DE2703731A1

DE2703731A1 - Antibiotica

Info

Publication number: DE2703731A1
Application number: DE19772703731
Authority: DE
Inventors: Walter D Celmer; Walter P Cullen; Charles E Moppett; John B Routien; Riichiro Shibakawa; Junsuke Tone
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1976-02-04
Filing date: 1977-01-29
Publication date: 1977-08-11
Also published as: DK16977A; DK144765B; US4031206A; JPS603476B2; IE44216B1; BE850429A; FR2340098A1; JPS52105293A; NL167728B; GB1521945A; IE44216L; FR2340098B1; CA1092042A; DK144765C; LU76594A1; NL7700424A; NL167728C

Description

Unsere Nr. 20 859 Ec/br

Pfizer Inc. New York, N.Y.,V.St.A.

Antibiotica

Die Erfindung betrifft zwei neue Antibiotica, die Verbindungen 41 043 und 41 494, die makrobicyclische Peptide darstellen und die bei der Züchtung einer neuen Art von Pseudonocardia, die als Pseudonocardia fastidiosa sp. nov. Routien, ATCC 3118l bezeichnet wird, unter submersen aeroben Bedingungen als Gemisch erhalten werden.

Die Suche nach neuen Antibiotica, die von Mikroorganismen aus Bodenproben produziert werden, hat die überprüfung vieler Gattungen von Bakterien, höheren Bakterien und Pilzen mit sich gebracht, wobei innerhalb jeder Gattung viele Arten und innerhalb jeder Art viele Stämme Überprüft wurden.

Zu den Mikroorganismen, denen bisher nicht viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, gehören die Mikroorganismen, die zu der Gattung Pseudonocardia gehören. Diese Gattung und die Gattung Nocardia

709832/1005

gehören zu der Ordnung der Actinomycetales, wobei die Gattung Pseudonocardia sich von der Gattung Nocardia durch die Herstellung langer unverzweigter Sporenketten im Luftmycel durch akropetale Entwicklung und durch das Wachstum einiger Hyphen im Zick-Zack-Muster unterscheidet.

Der zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotica brauchbare Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe aus Ägypten isoliert. Diese Kultur (Pfizer P.D. 25 028), die als Pseudonocardia fastidiosa sp.nov. Routien bezeichnet wurde, wurde bei der The American Type Culture Collection, Rockville, Md. als Typus-Kultur (type culture) unter der Nummer ATCC 3H8l hinterlegt.

Zur Kennzeichnung des Mikroorganismus, die nachstehend angegeben ist, wurden viele Züchtungsversuche auf den verschiedensten Nährmedien durchgeführt. Dabei wurde die Kultur, wenn nichtsjanderes angegeben ist, bei 28°C gezüchtet, und die Ergebnisse wurden jeweils nach einer geeigneten Züchtungsdauer aufgezeichnet. Die Farben wurden mit allgemeinen Ausdrücken und mit Namen aus Color Standards and Nomenclature, 1912, von Ridgway angegeben. Zu den eingesetzten Nährmedien oder Versuchen seien die folgenden Erläuterungen und Literaturhinweise angegeben:

1. Leitungswasser-Agar: 2 % Agar plus Leitungswasser.

2. Kartoffel-Karotten-Agar: M.P. Lechevalier, Jr. Lab. and Clinical Med., Bd. 71 (1968;, S. 934-9¹J¹*. Es wurden nur 30 g Kartoffeln und 2,5 g Karotten sowie 20 g Agar pro Liter eingesetzt.

3a. Kartoffel-Dextrose-Agar (Difco).

3b. Kartoffel-Dextrose-Agar, hergestellt durch Infusion von 100 g geschälten Kartoffeln pro Liter und 10 g Glukose pro Liter bei einem pH-Wert von 7,0.

3c. Kartoffel-Dextrose-Agar, hergestellt wie in 3b., jedoch bei einen pH-Wert von 5,5 wie bei 3a.

709832/1005

4. Glycerin-Asparagin-Agar: Waksman, S.A. The Actinomycetes, Bd. II (196I), Medium Nr. 3 auf Seite 328.

5. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: T.G. Pridham u.a., Antibiotics Ann. 1956/57, Seiten 947 bis 953.

6. Kartoffelmasse (potato plugs).

7. Aerobiose-Test: ATCC Medium Nr. 172 auf Seite 235 des American Type Culture Katalogs, 10. Auflage 1972.

8. Magermilch-Agar halber Stärke (half strength) (Magermilch von Difco).

9. Czapek-Saccharose-Agar: Waksman, S.A., The Actinomycetes, Bd. II (I96I), Medium Nr. 1 auf Seite 328.

10. Glukose-Hefeextrakt-Agar: Waksman, S.A., The Actinomycetes, Bd. II (1961), Medium Nr. 29 auf Seite 331.

11. Gelatine: R.E. Gordon und J.M. Mihm, Jr.Bact., Bd. 73 (1957), Seiten 15 bis 27.

12. Stärke-Agar: vgl. vorstehende Literaturstelle.

13. Anorganische Salze-Stärke-Agar: ISP-Medium Nr. 4.

14.Magermilch.
15· Cellulose

a) H.L.Jensen, Proc.Linnean Soc. N.S. Wales, Bd. 55 (1930), S. 231 bis 248.

b) M. Levine und H.W.Schoenlein, A Compilation of Culture Media, (1930), Medium Nr. 2511.

16. Temperaturbereich: ATCC Medium Nr. 172 aus dem American Type Culture Katalog, 10. Aufl. (1972), S. 235.

17.Trypton-Hefeextrakt-Brühe: T.G. Pridham und D. Gottlieb, Jr. Bact., Bd. 56 (1948), Seiten 107 bis 4

18. Pepton-Eisen-Agar (Difco) mit Bleiacetat-Streifen.

19. Hafermehl-Agar: ISP-Medium Nr. 3.

20. Nitrat-Reduktion:

a) Dextrose-Nitrat-Brühe: Waksman S.A., The Actinomycetes,

709832/1005

- C.

Band II (196I), Medium Nr. 1 auf Seite 328, wobei jedoch anstelle von 30 g Saccharose 3 g Dextrose eingesetzt wurden und der Agar weggelassen wurde.

b) Organische Nitrat-Brühe:

vgl.vorstehende Literaturstelle, Medium Nr. 37 auf S.332.

21. Hyphen-Untersuchung: G.M. Luedemann und B.C. Brodsky, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1964, Seiten 47-52.

22a. Kohlehydratausnutzung: ISP-Medium Nr. 9.

22b. Kohlehydratausnutzung: ISP-Medium Nr. 4 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen anstelle der Stärke.

Der Mikroorganismus Pseudonocardia fastidiosa sp.nov. Routien, ATCC 31181, kann wie folgt beschrieben und gekennzeichnet werden:

Anorganische Salze-Stärke-Agar:

Wachstum mäßig, flach mit etwas aufgerauhter Oberfläche; Wachstum gelb (Maisgelb bis Ledergelb nach Ridgway)mit blaßrosa Luftmycel (zwei Wochen lang weiß, aber am Ende von vier Wochen rosa); Revers gelb; blaß-gelbes lösliches Pigment; kein Geruch.

Czapek-Saccharose:

Wachstum gut, geringfügig erhöht, etwas aufgerauht; Wachstum gelb (Maisgelb bis Ledergelb) mit weißem bis blaß-rosa Luftmycel am Rand entlang nach vier Wochen; Revers gelb; gelbes, lösliches Pigment; schwacher unangenehmer Geruch.

Glycerin-Asparagin-Agar:

Wachstum schwach, dünn, flach, glatt, gelb (fast wie blasses Chalzedongelb ); kein Luftmycel; Revers blaß-gelb; sehr blaßgelbes,lösliches Pigment; kein Geruch (nach vier Wochen).

709832/1005

Gelabine:

Wachstum gut, etwas erhöht und mit etwas aufgerauhter Oberfläche, dunkel-gelbe (dull yellow) Farbe; kein Luftmycel; Revers bräunlichgelb; gelbes, lösliches Pigment; kein Geruch (nach vier Wochen).

Stärke-Agar:

Wachstum ausgezeichnet, erhöht, aufgerauht, gelblich-orange; kein Luftmycel; Revers dunkelorange-geIb bis bräunlich-orange; bräunlich-gelbes, lösliches Pigment; kein Geruch (nach vier Wochen).

Glukose-Hefeextrakt-Agar:

Wachstum mäßig, dünn, flach, geringfügig aufgerauht; Wachstum leuchtend, gelb; kleine Sektoren von weißem Luftmycel am Rande des Wachstums entlang; Revers gelb; gelbes, lösliches Pigment; kein Geruch (nach vier Wochen).

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:

Wachstum gut, etwas erhöht, mit feinen Unebenheiten; dunkelgelb (dull yellow) bis blaß-lachsfarbig (cHcerfarbig-ledergelb bis Antimongelb) am Rand; kein Luftmycel; Revers dunkelgelb; schwach bräunlich-gelbes, lösliches Pigment; schwacher unangenehmer Geruch (nach vier Wochen).

Kartoffel-Dextrose-Agar:

Kein Wachstum auf Difco-Medium, aber gutes Wachstum auf Medien 3b und 3c, cremefarbig, kahl; Revers cremefarbig; kein lösliches Pigment.

Hafermehl-Agar:

Wachstum mäßig, flach, blaß-gelb bis cremefarbig; kein Luftmycel; Revers blaß-gelb; blaß-gelbes, lösliches Pigment; kein Geruch (nach vier Wochen).

709832/1005

Leitungswasser-Agar:

Wachstum sehr spärlich, dünn, flach, sehr blaß-gelb; kein Luftmy eel; Revers fast farblos; kein lösliches Pigment; kein Geruch (nach vier Wochen).

Kartoffel-Karotten-Agar:

Wachstum spärlich, dünn, flach, sehr matt-gelbe Farbe in dickeren Wachstumsteilen; Auswüchse von weißem Luftmycel am Rand entlang; Revers sehr blaß-gelb; blaß-gelbes, lösliches Pigment; kein Geruch (nach vier Wochen).

Map;ermilch-Agar halber Stärke:

Wachstum mäßig, flach, glatt mit Ausnahme einiger Unebenheiten am Rande, braun (beinahe wie Zimtbraun bis Rotbraun); kein Luft-» myeel; Revers braun; braunes, lösliches Pigment; unangenehmer Geruch (nach vier Wochen).

Biochemische Eigenschaften:

Stärke wird hydrolysiert (in 3 Tagen); Gelatine wird verflüssigt (in 3 Tagen); keine Melaninbildung in Trypton-Hefeextrakt-Brühe oder Pepton-Eisen-Agar; keine HgS-Bildung; sowohl in Dextrose-Nitrat-Brühe als auch in organischer Nitratbrühe wird das Nitrat rasch (in 3 Tagen) zum Nitrit reduziert; Wachstum (1Ί bis 21 Tage) ohne Digestion auf dem Cellulose-Medium nach Jensen, aber kein Wachstum auf dem Medium von Levine und Schoenlein; Milch teilweise koaguliert und geringfügig peptonisiert (14 bis 21 Tage); aerob; kein Wachstum auf irgendeinem der getesteten Kohlehydrate, wenn das ISP-Medium Nr. 9 verwendet wurde, aber die Kultur verbrauchte auf dem ISP-Medium Nr. 4 ohne Stärke die Kohlehydrate Glukose, Arabinose, Fructose, Raffinose (schwach), Stärke und Xylose, verbrauchte jedoch nicht Inosit, Mannit und Rhamnose.

709832/1005

Vegetatives Wachstum;

Substrathyphen einer Größe von 0,5 bis 1,0 um, oft mit Zickzack-Form; Entwicklung von Zweigen im rechten Winkel oder spitzen Winkel, wobei die ersteren oft eine endständige, ovale bis birnenförmige Quellung (1,6 bis 2,0 um groß) aufwiesen, die bei weiterem Wachstum dazu führte, daß eine dünne Hyphe aus dem gequollenen Teil herausragte, wodurch eingeschobene Quellungen erhalten wurden.

Luftmycel:

Nach frischer Isolierung produzierte die Kultur eine flache Masse aus weißem Luftmycel mit einer Fülle langer Ketten sporenähnlicher Segmente, die sich später in zwei Sporen gleicher Größe teilten. Durch akropetales Keimen wurden Segmente gebildet, und manchmal entwickelten sich dünnere Zweige, ausgehend von der Nähe der scheinbaren Spitze eines Segments. Manchmal wiesen die Ketten eine schwache Zickzack-Form auf. Die längeren Segmente waren stabchenförmig, meistens gerade, 9 bis 10 χ 1,0 um. Wenn die Kultur älter wurde, teilte sich jedes Segment in zwei kleinere Körper, und es entstanden Sporen mit einer Größe von etwa 1,5 χ 1,2 ,um , die geringfügig größer waren als die Stammsegmente (parent segments). Eingehende Überprüfungen mit dem Elektronenmikroskop zeigten, daß die Sporen eine glatte Oberfläche haben.

Die Kultur zeigte soviele Eigenschaften, die sich von denen der beschriebenen Arten von Pseudonocardia unterschieden, daß sie als eine neue Art angesehen werden mußte. Da sie. auf dem normalerweise für Kulturen von Actinomyceten verwendeten Medium mit anorganischen Salzen kein Wachstum entwickelte, wurde sie Pseudonocardia fastidiosa genannt.

709832/1005

Vorzugsweise findet die Züchtung der Pseudonocardia-Kultur in den Nährmedien unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 28 bis 36⁰C und unter aeroben submersen Bedingungen statt. Zu den Nährmedien, die für diese Zwecke brauchbar sind, gehören eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, wie Zucker, Stärke, Glycerin und Melassen; eine Quelle für organischen Stickstoff, wie Fischmehl, Casein, enzymatisches Abbauprodukt von Casein, Fleischmehl, Weizengluten, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl und Erdnußmehl. Eine Quelle für Wachstumssubstanzen, wie Brenntweintrester und/oder Hefeextrakt, sowie Salze, wie Natriumchlorid, Ammoniumacetat, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat und Spurenmineralien, wie Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan, können ebenfalls mit vorteilhaften Ergebnissen eingesetzt werden. Wenn während der Fermentation ein übermäßiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel, wie pflanzliche öle oder Silikone, dem Fermentationsmedium zugesetzt werden. Der pH-Wert der Fermentation pflegt ziemlich konstant zu bleiben, wenn jedoch Abweichungen auftreten, kann dem Medium auch ein Püffermittel, wie Calciumcarbonat, zugesetzt werden. Die Belüftung des Mediums in Tanks für submerses Wachstum erfolgt vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 bis 2 Volumen freie Luft pro Volumen Brühe pro Minute. Das Rühren kann mit Hilfe von Rührern erfolgen, die dem Fachmann der Fermentationsindustrie allgemein bekannt sind. Während der überführung des Mikroorganismus und während des Wachstums müssen selbstverständlich aseptische Bedingungen aufrechterhalten werden.

Das Impfmaterial für die Herstellung der Antibiotica kann unter Verwendung von Wachstum auf Schrägkulturen oder Roux-Flaseben (Roux bottles) von P.fastidiosa auf Agai—Medien, wie dem ATCC-Medium Nr. 172, das vorstehend bereits erläutert wurde, erhalten werden. Das Wachstum kann zur Beimpfung von Schüttelkolben oder

709832/1005

Impftanks verwendet werden,oder es können auch die Impftanks mit Impfmaterial aus den Schüttelkolben versehen werden. Das Wachstum des Mikroorganismus erreicht gewöhnlich sein Maximum in etwa 2 oder 3 Tagen. Abweichungen in der eingesetzten Einrichtung, Belüftung, Rührgeschwindigkeit usw. können jedoch die Geschwindigkeit, mit der das maximale Wachstum erreicht wird, beeinflussen. Im allgemeinen wird die Fermentation solange durchgeführt, bis dem Medium eine wesentliche antimikrobiell Wirksamkeit verliehen worden ist, wozu für die meisten Zwecke etwa 24 Stunden bis etwa 4 Tage ausreichen.

Das Verfahren der Antibioticaherstellung wird zweckmäßig während der Fermentation verfolgt, indem man die Brühe unter Verwendung eines empfindlichen Stammes von Staphylococcus aureus biologisch prüft. Es wird eine übliche PlattenprUfmethode angewandt, bei der als Maß der antibiotischen Wirksamkeit die Hemmzone eingesetzt wird, die ein mit der Brühe gesättigtes Rundfilter aus Papier umgibt.

Ein brauchbares Instrument zur Analyse der Antibiotica, die durch Pseudonocardia fastidiosa in den Fermentationsmedien gebildet wurden, und der Zusammensetzung der rohen und gereinigten Stoffe, die aus den FermentationsbrUhen extrahiert wurden, ist die DünnschichtChromatographie unter Verwendung von Silicagel. Es werden Silicagelplatten mit einem Entwicklungssystem aus Chloroform und Xthanol im Volumenverhältnis 85:15 verwendet, und die entwickelten Platten werden unter Licht von 254 nm beobachtet. Mit diesen Methoden erscheinen zwei Antibiotica, die Verbindungen 4l 043 (größerer Teil, weniger polar) und 41 494 (geringerer Teil, größere Polarität). Wenn dies gewünscht wird, kann ein bioautographischer Nachweis der Antibioticabestandteile geführt werden, indem man die entwickelten SiIicagelchromatogramme mit einer dünnen Agar-Schicht bedeckt,

709832/1005

- VG -

die mit einem empfindlichen Stamm von Staphylococcus aureus oder einem anderen empfindlichen Organismus beimpft wird.

Die Antibiotica der vorliegenden Erfindung sind makrobicyclische Peptide und gehören zu der allgemeinen Klasse ähnlicher, früher beschriebener Antibiotica: Multhiomycin, The Journal of Antibiotics, Bd. 23 (1970), Nr. 5, Seite 231; Thiopeptin, The Journal of Antibiotics, Bd. 23-(1970), Nr. 3, Seite 113; Thiostrepton, Antibiotics Annual, 560 (1955-1956); Siomycin, The Journal of Antibiotics, Reihe A, Bd. 14 (1961), S. 255; und A-59, The Journal of Antibiotics, Reihe A, Bd. 14 (1961), S. 194.

Die Verbindungen 41 043 und 41 494 können nach den für die anderen makrobicyclischen Peptide angegebenen Methoden gewonnen und gereinigt werden, z.B. durch Lösungsmittelextraktion und Säulenchromatographie oder Kombinationen daraus. Organische Lösungsmittel, wie z.B. n-Butanol, Methylisobutylketon, Äthylacetat und chlorierte Kohlenwasserstoffe, können verwendet werden, um die Antibiotica aus der gesamten oder geklärten Fermentationsbrühe bei pH-Bereichen von 4,0 bis 10,0 zu extrahieren. Es kann aber auch das abgetrennte Mycel mit Methanol extrahiert, der Methanolextrakt im Vakuum konzentriert und das Methanolkonzentrat mit Wasser auf 1/10 seines ursprünglichen Volumens verdünnt und zweimal mit jeweils 1/3 Volumen an Methylisobutylketon extrahiert werden. Das Lösungsmittel wird zu einem dünnen Sirup konzentriert, und die Antibiotica werden mit Heptan ausgefällt. Die rohen Antibiotica werden in Aceton gelöst und über einer mit Silicagel gefüllten Säule chromatographiert, wobei nacheinander mit Hexan, Chloroform, Chloroform/ Äthanol (Volumenverhältnis 98:2 bis 90:10) und Aceton/Chloroform (Volumenverhältnis 50:50) entwickelt wird.

70983 2/1005

'43,

Die vorliegende Erfindung umfaßt die verdünnten Formen und die rohen Konzentrate des Antibioticageraisches und die einzelnen rohen und gereinigten Antibioticabestandteile. All diese Produkte sind brauchbar zur Bekämpfung von Mikroorganismen« wie z.B. Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes und Staphylococcus aureus. Darüberhinaus sind sie brauchbar als Desinfektionsmittel gegenüber solchen Mikroorganismen und als Hilfsmittel zur Reinigung gemischter Kulturen für medizinische, diagnostische und biologische Forschungszwecke.

Die nachstehende Tabelle I erläutert die antibakteriellen Spektren der Antibioticabestandteile. Diese Versuche wurden durchgeführt, indem man Röhrchen mit Nährbrühe herstellte, die stufenweise ansteigende Konzentrationen des reinen Antibioticums enthielten, und diese Brühen dann mit dem angegebenen besonderen Organismus impfte. Die Mindesthemmkonzentration, die in Tabelle I angegeben ist, ist die Mindestkonzentration des Antibioticums (in ,ug/ml), bei der der Mikroorganismus nicht mehr wuchs. Die Versuche wurden unter den in Proc.Soc.Exp.Biol. ft Med., Bd. 122 (1966), S. 1107, beschriebenen üblichen Bedingungen durchgeführt.

709832/1005

TABELLE I

Organismus	01A005	67BOO3
Staphylococcus aureus	OIAO52 OIAIO9 01A110 OlAlll OIAO87 OlAlfOO 02A006	66COOO
Streptococcus faecalis	O2C203
Streptococcus pyogenes	O5AOOI
Hycobacterium smegnsatis	O6AOOI
Bacillus subtills	5IA229
Escherichia coll	51A266 5IAI25 52AIOU
Pseudomonas aeruRinosa	53AOO9
Klebsiella pneuooniae	53A031
Proteus mirabilis	57GOO1
Proteus morgani	58Κΐώ
Salnoneiia cholerae-suis	58D009
Salmonella typhi-jnurium	58DO13-C 59AOO1
Basteurella multOcida	63AO17
Serratia marcescens	Enterobacter- . aerogenes 67AO^O .
	Enterobacter'* cloacae
Neisserla slcca

Mindesthemmkonzentration an

Verbindung

Hl 49¹» ^l 043

(>ig/ml) (yg/ml)

It .	' 0_f20 ⁰A³⁹
If	It
Il η	0,20
It
< o_rio	O_?39
< 0,10	< o_Tio
100	50
0_r20	< 0.10
> 200 It	>200 η
η	H . *
> 200 tt	>200 η
> 200 Il	>200 η
> 200	>200
> 200	>20O
>200	>200
> 200 It	>200 It
> 200 =	' >200
>200	>200
> 200	>200
> 200	>200
< 0.10	< 0,1O

709832/1005

Die nachstehende Tabelle II erläutert den Schutz, der in vivo durch die Verbindung 4l 043 bei Mäusen erreicht wird, die experimentell mit Staphylococcus aureus OIAOOS infiziert wurden.

TABELLE II
Verbindung Ml 043

Dosis mg/kg	% Schutz
400 (subkutan)	80
200 (subkutan)	60
100 (subkutan)	40
400 (oral)	0

Die erfindungsgemäßen Antibiotica können oral oder parenteral zur Behandlung von Infektionen durch Pneumokokken, Streptokokken, Staphylokokken oder Tuberkelbazillen und von anderen antibioticaempfindlichen Infektionen an Tiere und Menschen verabreicht werden. Im allgemeinen werden diese Antibiotica am besten in täglichen oralen Dosen von 0,5 bis 1 g oder als parenterale Injektionen von 100 bis 500 mg verabreicht, je nach der Art und Schwere der Infektion und dem Gewicht des zu behandelnden Patienten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen verabreicht werden, und diese Verabreichungen können sowohl in Einfachdosen als auch in Mehrfachdosen durchgeführt werden.

Für die Zwecke der oralen Verabreichung können Tabletten, die verschiedene Trägerstoffe, wie Natriumeitrat, Calciumcarbonat und Dicalciumphosphat, zusammen mit verschiedenen Sprengmitteln, wie Stärke, Alginsäure und bestimmte komplexe Silicate, sowie Bindemitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und

709832/ 1OU 5

Akaziengummi, enthalten, eingesetzt werden. Zusätzlich sind häufig Gleitmittel , wie Magnesiumstearat, Natriumlaury1sulfat und Talkum, brauchbar für Tablettierungszwecke. Feste Zusammensetzungen gleicher oder ähnlicher Art können auch als Füllstoffe für Füllungen von Weich- und Hartgelatinekapseln verwendet werden; zu den bevorzugten Füllstoffen für diesen Zweck gehören Lactose,sowie Polyäthylenglykole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wäßrige Suspensionen und/oder Elixiere für die orale Verabreichung gewünscht werden, kann deren wesentlicher wirksamer Bestandteil mit verschiedenen Süß- oder Geschmacksstoffen, färbenden Substanzen oder Farbstoffen und gegebenenfalls Emu^gier- und/oder Suspendiermitteln sowie mit Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Äthanol, Propylenglykol, Glycerin und verschiedenen Kombinationen daraus kombiniert werden.

Für die Zwecke der parenteralen Verabreichung können Lösungen dieser Antibiotica in Sesamöl oder Erdnußöl oder in wäßrigem Propylenglykol verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Es wurde ein steriles wäßriges Medium mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Bestandteil g/l

Glucose	10
Stärke	20 .
Hefeextrakt	• 5
enzymatisches Abbauprodukt von Casein	5
Fleischmehl	- 5
K₂HPO₁,	0,5
CoCl₂* 6H₂O	0,002
CaCO,	1

709832/1005

Das Medium hatte einen pH-Wert von 7,1 bis 7,2.

Auf mehrere 300 ml Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 50 ml des vorstehenden Mediums enthielten, wurden Zellen von einer Schrägnährbodenkultur von Pseudonocardia fastidiosa ATCC 31181 übertragen, und die Kolben wurden 3 bis k Tage lang bei 28°C auf einer drehbaren Schüttelvorrichtung geschüttelt.

Anschließend wurde ein steriles wäßriges Medium mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Bestandteil g/l

Glucose 10 enzymatisches Abbauprodukt von Casein 5 Hefeextrakt 5

Stärke 20 CaCO 1

CoCl₂.6H₂O 0,002

Dieses Medium hatte einen pH-Wert von 7,1 +. 0,1.

Fermentatoren, die 2 1 des vorstehend beschriebenen sterilen Mediums enthielten, wurden mit 5 Vol.-* des gewachsenen Impfmaterials beimpft. Die Temperatur wurde bei 28 bis 36⁰C gehalten, und die Brühe wurde mit 1 700 UpM gerührt und mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute belüftet. Nach etwa 40 bis 60 Stunden wurde die geklärte Brühe oder die gesamte Brühe 2 mal mit 1/3 bis 1/2 Volumen Methylisobutylketon extrahiert, der Lösungsmittelextrakt wurde im Vakuum konsentriert,und die Antibiotica wurden durch Zusatz von n-Heptan ausgefällt.

709832/1005

• ft-

Beispiel 2

Das Fermentationsverfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt. Das Mycel wurde aus der gesamten Brühe abgetrennt und mit Methanol aufgeschlämmt. Der Methanolextrakt wurde im Vakuum auf weniger als 1/10 seines Volumens konzentriert. Das Konzentrat wurde auf bis zu 1/10 bis 1/5 seines ursprünglichen Volumens mit Wasser verdünnt, der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt, und die Flüssigkeit wurde 2 mal mit 1/3 Volumen Methylisobutylketon extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wurde im Vakuum zu einem Sirup konzentriert, und die Antibiotica wurde durch Zusatz von n-Heptan ausgefällt.

Beispiel 3

Das Fermentationsverfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt. Etwa 10 % des gewachsenen Impfmaterials wurden verwendet, um 2 Fermentatoren mit einem Fassungsvermögen von 9**6 1, die jeweils 379 1 des Mediums von Beispiel 1 enthielten, zu beimpfen. Die Tanks wurden 2 bis 4 Tage fermentiert, und in dieser Zeit wurde ein ausreichendes Volumen Brühe verbraucht, um ein lOZiges Impfmaterial für zwei Fermentatoren mit einem Fassungsvermögen von 5 680 1, die jweils 3 800 1 des Mediums von Beispiel 1 enthielten, zu erzeugen. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 30°C und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute durchgeführt. Nachdem eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten worden war ( etwa nach 48 bis 72 Stunden), wurde die gesamte Fermentationsbrühe mit 50?iger Schwefelsäure auf einen pH-Wort von 6,0 eingestellt und mit 1 514 1 Methylisobutylketon (auf einem Fodbelniak) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und die in dem Konzentrat enthaltenen Anti-

70 9 832/100 5

a.

biotica wurden durch Zusatz von 4 Volumen n-Heptan ausgefällt. Die ausgefällten Feststoffe (420 g) wurden durch Filtration gesammelt, mit n-Heptan gewaschen und im Vakuum getrocknet.

100 g des Antibioticagemisches wurden im geringstmöglichen Volumen Aceton gelöst und mit 500 g Silicagel PFp«54 (E.Merck, Darmstadt) behandelt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Hexan behandelt, um eine bewegliche Aufschlämmung zu erhalten, die anschließend auf einen Sinterglastrichter gegeben wurde, der eine Schicht aus etwa 100 g Silicagel 60 (E. Merck, Darmstadt) und darüber eine Schicht aus etwa 100 g Silicagel PF₂Ci₁ enthielt. Die Antibiötica wurden dann nacheinander mit Hexan, Chloroform, Gemischen aus Chloroform und Äthanol (im Volumenverhältnis von 98:2 bis 90:10) und Gemischen aus Aceton und Chloroform (im Volumenverhältnis von 50:50) eluiert. Alle Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie und biologis ehe zfPrüf ung untersucht, und geeignete Fraktionen wurden vereinigt. Die Fraktionen, die reich an Verbindung 41043 waren (Chloroform/Äthanol: 95:5 bis 93:7 Vol.-J, 59 g) wurden weiter durch Chromatographie über Silicagel PF₂54 ^benandelt» wobei mit Chloroform/Äthanol (90:10 Vol.-X) eluiert wurde. Anteile von jeweils 5,0 g dieses Materials ließen sich leicht über einer Silicagelsäule von 2,54 cm Chromatographieren. Alle Schnitte wurden mittels DUnnschichtchromatographie untersucht, und die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff, eingedampft, der aus 2,02 g der Verbindung 41043 bestand. Dieser Feststoff ließ sich nicht kristallisieren.

Eigenschaften der Verbindung 41043: Elementaranalyse (die Probe wurde über Nacht im Vakuum über Phosphorpentoxid bei Raumtemperatur getrocknet)

C; 50,10; H; 4,88;

709832/100 5

	- ld.	9,15;	.0H 225 1* ⁵ E 270 lern	444 217
N:	8,40;	^⁰⁰Sh	183
S:	27,47 (aus Differenz)	350 nm	91
O:	Drehung:
Optische	77° (c = 1,0, Aceton)
^aD ⁺	Maxima der UV-Abaorption:
C₂H max

Charakteristische IR-Banden (KBr-Scheibe) in um gemäß Fig.

der Zeichnungen:

3,00; 3,^5; 5,72; 5,80; 5,90; 6,00; 6,45; 6,52; 7,22; 7,60; 8,00;, 8,30; 8,60; 8,95; 9,35; 9,98; 10,15; 11,00; 12,68 und

Löslichkeiten:

Löslich in Aceton, Chloroform, Methylisobutylketon, Xthylacetat, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid; unlöslich in Hexan, Heptan, Wasser und Diäthyläther.

Ein Anteil von 2,5 g des Materials, das reich an Verbindung 4l 494 war (aus den ursprünglich chromatographierten 100 g Antibioticagemisch), wurde auf eine mit Silicagel PF₂«54 gefüllte Säule mit den Maßen 2,54 χ 92 cm aufgebracht und mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 90:10 eluiert. Alle Fraktionen wurden mittels DünnschichtChromatographie untersucht,und die geeigneten Säulenschnitte wurden gesammelt, wobei 0,67 g der Verbindung 41 494 als amorpher Feststoff erhalten wurden. Dieser Stoff ließ sich nicht kristallisieren.

709832/100 5

Eigenschaften der Verbindung 4l 494: Elementaranalyse (die Probe wurde im Vakuum Über Phosphorpentoxid

bei Raumtemperatur getrocknet)

C: 19,94; H: 4,80; N: 9,29; S: 8,46;

0: 27,52 (aus Differenz)

Optische Drehung; ¹D

a_n + 29° (c = 0,5, Aceton)

Charakteristische IR-Banden (KBr-Scheibe) in um gemäß Fig. der Zeichnungen:

3,00; 3,45; 5,72; 5,78; 5,90; 6,00; 6,55; 6,75; 7,25; 7,60; 8,02; 8,40; 8,60; 9,00; 9,25; 10,17; 10,40; 11,15; 12,60 und 13,35.

Maxima der UV-Absorption:

C₂K₅OH	270	1% E	241
max	²⁹⁵Sh	lern	224
	350 nm		114
Löslichkeiten:

Löslich in Aceton, Chloroform, Me thylisobutylketon, Äthylacetat, Äthanol, Dirnethylsulfoxid und Dimethylformamid; unlöslich in Hexan, Heptan, Wasser und Diäthylather.

709832/1005

Claims

Patentansprüche:

1. Antibioticagemisch, enthaltend die Verbindungen 41 043 und 41 494, erhältlich durch Züchtung von Pseudonocardia fastidiosa sp. nov. Routien ATCC 3H8l unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, bis eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten ist, und Abtrennen des Antibioticagemisches aus dem Gemisch.

Antibioticum in Form der Verbindung 41 043, gekennzeichnet durch eine Löslichkeit in Aceton, Chloroform, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid; Unlöslichkeit in Hexan, Heptan, Wasser und Diäthyläther; Absorptionsmaxima in Äthanol im UV-Bereich des Spektrums bei 225, 270, 300 und 350 nm mit E* -Werten von 444, 215, 183 bzw. 91; eine durchschnittliche Zusammensetzung aus 50,10 Gew.-i C, 4,88 Gew.-* H, 9,15 Gew.-J N, 8,40 Gew.-} S und 27,50 Gew.-} 0 (aus Differenz); eine, optische Drehung von a~ + 77° (c - 1,0, Aceton); und nach Pelletisierung in KBr charakteristische 'Absorptionsbanden im IR-Bereich bei den folgenden Wellenlängen in ^im: 3,00; 3,45; 5,72; 5,80; 5,90; 6,00; 6,45; 6,52; 7,22; 7,60; 8,00; 8,30; 8,60; 8,95; 9,35; 9,98; 10,15; 11,00; 12,68 und 13,35.

3. Antibioticum in Form der Verbindung 41 494, gekennzeichnet durch eine Löslichkeit in Aceton, Chloroform, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid; Unlöslichkeit in Hexan, Heptan, Wasser und DiäthyI-äther; Absorptionsmaxima in Äthanol im uV-Bereich des

70 9832/1005

•ι.

Spektrums bei 270, 295 und 350 nm mit E* -Werten von 241, 224 bzw. 114; eine durchschnittliche Zusammensetzung aus 49,94 Gew.-? C, 4,80 Gew.-* H, 9,29 Gew.-* N, 8,46 Gew.-* S und 27,52 Gew.-* 0 (aus Differenz); eine optische Drehung a~ + 29° (c = o,5, Aceton); und nach Pelletisierung in KBr charakteristische Absorptionsbanden im IR-Bereich bei den folgenden Wellenlängen in -um:

3,00; 3,45; 5,78; 5,90; 6,00; 6,55; 6,75; 7,25; 7,60; 8,02; 8,40; 8,60; 9,00; 9,25; 10,17; 10,40; 11,15; 12,60 und

Für: Pfizer Inc.

New York, N/Ä., V.St.A.

Dr\H. ST. Wolff Rechtsanwalt

709832/1005