DK144765B - Fremgangsmaade til fremstilling af en antibiotisk blanding indeholdende orbindelse 41043 og forbindelse 41494, eller de enkelte komponenter i blandingen - Google Patents

Description

(19) DANMARK (W

(12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (11) 144765 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1 69/77 (51) (rrt.Cl.a C 12 P 21/00 (22) Indleveringsdag 17· jan. 1977 C 07 G 11/00 (24) Løbedag 17· jan. 1977 (41) Aim. tilgængelig 5· aug. 1977 (44) Fremlagt 1· jun. 1982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 4. feb. 1976, 655075, US

(71) Ansøger PFIZER INC., New York, US.

(72) Opfinder Walter D. _Celmer, US: Walter P. _Cullen, US: Charles E. Mop= pett, US: John B. Routien, US: Riichiro Shibakawa, JP: m. fl.

(74) Fuldmægtig Ingeniør firmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af en antibiotisk blanding inde= holdende forbindelse 4l04j og forbindelse 4l494, eller de en= kelte komponenter i blandingen.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt antibiotisk blanding indeholdende forbindelse 41043 og forbindelse 41494, eller de enkelte komponenter i blandingen.

Eftersøgningen af nye antibiotika produceret af jordmikroorganismer har omfattet prøvning af forskellige slægter af bakterier og svampe, herunder mange arter inden for hver slægt og mange stammer inden for hver art.

Blandt de mikroorganismer, som ikke hidtil har modtaget megen op mærksomhed, er dem, der tilhører slægten Pseudonocardia. Denne slægt og slægten Nocardia tilhører ordenen Actinomycetales, hvor 2 144765 slægten Pseudonocardia skelnes fra Nocardia ved fremkomsten i luftmyceliet af lange uforgrenede kæder af sporer ved acropetal udvikling og zig-zag vækstmønsteret for nogle hypher.

Det har nu vist sig at en mikroorganisme tilhørende en hidtil ukendt art af slægten Pseudonocardia danner den nævnte hidtil ukendte antibiotiske "blanding, og i overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Den mikroorganisme, som er nyttig til fremstilling af de omhandlede antibiotics, blev isoleret fra en jordprøve fra Ægypten.

Denne kultur (Pfizer F.D. 25028), kaldet Pseudonocardia fastidiosa sp. nov. Routien, er blevet deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Md. som typekultur under accessionsnumme-ret ATCC 31181.

Kulturen blev inkuberet ved 28°C, medmindre andet er anført, og optegnelser af resultaterne blev foretaget efter passende inku-beringstid. Farver blev angivet i almene vendinger og ved navne fra Ridgway's Color Standards and Nomenclature, 1912.

Medierne eller prøvningerne og passende referencer er som følger: 1. Ledningsvandagar - 2% agar plus ledningevand.

2. Kartoffel-gulerod-agar - M.P. Lechevallier, Jr. Lab. and Clinical Med. 71^934-944, 1968. Der bruges kun 30 g kartofler og 2.5 g gulerødder og 20 g agar pr. liter.

3a. Kartoffel-dextrose-agar (Difco).

3b. Kartoffel-dextrose-agar fremstillet af en infusion af 100 g skrællede kartofler pr.liter og 10 g glucose pr. liter, pH 7,0.

3c. Kartoffel-dextrose-agar fremstilet som under 3b, men med pH

5.5 som den under 3a.

4. Glycerol-asparagin-agar- Naksman, S. A. The actinomycetes,

Vol. II, medium 3 på side 328, 1961.

5. Gærekstrakt-maltekstrakt-agar - T.G. Pridham et al. Antibiotics Ann. 1956/57, side 947-953· 6. Aerobprøvning - ATCC medium 172 på side 235 i American Type Culture Catalogue, 10th ed., 1972.

7. Halvstyrke-skummetmælk-agar (Difco Skim Milk).

8. Czapek—sucrose—agar — Waksman, S.A., The Actinomycetes, Vol.

II, medium 1, side 328, 1961.

3 144765 9. Glucose-gærekstrakt-agar - Waksman, S.A., The Actinomycetes,

Vol. II, medium 29, side 331, 1961.

10. Gelatine - R.E. Gordon and J.M. Mihm, Jr. Bact. 73:15-27« 1957.

11. Stivelse-agar-lbid.

12. Uorganiske salte-stivelse-agar - ISP medium No. 4.

13. Skummetmælk.

14. Cellulose.

a) H.L. Jensen, Proc. Linnean Soc. N.S. Wales 55:231-248, 1930.

b) M. Levine and H.W. Scoenlein, A Compilation of Culture Media, medium nr. 2511, 1930.

15. Temperaturområde - ATCC medium 172 fra American Type Culture Catalogue, 10th ed., side 235, 1972.

16. Trypton-gærekstrakt-væske - T.G, Pridham and D. Gottlieb,

Jr. Bact. 56:107-114, 1948.

17. Pepton-jern-agar (Difco) med bly-acetat-striber.

18. Havremel-agar - ISP medium 3.

19. Nitratreduktion.

a) Dextrose-nitrat-vseske - Waksman, S.A. The Actinomycetes, Vol.

II, medium nr. 1, side 328, 1961 men 3 g dextrose i stedet for 30 g sucrose og agar udeladt.

b) Organisk nitrat-væske.

Ibid., medium nr. 37, side 332, 20. Hyphe-undersøgelse - G.M. Luedemann and B.C. Brodsky. Anti-micorbial Agents and Chemotherapy, 1964, side 47-52.

21a.. Carbonhydrat-udnyttelse - ISP medium Nr. 9.

21b. Carbonhydrat-udnyttelse - ISP medium Nr. 4 med forskellige carbohkilder i stedet for stivelsen.

Beskrivelsen af Pseudonocardia fastidiosa sp. nov. Routien:

Uorganiske-salte-stivelse-agar - vækst moderat, flad med svagt ru overflade, gul (Ridgway's Maize Yellow to Buff Yellow) med blegt lyserødt luftmycelium (hvidt i to uger, men lyserødet efter fire uger); bagside gul; bleggult opløseligt pigment; ingen lugt.

Czapek Sucrose - vækst god, svagt hævet, noget ru, gul (Maize Yellow to Buff Yellow) med hvidt til blegt lyserødt luftmycelium langs kanten efter fire uger; bagside gul; gult opløseligt pigment; svag ubehagelig lugt.

Glycerol-asparagin-agar - vækst ringe, tynd, flad, glat, gul (nærved Pale Chalcedony Yellow); intet luftmycelium; bagside bleggul; meget bleggult opløseligt pigment; ingen lugt (efter fire uger).

4 144765

Gelatine - vækst god, noget hævet og med noget ru overflade, mat gul farve; intet luftmycelium; bagside brunliggul; gult opløseligt pigment; ingen lugt (efter fire uger).

Stivelse-agar - vækst udmærket, hævet, ru, gullig orange; intet luftmycelium; bagside mørk orangegul til brunlig orange; brunliggult opløseligt pigment; ingen lugt (efter fire uger).

Glucos e-gærekstrakt-agar - vækst moderat, tynd, flad, svagt ru, skinnende gul; små sektorer af luftmycelium langs vækstkanten; bagside gul; gult opløseligt pigment; ingen lugt (efter fire uger).

Gærekstrakt-maltekstrakt-agar - vækst god, noget hævet, fint rynket, matgul til bleg laksefarvet (Ochraceous Buff to Antimony Yellow) ved kanten; intet luftmycelium; bagside matgul; svagt brunliggult opløseligt pigment; svag ubehagelig lugt (efter fire uger).

Kartoffel-dextrose-agar - ingen vækst på Difco-medium, men god vækst på medierne 3b og 3c, flødefarvet, nøgen; bagside flødefarvet; intet opløseligt pigment.

Havremel-agar - vækst moderat, flad, bleggul til flødefarvet; intet luftmycelium; bagside bleggul; bleggult opløseligt pigment; ingen lugt (efter fire uger).

Ledningsvand-agar - vækst meget ringe, tynd, flad, meget bleggul; intet luftmycelium; bagside næsten farveløs; intet opløseligt pigment; ingen lugt (efter fire uger).

Kartoffel-gulerod-agar - vækst ringe, tynd, flad, meget svag gul farve i tykkere vækstdele; udvoksninger af hvidt luftmycelium langs kanten; bagside meget bleg gul ; bleggult opløseligt pigment; ingen lugt (efter fire uger).

Halvstyrke-skummetmælk-agar - vækst moderat, flad, glat undtagen nogen rynken ved kanten, brun (nær ved Cinnamon Brown to Russet); intet luftmycelium; bagside brun; brunt opløseligt pigment; u-behagelig lugt (efter fire uger).

Biokemiske egenskaber - stivelse hydrolyseret (tre dage); gelatine smeltet (tre dage); intet melanin produceret i trypton-gærekstraktvæske eller pepton-jern-agar; intet EUS produceret; nitrat blev reduceret hurtigt (tre dage) til nitrit i både dextrose-nitrat-væske og organisk-nitrat-væske; vækst (l4 - 21 dage) uden nedbrydning på Jensens cellulosemedium, men ingen vækst på medium fra Levine og Schoenlein; mælk delvis koaguleret og svag peptoni-sering (14 - 21 dage); aårob; ingen vækst på noget prøvet carbon-hydrat ved anvendelse af ISP medium nr. 9, men på ISP medium nr.4 minus stivelse udnyttede kulturen glucose, arabinose, fructose, raffinose (svagt), stivelse og xylose, men udnyttede ikke inositol, mannitol og rhamnose.

Vegetativ vækst - substrathypher 0,5-1,0jum brede, ofte med zig-zåg-form; forgreninger udviklet i rette vinkler eller skarpe vinkler, de førstenævnte ofte med en afsluttende oval til pæreformet opsvulmning (1,6-2,0/jul bred), som ved yderligere vækst resulterede i en tynd hyphe, som strakte sig udad fra den opsvulmende del og således frembragte indskudte opsvulmninger.

Luftmycelium - når den var frisk isoleret, producerede kulturen 5 144765 en flad masse af luftmycelium med en rigdom af lange kæder af sporelignende segmenter, som senere delte sig i to sporer af ens størrelse. Segmenter blev frembragt ved acropetal knopskydning, og somme tider udviklede tyndere forgreninger sig fra nær ved den tilsyneladende spids af et segment. Der var somme tider et svagt zig-zag-præg over kæderne. De længere segmenter var stavformede, mest lige, 9-10 x 1,0 jum. Deling af hver i to mindre legemer, efterhånden som kulturen blev ældre, frembragte sporer på omkring 4,5 x 1,2 Jom, en smule bredere end stamsegmenteme. Skanderende elektronmikroskop-undersøgelse viste, at sporerne har en glat overflade.

Kulturen viste så mange egenskaber forskellige fra beskrevne arter af Pseudonocardia, at den blev betragtet som en hidtil ukendt art. Fordi den ikke voksede på det uorganiske-salt-medium, som normalt anvendes til kulturer af actinomyceter, blev den navngivet Pseudonocardia fastidiosa.

Dyrkning af Pseudonocardia-kulturen finder fortrinsvis sted i næringsmedier ved en temperatur på omkring 28-36°C og under aerobe submerse betingelser med omrøring. Næringsmedier, som er egnede til sådanne formål, inkluderer en kilde for assimilerbart carbon, såsom sukkerstoffer, stivelse, glycerol og melasse; en kilde for organisk nitrogen, såsom fiskemel, casein, enzymatisk nedbrudt casein, kødmel, hvedegluten, bomuldsfrømel, soyabønne-mel og Jordnøddemel. En kilde for vækststoffer, såsom "distillers solubles" og/eller gærekstrakt såvel som salte, såsom na-triumchlorid, ammoniumacetat, ammoniumsulfat og kaliumphosphat, og spormineraler, såsom Jern, magnesium, zink, cobalt og mangan, kan også udnyttes med fordelagtige resultater. Hvis der opstår overdreven skumning under gæringen, kan der sættes antiskum-mid-ler, såsom vegetabilske olier eller siliconer, til gæringsmediet. Mediets pH værdi har tendens til at forblive ret konstant tinder gæringen, men hvis der opstår variationer, kan der sættes et puffermiddel, såsom calciumcarbonat til mediet. Luftning af mediet i tanke til submers vækst opretholdes fortrinsvis ved en hastighed på omkring 1/2 til 2 volumener frisk luft pr. volumen væske pr. minut. Omrøring kan foretages ved hjælp af velkendte omrørere inden for gæringsindustrien. Aseptiske betingelser må selvfølgelig opretholdes tinder overførslen af mikroorganismen og dens vækst.

Podemedium til fremstillingen af antibioticumet kan opnås ved at anvende vækst fra skråsubstrater eller Roux-flasker af P. fastidiosa på sådanne agarmedier som ATCC Medium 172, hvortil der 6 144765 tidligere er henvist. Væksten kan anvendes til at pode enten rys-tekolher eller podetanke, eller alternativt kan podetankene podes fra rystekolberne. Mikroorganismens vækst når sædvanligvis et maximum på omkring to eller tre dage. Imidlertid kan variationer i det anvendte udstyr, luftningen, omrøringshastigheden o.s.v. påvirke den hastighed, hvormed den maximale vækst nås.

I almindelighed gennemføres gæringen, indtil der er opstået væsentlig antimikrobiel aktivitet i mediet, hvortil et tidsrum på fra omkring 24 timer til omkring 4 dage er tilstrækkeligt til de fleste formål.

Antibioticumproduktionen følges hensigtsmæssigt under gæringen ved biologisk prøvning af væsken under anvendelse af en følsom stamme af Staphylococcus aureus. Der anvendes standardpladeprøv-ningsteknik, hvorved inhiberingszonen omkring en filterpapirskive mættet med væsken anvendes som et mål for antibiotisk styrke.

Tyndtlagschromatografi under anvendelse af silicagel er et nyttigt redskab til at analysere de antibiotica, som produceres af Pseudonocardia fastidiosa i gæringsmedier og sammensætningen af rå eller rensede materialer ekstraheret fra gæringsvæsker. Si-licagelplader anvendes med et udviklingssystem af chloroform/ ethanol i volumenforholdet 85:15 og med iagttagelse af de udviklede plader under 254 nm lys. To antibiotica, Forbindelse 41043 (overvejende del, mindre polær) og Forbindelse 41494 (mindre del, mere polær) viser sig ved denne teknik. Om ønsket kan bio-autografisk sporing af de antibiotiske komponenter gennemføres ved hjælp af et overliggende tyndt lag agar podet med en følsom stamme af Staphylococcus aureus eller en anden følsom organisme på de udviklede silicagel-chromatogrammer.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede antibiotica er makrobicykliske peptider og tilhører den almene klasse af lignende, tidligere rapporterede antibiotica: Multhiomycin, The Journal of Antibiotics, 23, No. 5, 231 (1970); Thiopeptin, The Journal of Antibiotics, 23, No. 3, 113 (1970); Thiostrepton, Antibiotics Annual, 560 (1955-1956); Siomycin, The Journal of Antibiotics, Ser. A, 14, 255 (1961); og A-59, The Journal of Antibiotics, Ser. A, 14, 194 (1961).

7 144765

Forbindelse 41043 og Forbindelse 41494 kan udvindes og renses ved metoder, som er rapporteret for andre makrobicykliske peptider, herunder opløsningsmiddelekstraktion og søjlechromatografi eller kombinationer deraf. Organiske opløsningsmidler, såsom n-butanol, methylisobutylketon, ethylacetat og chlorerede carbonhydrider, kan anvendes til at ekstrahere antibioticaene fra hel eller klaret gæringsvæske ved pH områder på fra 4,0 til 10,0. Alternativt ekstraheres det udskilte mycelium med methanol, methanolekstrak-ten koncentreres i vakuum, og methanolkoncentratet, fortyndet til 1/10 af dets oprindelige volumen med vand, ekstraheres to gange med 1/3 volumener methylisobutylketon. Opløsningen koncentreres til en tynd sirup, og antibioticaeme udfældes med heptan.

De rå antibiotica opløses i acetone og chromatograferes på en silicagelsøjle udviklet med hexan, chloroform, chloroform/ethanol (volumenforhold 98:2 til 90:10) og acetone/chloroform (volumenforhold 50:50).

Der kan fremstilles såvel de fortyndede former og rå koncentrater af blandingen af antibiotica som de enkelte rå og rensede antibiotiske komponenter. Alle disse produkter er nyttige til bekæmpelse af mikroorganismer, såsom Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes og Staphylococcus aureus. Desuden er de nyttige som desinfektionsmidler over for sådanne mikroorganismer og som en hjælp til rensningen af blandede kulturer til medicinske, diagnostiske og biologiske forsøgsmål.

Tabel I belyser de antibiotiske komponenters antibakterielle spektre. Disse prøvninger blev gennemført ved at præparere glas af næringsvæske med gradvis stigende koncentrationer af det rene antibioticum og derpå pode væskerne med den bestemte angivne organisme. Den minimale inhiberende koncentration, som er angivet i tabel I er den minimale koncentration af antibioticumet (i yug/ml), hvorved mikroorganismen ikke voksede. Prøvningerne blev gennemført under standardiserede betingelser som beskrevet i Proc. Soc.

Exp. Biol. & Med., 122, 1107 (1966).

8 144765

Tabel I

Organisme Forbindelse 41 494 41 045

Staphylococcus aureus 01A005 0,78 0,20 01A052 " 0,39 01A109 " " 01A110 ” " 01A111 " 0,20 01A087 " 0,39 01A400 " "

Streptococcus faecalis 02A006 <0,10 0,39

Streptococcus pyogenes 02C203 <0,10 <0,10

Mycobacterium smegmatis 05A001 100 50

Bacillus subtilis 06A001 0,20 <0,10

Escherichia coli 51A229 > 200 > 200 51A266 " " 51A125 " "

Pseudomonas aeruginosa 52A104 > 200 > 200 52A440 " "

Klebsiella pneumoniae 53A009 > 200 > 200 53AO31 " "

Proteus mirabilis 57C064 > 200 >200

Proteus morgani 57G001 > 200 > 200

Salomonella cholerae-suis 58B242 > 200 > 200

Salmonella typhimurium 58D009 > 200 > 200 —-- 58D013-C " "

Pasteurella multocida 59A001 > 200 > 200

Serratia marcescens 63A017 >200 > 200

Enterobacter aerogenes 67A040 > 200 > 200

Enterobacter cloacae 67B003 > 200 > 200

Neisseria sicca 66C000 <0,10 <0,10 9 144765

In vivo beskyttelsen, som Forbindelse 41043 giver mus eksperimentelt inficeret med Staphylococcus aureus 01A005, er vist i tabel II.

Tabel II

Forbindelse 41043 Dosis (mg/kg) % Beskyttelse 400 (subcutant) 80 200 (subcutant) 60 100 (subcutant) 40 400 (oralt) 0

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede antibio-tica kan indgives ad oral eller parenteral vej til behandling af dyr, herunder mennesker, for pneumococciske, streptococciske, staphylococciske, tuberculøse og andre antibioticum-følsomme infektioner. I almindelighed indgives disse antibiotica mest ønskeligt i daglige orale doser på 0,1-1 g eller som parenterale injektioner på 100-500 mg, afhængigt af infektionens type og alvor og vægten af det behandlede individ.

Forbindelserne kan indgives alene eller i kombination med far-meceutisk acceptable bærere, og en sådan indgivning kan gennemføres i både enkelte og flergangsdoser.

Til oral indgivning kan anvendes tabletter indeholdende forskellige excipienter, såsom natriumcitrat, calciumcarbonat og di-calciumphosphat, sammen med forskellige nedbrydningsmidler, såsom stivelse, alginsyre og visse komplekse silicater sammen med bindingsmidler, såsom polyvinylpyrrolidon, saccharose, gelatine og gummiacacia. Desuden er glittemidler, såsom magnesiumstearat, natriumlaurylsulfat og talcum, ofte nyttige til tabletteringsformål. Faste blandinger af en lignende type kan også anvendes som fyldstoffer i bløde eller hårdt-fyldte gelatinekapsler; foretrukne materialer inkluderer lactose såvel som højmolekylære polyethylenglycoler. Når vandige suspensioner og/eller eliksirer er ønskelige til oral indgivning, kan den nødvendige aktive ingrediens deri kombineres med forskellige søde-eller aromamidler, farvematerialer eller farvestoffer og, om ønsket, emulgerings-og/eller suspenderingsmidler sammen med fortyndingsmidler som vand, ethanol, propylenglycol, glycerol og forskellige kombina- 10 144765 tioner deraf.

Til parenteral indgivning kan anvendes opløsninger af disse an-tibiotica i sesam- eller jordnødolie eller i vandig propylen-glycol.

De følgende eksempler tjener til nærmere at belyse fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL 1

Der fremstilledes et sterilt vandigt medium med den følgende sammensætning:

Ingrediens g/liter

Glucose 10

Stivelse 20 Gærekstrakt 5

Enzymatisk nedbrudt casein 5 Kødmel 5 K2HP04 0,5

CoC12*6H20 0,002

CaCO^ 4

Celler fra en skråkultur af Pseudonocardia fastidiosa ATCC 31181 blev overført til hver af et antal 300 ml Erlenmeyer-kolber,som hver indeholdt 50 ml af det ovenstående medium, og kolberne blev rystet ved 28°C på en rotationsryster i 3-4 dage.

Der fremstilledes et sterilt vandigt medium med den følgende sammensætning:

Ingrediens g/liter

Glucose 10

Enzymatisk nedbrudt casein 5 Gærekstrakt 5

Stivelse 20

CaCO^ 1

CoCl2* 6H20 0,002 pH 7,1 - 0,1 11 144765

Fermentorer indeholdende to liter af det ovenfor beskrevne sterile medium blev podet med 5 volumen-% dyrket podemateriale. Temperaturen holdtes ved 28-36°C, og væsken blev omrørt med 1700 omdr./min. og luftet med en hastighed på omkring 1 volumen luft pr. volumen væske pr. minut. Efter omkring 40-60 timer blev den klarede væske eller hele væsken ekstraheret to gange med 1/3 til l/2 volumen methylisobutylketon, opløsningsmiddelekstrakten koncentreret i vakuum, og antibioticaerne udfældet ved tilsætning af n-heptan.

EKSEMPEL 2 Gæringsprocessen fra eksempel 1 blev gentaget. Myceliet blev adskilt fra hele væsken og opslæmmet i methanol. Methanolekstrak-ten blev koncentreret i vakuum til under 1/10 volumen. Koncentratet blev fortyndet op til 1/10 til 1/5 af dets oprindelige volumen med vand, pH-værdien indstillet til 6,0, og blandingen ekstraheret to gange med l/3 volumen methylisobutylketon. Opløsningsmiddelekstrakten blev koncentreret under vakuum til sirup, og antibioticaerne udfældet ved tilsætning af n-heptan.

EKSEMPEL 5 Gæringsprocessen fra eksempel 1 blev gentaget. Omkring 10% af det dyrkede podemateriale blev anvendt til at pode to 0,95 m fermentorer, som hver indeholdt 380 liter af mediet fra eksempel 1. Tankenes indhold blev gæret i 2-4 dage, hvorefter et tilstrækkeligt volumen væske blev anvendt til at give 10% podemate- 3 3 riale til to 5,7 nr fermentorer, der hver indeholdt 3,8 m af mediet fra eksempel 1. Gæringen blev gennemført ved en temperatur på 30°C og en luftningshastighed på 1 volumen luft per volumen væske per minut. Efter at· der var opnået væsentlig antibiotisk aktivitet (48-72 timer), blev hele gæringsvæsken indstillet til pH 6,0 med 50% svovlsyre og ekstraheret med 1,5 m methylisobutylketon på en Podbelniak. Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum, og antibioticum-indholdet i koncentratet blev udfældet ved tilsætning af 4 volumener n-heptan. Det udfældede faste stof (420 g) blev opsamlet ved filtrering, vasket med n-heptan og tørret i vakuum.

Den antibiotiske blanding (lOOg) blev opløst i det minimale vo- 12 144765 lumen acetone og behandlet med 500 g silicagel PF254 ΜβΓ0^» Darmstadt, Tyskland). Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum, og remanensen behandlet med hexan til opnåelse af en mobil opslæmning, som derpå sattes til en sinterglastragt indeholdende et lag af omkring 100 g silicagel 60 (E. Merck, Darmstadt,

Tyskland) overlejret med et lag af omkring 100 g silicagel ^23k‘ Antibioticaerne blev derpå elueret med hexan, chloroform, chloroform/ethanol (volumenforhold 98:2 til 90:10) og acetone/ . chloroform (volumenforhold 50:50). Alle fraktioner blev prøvet ved tyndtlagschromatografi og bioprøvning, og passende fraktioner blev hældt sammen. De fraktioner, som var rige på Forbindelse 41043 (chloroform/ethanol i volumenforhold på 95:5 til 93:7» 59 g) blev yderligere behandlet ved chromatografi på silicagel PF^^ under eluering med chloroform/ethanol (volumenforhold 90:10). Portioner på 5,0 g af dette materiale blev let håndteret på en 2,54 cm silicagelsøjle. Alle snit blev prøvet ved tyndtlagschromatografi, og de passende fraktioner blev kombineret og inddampet i vakuum til et amorpht fast stof bestående af Forbindelse 41043 (2,02 g). Dette materiale kunne ikke bringes til krystallisere .

Forbindelse 41043

Elementanalyse (prøvetørret natten over i vakuum over phosphor-pentoxid ved stuetemperatur).

C 50,10 H 4,88 N 9,15 S 8,40 0 27,47 (som differens)

Optisk drejning ocD + 77° (c = 1,0, acetone) 13 1A 47 6 5

Ultraviolette abxorptionsmaxima -v EtOH . s ooc. „196 ,,,

Xmax (™): 225 E1 cm: 444 270 217 3°°(skulder) 183 350 91

Karakteristiske infrarøde bånd (KBr-skive) i yum som vist i fig. 1 3,00, 3,45, 5,72, 5,80, 5,90, 6,00, 6,45, 6,52, 7,22, 7,60, 8,00, 8,30, 8,60, 8,95, 9,35, 9,98, 10,15, 11,00, 12,68 og 13,35.

Opløseligheder

Opløselig i acetone, chloroform, methylisobutylketon, ethylacetat, ethanol, dimethylsulfoxid og dimethylformamid; uopløselig i hexan, heptan, vand og diethylether.

En portion på 2,5 g af det materiale, som var rigt på Forbindelse 41494 (fra de først chromatograferede 100 g blanding af antibiotics) blev påført en 2,54 x 92 cm silicagel PF254 søjle °g elueret med chloroform/ethanol (volumenforhold 90:10). Alle fraktioner blev prøvet ved tyndtlagschromatografi, og de passende søjlesnit hældt sammen til opnåelse af 0,67 g af Forbindelse 41494 som et amorpht fast stof. Dette materiale kunne ikke bringes til at krystallisere.

Forbindelse 41494

Elementanalyse (prøvetørret i vakuum over phosphorpentoxid ved stuetemperatur) C 49,94 H 4,80 N 9,29 S 8,46 0 27,52 (som differens)

Optisk dre.jning tXp + 29° (c = 0,5, acetone)