DE2830856A1 - Neue antibiotisch wirksame verbindungen, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel - Google Patents

Description

ι (ο

\ PATENTANWÄLTE

j PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER

j DR.-ING. WOLFRAM BUNTE

; DR. WERNER KINZEBACH I

I D-BOOO MÜNCHEN 4O, BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF tO89) 37 63 Q3 · TELEX 52152Ο8 ISAR D POSTANSCHRIFT: D-BOOO MÜNCHEN 43, POSTFACH 78Ο

München, 13. Juli 1978 M/19 183

SY-1547A

BRISTOL-MYERS COMPANY 345 Park Avenue

New York, N . Y . 10022/USA

Neue antibiotisch wirksame Verbindungen, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel

SY-1547A

Die Erfindung betrifft neue antibiotische Substanzen, insbesondere einen anti biotisch wirksamen Komplex, der hier als Bu-2313 bezeichnet wird. Dieser Komplex wird dadurch produziert, daß man einen Stamm von Micropolyspora caesia mit den Hinter- ! legungsnummern ATCC 31295, 31296, 31297 oder 31298 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Medium kultiviert,

] ι

bis im Kulturmedium eine nennenswerte Menge an Bu-2313 produziert ist und gewünschtenfalls das Bu-2313 aus dem Kulturmedium gewinnt.

Die Erfindung betrifft auch zwei neue antibiotisch wirksame Komponenten des Bu-2313, die hier als Bu-2313A und 2313B bezeichnet werden. Diese werden aus dem Komplex Bu-2313 durch chromatographische Arbeitsweisen gewonnen. Bu-2313 und seine

;■ bioaktiven Komponenten Bu-2313A und BU-2313B besitzen gegenüber

j einer Vielzahl anaerober Bakterien und einigen aeroben Bakterien antibakterielle Wirksamkeit. Bu-2313A und Bu-2313B sind

j zur Behandlung infektiöser Erkrankungen bei Tieren sowie dem Menschen brauchbar, insbesondere zur Behandlung von Erkrankun-

Ϊ gen, die durch anaerobe Bakterien verursacht wurden.

Figur 1 zeigt die Ultraviölettabsorptionsspektren von Bu-2313A in Äthanol,, in N/10 NaOH-5 % Äthanol, in Phosphatpuffer von pH 7,0 und in N/10 HCl-5 % Äthanol.

Figur 2 zeigt die Ultraviolettabsorptionsspektren von Bu-2313B in Äthanol, in N/10 MaOH-5 % Äthanol, in Phosphatpuffer von pH 7,0 und in N/10 HCl-5 % Äthanol.

Figur.3 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Bu-2313A_S pelletiert in Kaliumbromid.

Figur 4 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Bu-2313B, pelletiert in Kaliumbromid.

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M/19 183 SY-1547A

Figur 5 zeigt das kernmagnetische Resonanzspektrum von Bu-2313A in CDCl₃ (60 MHz).

Figur 6 zeigt das kernmagnetische Resonanzspektrum von Bu-2313B in CDCl₃ (60 MHz).

Bu-2313 und seine Komponenten Bu-2313A und Bu-2313B können

^: durch Fermentation bestimmter neuer chromogener Subspezien von Micropolyspora caesia produziert werden. Die Strukturen von ; BU-2313A und Bu-2313B sind wie folgt:

CH

BU-2313A BU-2313B

R = CH.

Mi kroorganismus

Im Zuge der Durchführung von Globaltests auf anti-anaerobe Antibiotika wurde ein öligosporischer Actinomycetenstamm Nr. E864-61 aus einer Bodenprobe isoliert, die im Distrikt Rajasthanl in Indien gesammelt wurde. Er wurde bei 42 C auf einer Agarplatte mit Rinderextrakt-Pepton-anorganischem Salzmedium, ' das mit 2 jjg/ml Dihydroxymethyl furatrizin und 40 jig/ml Nystatin-' "" 809885/0849

; μ/ 19 183 - 9 - 283Q856

I SY-1547A

ergänzt war, isoliert. Es wurde festgestellt, daß der Stamm
E864-61 einen neuen antibiotisehen Komplex namens Bu-2313
produziert, der hauptsächlich gegen verschiedene anaerobe
Bakterien wirksam ist.

Morphoiogie

Der Stamm E864-61 bildet auf dem Luft- und Substratmycel Sporen, Die Hauptmenge der Sporen wird einzeln getragen und zwar entweder direkt auf den Hyphen oder auf kurzen Sporophoren. Bis- . weilen werden paarförmige Sporen und Ketten von zwei bis acht
Sporen beobachtet. Die Farbe des Luftmycels ist weiß und nimmt \ später eine stumpfe blaugrüne oder hellgraugrüne Farbe an, wo-

j bei üppige Sporulation auftritt. Zwei Typen von Pigment,

violett und dunkelgrün, werden im Agarmedium produziert. Die '■ Gestalt der Sporen ist kugelig bis oval, ihre Größe beträgt
0,5 bis 0,7 χ 0,5 bis 1,2 μ, und sie besitzen eine glatte Ober-' fläche. Die Lufthyphen sind bisweilen mehrfach bis zu !Oma! \ verdreht, was das Aussehen einer geraden Sporenkette hervor- ; ruft. Im allgemeinen wird eine Fragmentation des Substratmycels nicht beobachtet, während eine Variante ohne Luftmycel nach
einer langen Inkubationszeit fragmentierte Zellen bildet. Der
Mutterstamm (S-2) neigt zur Bildung spontaner Varianten, die
sich in der Fähigkeit zur Bildung einer grünlichen Sporenmasse, des Luftmycels und des violetten oder grünen Pigments unterscheiden. Die Eigenschaften des Originalstamms und einiger
Varianten sind in Tabelle 1 aufgeführt.

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SY-1547A

	grün1iehe	TABELLE 1	+	♦ -	Verhältni	s an ge-
Stamm	Sporen	Luft- Pigmentpro-		bi1detem	BU-2313A/
Nr.	masse	mycel duktion	- +	BU-2313B
	+	violett grün		8 :	CVi
S-2 (Origi
nal stamm)			1	Q
S-26			1	y
(Variante)	-	6 :	4
S-7 (Variante)		1 :	Q
Y-29			y
(Variante)

Die aus dem Original stamm S-2 durch Monosporen-Isolierungstech· nik produzierte Variante Y-29 wurde als stark produzierender Stamm gewählt. Kulturen der Actinomyceten E864-61-Stämme S-2, S-26, S-7 und Y-29 sind bei der American Type Culture Collection, Washington D.C. hinterlegt und der permanenten Sammlung von Mikroorganismen unter den Hinterlegungsnummern ATCC 31295, 31297, 31296 bzw. 31298, einverleibt worden.

Zusammensetzung der Zellwand

Der Stamm E864-61 enthält meso-DAP, Galactose und Rhamnose als diagnostische ZeI 1 wandkomponenten. Die Zusammensetzung der Zeil wand ist in Tabelle 2 dargestellt.

8 0 9 8 8 5/Ö 8 4 9

SY-1547A

TABELLE 2

Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung der ZeI1 wand

Aminosäure Stamm E864-61

meso-DAP +++

LL-DAP Glycin

Glutaminsäure +++

Alanin +++

Kohlehydrat

Arabinose

Galactose +++

Rhamnose +

Mannose Spur

Kulturcharakteristika .

ι Der Stamm E864-61 wächst auf nährstoffreichem Medium, wie '· Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar und Bennett's Agar heftig, während das Wachstum auf chemisch definierten Medien, wie Stärke-Mineral salz-Agar, Glucose-Asparagin-Agar, Tyrosinagar und Glucose-Ammoniumsalze -Agar gering ist. Auf Czapek's Agar ergibt der Stamm kein Wachstum.

Der Original stamm von E864-61 (S-2) bildet üppig Sporen und Luftmycel. Er produziert zwei Typen von Pigment: rötl ich-pu.r- ^! purfarbenes Pigment bis rötlich-braunes Pigment auf Hefeextraktr Malzextrakt-Agar, Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar und Glucose- | Ammoniumsalze-Agar, sowie dunkelgrünes Pigment auf Hafermehl- ■ agai% Tyrosinagar und Bennett's Agar. Die Variante Nr. S-26 ;

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sporuliert gut und bildet ein Luftmycel, besitzt jedoch nicht die Fähigkeit zur Bildung von Pigment. Die Variante Nr. S-7 bildet ein weißes Luftmycel ohne grünliche Sporenmasse und bildet reichlich rötlich-purpurfarbenes Pigment, nicht jedoch das grünliche Pigment. Variante Nr. Y-29 besitzt keine Fähigkeit zur Bildung von Sporenmasse und Luftmycel und zeigt somit ein bakterienartiges Erscheinungsbild. Sie produziert nur grünliches Pigments diese Eigenschaft geht jedoch durch Transfer sehr leicht verloren. Die KuI turcharakteristika des OriginalStamms und der spontanen Varianten sind in Tabelle 3 dargestelIt.

80 9885/084 9

TABELLE 3
KuIturcharakteristika des Stamms E864-61 und Varianten

-^i oo

Stamm E864-61 Nr.S-2 Variante Nr. S-26 Variante Nr. S-7 Variante Nr. Y-29

Sucrose-Nitratagar G. VM (Czapek's Agar).

Hefeextrakt-Mal zextraktagar
(ISP Nr. 2)

Hafermehl agar
(ISP Nr. 3)

AM D

G. VM AM

D G. VM

AM D

kein Wachstum

kein Wachstum

mäßiges Wachstum; rötlich-braun.

reichlich; stumpfes Bläulich-grün

mäßiges Wachstum; gelblich-braun.

reichlich; stumpes Gelb bis hellgraues Grün.

helles Rötlich-braun helles Rötlich-braun

mäßiges Wachstum; dunkelgrün

reichlich; stumpfes Bläulich-grün

helles Rötlich-braun

mäßiges Wachstum; hellbraun

spärlich,weißes und hellgraues Grün

keines kein Wachstum, oder Wachstum von Kolonien; dunkelrosa.

mäßig; weiß keines

mäßiges Wachstum; dunkelorange.

keines oder spärlich; weiß

dunkles Rötlichorange

mäßiges Wachstum; stumpfes Rötlichpurpur

keines oder spärlich; weiß

stumpfes Rötlichpurpur

kein Wachstum

mäßiges Wachstum;, gold oder ölivgrün„

keines

gold- oder ol ivfarben

spärliches Wachstum; stumpfes Gelb

keines keines

CO OJ O OO CJl CD

	4.	;	OO	Stärke-Mineral salze-	G.VM	TABELLE 3 (Fortsetzung)	Variante Nr. S-26	Variante Nr. S-7	I cn	Variante Nr. Y-29	183
		ο; co	Agar (ISP Nr.4)			spärliches Wachstum	spärliches Wachstum	i47A	;spärliches Wachstum;
		co 5.		AM	Stamm E864-61 Nr. S-2		hell gelblich-braun	farblos
	CO cn			spärliches Wachstum		keines oder spär	keines
i	/-^ ■		D			lich; weiß
	*—^ I co					blaß purpurfarben-	keines
		GIucose-Asparagin-	G. VM			rosa
	Agar (ISP Nr. 5)			spärliches Wachstum	spärliches Wachstum;	geringes Wachstum;
		AM			orangenfarben	weißlich
		D	spärliches Wachstum	spärlich; weiß	keines	keines	I
	Pepton-Hefeextrakt-	G.VM		keines	keines	keines
	Eisenagar			geringes Wachstum;	gehemmtes Wachstum;	geringes Wachstum;	I
	(ISP Nr. 6)	AM		farblos	farblos	weißlich
		D	geringes Wachstum	keines	keines	keines
				keines	keines	keines
		keines
	stumpfes Rötlich
	purpur

OO CaJ CD OO

TABELLE 3 (Fortsetzung)

Stamm E864-61 Nr. S-2 Variante Nr. S-26 Variante Nr. S-7 Variante Nr. Y-29

7. Tyrosinagar (ISP Nr. 7)

co 8. Glucose-Ammonium-⁰⁰ salze-Agar

9c Bennett's Agar

G. VM gehemmtes Wachstum; olivgrün

AM reichlich; blaßes Bläulich-grün

D keines

G. VM geringes Wachstum; hellgelb!iches Braun bis hell rötliches Braun

geringes Wachstum; blaßgelbliches Rosa

spärlich; weiß keines

spärliches Wachstum; hellbraun

geringes Wachstum; geringes Wachstum;

hellgelbliches goldfarben
Braun

spärlich; blaßgelb keines

stumpfes Rötlichpurpur

keines

spärliches Wachstum;spärliches Wachstum; hellgelb!iches goldenes bis gelb-Braun 1iches Braun

AM	spärlich; weiß	spärlich; weiß	keines	keines
■D	keines	keines	dunkel rötlich	keines
			purpur
G. VM	mäßiges Wachstum;	geringes Wachstum;	mäßiges Wachstum;	geringes Wachstum;
	dunkelgrün	farblos	dunkelorange	weißlich
AM	reichlich; helles	spärlich; weiß und	keines	keines
	Graugrün	helles Graugrün
D	olivfarben	keines	Graurosa	keines

OO CJ O QQ

cn

OD

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Physiologische Kennzeichen

Der Stamm E864-61 ist ein aerober und mesophiler Actinomycet. Die optimale Wachstumstemperatur für den Stamm liegt im Bereich von 32⁰C bis 42⁰C₅ und ein mäßiges Wachstum wird bei 2O⁰C und 48⁰C erzielt. Bei 55⁰C wird kein Wachstum festgestellt. Die physiologischen Reaktionen und Kohlehydratverwertungen des originalen Stamms und der Variantenstä'mme sind in den Tabellen 4 bzw. 5 dargestellt.

TABELLE 4 Physiologische Reaktionen

Test

Ansprechen

S-2 S-26

Y-29

Methode und Medium

Nitrit aus Nitrat in anorganischem Medium

Nitrit aus Nitrat in organischem Medium

Natriumchloridverträgli chkeit

Mäßiges Wachstum bei 4 % NaCl oder einer geringeren Konzentration; kein Wachstum bei 5 % NaCl

Czapek's Sucrose-Ni tratbrühe

0,5 % Hefeextrakt, 1,0 % Glucose, 0,5 % KNO₃, 0,1 % CaCO₃

Basalmedium: 1 % Hefeextrakt, 2 % lösliche Stärke, 1,5 % Agar

Kaseinhydrolyse in Agarmedium

Reaktionen in entrahmter Milchlösung

Koagulation: Peptonisie rung:

Gelatineverflüssigung

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Lüdemann ¹S Agarmedium

1,0 % Malzextrakt, 0,4 % Hefeextrakt,0,4% Glucose, 16% Gelatine'

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TABELLE 4 (Fortsetzung)

■ Test

Ansprechen

S-2 S-26 Y-29

Methode und Medium

HpS-Produktion aus L-Cystein

Hydrolyse von Tyrosin

Bildung von Melanoid

Katalase

Oxi dase

Einfluß der Temperatur Maximales Wachstum
bei 32 bis 42⁰C.
Mäßiges Wachstum
bei 2O⁰C und 48⁰C.
Kein Wachstum bei
55⁰C.

L-Cystein (0,1 %) ' zu Trypton -Hefeextraktbrühe (ISP : Nr. 1 Medi um) pi us Agar zugesetzt.HgS mit einem Papierstreifen nachgewiesen, der eine 10%-. ige wäßrige Bl ei acetatlösung enthält.

L-Asparaginin wird aus dem Tyrosinagar weggelassen.

Tyrosinagar und

Peptone-Hefe-Eisen-

Agar

Übernacht-Wachstum auf Nähragar. Wasserstof f-peroxydlösung.

Übernacht-Wachstum! auf Nähragar. Kovac ' s Reagens. ;

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar.

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TABELLE 5

Kohlehydratverwertung des Stamms E864--61

	Original- stamm	Variante Nr.
	Nr. S-2	S-26 S-7 Y-29
1.	Glycerin +	+ + +
2.	D(-)-Arabinose +	+ + +
3.	L(+)-Arabinose +	+ + +
4.	D-Xylose +	+ + +
5.	D-Ribose +	+ + +
6.	L-Rhamnose +	+ - +
7.	D-Glucose + (positive Kontrolle)	+ + +
8.	D-Galactose +	+ + +
9.	D-Fructose +	+ + +
10.	D-Mannose +	+ + +
11.	L(-)-Sorbose	_
12.	Sucrose	_
13.	Lactose +	+ +
14.	Cellobiose +	+ + +
15.	Melibiose +	+ + +
16.	Trehalose +	+ + +
17.	Raffinose	- -
18.	D(+)-Melezitose	_
19.	lösliche Stärke +	+ + +
20.	Dulcit	- -
21.	Inosit	+ +
22.	D-Mannit +	+ + +
23.	D-Sorbit	_
24.	Salicin +	-
25.	Cellulose	_ _ _

Basalmedien: Luedemann Basalmedium ungen: 37⁰C, 2

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Kulturbedingungen: 37⁰C, 2 Wochen

I M/19 183 - 19 - Οβ^ΠΡζβ

i SY-1547A 283.0855

; Taxonomie

Die morphologischen Charakteristiken und Zellwandzusammensetzung ' des Stamms E864-61 zeigen an, daß der Organismus in der Familie ■· Mi cromonosporaceae Krasilnikov 1938, beschrieben in Bergey's

Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1975_S klassi-, fiziert werden sollte. Im Vergleich mit den Genera von Micro-

monosporaceae, unterscheidet sich der Stamm E864-61 vom Genus j Micromonospora hinsichtlich seiner Bildung von Luftmycel und ! hinsichtlich seiner Zeilwandzusammensetzung des Typs IV, ob- ! gleich Rhamnose anstelle von Arabinose vorliegt. Er unterschei-I det sich auch von den Genera Thermoactinomyces, Actinobifida, ; Thermomonospora, Microbispora und Microtetraspora hinsichtlich j der Sporenmorphologie und des Zellwandtyps (Typ III bei diesen J Genera). Der Stamm E864-61 ist hinsichtlich des Zellwandtyps, ! der Sporenmorphologie und der Art der Sporulierung dem Genus j Micropolyspora am nächsten verwandt. Unter dem Genus

Micropolyspora sind acht Spezien beschrieben, und unter diesen Γ Spezien wird hinsichtlich der Anzahl an Sporen in einer Kette :

eine beträchtliche Unterschiedlichkeit beobachtet. Es wird be-'; " richtet, daß Micropolyspora caesia 1 bis 5 Sporen und daß

drei Spezien 5 bis 20 Sporen in einer Kette aufweisen. Der ι Stamm E864-61 ist dem Micropolyspora caesia Kalakoutskii 1964 ' insofern ähnTich, als er überwiegend einzelne Sporen und ge-( legentlich Ketten von 2 bis 8 Sporen bildet. Darüber hinaus ähnelt der Stamm dem M. caesia hinsichtlich der Farbe seines LuftmyceTs, des Bereichs der Wachstumstemperatur und des Zeilwandtyps, obgleich er sich vom letzteren hinsichtlich der

Produktion von zwei Arten diffundierbarer Pigmente unterschei— ' det. Somit wird der Stamm E864-61 als eine neue chromogene ' Subspezies von Micropolyspora caesia betrachtet.

Da der Stamm E864-61 auf natürliche oder künstliche Weise leich mutiert werden kann,, soll die vorliegende Erfindung nicht auf den OrginaTstamm S-2 oder die Varianten S-26, S-7 oder Y-29

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beschränkt sein. Insbesondere sollen alle natürlichen und künstlichen Mutanten und Varianten umfaßt werden, die Bu-2313 produzieren und aus den beschriebenen Organismen beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstoff-Senfgasen, durch Behandlung mit Phagen, und dergleichen,erhalten werden können. Wie bei anderen Antibiotika ist zu erwarten, daß man eine gesteigerte Produktion von Bu-2313 erhalten kann, indem man nach einer einzelnen Kolonieselektion durch Behandlung mit verschiedenen Mutagenen oder durch die genetischen Arbeitsweisen der Rekombination, Transformation oder Transduktion, sehr produktive Stämme selektiert.

Herstellung des Antibiotikums

Der antibiotisehe Komplex Bu-2313 wird produziert, indem man einen Stamm von Micropolyspora caesia E864-61 (vorzugsweise ATCC 31295, 31296, 31297 oder 31298) unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert. Die allgemeinen Arbei tsweisei zur Kultivierung anderer Actinomyceten sind für die Kultivierung von Micropolyspora caesia E864-61 anwendbar. Das Nährmedium sollte ein oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen enthalten, beispielsweise Glycerin, Glucose, Fructose, Mannose, Stärke, Dextrin, Maltose, Molasse, öle, Fette und dergleichen, entweder in gereinigtem Zustand oder in roher Form. Das Nährmedium sollte auch ein oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen enthalten, beispielsweise Sojabohnenmehl, Fischmehl, Malzextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Distiller's Solubles (Brennereischlempe), Glutenmehl, Maismaischflüssigkeit, Baumwol1samenmehl , Kasein, hydrolysierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff, und dergleichen. Man kann zum Medium auch anorganische Nährsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Caiciumcarbonat und Spuren an Schwermetall salzen, wie Kupfer, Zink,

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Mangan·, Eisen₉ und dergleichen, zusetzen. In der belüfteten, submersen Kultur kann man ein Antischaummittel verwenden, beispielsweise flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl, Fett oder Silikon.

Die Fermentationstemperatur sollte vorzugsweise im Bereich von ungefähr 2O⁰C bis ungefähr 48⁰C liegen. Der bevorzugteste Bereich liegt zwischen 32⁰C und 42⁰C. Der pH des Fermentationsmediums sollte im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 10 liegen. Der bevorzugte Bereich liegt bei ungefähr 6 bis ungefähr 8. üblicherweise erhält man eine optimale Produktion im Verlauf von 3 bis 7 Tagen. Wenn eine Tankfermentation ausgeführt werden soll, ist es wünschenswert, ein vegetative Inokulum in einer Nährbrühe zu produzieren, in dem man die Kulturbrühe mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder einer lyophi1isierten Kultur des Organismus inokuliert. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, wird es aseptisch in das Fermentationstankmedium überführt. Die antibiotische Aktivität in der Fermentationsbrühe kann durch einen Papierscheiben-Agar- ■ plattenglobaltest unter Verwendung von Bacteroides fragilis ! als Testorganismus, der auf GAM (Gifu anaerobes Medium, Nissui) gezüchtet ist, unter anaeroben Bedingungen bestimmt werden. Nachdem die optimale Brühenwirksamkeit erzielt wurde, filtriert j man die Brühe, vorzugsweise unter Verwendung von Filterhilfe. Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen und vereinigtes Fi 1 trait und Waschflüssigkeiten werden auf einen pH von ungefähr 8 eingestellt und durch eine Säule mit einem nicht-ionischen makrovernetzten (macroreticular) , (makroporösen) polymeren Harz, wie Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries) oder Amberlite XAD-2 (Rohm und Haas Co.) durchgegeben. Man wäscht die das Harz enthaltende Säule mit Wasser und wäßrigem Methanol (bei- , spielsweise 40 %-igem Methanol) und eluiert dann mit ungefähr 95 %-igem wäßrigem Methanol. Man vereinigt die aktiven Fraktionen, konzentriert im Vakuum und dampft ein' oder lyophi 1 isierü, um den rohen Bu-2313-Komplex zu erhalten. Der so erhaltene !

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rohe Feststoff kann in seine Komponenten Bu-2313A und Bu-2313B durch Chromatographie auf makrovernetztem Harz wie oben angegeben und/oder durch Chromatographie über Silikagel aufgetrennt werden.

Bei der Fermentierung einiger Stämme von Micropolyspora caesia E864-61 wurde festgestellt, daß der Zusatz von Glycin zum Fer-. mentationsmedium (beispielsweise 1 %) die Produktion von Bu-2313A unterdrückt und Bu-2313B als Hauptprodukt ergibt.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von Bu-2313A und Bu-2313B

BU-2313A und Bu-2313B sind beides saure Substanzen, die als j blaßgelbe Kristalle isoliert werden. Sie sind in den meisten ! organischen Lösungsmitteln, wie niedrigen Alkoholen, Äthylacetat, , Chloroform und Benzol, leicht löslich, in Hexan und alkalischem Wasser etwas löslich, in Wasser jedoch praktisch unlöslich. ' In saurer Lösung sind sie stabil, weniger so in alkalischer ; Lösung, wobei sie inaktiviert werden, wenn man sie bei Raumtemperatur über Nacht in einer N/10 NaOH-Lösung hält. Beide Komponenten ergeben mit Eisen-III-Chlorid eine positive Reaktion, die Reaktion mit Ninhydrin, Anthron, Sakaguchi- und Tollen's Reagens ist jedoch negativ. Bu-2313A und Bu-2313B können durch zwei TLC-Systeme unterschieden werden, wie dies nachstehend angegeben ist:

Komponente	System	1*	Rf	System	2**
	0,31 0,05			0,39 0s30
BU-2313A BU-2313B

Silikagel, Chloroform - Methanol (100:3) Silikagel, Benzol - Methanol (4:1)

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M/19 183
SY-1547A

BU-2313A schmilzt bei 116 bis 118⁰C und ist optisch aktiv: [öQd⁶ = "⁵⁸° (c = 0,5; MeOH). Es zeigt einen pKa' von 5,2 in 50 %-iger wäßriger Äthanol 1ösung mit einem Titrationsäquivalent von 519. Sein Massenspektrum ergibt einen Molekülionenpeak bei m/e 517. Bu-2313B schmilzt bei 160 bis 162⁰C und ist optisch aktiv: [>Üq^{5 =} -6.9,9° (c = 0,3; MeOH) und -34,9° (c = 0,93; CHCl₃). Es zeigt pKa^! von 4,9 in 46 %-iger wäßriger Äthanol 1ösung mit einem Titrationsäquivalent von 509. Es ergibt im Massenspektrum einen Molekülionenpeak bei m/e

Die Ultraviolettspektren von Bu-2313A und Bu-2313B in verschiedenen Lösungsmitteln sind in den Figuren 1 bzw. 2 dargestellt. Die Absorptionsmaxima sind nachstehend aufgeführt:

Lösungsmittel

Äthanol

N/10 NaOH-5 % Äthanol pH 7,0 Phosphatpuffer N/10 HCl-5 % Äthanol

BU-2313A:

_max

in

235(330), 288(290), 344(535), 355(555)

257(400), 293(415), 337(520)

261(418), 291(430), 339(482)

241(31O)₅ 361(69O)₅ 373(670)

Lösungsmittel

Äthanol

N/10 NaOH-5 % Äthanol pH 7,0 Phosphatpuffer N/10 HCl-5 % Äthanol

BU-2313B:

239(22O)₅ 295(260), 352(730), 368(610);

248(328), 295(415), 332(600)

251(335), 294(454), 332(580)

241(210), 259(656), 370(665)

Die Infrarotspektren von Bu-2313A und Bu-2313B (in KBr-Pellets) sind in den Figuren 3 bzw. 4 dargestellt. Sie sind hinsichtlich , der charakteristischen Absorptionsbanden, die bei 1730, 1660, I

1630, 1580 und 1210 cm

beobachtet werden, einander sehr ähnlich. In der Komponente A ist eine scharfe Bande bei 1500 cm

809 885/0849

^{M/19 183} - ²⁴ "

SY-1547A

vorhanden, hingegen zeigt die Komponente B die charakteristi- ! sehen N-H Absorptionen bei 3200 bis 3400 cm , die in der

Komponente A fehlen. Die NMR-Spektren der Protonen von Bu-2313A und BU-2313B (in CDCl₃) sind in den Figuren 5 bzw. 6 dargestellt. Diese zeigen die Anwesenheit von fünf C-Methylgruppen, [ einer Methyl estergruppe und eines trans-Diensä'ure-chromophors an. Das NMR-Spektrum der Komponente A zeigt bei (f 3,03 ppm ein

N-Methylsignal, das in der Komponente B fehlt. Der Molekülionen- ! peak wurde durch Massenspektroskopie für Bu-2313A zu m/e ! und BU-2313B zu m/e 503 beobachtet. In den Massenspektren sind Hauptfragmentionenpeaks bei m/e 221 (Basispeak für die Komponente B), m/e 235 (Basispeak für die Komponente A) und m/e (intensiver Peak bei beiden Komponenten A und B) zu sehen. i

\ BU-2313A und Bu-2313B sind saure Substanzen. Sie und ihre Mi- ; schung bilden mit Basen Salze. Der hier verwendete Begriff "nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Salz" umfaßt deren Salze mit metallischen Kationen, beispielsweise mit Alkalimetall- oder Erdalkaiimetallkationen, wie Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium.

Biologische Eigenschaften von Bu-2313A und Bu-2313B Antibakterielles Spektrum

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von Bu-2313A und BU-2313B wurden durch die zweimalige Agarreihenverdünnungsmethode unter Verwendung einer MuIti-Inokulierungsvorrichtung gegen verschiedene aerobe und anaerobe Bakterien bestimmt. Im allgemeinen wurde für aerobe Bakterien Nähragarmedium (Eiken), für heikle aerobe Organismen, wie Streptokokken, Neisseria und Hemophilus species, Gonococcus (GC) Medium (Eiken) und für anaerobe Bakterien GAM-Agarmedium (Nissui) verwendet.

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SY-1547A Awowwww

Die in· vitro-Aktivitäten von Bu-2313A und Bu-2313B gegen verschiedene aerobe und anaerobe Organismen sind in den Tabellen 6 bzw. 7 dargestellt. Dort sind auch die Daten für das Tirandamycin und das Clindamycin aufgeführt, die als Vergleichs verbindungen verwendet wurden. Bu-2313A und Bu~2313B inhibieren das Wachstum verschiedener anaerober Bakterien bei niedrigen Konzentrationen, besitzen jedoch nur mäßige bis schwache Aktivität gegen viele der üblichen aeroben Organismen, wie S.aureus, E.coli und K.pneumoniae. Jedoch erwiesen sich Stämme von Bacillus species, Streptokokken, Neisseria memingitidis, N.gonorrhoeae und Hemophilus influenzae gegenüber Bu-2313A und Bu-23136 als empfindlich. Im allgemeinen sind die Aktivität und das antibakterielle Spektrum von Bu-2313A und Bu-2313B dem des Tirandamycins sehr ähnlich. Die in vitro-Eigenaktivitat von BU-2313B scheint etwas höher als die von Bu-2313A zu sein.

Einfluß der Inokulumgröße

Der Einfluß der Inokulumgröße auf die MIC wurde bei zwei anaeroben Organismen untersucht (B. fragilis und C. perfringens), wobei man GAM-Brühe und Agarmedien verwendete. Wie in Tabelle dargestellt, sind die MIC-Werte von Bu-2313A und Bu-2313B bei Untersuchung mit der Brühenverdünnungsmethode stark von der Inokulumgröße beeinflußt.

Bakterizide Aktivität

Das bakterizide Wirkungsvermögen von Bu-2313A und Bu-2313B wurde bei zwei anaeroben und einem aeroben Organismus untersucht. Zählungen lebensfähiger Zellen wurden durchgeführt, indem man nach der MIC-Bestimmung einen 0,1 ml aliquoten Brühenanteil aus jedem trübungsfreien Röhrchen plattierte. Man ver-

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M/19 183 - 26 -

j SY-1547A

wendete bei der Zählung von Lebendzellen von B. fragilis und C. perfringens GAM-Agarplatten und setzte bei S.pyogenes einen Nähragar ein, der 5 % Pferdeserum enthielt. Die Platten wurden 18 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Es wurde festgelegt, daß eine Antibiotikumkonzentration₃ die ein Wachstum von weniger als 100 Kolonien pro Platte ermöglichtes als bakterizid aufzufassen ist (ursprüngliche Inokulumgröße: 10 bis 10 Zellen/ml). Wie in Tabelle 9 dargestellt, erscheint die antibakterielle Wirkung von BU-2313A und Bu-2313B eher bakteriostatisch als bakterizid.

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TABELLE 6

In vitro-Aktivität gegen aerobe Bakterien

	Kode No.
	Ec-3
	Ec-8
	Kp-2 .
co ca	Sm-I
CD CXJ	Pa-13
OO cn	Pm-I
O	Pg-I
OO
to	Sa-I
	Sa-2
	Sa-B
	Sl-I
	Mf-I

Testorganisrous

Eacherichia coil Juhl A15119 Escherichia coli K-12 Λ9632 Klebsiella pneurconiae A967B Serratia marcescena A20019

Pscudomonas acruginosa Λ9843 Proteu3 mirabilie A9554 Proteus morganii A9553

Staphylococcus aiireua 209P Staphylococcus aereus Smith Staphylococcus aureua 152-34 Sarcina lutea PCI-IOOl Micrococcu3 flavus

Test-	BU-2313A	DU-2313B	MIC (nq/ml }	Clindamycin	ro OO
medium*	>100	>100	Tirandamycin	12.5	CD OO cn
A .	>100	>100	>100	25
A	MOO	>100	>100	100
A	>100	>100	>100	50
A	>100	>100	>100	>100
A	>100	' >100	>100	100
A	>100	>100	>100	100 e
A	25	25	>100	0.1
A	12.5 ·	12.5	100	0.1
A	12.5	12.5	>100	0.1
A	25	12.5	50	0.025
A	6.3	25	50	0.0125
A			25

Kode No.

Testorgani smus

Bacillus cereua ATCC 10702 A Bacillus subtilis PCI-219

Streptococcus pyogenea A9604 Streptococcus pyogeneg A20201 Streptococcus viridans Λ21354 Diplococcus pneuinoniae A9585

Neisseria mcningitidia Λ20049 NeJ3seria meningitidia A2.1496 Neisseria gonorrhoeae Λ15112 Neisseria gonorrhoeae A20154 llemophilua influenzae A9832 Hemophilus influenzae Λ2018 8

IAtStLLt 0	^ Γ U Γ 03	.8	a /	BU-2313B	.8	Mic (. Mg/ml )	Clindamycin	4	M/19 1 SY-154
Teat ~		.6		0	.6	Tirandamycin	0.	8	^JOo
medium*	BU-2313A	.8	1	= 4	0.4	0.	0125	3» Co
A	0	.8	0	.4	3.1	0.	0125
A	1	.8	0	4	0.8	0.	025
B	0	.8	0	4	0.8	0.	0125
B	0	6 1	0, ι	8 6	0.4	0,	05 025 '
B	0	6	0. 1.	8	0.4	0. 0.	2
B	0	8	0.	8	0.8 0.8	0.	2	I ro oo
B B	1. 3.	β	0.	4	0.4	0.	4
B	1.	6	0,	8	0.4	0.	8
B	0.	0.	0.4	0.
B	0.	0.8
B	Io

^A » Nä'hragar (E"iken) B j GC Medium (Eiken)

CO CD OO

TABELLE 7

In vi tro-Akti vitä't gegen anaerobe Bakterien

"~J OO

Kode No.

Bf-I Bf-3 Bf-4 Bf-6 Bf-7 Bf-IO "

Testorganis'mus

σ co co co

Fo-I Fv-I

Ae-I Vp-I

Cb-I

Bacteroides fragilia A20926 Bacteroidea fragilia A20928-1 Bacteroidea fragilia A20929 Bacteroidea fragilis A20930 Bacteroidea fragilia A20932 Bacteroides fragilia A20935 Sphaerophorus necrophorua A15202 Sphaerophorua paeudonecrophorua A20013 Fusobacterium mortiferum ATCC 9817 Fusobacterium varium ATCC 8501

Acidoaminococcus fermentana ATCC 25085 Veillonella parvula ATCC 1774

Clostridium acetobutylicum IAM 19011

BU-2313A

0.2 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
. 0.1

0.2
0.2

0.4

BU-25X3B

0.1 0.1

oa

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

0.1 0.1

0.2

Tirandamycin

0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0,1

0.1 0.1

0.2

Clindamycin

0.05

0.05

0.05

0.05 '

0.05

0.025

0.025

0.05

0.05

0.05

COS 0.05

O₀I

OO CJ CD OO

cn

CD

	Hbde No.
	Cc-I
	Ch-I
	Cp-I *
	Cp-2 '
OO
O	Pp-I
co
OO	Pe-IOl
OO
cn	Pb-I
O
co

Testorganismus

Clostridium caproicum IAM 19228 Clostridium chavoei A9561 Clostridium perfringens A9635 Clostridium pcrfringens A2.1204

Peptocuccus prevotii ATCC 9321 Peptococcus aerogenea ATCC 14 Pcptostreptococcus anaerobiu3 B43

"tsetzung)	BU-2313B	Tirandamycln	Clindamycin	co I	I t
	0.2	0.2	O.I	cn	UD
DU-2313A	0.2	0.2	0.025	S	OO OJ
0.4	0.2 I	0.1	0.025
0.2	0.2	0.1	0.025
0.4	0.1	0.2	0.1
0.4	0.2	0.1	0.2
0.2	' .0.4	0.2	0.8
0.2
0.4				,
				OO O

lsi

OO

GJ Q CO

cn

CD

-M/19- 183 SY-1547A

- 31 -

	fragilis	TABELLE	' Inokul	8	0,05	in GAM-Agar	- Clinda mycin
	A20928-1	Einfluß der		umgröße	O5I	Tiranda my ei η	0,025 :
	perfringens	Inokulum	MIC (μg/mV)	0,1	0,2	0,025
	A9635	größe ZeIlen/ml	BU-2313A BU-2313B	0,1	0,2	0,0125
B.	1,2 χ 106	0,1		0,8	0,0125 .
	1,2 χ 107	0,1		0,8
C.	7 χ 105	0,1
	7 χ 106	0,1

	fragilis	Inokul	ΙΟ6	Bu-2	MI	313A	C (jug/ml )	!313B	in GAM-Brühe	- Clinda mycin
	A2O928-1	I um-	107	0,	006	Bu-2	,013	Ti randa- mycin	0,025
B.	perfringens	größe ZeI1en/ml	10 5	0,	8	o;	,4	0,006	0,05
	A9635	2,8 χ	10b	0,	1	o:	,1	0,2	0,025 ;
C.	2,8 χ		100		0:		0,1	12 ,5
	1,2 χ	25	12,5
	1,2 χ

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: Μ/19 183
ί SY-1547A

CTi UJ

CQ

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CU

OQ

	•r—	CJ	Cl
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CO		CM
S-	CJ	°
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	CQ	CJ
	OO	CQ
CJ	t—t	σ:
CQ	OO
σ:	CM
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	CJ
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I	ο
	ι—ι
CQ	σ:

VD O O

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CM

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CM

CM

CM

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CM

B r—	LO	Ln	Ln
E E	ο	ο	ο
3 \	r-ί	f—t
ι— CZ
3 CU CU	X	χ	χ
^i CQi—
ο :ο r— C S- CU	co	CVl	LO
ι—( Ο5Μ	CM	«—I

	ΐ—I	φ	Ln	Ol	ΐ-Η
(Λ	I	σ>	OO	CU	O
•r—	co	C	LO	c	CM
ι—	CM	•Γ-	CT)	CU	ο
•Γ—	σι		<:	cn	CM
CT)	ο	H-		ο
rO	CM	S.	>)
S.	<	CU	Q.
ί<-	Q.

CJ

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I M/19 183 j SY-1547A

Blutspiegel bei Mäusen

Nach subkutaner oder oraler Verabreichung von Bu-2313B (Natriumsalz), Clindamycin und Flagyl in abgestuften Dosishöhen (100, 50, 25 und 12,5 mg/kg) wurden die Blutspiegel bei Mäusen bestimmt. Die Blutproben wurden aus dem Orbitalsinus gesammelt und durch Papierscheiben-Agarplattenmethode unter Verwendung von B. fragilis A20926 als Testorganismus untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt. Die mit Bu-2313B erhaltenen Blutspiegel-Spitzenwerte sind angenähert 3 bis 4mal höher als die von Clindamycin und zwar sowohl bei parenteraler wie auch oraler Verabreichung, wogegen Flagyl bessere Absorptionen als BU-2313B aufwies.

TABELLE 10 Blutspiegel bei Mäusen Subkutane Verabreichung

	Dos	is	Bl	utspiegel (μ	g/ml)	2 Std. ;
Antibiotikum	100	mg/ kg	15 Min	30 Min.	1 Std.	29
BU-2313B	50		28	34	38	9,3
	25		25	27	20	0,9
	12,	5	12	10	4,6
	100		4,4	1,7	0,4	0,4
Clindamycin	• 50		11	9,5	5,2	0,3 ;
	25		7,0	5,8	3,4	0,4
	12,	5	3,8	2,1	0,8	0,3
		1,9	1,2	0,5

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M/19 183 SY-1547A

TABELLE 10 (Fortsetzung)

	Dos	is	15 Min.	Blutspiegel	(/ig/ml )	2 Std.
Antibiotikum	100	mg/kg	98	30 Min.	1 Std.	40
Flagyl	50		32	121	98	12
	25		16	32	26	8,3 "
	12,	5	6,7	15	12	_
			3,8	3,0

Orale Verabreichung Blutspiegel (pg/inl )

Antibiotikum	Dos	is	30 Min.	1 Std.	3 Std.	5 Std.	13	-
■ BU-2313B	100	mg/ kg	12	5,5	0,4	0,3	-
i	50		3,0	0,7	0,2	0,1
	25		0,4	0,2	0,1	-
	12,	5	0,3	0,2	0,1	-
, Clindamycin	100		2,8	1,3	0,6	-
t	50		0,9	0,5	0,3	-
	25		0,8	0,5	0,3	-
ι	12,	5	0,6	0,4	0,3	-
. Flagyl	100		56	41	24
	50		20	15	11
	25		8,8	6,7	6,1
	12,	5	6,0	6,0	3,0

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SY-1547A "^Λϋ03°

In vivo-Aktivität

i "■ "

• Die Wirksamkeit von Bu-2313A und B.U-2313.B in vivo wurde bei

■ Mäusen untersucht, die mit B. fragilis A20926 (lokal), C.perfrin-

j gens A9635 und S.pyogenes A20201 (systemisch) infiziert worden

: waren. _;

Durch subkutane Injektion in den dorsalen Nacken von Mäusen ^] wurde eine lokalisierte Infektion mit B.fragilis hervorgerufen, . wobei 0,5 ml der Bakteriensuspension, die 2 bis 5 χ 10 Zellen plus 10 ml mikrokristalline Cellulose enthielt, verwendet wurde.; Die Behandlung wurde subkutan oder oral einmal täglich während 5 Tagen durchgeführt, wobei 30 Minuten nach dem Bakterieninsult begonnen wurde. Für jede Dosismenge wurde eine Gruppe von fünf Mäusen verwendet. Die Tiere wurden am sechsten Tag seziert,: um die Größe des subkutanen Abszesses zu messen. Das Ansprechen bei jedem Tier wurde mit 0 bis 5 bewertet, je nach der Größe der Läsion, und die Summe der Läsionsbewertungen wurde durch die Anzahl Mäuse, die einer Gruppe eingesetzt wurden, dividiert. Hierdurch erhielt man für jede Behandlung und für die Kontroll- ' gruppe die mittlere Bewertung. Indem man die mittlere Bewertung der Kontrollgruppe als 100 %-ige Infektionsgröße nahm, wurde die relative Injektionsgröße für jede der behandelten Gruppen '. berechnet. Mit Hilfe eines Log-Probit-Plots wurde ein PD__Q ermittelt . Di e mi t BU-2313B erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammen mit den Ergebnissen bei Clindamycin und Flagyl , dargestellt. Bei diesem Infektionsmodell erweist sich das ■ Clindamycin wirksamer als Bu-2313B oder Flagyl.

Eine systemische Infektion mit C. perfringens oder S. pyogenes wird bei Mäusen hervorgerufen, indem man mit einer lethalen \ Dosis des Pathogens in einer 5 %-igen Suspension in Schweine- ; magenmucin (American Laboratories) intraperitoneal versetzt. \ Man verabreicht das Antibiotikum subkutan oder oral unmittelbar j vor dem Bakterieninsult. Nach 5 Tagen wird die PD-q bestimmt.

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SY-1547A

i Wie in Tabelle 12 dargestellt, ergibt das Bu-2313B gegen diese systemischen Infektionen bei subkutaner und oraler Verabreichung einen recht guten Schutz, wogegen das Bu-2313A bei oraler Verab-

j reichung inaktiv ist. Bei diesen in vivo-Tests erweist sich

^; das Clindamycin als wirksamstes Mittel.

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M/19 183
SY-1547A

•TABELLE-

Lokalisierte Infektion mit B.fragilis

Subkutane Behänd!unq

Dosis
Antibiotikum (ir.g/kg)

,, , Infek-

individuelle Summe der mittlere ti ons-

Bewertung Bewertung Bewertung größe (%)

se PD

BU-2313B
Na-SaIz

Clindamycin

Flagyl

Kontroll e

50 χ 5 0, 2, 3,3,3

12.5 χ 5 2, 3, 3, 3, 3

3.1 χ 5 3, 3_f 3, 4, 4

0.8 χ 5 4, 4, 4, 4, 4

50 χ 5 0, 0, 1, 1., 2

12.5 χ 5 1,1, 1, 2, 2

3.1 χ 5 2, 2, 2, 2, 2

0.8 χ 5 4, 4, 4, 4, 4

50 χ 5 2, 2, 2, 2, 2

12.5 χ 5 2, 2, 2, 3, 3

3.1 x 5 3, 3, 3, 4, 4

0.8' χ 5 4,4, 4, 4, 4

4, 4, 4, 4, 5 2.2

2.8 3.4

4.0

52.4 66.7 81.0 95.2

60 mg/kg

4	0	.B	19.	0	2.8 mg/kg
7	1	.4	33.	3
10	2	,0'	47.	6
20	4	.0	95.	2
10	2	.0	47.	6	35 mg/kg
12	2	.4-	57.	1
17	3	.4	81.	O
20	4	.0	95.	2

4.2

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M/19 183
SY-1547A

TABELLE 11 (Fortsetzung)

QraJe Behandlung

. Tnfal·»

^Dosis - individuelle Summe der mittlere ti ons-Antibiotikum (mg/kg) Bewertung Bewertung Bewertung größe (%}

po

PD

BU-2313B
Na-SaIz

Clindamycin

Flagyl

Kontrolle

50

100 x 5 2, 2, 2, 3, 3 12

25 χ 5 3, 3, 3, 3, 3 15

6.3 χ 5 3, 3, 3, 4, 4 17

1.6 χ 5 4, 4, 4, 4, 4 20

57.1 71.4 81.0 95.2

100 χ 5 0, 0, 0, 1, 1

25 χ 5 1, 2, 2, 2, 2

6.3 χ 5 2, 2, 3, 3, 3

1.6 χ 5 4, 4, 4, 4, 4

100 χ 5 0,1, 2, 2_} 3

25 χ 5 2, 2, 3, 3, 3

6.3 χ 5 3, 3, 3, 4, 4

1.6 x"5 4, 4, 4, 4, 4

4, 4, 4, 4, 5 21 4.2 100

2	0.4	9.	5
9	1.8	42.	9
13	2.6	61.	9
20	4.0	35.	2
8	1.6	38.	1
13	2.6	61.	9
17	3.4	81.	0
20	4.0	95.	2

ca 220 mg/kg

11 mg/kg

50 mg/kg

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I M/1-9 183 ! SY-1547A

TABELLE 12

Systemische Infektion mit C.perfringens
und S. pyogenes

	-2 313A	C	PD	po	50 (mg/kg)	pyogenes
	-2313B		. ρerfringen	NA bei	s S.	££
	randamycin	6	C	30	SC	NA bei 2 5
Bu	indamycin	6	S25	60	50 7,6	25
Bu	agyl	17	,25	0,22	9	50
Ti		O		60	9,7	2,1
Cl		31	,08	keine	0,3	NT
Fl				nicht	NT
		NA:	Wirksamkeit
		NT:	untersucht

Akute Toxizitä't

Die akuten LD_cri-Werte von Bu-2313A und B wurden subkutan,
bU

intraperitoneal und oral bestimmt. Sowohl die freie Säure
wie auch die Natriumsalze des Bu-2313 wurden untersucht. Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 13 dargestellt. Bu-2313B erwies sich als signifikant weniger toxisch als Bu-2313A, was i im Hinblick darauf_s daß zwischen den beiden Komponenten nur j ein geringer strukturell er Unterschied besteht (Anwesenheit j oder Abwesenheit einer N-Methylgruppe) von besonderem Interesse! ist. i

809885/0 849

M/19 183
SY-1547A

TABELLE 13

Akute Toxizität

BU-2313A (freie Säure) BU-2313A (Na-SaIz)

BU-2313B (freie Säure) BU-2313B (Na-SaIz)

se

LD₅₀ (mg/kg)

90	14
90	14
225	115
200	55

280

Die Erfindung betrifft somit antibiotisch wirksame Verbindungen der allgemeinen Formel:

CH

worin R für H oder CH, steht, sowie deren Mischungen, und deren !

^J I

nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Salze (vorzugsweise | die Natriumsalze). ;

809885/0849

SY-1547A ■

Bei der* mit ßu-2313A bezeichneten antibiotisehen Verbindung handelt es sich um eine saure Substanz, die in niedrigen Alkoholen, Äthylacetat, Chloroform und Benzol leicht löslich, in Hexan und alkalischem Wasser etwas löslich, in Wasser jedoch praktisch unlöslich ist. Sie ergibt mit Eisen-III-Chlorid eine positive Reaktion., jedoch negative Reaktionen mit Ninhydrin, Anthron, Sakaguchi- und Tollen's Reagentien. In gereinigter Form schmilzt die Substanz bei ungefähr 116 bis 118⁰C. Sie ist optisch aktiv und besitzt einen Q/Jn von ungefähr -58° (c = 0,5; Methanol). Sie besitzt einen pKa¹ von ungefähr 5,2 in 50 %-igem wäßrigem Äthanol mit einem Titrationsäquivalent ; von 519. Die Verbindung zeigt im Massenspektrum einen Molekülionenpeak bei m/e 517 und entspricht der Summenformel C^yH-j-NOg. Ihre ultraviolett-, infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren sind im wesentlichen wie in den Figuren 1, 3 und 5

; dargestellt. Diese Substanz kann auch in Form ihrer nicht-toxi- ! sehen, pharmazeutisch verträglichen Salze (vorzugsweise in . , ι Form des Natriumsalzes) vorliegen.

·-- Die als Bu-2313B bezeichnete antibiotische Verbindung ist

■ ebenfalls eine saure Substanz, die in niedrigen Alkoholen, Äthylacetat, Chloroform und Benzol leicht löslich, in Hexan ;

: und alkalischem Wasser etwas löslich, in Wasser jedoch praktisch unlöslich ist. Sie ergibt mit Eisen-III-Chlorid eine positive

■ Reaktion, jedoch mit Ninhydrin, Anthron, Sakaguchi- und Tollen'si Reagentien negative Reaktionen. In gereinigter Form schmilzt < sie bei ungefähr 160 bis 162⁰C. Sie ist optisch aktiv und besitzt einen G?On. ^{von un}9^e^^^nr -69,9° (c = 0,3; Methanol) und -34,9° (c = 0,93; CHCl₃). Sie besitzt einen pKa¹ von ungefähr 4,9 in 46 %-igem wäßrigem Äthanol mit einem Titrationsäquivalentj von 509. Ihr Massenspektrum zeigt einen Molekülionenpeak bei ' m/e 503. Die Substanz besitzt die Summenformel Co6^33^9" I^nre ultraviolett-, infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren entsprechen im wesentlichen den in den Figuren 2, 4 und 6 dar-

809885/0849

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gestellten Spektren. Die Substanz kann auch in Form ihrer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Salze (vorzugsweise in Form des Natriumsalzes) vorliegen.

Die Erfindung betrifft auch ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung einer Mischung der Antibiotika Bu-2313A und BU-2313B, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm von Micropolyspora caesia mit den Hinterlegungsnummern ATCC 31295, 31296, 31297 oder 31298 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert, bis eine nennenswerte oder wesentliche Menge der antibiotischen Mischung durch den Mikroorganismus im Kulturmedium produziert ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren als zusätzliche Stufe die Gewinnung der Antibiotikamischung aus dem Kulturmedium. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform verwendet man als Mikroorganismus Micropolyspora caesia ATCC 31298.

Die Erfindung betrifft auch ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Bu-2313B, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) einen Stamm von Micropolyspora caesia mit den Hinterlegungsnummern ATCC 31295₅ 31296, 31297 oder 31298 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert, bis eine nennenswerte oder wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität vom Mikroorganismus im Kulturmedium produziert ist, (b) die in Stufe (a) gebildete antibiotische Mischung aus dem Kulturmedium gewinnt und (c) das BU-2313B aus der Antibiotikummischung durch Chromatographie auf einem makrovernetzten polymeren Harz abtrennt. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform verwendet man als Mikroorganismus ι Micropolyspora caesia ATCC 31298.

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Die Erfindung betrifft auch ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Bu-2313A, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) einen Stamm von Micropolyspora caesia mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31295, 31296, 31297 oder 31298 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert, bis eine nennenswerte oder wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität vom Mikroorganismus im Kulturmedium produziert ist, (b) die in Stufe (a) produzierte Antibiotikummischung aus dem Kulturmedium gewinnt, (c) den Hauptteil an B-U-2313B aus der Antibiotikummischung durch Chromatographie auf einem makrovernetzten polymeren Harz abtrennt und (d) das BU-2313A aus dem verbliebenen Bu-2313B durch Chromatographie auf Silikagel abtrennt. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform verwendet man als Mikroorganismus Micropolyspora caesia ATCC 31298.

Zu den erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen Verbindungen gehört der Bu-2313-Komplex, seine Komponenten ßu-2313A und ! BU-2313B, sowie Salze und Mischungen dieser Substanzen. Die Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Mittel, die mindestens eine dieser antibiotisch wirksamen Substanzen in einem mit die-! sen Substanzen vertrag!ichen, pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Das Mittel kann auch andere aktive antibakterielle Mittel enthalten. Das Mittel kann in irgendeiner geeigneten pharmazeutischen Formulierung vorliegen, die für den jeweiligen Verabreichungsweg geeignet ist. Zu Beispielen für derartige Mittel gehören feste Mittel für orale Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Puder und Granulat, flüssige Mittel zur oralen Verabreichung, wie Losungen, Suspensionen,. Sirups i und Elixiere und Präparationen zur parenteralen Verabreichung_s wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen.

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Wie auch bei anderen Antibiotika hängt die Dosisvorschrift für BU-2313A oder B vom Gewichts Alter und allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und von der Art der Erkrankung ab und liegt im Ermessensspiel raum des Arztes. Im allgemeinen liegt die orale Dosis im Bereich von 50 bis 750 mg Bu-2313A oder B (oder deren Mischungen) und wird 3 bis 4-mal täglich verabreicht.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Beispiel I^

Herstellung einer Saatkultur und Schütte!kolbenfermentation in kleinem Maßstab

Man verwendet eine gut gewachsene Agar-Schrägkultür des Bu-2313-produzierenden Organismus vom Stamm E864-61, Nr. Y-29, um 100 ml flüssiges vegetatives Medium in einem 500 ml Erlenmeyerkolben zu inokulieren. Der ErIenmeyerkolben enthält die folgenden Bestandteile: 3 % Glucose, 3 % Sojabohnenmehl, 1 % Maismaischf1Ussigkeit und 0,5 % CaCOn. Der pH des Mediums wird vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt. Man inkubiert die Saatkultur 3 Tage lang bei 34⁰C auf einem Rotationsschüttler (250 Upm) und überführt 2 bis 3 ml der Kultur in einen 500 ml-ErIenmeyerkolben, der 100 ml Fermentationsmedium enthält. Dieses Fermentationsmedium besteht aus 3 % Sucrose, 3 % Leinsamenmehl, 0,3 % (NH₄)₂ SO₄, 0,003 % ZnS0₄-7H₂0 und 0,5 % CaCO₃. Nach 4 bis 7-tägigem Schütteln bei 28⁰C erreicht die Antibiotikumproduktion ihr Maximum. Der pH der Brühe steigt mit fort- ^] schreitender Fermentation langsam an und erreicht einen Wert <

von 8,1 bis 8,8, sobald eine anti biotische Wirksamkeit von i 150 ug/ml produziert sind. Man bestimmt die antibiotische Akti-,

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vität in der Fermentationsbrühe durch die Papierscheiben-Agar- : plattenmethode unter Verwendung von Bacteroides fragil is als Testorganismus, der auf GAM-Agarplatten unter anaeroben Bedingungen gezüchtet wurde.

Beispiel Tankfermentation in großem Maßstab

Man inokuliert 1500 Liter Fermentationsmedium, das 3 % Glucose, ' 3 % Sojabohnenmehl, 1 % Maismaischflüssigkeit und 0,5 % CaCOo enthält, in einem 2500 Liter-Tank mit einer Saatkultur (110 Liter), die aus einer wohl gewachsenen Agar-Schrägkultür des Stamms E864-61 Nr. Y-29 hergestellt wurde. Man führt die Fermentation unter Rühren bei 200 Upm und einer Belüftungsrate von 1000 Liter/ Minute bei 31⁰C durch. Nach 72 Stunden erreicht der pH der '. Fermentationsbrühe einen Wert von 8,2. Die antibiotische Wirk- ; samkeit wird zu 265 }jg/ml bestimmt. ^!

Beispiel Isolierung und Reinigung

Man filtriert eine Fermentationsbrühe (1500 Liter, Globaltest ^: ergibt 200 jjg/ml) unter Verwendung von Filterhilfe und wäscht ■ den Mycelkuchen mit Wasser. Man vereinigt das Filtrat mit j der Waschflüssigkeit, stellt auf pH 8,3 ein und gibt auf eine j Säule mit makrovernetztem Harz (Diaion HP-20, 100 Liter). Die _; Säule wird mit Wasser (400 Liter) und anschließend mit 40 %-igerj wäßriger Methanol lösung (410 Liter) gewaschen und dann mit einer 95 %-igen wäßrigen Methanol lösung (400 Liter) entwickelt. Man vereinigt die aktiven Fraktionen und konzentriert im Vakuum j zu einem wäßrigen Konzentrat. Den oben erhaltenen naßen Mycel- |

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kuchen (360 kg) suspendiert man in Methanol (300 Liter) und extrahiert durch Rühren. Diesen Vorgang wiederholt man zweimal und konzentriert dann den vereinigten Methanol extrakt (700 Liter) im Vakuum. Die aus dem HP-20-Eluat und dem Mycelkuchenextrakt erhaltenen zwei wäßrigen Konzentrate werden vereinigt und im Vakuum weiter eingedampft (70 Liter). Dann wird die Aktivität im Konzentrat zweimal mit Äthylacetat (2 χ 35 Liter) extrahi er-t. Man konzentriert den Extrakt im Vakuum zur Trockne_s wobei ein öliger Feststoff (1,03 kg, 220 jug/mg) zurückbleibt. Dieser wird in einer Mischung aus Äthylacetat und Methanol (20:1, 2,2 Liter) aufgelöst und auf eine Säule mit Aktivkohle (5 Litervolumen) aufgegeben. Man entwickelt die Säule mit derselben Lösungsmittel mischung, vereinigt die aktiven Eluate und konzentriert im Vakuum. Hierbei erhält man einen dunkelbraunen Feststoff, der aus heißem Methanol kristallisiert wird. Hierbei erhält man ein bräunlich-gelbes kristallines Pulver (279 g; 650 pg/mg).

Das so erhaltene kristalline Material ist eine Mischung der Komponenten A und B, deren Auftrennung durch Chromatographie an Diaion HP-20 erfolgt. Ein Teil der Mischung (100 g) wird in 90 %-igem wäßrigem Methanol aufgelöst und die Lösung wird auf eine Säule mit HP-20-Harz (5 Liter) aufgegeben. Man entwickelt die Säule mit 80 %-igem wäßrigem Methanol, wobei man zwei aktive Fraktionen erhält. Aus dem Konzentrat der ersten aktiven Fraktion (24 Liter) erhält man blaßgelbe nadelartige Kristalle von Bu-2313B (45 g), die zweimal aus Methanol umkristallisiert werden, wobei man ein analytisch reines Produkt (32 g) erhält.

Das zweite aktive Eluat (23 Liter) wird im Vakuum konzentriert, ι wobei man eine Mischung der Komponenten A und B (ungefähr 20 g) erhält, die durch Säulenchromatographie mit Silikagel unter Entwicklung mit Chloroform aufgetrennt wird. Aus den schnell i wandernden Fraktionen erhält man nach Umkristal1 isation reine

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: Kristalle von Komponente A (4 g). Eine/zusätzliche Menge an

Komponente B (7,5 g) wird aus dem letzteren Teil der Eluate ^! gewonnen.

Die Analysen der reinen kristallinen Produkte sind wie folgt:

BU-2313A

Analyse für C₂₇H₃₅NO₉

: CH N 0

berechnet: 62,65 6,82 2,71 27,82 % gefunden: 62,57 6,64 2,60 28,20 %

(durch Differenz)

BU-2313B

Analyse für G₂₅H₃₃NO₉

berechnet: 62,03 gefunden: 61,77

H	56	N	78	0	fferenz)
6,	80	2,	65	28,63 %
6,		2,		28,78 ■%
		(durch Di

Beispiel 4 Herstellung eines kristallinen Brombenzol-Sol vats von Bu-2313B

Man löst Bu-2313B (100 mg) in 4 ml heißem Brombenzol, zu dem man tropfenweise Petroläther zusetzt, bis eine leichte Trübung eingeleitet ist. Man läßt die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um die Kristallisation zu vervollständigen. Man ! erhält das Brombenzol sol vat von Bu-2313B in Form gelber Nadeln

(80 mg)

= -51,2° (c = 0,88; Methanol). λ max in Ätha-

nol: 225, 295(sh), 352 und 369 nm. NMR-Spektrum: cf7,l ppm (5H) für Brombenzöl .

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Analyse

	56	C	5	H	N	06	Br	80	(	du	23	0	%
berechnet:	56	,64	5	,90	2,	19	11,	10			23	,60	%
gefunden:		,87		,84	2,		12,			rch	,00	fferenz)
							Di

Beispiel 5_ Herstellung des Natriumsalzes von Bu-2313B

Zu einer Lösung von 200 mg Bu-2313B in 10 ml Methylenchlorid gibt man 30 ml Wasser. Zur Lösung gibt man tropfenweise unter Rühren IN NaOH bis auf pH 11,5 zu. Nach 30-minütigem Rühren wird die Lösungsmittelschicht abgetrennt und die wäßrige Schicht zweimal mit jeweils 30 ml n-Butanol extrahiert. Man vereinigt die Extrakte und konzentriert im Vakuum. Der so erhaltene Feststoff wird in einer kleinen Menge Aceton aufgelöst und durch Zugabe von η-Hexan ausgefällt. Hierbei erhält man 176 mg Bu-2313B-Natriumsalζ. Ein Teil dieses Materials (45 mg) wird aus einer Mischung von Benzol-Methanol kristallisiert, wobei man 36 mg blaßgelbe Kristalle erhält, die bei 236 bis

241⁰C (Zersetzung) schmelzen.

= ~⁷'⁴ (^{c =} 0,94; Methanol)

Analyse

	57	C	6	H	2	N
berechnet:	57	,46	'6	,26	2	,58
gefunden:	,57	,29	,39

Na 0 4,24 29,46 % 4,21 29,54 %

(durch Differenz)

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Beispiel Herstellung des Natriumsalzes von Bu-2313A

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels 5 mit der Ausnahme, daß man das dort verwendete Bu-2313B durch eine gleiche Menge an Bu-2313A ersetzt. Auf diese Weise erhält man das Natriumsalz von Bu-2313A.

Die beiden bioaktiven Komponenten Bu-2313A und Bu-2313B sind der Streptolydigin-Tirandamycin-Gruppe von Antibiotika struktu· rell verwandt.

2 l/V.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   2. Natriumsalze der Verbindungen nach Anspruch 1.

   3. Als BU-2313A bezeichnete antibiotisch wirksame Verbindung mit folgenden Kennzeichen: saure Substanz, in niedrigen Alkoholen, Äthylacetat, Chloroform und Benzol löslich, in Hexan und alkalischem Wasser etwas löslich, in Wasserpraktisch unlöslich, ergibt mit Eisen-IIl-Chlorid eine positive Reaktion, mit Ninhydrin, Anthron, Sakaguchi- und Tollen's Reagentien negative Reaktionen, mit Schmelzpunkt von ungefähr 116 bis 118⁰C in gereinigtem Zustand, optischer Aktivität mit einem |j>On von ungefähr -58° (c = 0,5; Methanol), einem pKa¹ von ungefähr 5,2 in 50 %-igem wäßrigem!

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   ORIGINAL INSPECTED

   ! SY-1547A ο

   Äthanol bei einem Titrationsäquivalent von 519, einem Molekülionenpeak bei m/e 517 im Massenspektrum, der Summenformel CpyhUcNOq und den in den Figuren 1, 3 und 5 dargestellten ul traviol ett-,inf rarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren,

   sowie deren nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Salze.

   4. Natriumsalz der Verbindung nach Anspruch 3.

   5. Als BU-2313B bezeichnete antibiotisch wirksame Verbindung mit folgenden Kennzeichen: saure Substanz, löslich in niedrigen Alkoholen, Äthylacetat, Chloroform und Benzol, etwas löslich in Hexan und alkalischem Wasser, in Wasser praktisch unlöslich, ergibt mit Eisen-III-Chlorid eine positive Reaktion, mit Ninhydrin, Anthron, Sakaguchi- und Tollen's Reagentien negative Reaktionen, mit einem Schmelzpunkt von ungefähr 160 bis 162⁰C in gereinigtem Zustand, mit optischer Aktivität mit einem jjxQn ^von ungefähr -69,9°

   : (c = 0,3; Methanol) und -34,9° (c = 0,93; CHCl₃), einem pKa¹ von ungefähr 4,9 in 46 %-igem wäßrigem Äthanol bei ! einem Titrationsäquivalent von 509, einem Molekülionenpeak > ' bei m/e 503 im Massenspektrum, der Summenformel C^HooNOg und den in den Figuren 2, 4 und 6 dargestellten ultraviolett-,

   infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren,

   sowie deren nicht-toxische,, pharmazeutisch verträgliche

   SaI ze.

   6. Natriumsalz der Verbindung nach Anspruch 5.

   7. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung einer Mischung der Antibiotika Bu-2313A und Bu-2313B, dadurch gekennzeich- ί net, daß man einen Stamm von Micropolyspora caesia mit den , Hinterlegungsnummern ATCC 31295, 31296, 31297 oder 31298

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   unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert, bis durch die Mikroorganismen im Kulturmedium eine nennenswerte Menge der antibiotischen Mischung produziert ist.

   8c Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer zusätzlichen Stufe die antibiotische Mischung aus dem Kulturmedium gewinnt.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micropolyspora caesia ATCC 31298 einsetzt.

   10. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Bu-2313B₅ dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) einen Stamm von Micropolyspora caesia mit den Hinterlegungsnummern ATCC 31295, 31296, 31297 oder 31298 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kultur- ; medium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert, bis durch den Mikroorganis- , mus im Kulturmedium eine nennenswerte Menge an antibiotischer Aktivität produziert ist;

   b) die in Stufe (a) produzierte antibiotische Mischung aus dem Kulturmedium gewinnt; und

   c) das BU-2313B durch Chromatographie auf einem makrovernetzten (macroreticular) polymeren Harz von der antibiotischen Mischung abtrennt.

   11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ! als Mikroorganismus Micropolyspora caesia ATCC 31298 ein- ; setzt. ^!

   -.— - 8 0 9 8'B 5 /0849

   j SY-1547A Ij

   ' 12. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotii kums Bu-2313A, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) einen Stamm von Micropolyspora caesia mit den Hinter-

   [ legungsnummern ATCC 31295, 31296, 31297 oder 31298 unter

   submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kultur-] medium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff- ; quellen enthält, kultiviert, bis vom Mikroorganismus ! im Kulturmedium eine nennenswerte Menge an antibioti-I scher Aktivität produziert ist;

   b) die in Stufe (a) produzierte antibiotische Mischung aus dem Kulturmedium gewinnt;

   c) aus der antibiotisehen Mischung den Hauptanteil an

   ; BU-2313B durch Chromatographie auf einem makrovernetzten (macroreticular) polymeren Harz abtrennt; und

   d) das BU-2313A durch Chromatographie auf Silikagel vom j restlichen Bu-2313B abtrennt.

   ; 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man

   als Mikroorganismus Micropolyspora caesia ATCC 31298 ein- ^! setzt.

   : 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung des Stamms unter sub-

   ^; mersen aeroben Bedingungen bei einem pH von 5,0 bis 10,0 und einer Temperatur von 2O⁰C bis 48⁰C durchführt.

   15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einem pH von 6,0 bis 8,0 und einer Temperatur von 32⁰C bis 42⁰C durchführt. :

   16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekenn-: zeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das zusätzlich ί

   Glycjn_en_thäl t.

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   SY-1547A . £-

   17. Mischung der Antibiotika Bu-2313A und 2313B.

   18. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen üblichen pharmazeutisch verträglichen Träger, sowie gegebenenfalls weitere Wirkstoffe und übliche Hilfsstoffe.

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