antibiotika werden mit entionisiertem V/asser mit 35 ml/min eluiert. Die Fraktionen werden wie folgt gesammelt: 1 Fraktion von 500 ml, gefolgt von 7 Fraktionen von je 250 ml, gefolgt von 4 Fraktionen von 500 ml.

Die Bioaktivität und die HAEA^_oZj-Werte werden an den Fraktionen 3 bis 12 bestimmt. Die Fraktionen 4 bis 9 mit einem Ap2o~^Ver]iläl'^fcnis über 0,01 werden für die weitere Reinigung ver einigt. Die Fraktion 3» die etwa 1/5 des angewandten Salzes enthält, wird ebenfalls zu dem vereinigten Material gegeben. Das vereinigte Material enthält 469

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,1 1 verdünnt und auf eine Säule (2,15 x 42 cm) von Dowex-1x4 (Cl"), minus 400 mesh bzw. -0,037 mm, mit 2 ml/min angewendet. Die Säule wird mit 100 ml 5O5oigem Methanol gewaschen, und das Antibiotikum wird mit 0,25 M NaCl + 0,01 M NH₄Cl + 0,0001 M NH₃ in 80&Lgem MeOH mit etwa 2 ml/min eluiert. Fraktionen mit 8 bis 12 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität und die Absorption bei 220 nm, 260 nm und 300 nm werden für jede fünfte Fraktion bestimmt, und HAEA^q₀ wird bei den bioaktiven Peakfraktionen bestimmt. Die 890A₁₀-Bioaktivität tritt in den Fraktionen 85 bis 150 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 120. Fraktionen mit /

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ten über 0,05 werden für die v/eitere Reinigung vereinigt. Die Fraktionen 105 bis 133 werden so vereinigt, sie enthalten insgesamt 130 HAEA-QQ-Einheiten. Die vereinigten Fraktionen 105 bis 133 werden mit entionisiertem Wasser auf 1900 ml verdünnt, und der pH-Wert wird auf 7,6 eingestellt. Die Probe wird auf eine Säule (2,15 x 42 cm) aus Dowex-1x2(Cl~), minus 400 mesh = -0,037 mm, aufgetragen, die zuvor mit 3 1 3/oigem NaCl in 5O5aigem Methanol und anschließend mit 50 ml 50?oigem Methanol gewaschen wurde. Ilachdem die gesamte Probe angewendet wurde, wird die Säule mit 100 ml 30%igem Methanol gewaschen und mit 2 ml/min mit 0,26 M NaCl + 0,005 M NH₄Cl + 0,0002 M NH₃ in 30%igem Methanol eluiert. Fraktionen von 10 bis 12 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁₀ tritt bei den Fraktionen 230 bis 290 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 260. Die Fraktionen mit einem A^^/Ao^-Verhältnis über 1,10 und einem Av_OQ/Ap2o~V^ernältnis ^u"^^er 0,83 werden für die v/eitere Reinigung vereinigt. Die Fraktionen 240 bis 275 werden so vereinigt, sie enthalten 91,6 HAEA₃₀₀-Einheiten.

Die vereinigten Fraktionen 240 bis 275 werden bei vermindertem Druck auf 10 ml konzentriert. Das Konzentrat wird von dem ausgefallenen Salz durch Abpipettieren getrennt. Das Salz wird mit 2 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Waschwasser wird zu dem Konzentrat zugegeben. Die vereinigten 12 ml Konzentrat und Waschwasser werden auf eine Säule (2,15 x 76 cm) aus Bio-Gel P-2 (0,074 bis 0,037 mm = 200-400 mesh) gegeben, die zuvor mit 30 ml gesättigtem NaCl in entionisiertem Wasser, gefolgt von 1500 ml entionisiertem Wasser und 50 ml 0,05 mM NH^ in entionisiartem Wasser gewaschen wurde. Nachdem die Anwendung vollständig ist, wird die Säule mit 3 x 1 ml Mengen an 0,05 mM NH, in entionisiertem Wasser zum Spülen gespült, und das Antibiotikum wird mit 0,05 mM NH^ in entionisiertem Wasser mit 0,73 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen von je 3,65 ml gesammelt.

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Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A₁₀ tritt bei den Fraktionen 29 bis 50 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 36. Die Fraktionen mit einem A;zQ₀/A_2t-Q-Verhältnis über 1,9 und ebenfalls mit einem A^₀₀/A₂₂Q-Verhältnis über 1,45 werden für die Lyophilisierung und NMR-Analyse vereinigt. Die Fraktionen 36 bis 45 werden so vereinigt, sie enthalten 50,8 A^₀₀-Einheiten, von denen 45,1 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen 36 bis 45 werden bei vermindertem Druck auf 1 ml konzentriert, und 5 ml D₂O werden zugegeben. Die Probe wird erneut auf 0,835 ml konzentriert und 0,825 ml davon werden in eine Glasampulle übertragen und gefriergetrocknet und lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe enthält 48,2 A^QQ-Einheiten und 4,6 mg Feststoffe.

Beispiel 4

Herstellung von Antibiotikums 890A₁

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600a wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der folgendes Zusammensetzung enthält:

Medium A	10,0 g
Hefeextrakt	10,0 g
Glucose	0,05g
MgSO4.7H2O	2 ml
Pho sphatpuffer+	1000 ml
destilliertes Wasser
Pho sphatpufferlö sung:	91,0 g
KH2PO4	95,0 g
Na2HPO4	1000 ml
destill.Wasser

Diese Suspension wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlenmeyer-Irapfkolbens mit dreifachen Ablenkorganen, der 54 ml

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Impf medium B der folgenden Zusammensetzung enthält, verwendet.

Medium B

autolysierte Hefe (Ardamine ) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgSO₄.7H₂O 0,05g

Phosphatpuffer⁺ 2,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt

+ Ardamine: Yeast Products Corporation ++ Phosphatpufferlösung:

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

Der Impfkolben wird mit Baumwolle "bzw. Watte verschlossen und 30 h bei 28+1⁰C auf einer 220 U/min Kreiselschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude)geschüttelt.

Fünfzig 250 ml Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkorgane, die je 40 ml Produktionsmedium C enthalten, werden mit 1 ml pro Kolben der Brühe von dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen.

Medium C

Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl₂.6H₂O 5,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Nach der Inokulation werden die Produktionskolben bei 28+1⁰C unter Schütteln auf einer 220 U/min Kreiselschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 3 Tage inkubiert. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegenüber Standard Vibrio per-

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colans ATCC 8461-Assayplatten unter Verwendung von 1,27 cm As s ays ehe it) en analysiert, die in die zentrifugierten Fermentationsbrüheproben getaucht werden. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Erntezeit bzw. Alter, h 72

pH-Wert 6,4

Vibrio ρercolans

(1/1OO Verdünnung) Assay 23 mm

890 Assay, Einheiten/ml 103

Die gesamte Brühe wird in 200 ml Teilen in Polycarbonatflaschen mit 9000 U/min während 15 min zentrifugiert; man erhält 1600 ml vereinigte überstehende Lösung mit einer Potenz von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml neutrale EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an einer Dowex-1x2(CT~), 0,297 bis 0,149 mm (50-100 mesh), Säule, Schichtdimensionen 3,8 χ 22 cm, mit einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 1 1 entionisiertem Wasser, das 50 g Natriumchlorid, 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0), und 25/UM neutrale EDTA enthält, bei einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890A₁ tritt bei den Fraktionen 13 bis 81 auf mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 33, gezählt von der ersten Anwendung des Salzeluats. Die Fraktionen 24 bis 41 mit den höchsten Biopotenz/A^QQ-Verhaltnissen werden für die weitere Behandlung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 29 000 Einheiten oder 17% der angewandten Bioaktivität.

Das Dowex-Eluat wird auf 10 ml konzentriert. Der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt, das

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Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3 x 36 cm, aufgebracht, die zuvor mit je 2 1 60%igem wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5/aigem (Gew./Vol) Natriumchlorid in entionisjH?tem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.

Die Aktivität des Antibiotikums tritt bei den Fraktionen 6 bis 14 auf, die sich von 220 bis 256O ml an eluiertem Volumen erstreckt. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf, die sich von 370 bis 590 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens ausmachen, besitzen die höchsten Verhältnisse von ΗΑΕΑ^₀₀/Αρρ₀ und werden für die weitere Behandlung vereinigt. Diese Fraktionen enthalten 36 600 Einheiten; dies entspricht 126?o der offensichtlichen, angewendeten Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 v/erden auf 100 ml konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Dowex-1x4(Cl*") , -0,037 mm (minus 400 mesh), Schichtdimensionen 2,2 χ 41 cm, mit einer Strömungsrate von 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 3 1 0,07 M NaCl + 0,005 M NH^Cl + 0,0001 M NH, in entionisjErtem Wasser bei einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend mit der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A^ tritt bei den Fraktionen 181 bis 217 mit einem Maximum bei der Fraktion 198 auf. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Absorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16/ul 1 M NaOH auf 7,3

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eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Bio-Gel P-2, 0,074 bis 0,037 mm (200-400 mesh), Schichtdimension 2,15 x 70 cm, aufgebracht und mit 3 χ 1 il Waschlösungen aus entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser bei 0,96 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 3,Q5 ml werden gesammelt.

ι Der Hauptpeak des Antibiotikums 890A^ tritt bei den Fraktionen 24 bis 44 mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 34 auf. Die Fraktionen 27 bis 38 mit den /höchsten A^₀₀/A₂a5-Verhältnissen werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 72 A^₀₀-Einheiten.

Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3»0 ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10 All 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Glasampullen mit Schraubverschluß lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 89OA,,; dies entspricht 35,8 A^₀₀-Einheiten.

Eine Kultur von Streptomyces flavogriseus mit der Bezeichnung MA-4600a bei der Merck & Co., Inc.-Hinterlegungsstelle wurde permanent ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit in der Culture Collection der Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und ist für die Öffentlichkeit unter der Nummer NRRL 8140 zugänglich.

Ende der Beschreibung.

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Claims (1)

1. I0.FE3RÜAR 1978

   MERCK & CO., INC. 15 975

   Patentansprüche

   Die Verbindung Desacetyl 890A₁₀ der Struktur

   CGOH
   und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.

   Verfahren zur Herstellung der Verbindung Desacetyl der Struktur

   -CH₂-CH₃-NH₂

   COOH

   dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung 890A₁₀ der Struktur

   -CH₂-CH₂-NH-C-CH₃ .

   mit einem Enzym, das die N-Acetyl-Gruppe hydrolysieren kann, innigst behandelt.

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Amidohydrolase ist.

   iNÄL INSPECTED

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   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Amidohydrolase eine N-Acetyläthanolamin-amidohydrolase ist.

   5· Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Amidohydrolase eine N-Acetyl-890A^₀-amidohydrolase ist.

   6. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen mit N-Acetyl-890A₁₀-amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Mikroorganismen auswählt, die fähig sind, N-Acetyläthanolamin für ihr Wachstum zu verwenden, und diese Mikroorganismen auf die Anwesenheit von N-Acetyl-890A₁₀-amidohydrolase prüft.

   7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit einer Amidohydrolase durchgeführt wird, die durch einen Amidohydrolase erzeugenden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber erzeugt wird.

   8. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl 890A₁₀, dadurch gekennzeichnet, daß man 890A_1Q innigst mit dem Enzym N-Acetyl-890A₁₀-amidohydrolase behandelt, die durch einen Amidohydrolase bildenden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber gebildet wird.

   9. Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer antibakteriellen, wirksamen Menge der Verbindung Desacetyl 890A₁₀ nach Anspruch 1 und einem nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür.