DE2718782C2

DE2718782C2 -

Info

Publication number: DE2718782C2
Application number: DE2718782A
Authority: DE
Inventors: Patrick Joseph Rahway N.J. Us Cassidy; Robert Thomas Linden N.J. Us Goegelman; Edward Olley Metuchen N.J. Us Stapley; Sebastian Madrid Es Hernandez
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1976-04-28
Filing date: 1977-04-27
Publication date: 1989-11-30
Also published as: DK145504B; DK145504C; FR2349586B1; CH634599A5; SE7704301L; PT66476A; JPS631315B2; NL7704040A; DE2718782A1; DK163977A; SE435935B; ES458070A1; JPS52131596A; US4141986A; FR2349586A1; PT66476B; GB1547949A; US4168202A

Description

Die Erfindung betrifft das Antibiotikum Epithienamycin B und dessen pharmazeutisch annehmbare Salze (im folgenden als Antibiotikum 890 A₂ bezeichnet) in verdünnten Formen, als rohe Konzentrate und in reinen Formen, die gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien aktiv sind. Das Antibiotikum wird durch Züchten von Streptomyces-Species auf geeigneten Fermentationsmedien hergestellt.

Die Feststellung der überraschenden antibiotischen Eigenschaften von Penicillin hat ein großes Interesse auf diesem Gebiet stimuliert. Dadurch wurden viele andere wertvolle antibiotische Substanzen, wie andere Penicilline, Cephalosporine, Streptomycin, Bacitracin, Tetracycline, Chloramphenicol und Arythromycine gefunden. Die antibakterielle Aktivität jedes dieser Antibiotika umfaßt im allgemeinen nicht bestimmte klinisch wichtige pathogene Bakterien. Beispielsweise sind einige hauptsächlich gegenüber nur gram-positiven Bakterienarten aktiv. Die durch die weitverbreitete Verwendung der vorhandenen Antibiotika bei der Behandlung von Bakterieninfektionen auftretende Resistenz hat ein ernstes Resistenzproblem erzeugt.

Die Nachteile der bekannten Antibiotika haben somit die weitere Forschung nach der Suche anderer Antibiotika stimuliert, die gegenüber einem großen Bereich von Pathogenen wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroorganismen aktiv sind.

Diese weitere Forschung hat zur Entwicklung der Familie der Thienamycin-Antibiotika geführt, zu der auch die erfindungsgemäßen Verbindungen gehören. Andere Mitglieder der Thienamycin-Familie der Antibiotika werden in den DE-OSen 25 52 638.9, 26 52 677.2, 26 52 681.8 und 26 52 678.3 beschrieben.

Thienamycin ist aus Chemical Abstracts, 85:92190t (1976) bekannt. Die beiden nachveröffentlichten Literaturstellen Journal of Antibiotics, 1981, Band 34, S. 628 bis 636 und S. 637 bis 648, beschreiben die biologischen und physikalischen Eigenschaften von Thienamycin, dem erfindungsgemäßen Epithienamycin B und weiteren strukturell ähnlichen Thienamycin-Derivaten.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Epithienamycin B der Formel

mit folgender absoluten Konfiguration C₅=R; C₆=R; und C₈=S sowie dessen pharmazeutisch annehmbare Salze bereitzustellen, die bei der Hemmung des Wachstums verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen sehr aktiv sind.

Die erfindungsgemäße antibiotische Verbindung wird durch Züchten bei kontrollierten Bedingungen von neuen Stämmen von Streptomyces flavogriseus hergestellt.

Aufgrund ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen wurden die Mikroorganismenstämme, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, als Stämme identifiziert, die zu den Species Streptomyces flavogriseus gehören und als MA-4434 und MA-4600 in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., bezeichnet. Eine Kultur von jedem Stamm wurde permanent ohne Beschränkung hinsichtlich der Freigabe bei der Kultursammlung des Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research und Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Ill., hinterlegt. Diese Kulturen sind öffentlich unter den Bezeichnungen NRRL 8139 bzw. 8140 zugänglich.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 und NRRL 8140 ergeben das Antibiotikum 890 A₂ im Gemisch mit einem zweiten Antibiotikum (890 A₅). Das Antibiotikum 890 A₂ kann in im wesentlichen reiner Form aus der Fermentationsbrühe isoliert werden.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Morphologie

Die Sporenträger sind verzweigt, gerade bis gekrümmte Sporenketten, Büschelbildung. Die Ketten sind mehr als 10 Sporen lang. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 µ×1,2 µ (970×).

Kultureigenschaften

Hafermehlagar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - gelblich-dunkelgelb, pergamentartiges Wachstum;
Luftmyzelium - hellgrau gesäumt mit mittelgrau;
lösliches Pigment - keins;

Saccharose-Nitrat-Agar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - braun gesäumt mit dunkelbraun;
Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig;
lösliches Pigment - geringes Braunwerden des Mediums;

Eialbuminagar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - gelblich-dunkelgelb, braun gesäumt;
Luftmyzelium - mittelgrau, vermischt mit gelblichgrau (2dc) und graugelb (2db);
lösliches Pigment - hellgelblich-dunkelgelb;

Glycerin-Asparagin-Agar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - gelblich-dunkelgelb, flach, sich ausbreitend;
Luftmyzelium - samtartig, hellgrau mit stark gelblicher Tönung bis grau (2dc);
lösliches Pigment - keines;

Anorganische Salze-Stärke-Agar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - braun;
Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig;
lösliches Pigment - hellgelblich-dunkelgelb;

Hefeextrakt-Dextrose+Salze-Agar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - braungesäumt mit sehr dunklem Braun;
Luftmyzelium - dunkelgrau, vermischt mit hellgrau, samtartig;
lösliches Pigment - keins;

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - dunkelbraun;
Luftmyzelium - dunkelgrau, samtartig;
lösliches Pigment - keins;

Magermilchagar
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb;
Luftmyzelium - spärlich, gräulich;
lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums;
Hydrolyse des Caseins - gut;

Lackmusmilch
Vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, stark dunkelgelb;
Luftmyzelium - keins;
Farbe - purpur;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden, pH 8,2;

Magermilch
Vegetatives Wachstum - mäßiges Ringwachstum, dunkelgelb;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - dunkelgelb;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden, pH 8,0;

Tyrosinagar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - dunkelbraun;
Luftmyzelium - dunkelgrau;
lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums;
Zersetzung von Tyrosin - keine;

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb;
Luftmyzelium - spärlich, gräulich;
lösliches Pigment - keins;
Melanin - keins;
H₂S-Bildung - keine;

Nähragar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - hellgräulich braungesäumt mit dunklerem Grau-Braun;
Luftmyzelium - hellgrau mit dunkelgrau gesäumt;
lösliches Pigment - keins;

Nährstärkeagar
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb, gesäumt mit Grau;
Luftmyzelium - mittelgrau, gesäumt mit Dunkelgrau;
lösliches Pigment - keins;
Hydrolyse der Stärke - gut;

Nährgelatineagar
Vegetatives Wachstum - farblos, gesäumt mit Dunkelgrau;
Luftmyzelium - gräulich-weiß;
lösliches Pigment - keins;
Verflüssigung von Gelatine - gut;

Kartoffelpfropfen
Vegetatives Wachstum - gutes Wachstum, stark gekräuselt;
Luftmyzelium - grau bis grünlich-grau;
lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums;

Loeffler's Blutserum
Vegetatives Wachstum - cremefarben;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;
Verflüssigung - keine;

Gelatinestiche bzw. -proben
Vegetatives Wachstum - cremefarben;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;
Verflüssigung von Gelatine - gut.

Alle die oben aufgeführten Ergebnisse werden nach dreiwöchiger Inkubation bei 28°C erhalten, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der bei diesen Versuchen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die Farbbezeichnungen, die in der Beschreibung verwendet werden, entsprechen den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Ed. (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Die Fähigkeit von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139, verschiedene Kohlenhydrate zu verwenden oder zu assimilieren, wurde ebenfalls geprüft. Zu diesem Zweck wird der Mikroorganismus in einem synthetischen Grundmedium, das 1% Kohlenhydrate enthält, 3 Wochen bei 28°C gezüchtet. Der pH-Wert der bei dieser Untersuchung verwendeten Medien ist ungefähr neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Verwendung dieser Kohlenhydratquellen von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 aufgeführt. + bedeutet gutes Wachstum, ± bedeutet schlechtes Wachstum, und - bedeutet kein Wachstum auf dem besonderen Kohlenhydrat.

Tabelle I

Die Wachstumsmenge bei Temperaturänderungen und der Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus ist wie folgt:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose+Salze Agar)
28°C - gut
37°C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen
50°C - kein Wachstum;

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose+Salze Agar)
aerob.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 werden in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Morphologie

Die Sporenträger sind verzweigt, gerade bis gekrümmte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten sind länger als 10 Sporen. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 µ×1,2 µ (970×).

Kultureigenschaften

Hafermehlagar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - gelblichdunkelgelb, gesäumt mit Dunkelbraun;
Luftmyzelium - hellgrau, gesäumt mit Mittelgrau;
lösliches Pigment - keins;

Saccharose-Nitrat-Agar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - braun, gesäumt mit Dunkelbraun;
Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig;
lösliches Pigment - keins;

Eialbuminagar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - gräulichdunkelgelb mit Teilen von stark Gelbdunkelgelb;
Luftmyzelium - Teile von Mittelgrau, Gräulichweiß und Gelblichgrau (2dc);
lösliches Pigment - sehr helles Dunkelgelb;

Glycerin-Asparaginagar
Vegetatives Wachstum - gelblichdunkelgelb;
Luftmyzelium - spärlich, gräulich;
lösliches Pigment - keins;

Anorganische Salze-Stärkeagar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - gräulichcreme;
Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig;
lösliches Pigment - keins;

Hefeextrakt-Dextrose+Salze Agar
Vegetatives Wachstum - umgekehrt - dunkelbraun;
Luftmyzelium - dunkelgrau, gemischt mit einem hellen Grau, samtartig;
lösliches Pigment - keins;

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;
Melanin - keins;
H₂S-Bildung - keine;

Nähragar
Vegetatives Wachstum - helles Dunkelgelb;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;

Nährstärkeagar
Vegetatives Wachstum - cremefarben;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;
Hydrolyse von Stärke - gut;

Nährgelatineagar
Vegetatives Wachstum - cremefarben;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;
Verflüssigung von Gelatine - gut;

Gelatinestiche
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;
Verflüssigung von Gelatine - vollständig;

Magermilchagar
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - keins;
Hydrolyse von Casein - gut;

Lackmusmilch
Vegetatives Wachstum - dunkelgelbes Ringwachstum;
Luftmyzelium - keins;
Farbe - bräunlich Purpur;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung, Alkalischwerden, pH 8,0;

Magermilch
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb, mäßiges Ringwachstum;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - hellbraun;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung, Alkalischwerden, pH 8,5;

Kartoffelpfropfen
Vegetatives Wachstum - gut, dunkelgelbfarben;
Luftmyzelium - sehr spärlich, weißlich;
lösliches Pigment - keins;

Tyrosinagar
Vegetatives Wachstum - dunkelgelb;
Luftmyzelium - keins;
lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums;
Zersetzung von Tyrosin - sehr gering.

Alle obigen Bestimmungen bzw. Ablesungen erfolgten, sofern nicht anders angegeben, nach dreiwöchiger Inkubation bei 28°C. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die bei der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen stehen in Übereinstimmung mit den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Ed. (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Die Fähigkeit von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140, verschiedene Kohlenhydrate zu verwenden oder zu assimilieren, wurde ebenfalls geprüft. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus auf einem synthetischen Grundmedium, das 1% Kohlenhydrate enthält, 3 Wochen bei 28°C gezüchtet. Der pH-Wert der bei diesem Versuch verwendeten Medien ist ungefähr neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle II ist die Verwendung dieser Kohlenhydratquellen von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 aufgeführt; + bedeutet gutes Wachstum; ± bedeutet schlechtes Wachstum; und - bedeutet kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlenhydrat.

Tabelle II

Die Menge des Wachstums mit der Temperaturänderung und der Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus sind wie folgt:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose+Salze Agar)
28°C - gut
37°C - mäßiges vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen
50°C - kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose+Salze Agar)
aerob.

Das Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums ist nicht auf den Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Organismen, die die obigen Wachstums- und mikroskopischen Eigenschaften, die zur Erläuterung aufgeführt werden, vollständig erfüllen, beschränkt. Von der vorliegenden Erfindung sollen ebenfalls die Mutanten mitumfaßt werden, die von den oben beschriebenen Organismen durch verschiedene Maßnahmen, wie durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Phageneinwirkung und ähnliche Maßnahmen, gebildet werden.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum, 890 A₂, wird (zusammen mit dem Antibiotikum 890 A₅) während der aeroben Fermentation bei kontrollierten Bedingungen geeigneter wäßriger Nährmedien, die mit Stämmen des Organismus Streptomyces flavogriseus inokuliert sind, gebildet. Für die Bildung von 890 A₂ (und 890 A₅) sind wäßrige Medien, wie sie für die Bildung anderer Antibiotika verwendet werden, geeignet. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und von dem Mikroorganismus assimilierbare Salze.

Im allgemeinen können als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium, entweder als Gemisch oder allein, Kohlenhydrate, wie Zucker, z. B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose oder Mannit, und Stärken, wie Dextrin, oder Getreide, wie z. B. Hafer, Roggen, Maisstärke oder Maismehl, verwendet werden. Die genaue Menge an in dem Medium verwendeter Kohlenhydratquelle oder -quellen hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab; im allgemeinen wird die Menge an Kohlenhydraten zwischen etwa 1 und 6 Gew.-%, bezogen auf das Medium, variieren. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder verschiedene solche Kohlenstoffquellen können in dem Medium vermischt werden. Im allgemeinen können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen z. B. Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maiseinweichflüssigkeit bzw. Maiswasser, lösliche Schlempeanteile oder Tomatenmark bzw. -paste. Stickstoffquellen, die entweder allein oder im Gemisch verwendet werden können, werden in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.-%, bezogen auf das wäßrige Medium, verwendet.

Unter den anorganischen Nährsalzen, die zu dem Kulturmedium zugegeben werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- oder Carbonationen ergeben. Weiterhin können Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen, zugegeben werden.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für eine große Vielzahl von Medien, die verwendet werden können.

Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37°C. Für optimale Ergebnisse ist es bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 23 bis 28°C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Wert der Nährmedien, die zum Züchten von Stämmen von Streptomyces-flavogriseus-Kulturen und zur Herstellung des Antibiotikums 890 A₂ (im Gemisch mit 890 A₅) geeignet sind, kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.

Obgleich das Antibiotikum 890 A₂ (im Gemisch mit 890 A₅) sowohl als Oberflächen- als auch als submerse Kultur hergestellt werden kann, ist es bevorzugt, die Fermentation in submersem Zustand durchzuführen.

Die Fermentation des Antibiotikums in kleinem Maßstab wird zweckdienlich ausgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibiotikum ergebenden Kultur animpft und nach der Übertragung in ein Produktionsmedium die Fermentation bei konstanter Temperatur von etwa 28°C auf einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage ablaufen läßt.

Die Fermentation wird in einem sterilisierten Kolben des Nährmediums über eine oder mehrere Stufen der Keimentwicklung durchgeführt. Das Nährmedium für die Keimungsstufe kann irgendein geeignetes Gemisch von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur von etwa 28°C einen Tag geschüttelt, bis das Wachstum zufriedenstellend ist, und ein Teil des entstehenden, gewachsenen Materials wird zum Inokulieren entweder eines Impfmediums der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Impfkolben der Zwischenstufen werden bei ihrer Verwendung im wesentlichen auf gleiche Weise entwickelt, d. h. ein Teil des Kolbeninhalts von der letzten Impfstufe wird zur Inokulierung des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden bei konstanter Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und gegen Ende der Inkubationszeit wird der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert.

Für das Arbeiten in großem Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und Einrichtungen zum Belüften des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium in einem Tank hergestellt und durch Erhitzen bei Temperaturen bis zu etwa 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit dem zuvor gezüchteten Impfkeim der Züchtungskultur inokuliert, und die Fermentation kann während einer Zeit, wie z. B. 1 bis 6 Tage, unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Halten der Temperatur bei etwa 24 bis 28°C durchgeführt werden. Dieses Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890 A₂ (im Gemisch mit 890 A₅) ist besonders für die Herstellung von großen Mengen des Antibiotikums geeignet.

Eigenschaften des Antibiotikums 890 A₂

Das Antibiotikum 890 A₂ ist eine saure Verbindung, die sich bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert in Richtung auf den positiven Pol bewegt.

Das Natriumsalz des Antibiotikums 890 A₂ ist nach der Lyophilisierung aus wäßriger Lösung ein weißes Pulver und ist sehr gut in Wasser löslich.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt Maxima bei 308 und 228 nm und ein Minimum bei 262 nm. Der E%-Wert bei 308 nm des Natriumsalzes des Antibiotikums 890 A₂ in Wasser bei neutralem pH-Wert wird auf einen Wert geschätzt, der größer ist als 490. Das Verhältnis der Absorptionswerte, A₃₀₈/A₂₆₀, beträgt 1,91 und A₃₀₈/A₂₂₈ beträgt 1,02 bei den besten erhaltenen Proben. Das Vorhandensein sehr geringer Verunreinigungen, die in diesen Proben verbleiben, legt den Schluß nahe, daß diese Verhältnisse für eine Probe mit allerhöchster Reinheit etwas höher sind.

Mehr als 80% der Absorption bei 308 nm können durch Umsetzung mit Hydroxylamin eliminiert werden, und eine ähnliche Abnahme wird bei der Umsetzung mit Cystein beobachtet. Die Absorption bei 260 nm nimmt nach diesen Umsetzungen um etwa ein Viertel des Wertes der A₃₀₈-Abnahme zu. Bei den Bedingungen, die in dem Teil beschrieben werden mit der Überschrift "Bioassay III" für die Bestimmung der HAEA₃₀₈-Werte, scheint die Reaktionskinetik erster Ordnung zu sein mit einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur zwischen 0,5 und 1,5 Minuten.

In der nachfolgenden Tabelle sind die 100 MHz-NMR-Signale für das 890 A₂-Natriumsalz in D₂O, bezogen auf den Innenstandard, Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat, der im folgenden als DSS bezeichnet wird, angegeben. Die chemischen Verlagerungen sind in ppm und die Kopplungskonstanten in Hz aufgeführt; die offensichtlichen Multiplizitäten sind angegeben.

δ = 1,33 (d, 3H; J = 6 Hz; CH₃-CH)
2,07 (s, 3H; CH₃-C=O)
3,15 (m, 2H; C-CH₂-C)
3,69 (m, 1H; CH-C=O)
∼4,3 (1H; CH-N)
∼4,3 (1H; CH-OH)
6,09 und 7,12 (2d, 2H; J = 13,5 Hz; S-CH=CH-N)

(Nachgereicht am 27. April 1989: Die in der oben erwähnten, nachveröffentlichten Literaturstelle Journal of Antibiotics, 1981, Band 34, S. 637 bis 648, beschriebenen ¹H-NMR-Daten sind mit den hier aufgeführten Daten nahezu identisch und zeigen, daß es sich bei dem Signal bei ∼4,3 ppm um ein Multiplett handelt.)

Die antibiotische Potenz von 890 A₂, bestimmt in Vibrio pervolans ATCC 8461 gemäß dem Teil mit der Überschrift "Bioassay I", beträgt etwa 180 Einheiten/HAEA₃₀₈-Einheit.

Massenspektrumsanalyse von 890 A₂

Die Massenspektrumswerte für 890 A₂ werden an Trimethylsilylderivaten, hergestellt aus Ammoniumsalzen des Antibiotikums mit bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid in Dimethylformamid, erhalten. Die Umwandlung des Natriumsalzes des Antibiotikums in die Ammoniumsalze wird unter Verwendung des Ammoniumsalzes eines sauren Ionenaustauschharzes durchgeführt.

Die Trimethyl-Silylierung von 890 A₂ ergibt drei unterschiedliche Derivate: ein Di- und ein Tri-trimethylsilylderivat (Molekulargewicht 456 bzw. 528) und eine geringe Menge eines Tetra-trimethylsilylderivats eines hydrolysierten Produktes (Molekulargewicht 628), worin der β-Lactamring geöffnet ist.

Die Werte der wichtigsten Massenspektrumsfragmente werden im folgenden aufgeführt:

Di-trimethylsilylderivat: 441, 299, 298 und 84;
Tri-trimethylsilylderivat: 513, 371 und 156;
Tetra-trimethylsilylderivat: (es wird nur ein Signal mit niedriger Auflösung beobachtet) 618 und 603.

Das Antibiotikum 890 A₂ hat die folgende molekulare Struktur:

Nach den Angaben in der nachveröffentlichten Literaturstelle Journal of Antibiotics, 1981, Band 34, S. 637 bis 648, besitzt der β-Lactamring des Antibiotikums 890 A₂ cis-Konfiguration (nachgereicht am 27. April 1989).

Das Antibiotikum 890 A₂ kann weiterhin durch die folgenden antibiotischen Spektrumprofile charakterisiert werden.

Der Versuch zur Bestimmung des antibiotischen Spektrumsprofils des Antibiotikums 890 A₂ wird durchgeführt, indem man eine Papierscheibe mit einem Durchmesser von 0,63 cm mit einer Lösung des Antibiotikums 890 A₂ in 5%igem Methanol bei einer Konzentration von 5 µg/ml sättigt, die gesättigten Papierscheiben in der Luft trocknet und sie dann auf die Oberfläche von 100×15 mm Petrischalen gibt, die 5 ml angeimpften Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthalten.

Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser in Millimeter der Hemmzone, sind in Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

In vitro antibakterielles Spektrumprofil (ASP) des Antibiotikums 890 A₂

Die folgenden Tabellen IV und V (beide nachgereicht am 25. Mai 1988 und veröffentlicht in Journal of Antibiotics, 1981, Band 34, S. 628 bis 636) zeigen Vergleiche des antibiotischen Spektrumprofils und der minimalen Hemmkonzentration des Antibiotikums 890 A₂ (Epithienamycin B) mit Thienamycin und weiteren strukturell ähnlichen Antibiotika.

Tabelle IV

Durchmesser der Hemmzone (in mm)*)

Tabelle V

Minimale Hemmkonzentration

Inocula mit 10³ Organismen einer Übernacht-Kultur wurden 18 Stunden bei 37°C in 2 ml Müller-Hinton-Brühe, die das Antibiotikum enthielt, inkubiert. Die niedrigste Konzentration, die zu einem klaren Röhrchen führt, ist die minimale Hemmkonzentration.

Das Antibiotikum 890 A₂ zeigt in-vivo-Aktivität gegenüber gram-negativen und gram-positiven Organismen und ist somit zur Kontrolle von Bakterieninfektionen bei Tieren und Menschen geeignet. Bei der Bestimmung der in-vivo-Aktivität wird das Antibiotikum 890 A₂ in 0,15 Mol NaCl, 0,01 Mol Natriumphosphat, pH 7,0, gelöst und mit Wasser verdünnt, wobei man fünf vierfache Konzentrationen des Arzneimittels für die Prüfung erhält. Weibliche weiße Schweizer Mäuse, die durchschnittlich 21 g wiegen, werden intraperitoneal mit den in einer Brühe suspendierten Testorganismen infiziert. Die Anzahl der injizierten Organismen wird nach Standardplatten-Zählverfahren bestimmt. Zum Zeitpunkt der Infizierung und erneut 6 Stunden später wird eine bestimmte Zahl der Mäuse intraperitoneal mit dem Antibiotikum behandelt. Fünf Mäuse werden jeweils für jede Konzentration des zu prüfenden Arzneimittels verwendet. Weitere zwei nichtinfizierte Mäuse werden mit dem Antibiotikum behandelt, um zu bestimmen, ob die injizierte Menge des Mittels toxisch ist. Bei jedem Versuch werden weiterhin Kontrollen von fünf Mäusen für jede der verschiedenen Verdünnungen der Infektionskulturen verwendet, damit man die Anzahl der Organismen berechnen kann, die für 50% der infizierten, nichtbehandelten Mäuse letal ist (LD₅₀). Diese Berechnung erfolgt unter Verwendung der Überlebenswerte am 7. Tag nach der Infektion. Zu diesem Zeitpunkt wird weiterhin die Menge an Arzneimittel berechnet, die 50% der infizierten Mäuse schützt (ED₅₀).

Alle Tiere, die diesem Immunitätstest unterworfen und nicht mit dem Antibiotikum behandelt wurden, starben innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion. Die Wirksamkeit des Antibiotikums 890 A₂ mit einer Potenz von 59 Einheiten/ml gegenüber Salmonella schottmuellari MB-2837 wird im folgenden aufgeführt.

Das Antibiotikum 890 A₂ ist für eine Vielzahl von gram-positiven und gram-negativen Bakterien ein wertvolles Antibiotikum und findet somit in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung. Die erfindungsgemäße Verbindung kann allein oder zusammen im Gemisch als antibakterielles Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien hervorgerufen werden, z. B. zur Behandlung von Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Salmonella schottmuellari. Die erfindungsgemäße antibakterielle Verbindung kann weiterhin als Zusatzstoff für Tierfutterstoffe, zur Konservierung von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Sie kann z. B. in wäßrigen Zubereitungen in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung für die Zerstörung und Hemmung des Wachstums von schädlichen Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Geräten und als Bakterizide bei industriellen Anwendungen, z. B. in Anstrichmitteln auf Wassergrundlage und in dem Weißwasser von Papiermühlen, zur Hemmung des Wachstums schädlicher Bakterien verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum kann in einer pharmazeutischen Zubereitung als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen mit entweder einem oder mehreren anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden. Als Beispiel für die erstere kann man ein Aminocyclit-Antibiotikum, wie Gentamicin, gleichzeitig mitverabreichen, so daß irgendwelche Chancen, daß resistente Organismen hervorkommen, minimal gehalten werden. Als Beispiel der letzteren können Diphenoxylate und Atropin in Dosiseinheitsformen, die für die Therapie der Gastroenteritis bestimmt sind, kombiniert werden. Das Antibiotikum kann in Kapselform oder als Tablette, Pulver oder flüssige Lösung oder als Suspension oder Elixier verabreicht werden. Es kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in Dosiseinheitsformen vorliegen, und sie können übliche Arzneimittelzusatzstoffe und -trägerstoffe, wie Bindemittel, z. B. Sirup, Acacia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Schmiermittel, z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Desintegrationsmittel, z. B. Kartoffelstärke, oder annehmbare Benetzungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Die Tabletten können nach an sich bekannten Verfahren überzogen werden. Orale, flüssige Zubereitungen können in Form wäßriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen oder Elixieren vorliegen, oder sie können als Trockenprodukt für die Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Zubereitungen können übliche Zusatzstoffe, wie Suspensionsmittel, z. B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte genießbare Fette; Emulgiermittel, z. B. Lecithin, Sorbitan-monooleat oder Acacia enthalten. Nichtwäßrige Trägerstoffe umfassen genießbare Öle, z. B. Mandelöl, fraktioniertes Cocosnußöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol; Konservierungsmittel, z. B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure. Suppositorien werden übliche Suppositorien-Grundstoffe, z. B. Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.

Zubereitungen für die Injektion können in Dosiseinheitsform in Ampullen oder in Behältern mit mehreren Dosen mit einem zugegebenen Konservierungsmittel vorhanden sein. Die Zubereitungen können in Form von Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen, und sie können weiterhin Hilfsstoffe für die Zubereitung, wie Suspensionsmittel, Stabilisatoren und/oder Dispersionsmittel, enthalten. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform für die Rekonstitution mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen.

Die Zubereitungen können ebenfalls in für die Absorption durch die Schleimmembranen der Nase und des Rachens oder der Bronchialgewebe geeigneter Form vorliegen, und zweckdienlich liegen sie als Pulver, flüssige Sprays oder Inhalationsmittel, Lutschbonbons oder Einpinselungsmittel für den Hals vor. Für die Medikation der Augen oder Ohren können die Zubereitungen als einzelne Kapseln, in flüssiger oder semifester Form, vorliegen, oder sie können als Tropfen verwendet werden. Zubereitungen für die topische Anwendung können in hydrophoben oder hydrophilen Grundstoffen als Salben, Cremes, Lotionen, Einpinselungsmittel oder Pulver vorliegen.

Zusätzlich zu dem Träger können die erfindungsgemäßen Zubereitungen andere Bestandteile enthalten, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder Geschmacks- bzw. Aromamittel.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Hühnern, Kühen, Schafen oder Schweinen, können die Zubereitungen z. B. als intramammare Zubereitung, entweder als Depotformen oder als schnellwirkende Formen, zubereitet werden.

Die zu verabreichende Dosis hängt in starkem Ausmaß von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung ab. Die parenterale Verabreichung ist im allgemeinen bei generalisierten Infektionen bevorzugt, und die orale Verabreichung ist bei intestinalen Infektionen bevorzugt.

Bei der Behandlung von Bakterieninfektionen bei Lebewesen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oral oder parenteral nach den für die antibiotische Verabreichung üblichen Verfahren in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag und bevorzugt von etwa 5 bos 100 mg/kg/Tag in einer bevorzugt geteilten Dosis, z. B. 3- bis 4mal am Tag, verabreicht. Sie können in Dosiseinheiten verabreicht werden, die z. B. 100, 330, 400 oder 1000 mg aktiven Bestandteil zusammen mit physiologisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen in Form flüssiger Zubereitungen, wie Lösungen oder Suspensionen, oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die optimale Dosis wird bei einem gegebenen Fall von der Art und Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen. Kleinere Dosen werden bei Kindern verwendet, und alle Einstellungen können leicht durch den Fachmann erfolgen.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die pharmazeutisch annehmbaren Salze von 890 A₂, z. B. die pharmakologisch annehmbaren Salze, die mit anorganischen und organischen Basen gebildet werden, die z. B. umfassen: die Metallsalze, die sich von Alkalimetall- oder Erdalkalimetyllhydroxiden, -carbonaten oder -bicarbonaten ableiten, wie solche, die sich von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium ableiten, und Salze, die sich von primären, sekundären oder tertiären Aminen ableiten, wie Monoalkylamine, Dialkylamine, Trialkylamine, niedrig-Alkanolamine, Di-niedrig-alkanolamine, niedrig-Alkylendiamine, N,N-Diaralkyl-niedrig-alkylendiamine, Aralkylamine, aminosubstituierte niedrig-Alkanole, N,N-Di-niedrig-alkylamino-subst.-niedrig-alkanole, Amino-, Polyamino- und Guanidino-subst.-niedrig-Alkansäuren und Stickstoff enthaltende heterocyclische Amine. Beispiele von Salzen sind auch Salze, die sich von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, N-Äthylpiperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N′-Dibenzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Theophyllin oder N-Methylglucamin ableiten.

Die Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die Monosalze, wie das Mononatriumsalz, durch Behandlung von 1 Äquiv. Natriumhydroxid mit 1 Äquiv. des Produktes (I) in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Man kann auch gemischte Salze mit zweiwertigen Kationen herstellen, indem man 1 Mol der zweiwertigen Base mit 1 Mol des Produktes (I) plus 1 Äquiv. einer anderen Säure vermischt. Alternativ kann man Salze durch Behandlung von 1 Äquiv. einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie Calciumhydroxid, mit 1 Äquiv. des Produktes (I) herstellen. Die erfindungsgemäßen Salze sind pharmakologisch annehmbare, nichttoxische Derivate, die als aktiver Bestandteil in geeigneten pharmazeutischen Einheitsdosisformen verwendet werden können. Sie können weiterhin mit anderen Arzneimitteln zur Herstellung von Zubereitungen kombiniert werden, die ein breites Aktivitätsspektrum besitzen.

Die Fermentationsbrühen, die die Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, enthalten, besitzen Aktivitäten im Bereich von etwa 2 bis 170 Einheiten/ml, bestimmt nach dem Scheiben-Diffusionsassay unter Verwendung von Vibrio percolans (ATTC 8461). Das in diesen Fermentationsbrühen enthaltene Antibiotikum 890 A₂ kann nach einer Reihe von Verfahren von dem Antibiotikum 890 A₅ abgetrennt, isoliert und gereinigt werden. Bei einem dieser Verfahren werden die Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅ an stark basischem Anionenaustauschharz adsorbiert. Beispiele solcher stark basischen Anionenaustauschharze sind solche mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, z. B. quaternäres Ammoniumharz Dowex®-1×2 mit Polystyrolkern beim Chloridzyklus. Andere Beispiele dieser Klasse von stark basischen Austauschharzen sind die folgenden: Duolite®A-40, A-42, A-101, A-102 und A-114 und Amberlite®IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Alternativ kann ein schwach basisches Anionenaustauschharz, wie Amberlite®IRA-68, verwendet werden.

Das adsorbierte Antibiotikum wird leicht aus dem Anionenaustauschharz mit Salzlösungen in 50%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol eluiert. Das so erhaltene Eluat kann gegebenenfalls nach anderen Reinigungsverfahren weiter gereinigt werden. Das Eluat kann gereinigt werden, indem man es konzentriert und durch eine mit Acrylesterpolymer gepackte Säule mit Zwischenpolarität, wie XAD-7 oder 8, leitet oder indem man es durch eine Säule leitet, die mit einem Polystyrol, einem nicht-polaren, hydrophoben, vernetzten Divinylbenzol-Polymeren, wie XAD-1, 2 und 4, bevorzugt XAD-2, gepackt ist. Bei diesem Verfahren werden die Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅ teilweise gespalten bzw. getrennt. Die an 890 A₂ reichen Fraktionen werden vereinigt und weiter gereinigt.

Ein Verfahren zur Herstellung von weiter gereinigtem Antibiotikum 890 A₂ ist die Verwendung der Gelfiltration mit Polyacrylamidgel mit einer Porengröße, die Moleküle mit einem Molekulargewicht über 1800 ausschließt, wie Bio-Gel P-2. Andere Gele, wie Sephadex®G-10, können ebenfalls für die Entsalzung verwendet werden.

Das bevorzugte Verfahren, gemäß dem das Antibiotikum 890 A₂ von 890 A₅ abgetrennt und in hoher Reinheit aus einer Brühe gewonnen werden kann, besteht in einem Zentrifugieren oder Filtrieren der Brühe zur Entfernung der Feststoffe, einer Adsorption und Elution des Filtrats aus einem Anionenaustauschharz, wie Dowex®-1×2 im Chloridzyklus mit 3%iger NaCl in 50%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol, wodurch die Antibiotika sowohl konzentriert als auch teilweise gereinigt werden, einem Durchgang über eine Säule mit geeignet hergestelltem XAD-2, das die Antibiotika zurückhält und dadurch das Dowex®-1×2-Eluat reinigt und entsalzt. Außerdem wird das Antibiotikum 890 A₅ stärker zurückgehalten als das Antibiotikum 890 A₂, und dadurch werden die beiden Antibiotika teilweise getrennt. Die mit 890 A₂ angereicherten Fraktionen werden vereinigt und weiter gereinigt. Die Chromatographie an einem Dowex®-1×2-Harz (Teilchengröße größer als 0,037 mm) unter Eluierung mit NaCl und/oder NH₄Cl in 50%igem wäßrigem Methanol ergibt ein Produkt, das von UV-absorbierenden Verunreinigungen fast frei ist (das NH₄Cl wird verwendet, damit man in dem Eluierungsmittel eine gewisse Pufferkapazität erhält). Die Entsalzung an Bio-Gel P-2 oder Sephadex®G-10 entfernt die Hauptmenge des bei der Dowex®-1×2-Chromatographie eingeführten Salzes.

Werden Brühen mit niedriger Potenz nach dem obigen Verfahren behandelt, so kann das Endprodukt wesentliche Mengen (mehr als 50%) restlicher Verunreinigungen enthalten. Diese Verunreinigungen können durch einen zusätzlichen Zyklus der Chromatographie an Dowex®-1×2 (Teilchengröße größer als 0,037 mm), unter Elution mit einer Natriumchlorid und 50%iges Isopropanol enthaltenden Lösung entfernt werden. Es ist weiterhin bei der Isolierung der Antibiotika aus Brühen mit niedriger Potenz empfehlenswert, eine zweite XAD-2-Chromatographiestufe durchzuführen. Dies ermöglicht eine weitere Reinigung, die Entfernung von restlichem Salz und eine teilweise Abspaltung des Antibiotikums 890 A₂ von 890 A₅. Genauer, wird das 890 A₅ später als das 890 A₂ eluiert, und die beiden können durch ihre unterschiedlichen Bioaktivitätsverhältnisse gegenüber HAEA₃₀₈ unterschieden werden. Solche Fraktionen, die ein Bioaktivitätsverhältnis an Vibrio percolans ATCC 8461 zu HAEA₃₀₈ von 180 Bioaktivitätseinheiten/HAEA₃₀₈-Einheit zeigen, enthalten das Antibiotikum 890 A₂, und solche Fraktionen, die ein Bioaktivitätsverhältnis an Vibrio percolans ATCC 8461 zu HAEA₃₀₈ von 12 Bioaktivitätseinheiten/HAEA₃₀₈-Einheit zeigen, enthalten das Antibiotikum 890 A₅.

Bei der Reinigung durch Säulenchromatographie werden im allgemeinen für die weitere Reinigung nur solche Fraktionen des eluierten Volumens vereinigt, die das Antibiotikum in mindestens 30%iger Reinheit wie die reinste Fraktion enthalten. Die Kriterien für die Reinheit sind die Verhältnisse der Bioaktivität/A₂₂₀, A₃₀₈/A₂₆₀ und HAEA₃₀₈/A₂₂₀, und bei dem Entsalzungsverfahren die Leitfähigkeit. Bei jeder Chromatographiestufe werden A₂₂₀, A₂₆₀, A₃₀₈ und die Bioaktivität geeigneter Fraktionen gemessen. Sofern möglich, wird HAEA₃₀₈ ebenfalls gemessen, und beim Entsalzen werden die Leitfähigkeiten gemessen. Die Kriterien für die Entscheidung, welche Fraktionen für die nachfolgenden Verfahrensstufen vereinigt werden, können, damit man eine höhere Ausbeute erhält, auf Kosten der Reinheit etwas eingestellt werden; umgekehrt kann man eine höhere Reinheit auf Kosten der Ausbeute erzielen.

Bei Versuchen im Labormaßstab (weniger als 20 l Probenvolumen) werden alle Chromatographiestufen, mit Ausnahme der XAD-2-Chromatographie, in einem Kühlraum bei 2 bis 5°C durchgeführt. Die XAD-2-Chromatographie wird bei Zimmertemperatur, sofern nicht anders angegeben, durchgeführt. Der pH-Wert der antibiotischen Lösungen, die gelagert werden, wird durch sorgfältige Zugabe von verdünnten NaOH- oder HCl-Lösungen auf 7 bis 8 eingestellt. Die wäßrigen Lösungen werden in einem Kühlschrank, oder bevorzugt in Eiswasser, aufbewahrt. 50%ige Methanollösungen werden bei -20°C aufbewahrt.

Bei den Reinigungsstufen vor der XAD-2-Chromatographie werden die Lösungen im allgemeinen auf 25 µMol in EDTA durch Zugabe von 1/4000stel Volumen einer Lösung aus 0,1 Mol Na₂ EDTA, die durch Zugabe von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert wurde (0,1 Mol "neutrales EDTA"), eingestellt.

In der Fig. 1 ist ein Fließschema des Reinigungsverfahrens bei der Herstellung des Antibiotikums 890 A₂ dargestellt.

Bestimmungsverfahren für das Antibiotikum 890 A₂ I. Bioassay (Bioversuch)

Ein Agarplatten-Scheiben-Diffusions-Verfahren wird entweder unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 oder von Salmonella gallinarum MB-1287 als Testorganismen verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890 A₁ wird als Standard verwendet. Das Antibiotikum 890 A₁ wird gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt.

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml sterilisiertem Medium suspendiert, das 8 g/l Difco Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält ("Nährbrühe-Hefeextrakt", im folgenden ans NBYE bezeichnet). Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert. Diese Kultur wird dann zum Inokulieren der Oberflächen von Schrägkulturen, die 1,5% Agar in NBYE enthalten, verwendet. Die inokulierten Schrägkulturen werden über Nacht bei 28°C inkubiert und dann in einem Kühlschrank gelagert.

Die gekühlten Schrägkulturen, die aus einer einzigen, lyophilisierten Kultur hergestellt werden, werden bis zu 4 Wochen von ihrer Herstellung folgendermaßen verwendet: Eine Schleife des Inokulums aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, das in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben enthalten ist, dispergiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert. Sie wird dann auf eine Dichte, die eine 50%ige Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt, verdünnt. Ein 33,2-ml-Teil der verdünnten Kultur wird zu 1 l NBYE, das 15 g Agar enthält, zugegeben und bei 46°C gehalten. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100×15 mm Kunststoff-Petrischalen gegossen, jeweils 5 ml/Schale, anschließend wird abgekühlt, und vor der Verwendung lagert man bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen.

Salmonella gallinarum MB-1287 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt.

Ein verschlossenes Rohr, das Salmonella-gallinarum-MB-1287-Zellen in Magermilch enthält, das unter Vakuum gefroren, lyophilisiert und verschlossen wurde, wird geöffnet und zum Inokulieren von 15 ml Gehirn-Herz-Infusionsbrühe verwendet. Die Zellen können ohne Schütteln bei 37°C über Nacht wachsen, und diese Kultur wird dann zum Inokulieren von Schrägkulturen von 0,8% BBL-Nährbrühe + 0,2% Difco Hefeextrakt + 1,5% Agar verwendet. Nach dem Wachsen über Nacht bei 37°C wird eine Schlinge der Kultur von der Schrägkultur in einen Kolben übertragen, der 50 ml 0,8%ige Nährbrühe + 0,2% Hefeextrakt enthält. Der Kolben wird über Nacht geschüttelt, und 20 ml dieser Kultur werden zum Inokulieren in 1 l eines Gemisches aus 0,8% Nährbrühe + 0,2% Hefeextrakt + 1,5% Agar verwendet, das zuvor sterilisiert und auf 48°C abgekühlt wurde. Der inokulierte NBYE-Agar wird sofort in 100×15 mm Kunststoff-Petrischalen gegeben, 5 ml/Schale, und die Platten werden dann bei 2 bis 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.

Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm werden in die zu prüfende Lösung eingetaucht und dann auf das Agar gelegt. Alternativ können die Scheiben durch Auftragen mit der Pipette von 1/10 ml Lösung auf eine trockene Scheibe beladen werden, und dann können die Scheiben auf den Agar gesetzt werden. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach der geeigneten Inkubation (9 bis 18 h bei 37°C für Salmonella gallinarum MB-1287 oder 12 bis 24 h bei 25°C für Vibrio percolans ATCC 8461) bestimmt. Gegebenenfalls werden Verdünnungen der zu prüfenden Lösungen in 0,05 Mol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 ("Kaliumphosphatpuffer", der im folgenden als KPB bezeichnet wird), oder in entionisiertem Wasser hergestellt.

Die Berechnungen der Potenz (Wirksamkeit) erfolgt folgendermaßen: Die Steigung wird bestimmt, indem man die Durchmesser der Zone einer Lösung des Antibiotikums 890 A₂ bestimmt und dann die vierfache Verdünnung (in KPB) dieser Lösung. Zwei Scheiben von jeder Konzentration werden auf einer einzelnen Platte geprüft, und dann wird die durchschnittliche Zonengröße bei jeder Konzentration bestimmt. Die Steigung entspricht der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrößen. Die Wirksamkeiten werden dann nach der Formel berechnet:

wobei D der durchschnittliche Durchmesser der Zonen bedeutet, die von der unbekannten Verbindung gebildet werden, D _s der durchschnittliche Durchmesser der Standardzonen bedeutet und "Verdünnung" den Wert bedeutet, auf den die unbekannte Probe vor dem Versuch verdünnt wurde. Wird kein Standard verwendet, wird angenommen, daß D _s 25 mm beträgt, und die (Potenz des Standards) wird als 1 Einheit/ml angenommen, bestimmt an Vibrio percolans ATCC 8461. Reines 890 A₁ wird so definiert, daß es eine Potenz von 250 Einheiten/hydroxylaustauschbarer Absorptionseinheit bei 300 nm besitzt, wenn es als Standard verwendet wird.

Für Untersuchungen an Salmonella-gallinarum-MB-1287-Platten wird die Steigung auf gleiche Weise wie bei Vibrio-percolans-ATCC-8461-Platten bestimmt. Wenn kein Standard verwendet wird, werden nur relative Wirksamkeiten berechnet. Wird keine Steigung gemessen, wird ein Wert von 2,3 mm angenommen. Die Potenzberechnungen erfolgen wie bei dem Vibrio-percolans-ATCC-8461-Versuch. Wird kein 890 A₁-Standard verwendet, kann zur Verifizierung, daß die Empfindlichkeit des Organismus im normalen Bereich liegt, eine Kontrolle mit Penicillin G mit 250 µg/ml verwendet werden.

II. Assayverfahren bzw. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung der "890 Assay-Einheiten"

Ein übliches Agarplatten-Scheiben-Diffusions-Verfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als Standard verwendet. Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermaßen hergestellt. Eine Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in einem Nährbrühe-Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert und dann auf eine Dichte von 60% Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2-ml-Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 1 l eines Mediums zugegeben, das aus einem Nähragar + 0,2% Hefeextrakt besteht und bei 46°C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100×15 mm Kunststoff-Petrischalen, 10 ml/Schale, gegossen, abgekühlt und bei 2 bis 4°C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

Die Konzentration an Cephaloridin, die 1 Einheit/ml von 890 A äquivalent ist, wird durch Assay auf Platten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, jedoch 5 ml inokuliertes Medium/Platte enthalten, folgendermaßen bestimmt. Vier Konzentrationen von Cephaloridin stellen den Standard dar - 3,12, 6,25, 12,5 und 25 µg/ml mit 12,5 µg/ml als Vergleichslösung. Die Durchmesser der Zonen auf einer 5-ml-Platte für den Standard sind die folgenden.

Konzentration (µg/ml)
Zonendurchmesser (mm)
3,12
16,8
6,25	22,3
12,5	25,0
25	29,6

Eine Einheit wird als die Menge Antibiotikum/ml definiert, die eine 25-mm-Hemmzone auf einer 5-ml-Platte, wie bei Teil I oben beschrieben, ergibt. Bei diesem Assay wird eine Konzentration von 12,5 µg/ml Cephaloridin als äquivalent zu 1 Einheit 890 A/ml angesehen. Da die Krümmung der Linie für Cephaloridin 4,0 beträgt, erfolgen die Berechnungen für die Potenz der Probe unter Verwendung einer Krümmung von 4,0.

III. Hydroxylamin-Reaktion

Das Antibiotikum 890 A₂ reagiert mit Hydroxylamin und ergibt eine Substanz mit stark verminderter Absorption bei 308 nm. Dies kann als Grundlage für die quantitative Bestimmung des Antibiotikums 890 A₂ verwendet werden.

Die zu prüfende Lösung wird auf 0,05 Mol in Kaliumphosphat, pH 7,4, durch Zugabe von 1/20 Volumen einer Lösung eingestellt, die 0,8 Mol K₂HPO₄ und 0,2 Mol KH₂PO₄ enthält. 1/100 Volumen von 1 Mol Hydroxylamin-hydrochlorid wird dann zugegeben, und die Absorption bei 308 nm wird in Intervallen von ½ bis 2 min bestimmt. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Es wird eine Kinetik erster Ordnung angenommen, und die Halbwertszeit wird aus der Absorptionsabnahme während der ersten 10 min geschätzt. Aus dieser Halbwertszeit wird die Zeit, über die hinaus keine weitere Absorptionsabnahme mehr beobachtet werden sollte, bestimmt, und die Beobachtungen werden über diese Zeit hinweg geführt. Beobachtet man keine weitere Abnahme über diese Zeit hinaus, so wird die gesamte Absorptionsabnahme (korrigiert für den Verdünnungseffekt und für die Absorption des Hydroxylamins) als "durch Hydroxylamin beseitigbare Absorption bei 308 nm (HAEA₃₀₈)" genommen. Wird eine Absorptionsabnahme über diese Zeit hinaus beobachtet, so wird die Rate der Hintergrundabsorptionsabnahme berechnet, und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt wird durch die Hintergrundabnahme korrigiert, unter der Annahme, daß die Hintergrundabnahme mit der Zeit linear ist. Der korrigierte Wert wird dann als HAEA₃₀₈ aufgezeichnet.

Die Zahl der NAEA₃₀₈-Einheiten ist gleich der HAEA₃₀₈, multipliziert mit dem Volumen in ml.

In den folgenden Beispielen wird das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Produktes erläutert.

Beispiel 1 Herstellung eines die Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅ enthaltenden Gemisches

Ein Rohr mit einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml einer sterilen Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält.

Salzlösung
Natriumcitrat\|0,5 g
K₂HPO₄	7,0 g
KH₂PO₄	3,0 g
(NH₄)₂SO₄	1,0 g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,1 g
destilliertes Wasser	1000 ml

Diese Suspension wird zum Inokulieren von vier Schrägkulturen aus sterilem Medium A der folgenden Zusammensetzung verwendet.

Medium A
g
Dextrose\|10,0
Pepton	5,0
Hefeextrakt	3,0
NaCl	12,705
KCl	0,72
FeSO₄(NH₄)₂SO₄ · 6 H₂O	0,0351
MgCl₂ · 6 H₂O	5,32
CaCl₂ · 2 H₂O	0,728
destilliertes Wasser	1000 ml
pH 7,4 (vor der Sterilisation) @	Agar	25,0 g

Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis 28°C inkubiert und dann bei 4 bis 6°C, bis sie 10 Tage später verwendet werden. Der halbe Teil des Oberflächenwachstums einer dieser Schrägkulturen wird zur Inokulierung von 250 ml Erlenmeyerkolben mit Ablenkeinrichtungen verwendet, die 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten.

Medium B
Hefeautolysat\|10,0 g
Glucose	10,0 g
Phosphatpuffer⁽¹⁾	2,0 ml
MgSO₄ · 7 H₂O	50,0 mg
destilliertes Wasser	1000 ml
pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt

⁽¹⁾Phosphatpufferlösung
KH₂PO₄\|91,0 g
Na₂HPO₄	95,0 g
destilliertes Wasser	1000 ml

Drei Impfkolben werden inokuliert, so daß man ausreichend Inokulum für die zwölf 2-l-Produktionskolben, die bei diesem Ansatz fermentiert werden, erhält. Die Impfkolben werden 1 Tag bei 28°C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm=2″ Schwingungsamplitude) geschüttelt. Die Kolben werden von der Schüttelvorrichtung entfernt und 1 Tag bei 4°C gelagert. Der Inhalt dieser Impfkolben wird zur Inokulierung von zwölf 2-l-Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkeinrichtung (7 ml Inokulum/Kolben), die 250 ml des Produktionsmediums C der folgenden Zusammensetzung enthalten, verwendet.

Medium C
Tomatenpaste bzw. -mark\|20,0 g
primäre Hefe	10,0 g
Dextrin	20,0 g
entionisiertes Wasser	1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,3 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24°C unter Bewegen auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) während 4 Tagen und 5 Stunden verwendet. Am Ende dieser Zeit wird der Inhalt der Kolben gesammelt und auf die Aktivität unter Verwendung von Standard-Salmonella- gallinarum-MG-1287- und Vibrio-percolans-ATCC-8461-Versuchsplatten geprüft, wobei 1,27 cm Versuchsscheiben verwendet werden, die in die zentrifugierten Brühenproben eingetaucht werden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Sammelversuch
Alter zum Zeitpunkt des Sammelns (h)
101
pH	7,1
Salmonella gallinarum (mm Zone)	31
Vibrio percolans (mm Zone)	43

Die Fermentationsbrühe wird zentrifugiert. Man erhält 2,2 l klares Zentrifugat mit einem pH-Wert von 6,8. Dazu gibt man 22 mg (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure und stellt den pH-Wert auf 7,2 ein. Das Zentrifugat mit eingestelltem pH-Wert wird an 150 ml Dowex®-1×2-Harz in dem Cl^--Zyklus bei 15 ml/min adsorbiert, wobei der verbrauchte Strom als eine Fraktion gesammelt wird. Das Adsorbat wird mit 150 ml entionisiertem Wasser, das 10 µg/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, und dann mit 5% NaCl, das 10 µg/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, gewaschen. Es werden 5×75 ml Fraktionen gesammelt.

Auf die 5%ige NaCl-Eluierungslösung folgt ein Verdrängungswaschen mit 60 ml entionisiertem Wasser, und dann werden die Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅ mit 90%igem (Vol./Vol.) Methanol; 3%igem Ammoniumchlorid (Gew./Vol.); 10% Wasser (Vol./Vol.), das 10 µg/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, eluiert, wobei man 5×75 ml Fraktionen sammelt. Die Fraktionen werden gegenüber Vibrio percolans ATCC 8641 geprüft, und die erhaltenen Ergebnisse werden im folgenden als Prozent der Ausgangsbioaktivität angegeben.

Fraktion
Wiedergewinnung, %
Beschickung
100
verbraucht	0
Wasserverdrängungswaschen	1
MeOH/NH₄Cl-Eluatfraktionen 1 bis 3	24

Beispiel 2 Schüttelkolbenherstellung des Antibiotikums 890 A₂

Ein Rohr mit lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml einer sterilen Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält.

Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen aus sterilem Medium A der folgenden Zusammensetzung verwendet.

Medium A
Glycerin\|20,0 g
primäre Hefe	5,0 g
Fischmehl	15,0 g
destilliertes Wasser	1000 ml
Agar	20,0 g
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 eingestellt

Die inokulierten Schrägkulturen werden eine Woche bei 27 bis 28°C inkubiert und dann bei 4 bis 6°C bis zu ihrer Verwendung (nicht länger als 21 Tage) gelagert.

1/3-Teil des Wachstums von einer Schrägkultur wird zur Inokulierung eines 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens mit Ablenkeinrichtungen verwendet. Insgesamt werden vier Schrägkulturen zur Inokulierung von zwölf Kolben verwendet. Jeder Kolben enthält 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung.

Medium B
Hefeautolysat\|10,0 g
Glucose	10,0 g
Phosphatpuffer¹	2,0 ml
MgSO₄ · 7 H₂O	50,0 mg
destilliertes Wasser	1000 ml
pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt

¹Phosphatpufferlösung
KH₂PO₄\|91,0 g
Na₂HPO₄	95,0 g
destilliertes Wasser	1000 ml

Die Impfkolben werden 1 Tag bei 27 bis 28°C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt. Die Kolben und ihr Inhalt werden 1 Tag bei 4°C stationär gelagert.

Vierundvierzig 2-l-Erlenmeyer-Produktionskolben, die je 200 ml Medium C enthalten, werden mit 8 ml/Kolben des Wachstums von den Impfkolben inokuliert. Das Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung.

Medium C
Tomatenpaste bzw. -mark\|20,0 g
primäre Hefe	10,0 g
Dextrin	20,0 g
CoCl₂ · 6 H₂O	5,0 mg
destilliertes Wasser	1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24°C inkubiert. Dabei rührt man auf einer 212 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 4 Tage und 5 Stunden. Der Inhalt der Kolben wird gesammelt, und seine Aktivität wird unter Verwendung von Standard-Salmonella-gallinarum-MB-1287- und Vibrio-percolans-ATCC-8461-Versuchsplatten und 1,27 cm Assayscheiben, die in die zentrifugierten Brühenproben eingetaucht wurden, bestimmt. Die Proben werden, sofern erforderlich, mit 0,02 Mol Phosphatpuffer, pH 7,0, verdünnt. Die Ergebnisse sind im folgenden tabellarisch aufgeführt.

Zeitpunkt der Gewinnung des Ertrags, Std.
101
pH	7,2
Salmonella gallinarum (mm Zone)	35
Vibrio percolans 1/10 Verdünnung (mm Zone)	25
890 Assayeinheit	121

Die Gesamtmenge von 7,0 l der gesamten Brühe, die man bei dieser Fermentation erhält, wird auf 3°C gekühlt und in 200-ml-Teilen bei 9000 U/min während jeweils 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen gibt man 1,7 ml 0,1 Mol neutralem EDTA, und dann wird die Charge bei 3°C gehalten.

Die obige Fermentation wird bei im wesentlichen identischen Bedingungen wiederholt, mit der Ausnahme, daß die vierundvierzig 2-l-Erlenmeyer-Produktionskolben mit 7 ml/Kolben mit gewachsenem Material aus den Impfkolben inokuliert wurden. Der pH-Wert und die Versuchsergebnisse sind im folgenden aufgeführt.

Zeitpunkt der Gewinnung des Ertrags, Std.
101
pH	7,3
Salmonella gallinarum (mm Zone)	38
Vibrio percolans 1/10 Verdünn. (mm Zone)	27
890 Assayeinheiten	92,8

Die Gesamtmenge von 7,4 l der gesamten Brühe, die man bei dieser Fermentation erhält, wird auf 3°C gekühlt und in 200-ml-Teilen bei 9000 U/min während jeweils 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen gibt man 1,8 ml 0,1 Mol neutralem EDTA.

Die überstehenden Lösungen aus den zentrifugierten Brühen, die man bei den beiden obigen Fermentationen dieses Beispiels erhält, werden vereinigt und ergeben ein Gesamtvolumen von 13 l mit einer Potenz von 80 Einheiten/ml, bestimmt durch Assay an Vibrio percolans ATCC 8461.

Die vereinigten überstehenden Lösungen werden durch eine Säule aus Dowex®-1×2 (Cl^-), Teilchengröße 0,298 bis 0,149 mm, mit Schichtdimensionen von 4,7 cm×50 cm und einer Strömungsrate von 60 ml/min geleitet. Die Säule wird mit 1 l entionisiertem Wasser gewaschen und mit 5 l einer 5%igen (Gew./Vol.) NaCl-Lösung, die 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 µMol neutrales EDTA enthält, in einer Strömungsrate von 50 ml/min eluiert.

Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser gewaschen, und die Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅ werden mit 2 l 3%igem NaCl + 0,01 Mol tris-HCl, pH 7,0, + 25 µMol neutralem EDTA in 50%igem Methanol in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Fraktionen von 220 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MG-1287, erscheint in den Fraktionen 4 bis 8 mit einem Maximum in der Fraktion 5. Die Fraktionen 4 bis 8 enthalten 9% der in der Brühe vorhandenen anfänglichen Aktivität.

Die Fraktionen 4 bis 7 werden vereinigt, auf 150 ml an einem Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck konzentriert und durch Zugabe von 200 ml entionisiertem Wasser auf 350 ml verdünnt. Die Probe wird auf eine Säule (5 cm×25 cm) von XAD-2 gegeben, das zuvor mit jeweils 3 l 60%igem (Vol./Vol.) Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew./Vol.) NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser bei 20 ml/min und anschließend mit 500 ml 60%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Aceton eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 160 ml gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MB-1287, erscheint in den Fraktionen 1 bis 5 mit einem Maximum in den Fraktionen 3 und 4.

Die Fraktion 4, die erste, Aceton enthaltende Fraktion, wird auf 10 ml bei vermindertem Druck konzentriert und mit 90 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Diese Probe wird auf eine Säule (5 cm×25 cm) von XAD-2 gegeben, das zuvor mit je 3 l 60%igem (Vol./Vol.) Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew./Vol.) NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 20 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen von 140 bis 190 ml gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt an Versuchen mit Salmonella gallinarum MG-1287, erscheint in den Fraktionen 2 bis 7 mit einem Maximum in der Fraktion 4. Die Fraktionen 3, 4 und 5 werden vereinigt und zu der Fraktion 3 aus der XAD-Säule, die im vorhergehenden Absatz beschrieben wurde, zugegeben. Die vereinigten Fraktionen enthalten 26 400 Bioassayeinheiten, bestimmt durch Versuche an Vibrio percolans ATCC 8461; dies entspricht 2,5% der Ausgangsaktivität.

Die vereinigten XAD-2-Fraktionen 3 aus der ersten XAD-Säule und die Fraktionen 3, 4 und 5 aus der zweiten XAD-Säule werden bei vermindertem Druck auf 25 ml konzentriert und dann werden 25 ml entionisiertes Wasser und 50 ml Methanol zugegeben. Die methanolische Lösung wird an einer Säule (2,15×26,4 cm) von Dowex®-1×4 (Cl^-) (Teilchengröße größer 0,037 mm) adsorbiert, das mit 50%igem wäßrigem Methanol (Vol./Vol.) ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wird mit 1,44 ml von 0,07 Mol NaCl + 0,005 Mol NH₄Cl + 0,0001 Mol NH₃ in 50%igem Methanol in einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 12,1 ml werden gesammelt. Die Elution wird mit 2 l von 0,08 Mol NaCl + 0,005 Mol NH₄Cl + 0,0001 Mol NH₃ in 50%igem Methanol weitergeführt, wobei man Fraktionen von je 11,7 ml isoliert.

In den Fraktionen 138 bis 162 tritt in der UV-Absorption bei 300 nm ein Peak auf, mit einem Maximum bei den Fraktionen 149 bis 150. Die Absorption bei 305 nm kann durch Umsetzung mit L-Cystein bei neutralem pH-Wert bis zu 77% ausgelöscht werden. Die Fraktionen 145 bis 155, die das Antibiotikum 890 A₂ enthalten, werden gesammelt und auf 2,4 ml konzentriert, die insgesamt 70,5 A₃₀₀-Einheiten enthalten.

Die konzentrierte Probe wird auf eine Säule (2,2×70 cm) aus Bio-Gel P-2 (Teilchengröße 0,074 bis 0,037 mm), das mit 1 l entionisiertem Wasser gewaschen wurde, aufgebracht. Die Probe kann bis zur Schichthöhe ablaufen, und der Rückstand wird durch zweimaliges Spülen mit je 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser in einer Rate von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 2 bis 3,5 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak tritt bei den Fraktionen 64 bis 72 bei 308 nm auf, die unmittelbar dem Natriumchlorid vorhergehen und von diesem nicht vollständig abgetrennt sind. Die Fraktionen 66 und 67 werden vereinigt. Sie enthalten 27 Absorptionseinheiten des Antibiotikums 890 A₂ bei 308 nm und 29 bis 43 mg NaCl (geschätzt durch Leitfähigkeitsmessungen). Diese vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 1,5 ml konzentriert und lyophilisiert; man erhält 43,7 mg Feststoffe.

Beispiel 3 Herstellung der Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml einer sterilen Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält.

Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen des Mediums A der folgenden Zusammensetzung verwendet.

Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis 28°C inkubiert und dann bei 4 bis 6°C bis zu ihrer Verwendung gelagert (nicht länger als 21 Tage).

10 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung

werden aseptisch zu einer dieser Schrägkulturen gegeben, die Sporen und Luftmyzelia werden in die Suspension abgekratzt, und 3,3 ml dieser Suspension werden zur Inokulierung von 2-l-Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkeinrichtungen, der 500 ml Medium B enthält, verwendet. Dieser Impfkolben wird bei 28°C auf einer 160 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 36 h geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt ist das Wachstum zufriedenstellend.

Der Bewuchs (bzw. das gewachsene Material) aus diesem Impfkolben wird zur Inokulierung von einem 189 l rostfreien Stahlimpftank, der 160 l Medium B enthält, verwendet. Dieser Tank wird 24 h bei 28°C gehalten, wobei eine Rührrate von 150 U/min und eine Luftströmung von 84,9 l/min verwendet werden. Ein Entschäumungsmittel wird je nach Bedarf verwendet, aber nicht in einer größeren Menge als 0,1%. Die pH-Bestimmungen werden wie folgt durchgeführt:

43 l des in diesem Impftank gewaschenen Materials werden zur Inokulierung von einen 756 l rostfreien Stahl-Fermentationsbehälter, der 467 l Medium C enthält, verwendet. Das Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung.

Dieser Tank wird unter Verwendung einer Rührrate von 146 U/min und einer Luftströmung von 255 l/min 92 h bei 25°C in Gang gehalten. Zusätzliches Entschäumungsmittel wird je nach Bedarf zugegeben, wobei jedoch nicht mehr als 0,1% zugefügt wird. Die antibakteriellen Assays werden mit Salmonella gallinarum MB-1287, Vibrio percolans ATCC 8461 durchgeführt; man erhält die folgenden Ergebnisse.

Die 890 A Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift "II. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung von '890 Assay-Einheiten'" angegeben wird.

473 l Brühe werden auf 5°C gekühlt und durch bzw. mit einer Zentrifuge zentrifugiert. 22,7 kg Celite werden zu 379 l der überstehenden Flüssigkeit gegeben, und die Suspension wird durch eine 45,7-cm-Filterpresse filtriert. Die 344 l Filtrat werden an einer Säule adsorbiert, die 26,5 l Dowex®-1×2 (Cl^-), Teilchengröße 0,298 bis 0,149 mm, enthält, und die Säule wird mit 37,9 l entionisiertem Wasser und anschließend mit 114 l 5% NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 µMol neutrales EDTA in entionisiertem Wasser gewaschen. Nach einem weiteren Waschen mit 18,9 l entionisiertem Wasser werden die Antibiotika 890 A₂ und 890 A₅ mit 94,6 l 3% NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 µMol neutrales EDTA in 50%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol eluiert. 18,9 l Fraktionen werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287 bestimmt wird, erscheint in den Fraktionen 1 bis 5 mit einem Maximum in der Fraktion 3. Die Fraktionen 2 und 3, die 10,9% der Aktivität der angewendeten Brühe enthalten, werden vereinigt und auf 7,57 l bei vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Probe wird mit 30,3 l entionisiertem Wasser verdünnt und erneut auf 7,57 l bei vermindertem Druck zur Entfernung von restlichem Methanol konzentriert.

7,57 l Konzentrat werden auf eine Säule aufgebracht, die 37,9 l XAD-2 enthält, das zuvor mit 189 l 60%igem wäßrigem Aceton und anschließend mit 189 l entionisiertem Wasser und 189 l 5%igem NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit 142 l entionisiertem Wasser eluiert. Es werden drei Fraktionen mit 9,46 l und anschließend 6 Fraktionen mit 18,9 l gesammelt. Die Aktivität, die durch Versuche an Salmonella-gallinarum-MB-1287-Platten bestimmt wird, tritt in den Fraktionen 1 bis 6 auf mit einem Potenzpeak bei der Fraktion 2. Die Fraktionen 2 bis 5, die 64% der Aktivität, die auf die XAD-Säule aufgebracht wurde, oder 520 000 Einheiten enthalten, werden vereinigt.

Die Fraktionen 2 bis 5 werden durch Verdampfen bei vermindertem Druck auf 120 ml konzentriert. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt, und das Konzentrat wird auf eine Säule (7×50 cm) von XAD-2, die mit 8 l 60%igem wäßrigem Aceton und anschließend mit 4 l entionisiertem Wasser und 8 l 5%igem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde, aufgebracht. Die Probe kann bis zur Schichthöhe ablaufen, und dann wird die Säule dreimal mit 20 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült, wobei man jedesmal bis zur Schichthöhe ablaufen läßt. Das Antibiotikum wird mit 6 l entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Acht Fraktionen von 200 ml und anschließend elf Fraktionen von 400 ml werden gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella-gallinarum-MB-1287-Platten, tritt in den Fraktionen 3 bis 18 auf, wobei ein Aktivitätspeak in der Fraktion 8 beobachtet wird.

Die Fraktionen 8 bis 12 mit den höchsten Verhältnissen der Bioaktivität/A₂₂₀ und mit 225 000 Bioaktivitätseinheiten, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert, und 50 ml Methanol werden zugegeben. Die Probe wird auf eine Säule von Dowex®-1×4 (Cl^-) (Teilchengröße größer 0,037 mm), Schichtdimensionen 2,2×40 cm, das zuvor mit 50%igem Methanol gewaschen wurde, aufgebracht. Die Säule wird mit 2 l von 0,07 Mol NaCl + 0,005 Mol NH₄Cl + 0,0001 Mol NH₃ in 50%igem wäßrigem Methanol mit einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 12 ml werden gesammelt.

Man beobachtet in dem Abstrom zwei ungleiche Bioaktivitätspeaks, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, die den zwei Peaks des Materials mit einem Absorptionsmaximum bei 308 nm entsprechen. Der größte Teil der Absorption bei 308 nm in beiden Peaks ist durch Umsetzung mit Hydroxylamin auslöschbar.

Der erste Peak, der 890 A₂ enthält, tritt in den Fraktionen 98 bis 136 auf, und der zweite Peak, der 890 A₅ enthält, tritt in den Fraktionen 136 bis 158 auf. Die Fraktionen 112 bis 130 werden vereinigt; man erhält eine 890 A₂-Dowex®-Charge. Das 890 A₂ wird weiter durch Entsalzen an Sephadex®G-10 gereinigt.

Die Fraktionen 112 bis 130, die 890 A₂ enthalten, werden bei vermindertem Druck auf 5,5 ml konzentriert, und das Konzentrat wird auf eine Säule (2,15×70 cm) aus Sephadex®G-10 aufgebracht und mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Es werden jeweils Fraktionen von 2,85 ml gesammelt. Die Bioaktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287 bestimmt wurde, tritt in den Fraktionen 60 bis 98 auf. Die Fraktionen 78 bis 90 zeigen die höchsten A₃₀₈/A₂₆₀-Verhältnisse, und diese werden für die Lyophilisierung vereinigt. Der pH-Wert der vereinigten Fraktionen beträgt 4,1, und durch Zugabe von 8 µl 1molarem Ammoniak wird er auf 7,8 eingestellt. Das vereinigte Material enthält 52 A₃₀₈-Einheiten mit einem A₃₀₈/A₂₆₀-Verhältnis von 0,76, was einen wesentlichen Abbau des Antibiotikums während dieses Verfahrens anzeigt.

Die gesammelten Fraktionen 78 bis 90 werden bei vermindertem Druck auf 1,69 ml konzentriert. Zwei 0,1-ml-Proben werden entfernt und getrennt in kleinen, kegelförmigen Reaktionsglasampullen lyophilisiert. Der Rest wird in einer 14-ml-Glasampulle mit Schraubverschluß lyophilisiert; man erhält 1,29 mg Feststoffe, die 890 A₂ enthalten.

Beispiel 4 Schüttelproduktion des Antibiotikums 890 A₁

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält.

Medium A
Hefeextrakt\|10,0 g
Glucose	10,0 g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05 g
Phosphatpuffer¹	2 ml
destilliertes Wasser	1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulation eines 250-ml-Erlenmeyer-Impfkolbens mit Dreifachablenkeinrichtungen verwendet, der 54 ml Impfmedium B der folgenden Zusammensetzung enthält.

Medium B
Autolysierte Hefe\|10,0 g
Glucose	10,0 g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05 g
Phosphatpuffer¹	2 ml
destilliertes Wasser	1000 ml
pH: unter Verwendung von NaOH auf 6,5 eingestellt

Die Impfkolben werden mit Baumwolle verschlossen und 30 h bei 28±1°C auf einer 220 U/min Rotationsschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt.

Fünfzig 250-ml-Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkeinrichtungen, die je 40 ml Produktionsmedium C enthalten, werden mit 1 ml/Kolben Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Baumwolle verschlossen.

Nach der Inokulation werden die Produktionskolben bei 28±1°C unter Schütteln auf einer 220 U/min Rotationsschüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 3 Tage inkubiert. Die Aktivität des Materials in den Kolben wird gegenüber Standard-Vibrio-percolans-ATCC-8461-Assayplatten unter Verwendung von 1,27-cm-Versuchsscheiben, die in die zentrifugierte Fermentationsbrühenprobe eingetaucht sind, geprüft. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt.

Zeitpunkt bei der Sammlung des Ertrags, h\|72
pH	6,4
Vibrio percolans (1/100 Verdünnung) Assay	23 mm
890 Assay, Einheiten/ml	103

Die 890 A Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift "II. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung von '890 Assay-Einheiten'" beschrieben.

Die gesamte Brühe wird in 200-ml-Teilen in Polycarbonatflaschen bei 9000 U/min während 15 min zentrifugiert; man erhält 1600 ml vereinigte überstehende Lösung mit einer Wirksamkeit von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml 0,1 M neutrales EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an Dowex®-1×2-(Cl^-)-Säule (Teilchengröße 0,298 bis 0,149 mm), Schichtdimensionen 3,8×22 cm, in einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 1 l entionisiertem Wasser, das 50 g Natriumchlorid, 0,02 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 µMol neutrales EDTA, in einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen von 10 ml gesammelt.

Das Antibiotikum 890 A₁ tritt in den Fraktionen 13 bis 81 auf mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 33, was durch die erste Anwendung des Salzeluats hervorgerufen wird. Die Fraktionen 24 bis 41 mit den höchsten Biopotenz/A₂₂₀-Verhältnissen werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 29 000 Einheiten oder 17% der angewendeten Bioaktivität.

Das Dowex-Eluat wird auf 10 ml konzentriert, der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt, und das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3×36 cm, gegeben, wobei das Harz zuvor mit je 2 l 60%igem wäßrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität tritt in den Fraktionen 6 bis 14 auf, was 220 bis 2650 ml des eluierten Volumens entspricht. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf und erstreckt sich von 370 bis 590 ml des eluierten Volumens. Die Fraktionen 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens entsprechen, besitzen die höchsten HAEA₃₀₀/A₂₂₀-Verhältnisse und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Diese Fraktionen enthalten 36 600 Einheiten; dies entspricht 126% der offensichtlich angewendeten Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml konzentriert, und das Konzentrat wird auf eine Säule aus Dowex®-1×4 (Cl^-) (Teilchengröße größer 0,037 mm), Schichtdimensionen 2,2×41 cm, in einer Strömungsrate von 2 ml/min gegeben. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 3 l 0,07 M NaCl + 0,005 M NH₄Cl + 0,0001 M NH₃ in entionisiertem Wasser in einer Rate von 2 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend mit der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890 A₁ tritt in den Fraktionen 181 bis 217 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 198. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Adsorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16 µl 1 M NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Bio-Gel P-2 (Teilchengröße 0,074 bis 0,037 mm), Schichtdimensionen 2,15×70 cm, gegeben, mit 3×1 ml Waschlösungen aus entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser von 0,96 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890 A₁ tritt in den Fraktionen 24 bis 44 auf mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 34. Die Fraktionen 27 bis 38 mit den höchsten A₃₀₀/A₂₄₅-Verhältnissen werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 72 A₃₀₀-Einheiten.

Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3,0 ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10 µl 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Glasampullen mit Schraubverschluß lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 890 A₁; dies entspricht 35,8 A₃₀₀-Einheiten.

Das Antibiotikum 890 A₂ enthaltende Zubereitung

Zubereitungen, die das erfindungsgemäße Antibiotikum enthalten, können in verschiedenen Einheitsdosisformen verabreicht werden, z. B. in festen oder flüssigen oral einnehmbaren Dosisformen. Die Zusammensetzungen pro Einheitsdosis können sowohl in flüssiger als auch in fester Form von 0,1 bis 99% aktives Material enthalten, wobei der bevorzugte Bereich etwa 10 bis 60% beträgt. Die Zusammensetzung wird im allgemeinen etwa 100 bis etwa 2000 mg, ausgedrückt durch das Gewicht, an aktivem Bestandteil, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthalten. Es ist jedoch im allgemeinen bevorzugt, eine Dosismenge im Bereich von etwa 250 bis 2000 mg zu verwenden. Bei der parenteralen Verabreichung ist die Einheitsdosis im allgemeinen die reine Verbindung in steriler Wasserlösung oder in Form eines löslichen Pulvers, das für eine Lösung bestimmt ist. Beispielhafte Zubereitungen können nach den folgenden Verfahren hergestellt werden.

Kapseln

pro Kapsel

Antibiotikum|400 mg

Lactose, U.S.P. in einer Menge, die ausreicht, um in Kapseln jeweils etwa 475 mg einzufüllen.

Bei dem obigen Beispiel werden die aktive Verbindung und das Verdünnungsmittel unter Bildung eines einheitlichen Gemisches, das dann in Hartgelatinekapseln mit der Hand oder gegebenenfalls mit einer geeigneten Vorrichtung eingefüllt wird, vermischt. Das Mischen und Abfüllen erfolgt bevorzugt in einem Raum mit einer relativen Feuchtigkeit unter 40%.

Tabletten
pro Tablette
Antibiotikum 890 A₂\|330 mg
Calciumphosphat	192 mg
Lactose, U.S.P.	190 mg
Maisstärke	80 mg
Magnesiumstearat	8 mg
	800 mg

Bei dem obigen Beispiel wird die aktive Verbindung mit dem Calciumphosphat, der Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird mit einer 15%igen Maisstärkepaste granuliert und grobgesiebt und dann erneut durch ein Sieb mit einer Sieböffnung von 1,19 mm gesiebt. Der Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat werden zugegeben, und das Gemisch wird zu Tabletten verpreßt, die einen Durchmesser von etwa 1,27 cm besitzen und je 800 mg wiegen.

Alternativ kann die aktive Komponente mit dem Calciumphosphat, Lactose und der Hälfte der Maisstärke vermischt werden. Das Gemisch wird auf einer schweren Arbeitspresse unter Bildung einer kompakten, tablettenartigen Masse "verdichtet". Diese Masse wird zu einem Granulat mit einer Korngröße von 1,19 mm zerkleinert. Der Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat werden zugegeben, und das Gemisch wird zu Tabletten, die einen Durchmesser von etwa 1,27 cm besitzen und je 800 mg wiegen, gepreßt.

Lyo-Form (für die Injektion)
pro Ampulle
Antibiotikum 890 A₂\|500 mg
Wasser für die Injektion, U.S.P.	bis zu 2 ml

Bei dem obigen Beispiel wird die aktive Verbindung in ausreichend Wasser für die Injektion in dem angegebenen Verhältnis gelöst. Die Lösung wird zur Sterilisierung durch Selas-Kerzen oder Milliporen-Membranfilter filtriert. Die Lösung wird geteilt und in sterile Ampullen abgefüllt. Die Ampullen und der Inhalt werden gefroren, und das Wasser wird durch Lyophilisierung aseptisch entfernt. Die Ampullen, die den sterilen, trockenen Feststoff enthalten, werden aseptisch abgedichtet bzw. verschlossen.

Für die parenterale Verabreichung werden zu dem Inhalt einer Ampulle 2 ml steriles Wasser für die Injektion zugegeben.

Formen für die orale Verabreichung
pro 1000 ml
Antibiotikum 890 A₂\|1,0 g
Saccharose	600,0 g
Glucose	250,0 g
Natriumbenzoat	1,0 g
konzentriertes Orangenöl	0,2 ml
gereinigtes Wasser, U.S.P. bis zu	1000,0 ml

Die Saccharose und Glucose werden in etwa 400 ml Wasser unter Erhitzen zur leichteren Auflösung gelöst. Diese Lösung wird abgekühlt. Natriumbenzoat und anschließend konzentriertes Orangenöl werden zugegeben. Die Lösung wird mit Wasser auf ein Volumen von etwa 900 ml eingestellt, und das Antibiotikum wird zugegeben. Die Lösung wird durch Filtration durch ein grobes Filter geklärt.

Claims

1. Epithienamycin B der Formel mit folgender absoluten Konfiguration C₅=R; C₆=R; und C₈=S sowie dessen pharmazeutisch annehmbare Salze.

2. Zubereitung, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger.