DE1929107C3 - Antibiotika Axenomycin A und B, Verfahren zu deren Herstellung und ein die Antibiotika enthaltendes Arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sieh auf die Antibiotika Axenomycin A und Axenomycin B₁ auf ein Verfahren zu deren Herstellung und ein Arzneimittel auf der Basis dieser Antibiotika.

Der neue Stamm Streptomyces lisandri n. sp. NCIB 10985 (NCIB 1Ο985 - IMI 137178 -* IMRU 3935) zur Herstellung von Axenomycin A und Axenomycin B wurde aus einer in derNähe von Lisandro Olmes( Argentinien) entnommenen Bodenprobe isoliert Er wurde beim National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen, Scotland unter der Nummer NCIB 10985 hinterlegt und kann von dort zu den von der Rechtsprechung festgelegten Bedingungen (vgl. Bl. f. PMZ 1975, S. 171) bezogen werden.

Beschreibung des Streptomyces lisandri n. sp. NCIB 10985

Mikroskopische Eigenschaften

Auf den üblichen Kulturböden besteht das vegetative Mycel aus Hyphen, die mehr oder weniger ££nn sind und eine Dicke von 0,5 bis 0,9 μ aufweisen, lang und' reichlich verzweigt sind und lange und gerade Conidiophoren mit einer Dicke von 1,1 bis 1,3 μ bilden. Von diesen werden monopodial Hyphen abgezweigt, die Sporen von normaler Länge bilden, die in ihrem distalen Bereich nicht spiralförmig ausgebildet sind. Diese Hy phen können abwechselnd oder entgegengesetzt an Conidiophoren eingefügt sein, und bei Reife verwandeln sie sich in Sporen- oder Conidienketten. Die letzteren haben eine ovale, glatte Oberfläche und eine Größe von 0,9 bis 1,2 und 1 bis 1,4 μ.

Makroskopische Eigenschaften In Tabelle I sind die Kultureigenschaften angegeben,

die bei Kultivieren des Mikroorganismus auf verschiedenen Nährböden erhalten wurden, wobei man den Mikroorganismus bei 28°C wachsen HeB und die Beobachtungen am 3., 8., 15., 20. und 30. Tag nach der Animpfung -durchführte.

Der Mikroorganismus zeigt im wesentlichen ein schnelles und reichliches Wachstum unter Bildung eines kompakten, festen vegetativen Mycels, das auf synthetischen Nährböden eine glatte Patina und auf organischen Nährböden eine leicht gefaltete Patina auf- weist

Auf den synthetischen Nährböden ist das vegetative Mycel farblos, während seine Rückseite in Abhängigkeit vom Nährboden verschiedenfarbige Tönungen von strohgelb bis dunkelgelb und kastanienbraun oder grau mit violetten, weinrosa oder dunkelgrünen Tönungen annimmt

Auf den organischen Nährböden hat das vegetative Mycel eine honiggelbe Farbe, und seine Rückseite ist weniger wechselhaft, nämlich zitronengelb oder ocker gelb und beim Altern mehr oder weniger kastanien braun.

Das Luflmycel ist auf den synthetischen Nährböden reichlich und auf den organischen Nährböden ziemlich spärlich ausgebildet Auf den synthetischen Nährböden

μ» nimmt das Luflmycel im allgemeinen eine weiße Tönung an. Auf einigen synthetischen Nährböden nimmt das Luflmycel weinrosa oder elfenbeinfarbige oder braunhellgraue Tönungen an. Auf den organischen Nährböden erscheint es in reinweißen, schmutzig· weißen, oder braunhellgrauen Tönungen.

In Abhängigkeit vom Nährboden liegt das Luflmycel in einer wattigen bis pulvrigstaubigen Erscheinungsform vor.

Tabelle I Kulturejgenschaften von Streptomyces lisandri n. sp. NCIB 10985

Medium

Wachstum

Luftmycel

Vegetatives Mycet

Lösliche Pigmente

Bennet-Agar (1) reichlich, leicht gefaltete Patina

Czapeck-Agar spärlich

reichlich, leicht wattig; weiß mit beigerosa Tönungen

reichlich, ziemlich wattig, weiß

Asparagin-Glukose-Agar(l)

Glycerin-GIycin-Agar(l)

Emerson-Agar (1)

Stärkeagar und Salze (2) Kartoffel-Agar(4)

Hafer-Agar (3)

Asparagin-Glycerin-Agar(l) Glukose-Hefeextrakt-Agar (I) Pepton-Stärke-Agar(l)

Pepton-Agar KNO₃(I)

reichlich, glatte Patina

mäßig, glatte Patina

reichlich, Patina leicht gefaltet

mäßig, glatte Patina

reichlich, leicht gefaltete Patina

sehr mäßig und langsam, glatte Patina

mäßig, glatte Patina

reichlich, leicht gefaltene Patina reichlich, glatte Patina

mäßig, glatte Patina

mäßig, ziemlich glatt, weißlich mit rosa Tönungen

sehr reichlich, wattig, weiß mit einigen beige Tönungen

spärlich, weißlich, glatt

sehr reichlich, glatt, braunhellbeige

mäßig, ziemlich glatt weißlich mit beigebräunlichen Tönungen

reichlich, glatt, weiß bis braunhellgrau

sehr reichlich, glatt, weiß mit beige Tönungen

reichlich, ziemlich glatt, weiß

reichlich, ziemlich glatt, weiß

reichlich, leicht wattig, weiß honigfarbig, Rückseite hellocker bis hellbraun

farblos, Rückseite zuerst strohgelb, dann grauviolett, mehr oder weniger satt

farblos, Rückseite zuerst zitronengelb, dann weinrosa

farblos, Rückseite strohgelb bis ockerbraun

honigfarbig, Rückseite

tiefocker

farblos, Rückseite hellgelb

bis braun bis grau

stroh- bis zitronengelb, Rückseite dann kastanienbraun

farblos, Rückseite zuerst zitronengelb, dann hellbraun

strohgelb, Rückseite orangeocker bis braun

strohgelb, Rückseite he.llocker

helltee-

hellviolett, mit bräunlichen Tönungen

heliweinrot

keine

helltee-

farbig

/.itronen-

gelb

teefarbig

keine

hellgelbbraun

keine

honigfarbig bis zitronengelb, helltee-

Rückseite ockerbraun mit rosa farbig

Tönungen

farblos, Rückseite strohgelb keine

Die mit 1, 2, 3 bzw. 4 gekennzeichneten Medien der Spalte 1 der Tabelle I sind in folgenden Literaturstellen beschrieben:

(1) Waksman S. A.„ »The Actinomycetes«, Bd. H, The William and Wilkins Co. 1961, Seiten 328 bis 334.

(2) PridhamT.G., Anderson P., Foley C, Lindenfelser L. A., Hesseltine G. M. und Benedict R. B., »Antibiotics Annual«, 1956 bis 1957, Seiten 947-953.

(3) Baldacci E., Giolitti G., Küster B. und S cot ti T., »Giornale di Microbiologia« 9, Seite 39 (1961).

(4) Grein A., Spalla C. und Cotta E., »Giornale di Microbiologia« 13, Seite 299 (1965).

Stärke: Milch:

Melanoidpigmente:

Tyrosin:

H₂S:

totale Hydrolyse keine Gerinnung, totale Peplonisierung keine Erzeugung Zersetzung keine Erzeugung

■55

Biochemische Eigenschaften des Mikroorganismus

Gelatine: Nitrat:

totale Proteolyse keine Reduktion zu Nitriten Der Mikroorganismus erzeugt auf einem Agarnährboden ein lösliches Pigment, das auf synthetischen Nährböden hellweinrosa oder hellbraungelb ist, während es auf den organischen Nährböden hellteefarbig ist.

Der Mikroorganismus verwertet zum Wachsen folgende KohlenstofTquellen: Glukose, I-Airabinose, Saccharose, d-Xylose, Mesoinosit, d-Mannit, d-Fructose, Maltose und Raffinose.

Rhamnose wird nicht verwertet. Der Mikroorganismus wächst bei 50°C nicht und erzeugt keine. Sklerotien. In submerier gerührter flüssiger Kultur erzeugt der Mikroorganismus die Antibiotika Axenomycin A und B.

Identifizierung des Mikroorganismus

Die vorher beschriebenen Eigenschaften, die der geprüfte Mikroorganismus zeigt, erlauben es, ihn der Art Streptomyces Waksman et Henrici (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, 1957, S. 744 und 745) zuzuordnen. Der Stamm gehört zur Klasse »Spira«, Serie »White« von Pridham et al. (Appl. Microbiol., Bd. 6,1958, S. 52), zur Klasse II, Serie »Albidofiavus« von B a 1 d a c c i (Giorn. Microbiol. Bd 6, 1958, S. 10), zur Serie »Albus« von Waksman (The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S, 117) und schließlich zur Gruppe der Streptomyceten, die nach Hütter (Systematik der Streptomyceten, Bibl. Microbiol., Band 6, S. Karger, Basel, 1967, Seite 256) ein Luftmycel »niveus« besitzen.

Eiß Vergleich der Eigenschaften des geprüften Mikroorganismus mit denen bekannter Arten zeigt, daß keine bekannte Art oder Gruppe alle Eigenschaften des untersuchten Mikroorganismus aufweist

Aus obigen Gründen und weil der Mikroorganismus insbesondere auf synthetischen Nährböden ein lösliches Pigment erzeugt, das von rosa, rötfich, violettweinfarbig bis zitronengelb wechselt, und er die neuen Antibiotika Axenomycin A und B erzeugt, wird dieser Mikroorganismus als neue Art angesehen und Streptomyces lisandri n. sp. NCIB 10985 genannt

Der Mikroorganismus Streptomyces lisandri n. sp. NCIB 10985 kann durch aufeinanderfolgende Übertragungen auf feste Nährböden und durch Gefriertrocknung einer Suspension seiner Sporen in einem geeigneten Träger gelagert werden.

Bei dem Verfahren zur Herstellung von Axenomycin A und B können als Kohlenstoffquelle Glukose, Stärke, Dextrin, verschiedene Mehle (Soja-, Mais-, Weizenmehl usw.), Getreideweiche und andere gewöhnlich eingesetzte Stoffe verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können außer den obenerwähnten komplexen Substanzen, die Stickstoff enthalten, auch Kasein, Kaseinhydrolysate, Baumwollsamenmehl und Ammoniumsalze, wie Sulfate, Phosphate, Chloride und andere allgemein übliche Stoffe dienen.

Die verwendbaren Mineralsalze hängen von dem verwendeten Nährboden ab. Besonders geeignet ist Kaliumcarbonat. Außerdem .können die Chloride, Sulfate, Phosphate des Natriums, Kaliums, Magnesiums, Eisens, Kupfers, Zinks, Mangans und Kobalts zugesetzt werden.

Die Fermentation kann in Erlenmeyerkolben und in Laboratoriums- oder Industriefermentem durchgeführt werden.

Wenn die Fermentation beendet ist, werden Axenomycin A und B mit geeigneten Lösungsmitteln unter geeigneten Bedingungen aus der Kulturbrühe extrahiert und durch Absorption über eine chromatographische Säule getrennt.

Die Bestimmung der Konzentration der Antibiotika im Kulturmedium wird während der Wachstumspe-

Tabelle H

node des Mikroorganismus durchgeführt, wobei Proben geprüft werden, die durch Extrahieren des feuchten Mycels mit Äthylalkohol erhalten wurden. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Äthylalkohol, Methylalkohol, Dimethylformamid aufgenommen und dann mit Wasser verdünnt

Solche Proben werden mit Mikroorganismen geprüft, die gegenüber dem Axenomycin A und B empfindlich sind, z. B. Rhabditis macrocerca und Saccharomyces carlsbergensis, wobei eine Verdünnungsreihe der zu prüfenden Probe hergestellt wird und diese mit Lösungen der Antibioti ka mit bekanntem Titer verglichen wird.

Auf analoge Weise können die gereinigten Proben titriert werden.

Chemisch-physikalische Eigenschaften
der Antibiotic*

Die chemisch-physikalischen Kenndaten zur Kennzeichnung von Axenomycin A und Axenomycin B sind in den Ansprüchen 1 und 2 zusammengefaßt.
Darüber hinaus weisen Axenomycin A und Axenomyt.in B noch folgende Eigenschaften auf: Sie liegen in Form von gelblichweißen amorphen Produkten vor und sind in Benzol und Petroläther nicht löslich, kaum löslich in Wasser, Äthylacetat, Aceton und Chloroform, aber löslich in Äthyl-, Methyl- und Propylalkohol.

Sie reduzieren Fehlingsche Lösung und ammoniakalische Silbernitratlösung und reagieren mit Tetrazolblau. Die Molishsche Reaktion ist schwach positiv. Die Tüpfelreaktion mit Anilinphthalat auf Aldose und mit Naphthoresorcin auf Ketosen sind negativ. Die Reaktion mit Ferrichlorid ist negativ.

Wurmhemmende Wirksamkeit der Antibiotika

Die wurmhemmende Wirksamkeit wurde »in vitro« an verschiedenen Würmern unter verschiedenen Bedingungen geprüft.

Rhabditis macrocerca wurde in Hefeextraktagar mit den Antibiotika Axenomycin A bzw. B in verschiedenen Konzentrationen behandelt

Nach geeigneter Bebrütung wurd<* die Mindestdosis des Antibiotikums bestimmt, die die Entwicklung des geprüften Mikroorganismus total hemmt (MHD-Wert).

Syphacia obvelata und Hymenolepsis nana, die experimentell infizierten Mäusen entnommen wurden, wurden in gepufferte Kochsalzlösungen mit einem so pH-Wert von 7,5 eingetaucht Die Antibiotika Axenomycin A bzw. B wurden in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Nach verschiedenen Kontaktzeiten %urde geprüft, wieviele der beiden Wurmarten noch überlebt hatten, und so die Mindestdosis der Antibiotika bestimmt, die die Bewegungen des geprüften Organismus »in vitro« lähmt (MID-Wert).

In Tabelle II sind die MHD- und MID-Werte, bestimmt nach 4 Stunden Kofitaktzeit, zusammengefaßt.

Geprüfte Arten

Axenomycin A MHD μg/ml MID

Axenomycin B MHD μξ/τη\

MID

Rhabditis macrocerca
Syphacia obvelata
Hymenolepis nana

10

10

>1000
0,5

>1000
0,5

Die wurmhemmende Wirksamkeit wurde »in vivo« an Albinomäusen mit einem Gewicht von 25 g geprüft, die experimentell mit Hymenolepsis nana infiziert waren. Die Versuche wurden an Gruppen von jeweils 10 Mäusen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß 100% der befallenen Mäuse durch Verabreichung von Axenomycin A bzw. Axenomycin B, in einer einzigen oral verabreichten Dosis geheilt wurden. Diese Dosis oder die therapeutische Dosis von 10 mg/kg liegt deut lich unter der toxischen Dosis

In Tabelle III sind die Daten akuter Toxizitat bei Mausen angegeben

Tabelle III

\xcnnni\cin Λ

Axemimvun B

Oral
Intraperitoneal

2(Xl

ι -

300

Wirksamkeit gegen Protozoen

Die Wirksamkeit gegen Protozoen wurde »in \itro« .in Entjmoeba hislolytica Stamm Γ 22 in einem einphasigen Pa\lo\a-Medium und an Trichomonas foetus in einem /weiphasenmedium aus geronnenem F.i und Loek scher K ochsalzlösungs-Pferdeserum geprüft. Nach 48stündiger Bebrütung bei 37 C wurden durch mikroskopische Zählung der anwesenden Protozoen die MMD-Werte bestimmt. Die experimentell ermittelten Daten sind in Tabelle IY zusammengefaßt.

TabeilelV	MHI) Axeno mycin .	ig/ml Λ	Axeno mycin B
	0.1 ] >		0.1 1
Trichomanas f-.nijmo-jba hislolvtica

Wirksamkeit gegen Pilze

Die Wirksamkeit gegen Pilze wurde »in vitro« an Saccharom>ces carUbergensis und Candida albicans :n einem Sabouraudmedium geprüft. Nach 48stündiger Bebrütung bei 30 ( winden die Vf HD-Werte bestimmt. Die crh.iitenen Werte sind in Tah.üe V angegeben.

Tabelle V	.MHD -ig/m!	Axeno
	Axeno	mycin B
	mycin A	0.04
	0.04
Saccruromyces		1.25
Cdrlshergensis
Candida albicar.s

in ihrer Wirksamkeit gegenüber Hymenolepsis nana wurden Axenomycin A und Axenomycin B mit der dls gut wirksam bekannten Vergleichssubstanz N.N-Di- ^ut»!-4-hexyloy>naphthylamidin (Bunamidiiv .i dir W[IO '.orgeschiaeener Freiname verslichen. Diese

Vergleichssubstanz ist in »Progress in Drug Research«. 17, 1973, Seite 110 beschrieben.

Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle VI zusammengestellt:

Tabelle VI

Substanz

(mg/kg) (mg/kg

Axenomycin A 20 3(XI

Axenomycin B 13.5 300

N.N-Dihutyl-4-hexyl- 62 540

oxynaphthylamidin
(Bunamidin)

Therapeutischer Index

15

22.2
8.7

ilio [.'rtiphnlLtp /pio»>n /Im it I it'll H-jil /ti** h»-"»n t ιλγι ι.· h.

ten Verbindungen der Vergleichsverbindung überlegen sind.

Die MD;„-Werte wurden nach der Methode von O. D Standen. Experimental Chemotherapy. Vol. I, 1963. Seiten 717 bis 719 bestimmt, wobei die Methode jedoch insoweit abgeändert wurde, daß die infizierten Mause bereits nach 12 Tagen mit den untersuchten Verbindungen per os behandelt wurden und die behandelten M'.'se danach bereits nach 24 Stunden getötet und die Hingeweide auf die Anwesenheit von llymalepsis nana untersucht wurden Die LD^i-Werte wurden nach der üblichen Methode von W. A. Ritschel. »Angewandte Biopharmazie«. !973. Seiten 207 bis 209 bestimmt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

In zwei 300-ml-Krlcnmeyerkolben werden jeweils 60ml des folgenden vegetativen Mediums gegeben:

Dextrin

Kasein

Kaliumcarbonat

Ammoniumsulfat

Getreideweiche

Leitungswasser auf

3 %
0.5 \ 0.4 "-ή 0.1"»

I %

100

Die Sterilisierung erfolgt durch Erhitzen im Autoklav auf 120 C während 20Minuten. Der pH-Wert des Mediums liegt nach der Sterilisierung bei 6 8 bis 7.

Jedes Medium wird mit 0.5 ml einer Sporensuspen sion angeimpft, die durch Waschen der Patina einer 15 Tage alten, auf Glucose-Kartoffel-Agar entwickelten Schrägkultur von Streptomyces lisandri NCIB 10985 mit 4 ml sterilem destilliertem Wasser erhalten wird.

Die Kulturen werden bei 28 C während 48 Stunden auf einem Drehschüttler mit 225 U.p.M. mit einem Hub von 3 cm bebrütet.

2 ml der so gewonnenen Kultur werden dazu verwendet, um jeweils 6OmI des folgenden produktiven Mediums, das durch Erhitzen auf 120 C während 20 Minuten sterilisiert worden ist, anzuimpfen:

Stärke
Sojamehl
Getreide weiche
Kaliumcarbonat
Natriumchlorid
Leitungswasser auf

4.5'Vo 2.2% 2.3% 0.4% 0.5% 100

Die Kultur wird bei 28 C bebrütet, wie oben für die vegetative Kultur angegeben. Nach l20stündiger Bebrütung werden 50 ag desantibiotischen Komplexes (Axenomycin Λ und B) pro ml Kulturbrühe erhalten.

Beispiel 2

Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als produktive Phase wird das folgende Medium verwendet: ID

Lösliche Stärke

Baumwollsamenmehl

Getreideweichc

Schmalzöl

Kalziumcarbonat

Ammoniumsulfat

Mang;msiilf;)t

Kobaltsulfat

Leitungswasser auf

8%
4%
2.5 %
1.5 %
I %
1%

0.0! %
0.0007 % 100

Dextrin

Kalziumcarbonat

Getreideweiche

Kasein

Ammoniumsulfat

sek.-Kaliumphosphat

Leitungswasser auf

5%

0,5%

1%

1%

0,2%

0,01 %

100

Glukose

Sojamehl

Getreideweiche

Kalziumcarbonat

Natriumchlorid

Sojaöl

Leitungswasser auf

6%

3%

2%

1%

0,3 %

0,05%

100 Der pH-Wert des produktiven Mediums lag nach der Sterilisierung bei 6,2 bis 6,8.

Die Kulturen werden bei 28 C unter den in den Beispielen I und 2 angegebenen Schüttelbcdingungcn bebrütet.

Nach 120stiindiger Bebrütung werden 120 μg des antibiotischen Komplexes pro ml Kulturbrühe erhalten.

Beispiel 4

In einen 2000-ml-Kolben, der mit drei Wellenbrechereinrichtungen und einem seitlichen Inokulationsansatz versehen ist, werden StX) ml des in Beispiel 3 angegebenen vegetativen Mediums gegeben und durch Erhitzen auf 120 C während 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit der gesamten Sporensuspension angeimpft, die durch

Der pH-Wert wird mit einer 4 n-Natriumhydroxydlösung auf 6,2 eingestellt.

Die Sterilisierung erfolgt durch Erhitzen auf 120 C während 20 Minuten.

Es wird unter Rühren bei 28 C bebrütet, wie in Beispiel 1 angegeben. Nach 120stündiger Bebrütung werden 70 μg des antibiotischen Komplexes pro ml Kulturbrühe erhalten.

Beispiel 3

In zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben werden jeweils 60 ml des folgenden vegetativen Mediums gegeben:

Die Sterilisierung des Mediums erfolgt durch Erhitzen auf 120 C während 20 Minuten. Nach der Sterilisierung liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,7 bis 7. Die Medien werden mit jeweils 1 ml einer Sporensuspension angeimpft, die durch Waschen der Patina einer 15 Tage alten, auf Glukose-Kartoffel-Agar entwickelten Schrägkultur von Streptomyces lisandri NCIB 10985 mit 5 ml sterilem destilliertem Wasser erhalten wird.

Die Kulturen werden bei 28°C während 48 Stunden unter den gleichen Schüttelbedingungen, wie in Beispiel 1 und 2 angegeben, bebrütet.

2 ml der so erhaltenen Kultur werden dazu verwendet, um jeweils 60 ml eines produktiven Mediums der folgenden Zusammensetzung, das bei 120 C während 20 Minuten sterilisiert worden ist, anzuimpfen:

auf Glukose-Kartoffel-Agar entwickelten Kulturen mit destilliertem Wasser erhalten wird.

Die Kultur wird bei 28 C während 48 Stunden auf einem Drehschüttler mit 120 U.p.M. mit einem Hub von 4,5 cm bebrütet.

50ml der so erhaltenen vegetativen Kultur werden dazu verwendet, 3 I eines Mediums der folgenden Zusammensetzung, das bei 120 C während 30 Minuten sterilisiert worden ist, anzuimpfen:

Dextrin

Kasein Getreideweiche

Kalziumcarbonat

Ammoniumsulfat

Kaliummonophosphat

Leitungswasser auf

4%

1%

1%

0,5%

0,1%

0,01%

100

Die Kultur wird bei 400 U.p.M. gerührt, mit etwa einem Volumenteil Luft pro Volumenteil Medium pro Minute belüftet und bei einer Temperatur von 27 bis 28¹C während etwa 24 Stunden bebrütet. Danach) werden 3 I der so erhaltenen Mycelsuspension dazu verwendet, um 501 eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung, das bei 121 C für 30 Minuten sterilisiert worden ist, anzuimpfen:

Glukose

Sojamehl

Getreideweiche

Natriumchlorid

Kalziumcarbonat

Sojaöl

Leitungswasser auf

8%

3%

2%

0,25%

1%

0,5%

100

Dann wird die Kultur mittels eines mit vier Schraubenflügeln versehenen Rührwerks mit 200 U.p.M. gerührt und mit einer Luftzufuhr von 0,7 1 pro 11 Kultur pro Minute bei einer Temperatur von 27 bis 28°C während 120 Stunden belüftet Das durch Filtrieren von 51 Kulturbrühe erhaltene Mycel wird viermal mit je 3 1 Methanol extrahiert Die gesammelten Extrakte werden unter vermindertem Druck konzentriert und der wäßrige Rückstand mit Petroläther gewaschen und dann viermal mit dem gleichen Volumen n-Butylalkohol extrahiert Die gesammelten und unter Vakuum zur Trockene eingeengten Extrakte werden mit 100 ml Methylalkohol aufgenommen.

Der unlösliche Teil wird verworfen und die methanolische Lösung eingeengt. Der Rückstand wird in 200 ml

Chloroform suspendiert und dann filtriert. Die Chloroformlösung wird konzentriert und dann mit Petroläther ausgefällt, wobei 2,0 g eines rohen Produktes erhalten werden, welches die Antibiotika Axenomycin A und Axenomycin B enthält.

Das Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung im ZweiphasensJ )tem Chloroform-tetrachlorkohlenstoff-Methanol-Wasser (3:2:4:1) gereinigt. Wenn man eine Fraktionierung über 50 Röhren durchführt, erhält man die größte Wirkung in den Röhren 10 bis 20. Bei Eindampfen des Inhalts dieser Röhren /ur Trockene erhält man 0,20 g des reinen Axenomycinkomplexes. Bei Dünnschichtchromatographie zeigt sich, daß der erhaltene Komplex die zwei antibiotischen Komponenten Axenomycin A und Axcno-

myein B mit Rf 0,i9 und 0,61 enthält. Die Trennung der beiden aktiven Substanzen wird durch Chromatographie auf mit 0,05 m Phosphatpuffer auf pH 7 gepufferten Kieselgelsäulen unter Zugabe von 33% ZeIIulosepulver durchgeführt.

Für I g des antibiotischen Komplexes wird eine Säule mit einem Durchmesser von 2,4 cm und einer Höhe von 30 cm verwendet. Durch Eluieren mit n-Butylalkoho! : Essigsäure : Wasser (4:0,5:1 VoIu- menverhältnis) erhält man Fraktionen, die 0,6 g Axenomycin B und 0.25 g Axenomycin A enthalten. Die eingeengton Fluate werden in Methanol aufgenommen. Nach Entfernung des Methanols werden die Antibiotika über P,()< bei 0.2 mm Hg und Kaumtemperatur getrocknet.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Antibiotikum Axenomycin A mitderSummenformel C₇₅H₁₂₄O₂₆, einem Molekulargewicht von 1451,3, einem Schmelzpunkt von 127 bis 142°C unter Bildung eines transparenten, ziegelsteinroten Gels [β] ? = +10,5° (c = 0,9 in Methanol), R_r = 0,49 auf bei pH 7 gepuffertem Kieselgel (n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:0,5:1) einem Ultraviolettspektrum in Methanol mit Absorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen: 249, 254 und 330 ιημ und einerSchulterbei 265 bis 268 πιμ und einem Infrarotspektrum in KBr mit Banden bei den folgenden Wellenlängen in μ: 2,94,3,44,5,78,6,00,6,16,6,24,6,88, 7,25, 7,41, 8,61, 8,85, 9,35, 10,00, 10,40, 10,95, 11,8, 12,5; die als Teilstrukturen ein makrocyclisches Lacton, zwei Zuckerreste und einen 1,4-Naphthochinon-Chromophor aufweist; und seine Salze mit nichttoxischen Säuren.

2. Antibiotikum Axenomycin B mit derSummenformel C_7xH ^ΟI₀, einem Molekulargewicht von 1542, einem Schmelzpunkt von 122 bis 140⁰C [a]'J = +5° (c= 0,9 in Methanol), R_f = 0,61 auf bei pH 7 gepuffertem Kieselgel (n-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:0,5:1), einem Ultraviolettspektrum in Methanol mit Absorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen: 249,254 und 330 ιτιμ und einer Schulter bei 265 bis 268 Γημ und einem Infrarotspektrum in KBr mit Banden bei den folgenden Wellenlängen (in μ): 2^4, 3,40, 5,82, 6,00, 6,16, 6,24, 6,86, 7,25, 7,41, 8,60, 8,85, 9,35, 10,00, 10,40, 10,98, 11,8, 12,5; die als Teilstrukturen ein makrocyclisches Lacton, zwei Zuckerreste und einen 1,4-Naphthochinon-Chromophor aufweist; und ihre Salze mit nichttoxischen Säuren.

3. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika gemäß den Ansprüchen 1 und 2 und deren Salzen mit pharmazeutisch verträglichen Säuren, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lisandri n. sp. NCIB 10985 unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 23 bis 37°C während eines Zeitraums von 60 bis 160 Stunden bei einem pH-Wert von 6 bis 9 kultiviert, den so erhaltenen Komplex der Antibiotika aus der Fermentationsbrühe isoliert, dann in Axenomycin A und Axenomycin B durch Chromatographie auf mit 0,05 m PnosphatpufleraufpH7gepufTertenKieselgelsäulen mit 33% Cellulosepulver und mit der Mischung n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:0,5:1 Volumina), auftrennt

4. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend Axenomycin A oder/und Axenomycin B und pharmazeutische übliche Zusätze.