CH630957A5 - Verfahren zur herstellung von neuen antibiotischen verbindungen auf basis eines bohemsaeurekomplexes. - Google Patents

Description

45 Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Anthracyclin-Antibiotika.

In der Literatur sind mehrere Anthracyclinglykoside beschrieben. Von diesen stehen auf dem Gebiet der Krebschemotherapie insbesondere Daunomycin und Adriamycin im so Vordergrund des Interesses. Die beiden Glykoside wurden bereits klinisch zur Krebsbehandlung in der Humanmedizin eingesetzt.

Die Herstellung von Adriamycin durch Fermentation von S. peuceticus var. caesius ist in der US-PS 3 590 028 beschrie-55 ben. Aus der US-PS 3 803 124 ist die chemische Umwandlung von Daunomycin in Adriamycin bekannt.

Daunomycin (hergetellt durch Fermentation von S. peuceticus gemäss GB-PS 1 003 383) entspricht möglicherweise dem Wirkstoff 13057 R.P. von Rhone-Poulenc (früher Rubidomycin 60 und nunmehr Daunoribicin; vgl. die GB-PS 985 598,1 188 262 und 1 241 750 sowie die US-PS 3 616 242) und ist vermutlich mit dem in der US-PS 3 092 550 und der GB-PS 901 830 beschriebenen Danubomycin von Ciba identisch (vgl. auch die US-PS 3 686 163 hinsichtlich Dihydrodaunomycin).

Cinerubin A und Cinerubin B (Glykoside des Aglykons e-Pyrromycinon) sind in der GB-PS 846 130 beschrieben [vgl. auch die US-PS 3 864 480 sowie Keller-Schierlein et al., «Anti-microbial Agents and Chemotherapy» (1970), Seite 68, und

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«Chemical Abstracts», 54 (1960), 1466i].

Dem in J. Antibiotics 27 (1974), Seiten 254 bis 259, in der DE-PS 2 362 707 und in J. Amer. Chem. Soc. 97 (20) (1975), Seiten 5955 bis 5956 beschriebenen Anthracylinglykosid Carmino-mycin wurde Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Tumorsystemen bei Warmblütern zugeschrieben.

Aus Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1 (1972), Seiten 385 bis 391 geht hervor, dass Trypanomycin eine starke Aktivität gegen Protozon entfaltet. Es weist ein Aglykon auf, das e-Pyrromycinon ähnlich, mit diesem jedoch nicht identisch ist.

Das in «Chem. Ber.» 92 (1959), Seiten 1904 bis 1909 beschriebene Antibiotikum Pyrromycin enthält das Aglykon e-Pyrromycinon und den glykosidischen Zucker Rhodosamin.

Zur weiteren Erläuterung und Zusammenfassung von Anthracyclin-Antibiotika betreffenden Literaturstellen wird auf den «Index of Antibiotics from Actinomycetes» (1967), Hamao Umezawa, Hauptherausgeber, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA wie folgt hingewiesen:

Antibiotikum

Seitennummer

Aklavin

111

Cinerubin A

220

Cinerubin B

221

Danubomycin

242

Daunomycin

243

Pyrromycin

542

Rhodomycin A, B

561

Rubidomycin

574

Das Lehrbuch «Antibiotics», Band 1 : Wirkungsmechanismus (1967), herausgegeben von David Gottlieb und Paul D. Shaw, Springer-Verlag, New York, Inc., N.Y., N.Y., enthält auf den Seiten 190 bis 210 eine Abhandlung von A. DiMarco mit dem Titel «Daunomycin and Related Antibiotics».

In «Information Bulletin» Nr. 10 (Dezember 1972), Internationales Informationszentrum für Antibiotika (in Zusammenarbeit mit der WHO), Belgien, werden Anthracycline und ihre Derivate besprochen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Patentanspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung von neuen s Anthracyclin-Antibiotika, die im nachstehenden auch als «Bohemsäurekompiex» bezeichnet werden. Im erfindungsge-mässen Verfahren wird als Bohemsäure bildender Stamm von Actinosporangium sp. vorzugsweise Actinosporangium sp. A.T.C.C. 31127 verwendet. In einer bevorzugten Ausführungs-io form des erfindungsgemässen Verfahrens werden zwei neue bioaktive Anthracyclinkomponenten des Bohemsäurekomplexes dadurch hergestellt, dass man die gesamte Gär- bzw. Fermentationsbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und anschliessend die einzel-15 nen antibiotischen Verbindungen - beispielsweise nach chromatographischen Methoden - voneinander trennt und isoliert. Der Bohemsäurekomplex und seine bioaktiven Komponenten (hier als «Musettamycin» und «Marcellomycin» bezeichnet) weisen sowohl antibakterielle als auch Antitumor-Aktivität auf. 20 Der Bohemsäurekomplex und seine Bestandteile Marcellomycin und Musettamycin können durch Fermentation eines neuen Vertreters der Gattung Actinosporangium mit der Bezeichnung «Actinosporangium sp. Stamm C-36,145» hergestellt werden. Dieser Mikrooorganismus wurde aus einer in 25 Ontario, Canada, entnommenen Bodenprobe erhalten. Eine Kultur des Mikroorganismus wurde am 14. Februar 1975 in der American Type Culture Collection, Washington, D.C. hinterlegt und in deren ständige Mikroorganismensammlung unter der Bezeichnung «A.T.C.C. 31127» eingereiht.

30 Wie bei vielen Antibiotikum bildenden Kulturen entsteht bei der Fermentation von Actinosporangium sp. Stamm C-36,145 (A.T.C.C 31127) ein Gemisch oder Komplex aus verschiedenen Komponenten. Zwei bioaktive Anthracyclin-Kom-ponenten, nämlich Musettamycin und Marcellomycin, wurden 35 von den durch den vorgenannten Mikroorganismus gebildeten Bohemsäurekomplex abgetrennt.

Es wurde festgestellt, dass Musettamycin und Marcellomycin die nachstehenden Formeln aufweisen:

COOCH

ch3ch

I N(CH3)2

Musettamycin

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4

Marcellomycin

Wie die obigen Formeln zeigen, sind beide Komponenten sporangiumartige Körper und das Luftmyzel bilden sich an

Anthracyclinglykoside des Aglykons e-Pyrromycinon. Musetta- Glukose/Asparagin-Agar, Tyrosinagar, Hefeextrakt/Malzex-

mycin enthält zwei glykosidische Zuckereinheiten, d. h. 35 trakt-Agar und Hafermehlager. Ausser einer grossen Zahl fal-

2-Deoxy-L-fucose und L-Rhodosamin, während Marcellomycin scher Sporangien entstehen auch (allerdings wesentlich weni-

zwei 2-Deoxy-L-fucose-Einheiten und eine L-Rhodosamin-Ein- ger) gewöhnliche Sporenketten, welche offene Spiralen bilden,

heit aufweist. Die Strukturen der beiden Bestandteile wurden Die Sporen im sporangiumartigen Körper besitzen eine glatte durch Analyse ihrer IR- und NMR-Spektren bestimmt und ste- Oberfläche und ellipsoïde Form und sind nicht freibeweglich,

hen im Einklang mit den nachstehend angeführten physikali- 40 Die Sporen in der gewöhnlichen Sporenkette weisen eine sehen Daten. ovale Form und eine glatte oder gelegentlich warzige Ober-

Die punktierten Linien in den obigen Formeln zeigen an, fläche auf. Das primäre Myzel ist verzweigt, nicht-septiert und dass sich die betreffende gebundene Gruppe teilweise unter- nicht-fragmentiert.

halb der Ebene des Rings, mit dem sie verknüpft ist, befindet. Tabelle I zeigt die an verschiedenen Medien erzielten Kul-

Die spitzen Symbole zeigen an, dass die gebundene Gruppe 45 tureigenschaften. Der Stamm C-36,145 gedeiht an den meisten oberhalb der Ringebene angeordnet ist. getesteten Agarmedien gut, die Bildung des Luftmycels und die

Der Bohemsäurekomplex und seine Komponenten Muset- Sporenbildung verlaufen jedoch etwas langsam. Die Massen-

tamyein und Marcellomycin bilden sowohl mit Säuren als auch färbe (absolut deckende Farbe) des Luftmycels ist ein leicht mit Basen Salze. Die pharmakologisch verträglichen Salze des grünliches Grau. Die Rückseite der Wachstumskultur ist in

Komplexes und seiner Komponenten fallen ebenfalls unter die 50 Glukose/Asparagin-Agar, anorganische Salze/Stärke-Agar,

Erfindung. Beispiele für solche pharmakologisch verträgliche Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar und Hafermehlagar rötlich-

Salze sind die Salze mit starken Säuren, wie Chlorwasserstoff-, orange bis rot gefärbt. In Tyrosinagar und Pepton/Hefeextrakt/

Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter- oder Phosphorsäure Eisen-Agar bildet sie ein melanoides Pigment.

sowie mit Metallkationen, z. B. Alkalimetall- oder Erdalkalime- Die physiologischen Merkmale bzw. die Kohlenhydratver-

tallkationen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesium- 55 wertung des Stammes C-36,145 sind aus den Tabellen II bzw. III

ionen. ersichtlich. Die Kultivierungstemperatur liegt im Bereich von

Die erfindungsgemässe Synthese der Anthracyclin-Antibio- 20 bis 37 °C; bei 43 °C ist kein Gedeihen zu beobachten.

tika wird nachstehend beispielsweise beschrieben. Der Stamm C-36,145 enthält in der Zellwand als charakteristische Aminosäurekomponenten LL-Diaminopimelinsäure

Der Mikroorganismus 60 (LL-DAP) und Glycin. Diagnostisches Kohlenhydrat ist nicht

Der Stamm C-36,145 weist folgende morphologische Merk- vorhanden.

male auf. Der Stamm bildet einen sporangiumartigen Körper Die morphologischen, physiologischen und Kultivierungs-

(falsches Sporangium) an der Spitze des Sporenträgers (Sporo- merkmale des Stammes C-36,145 entsprechen jenen des Stam-

phors), welcher eine Agglomerierung einer dicht verknäuelten mes Streptomyces mit Ausnahme der Bildung des sporangium-

bzw. zusammengerollten Sporenkette darstellt. Die Sporen- 6.5 artigen Körpers. Die Zellwandzusammensetzung entspricht kette ist häufig mit den benachbarten Lufthyphen (aerial ebenfalls jener der Gruppe Typ I (Streptomyces-Typ) gemäss hyphae) verflochten und entwickelt sich zu der sporangiumarti- der Klassifikation von Lechevalier and Lechavalier in Int. J.

gen Struktur, die durch ein viskoses Material bedeckt ist. Der Syst. Bacteriol. 20 (1970), Seiten 435 bis 443. Der sporangiumar-

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tige Körper des Stammes C-36,145 unterscheidet sich anscheinend von dem durch die einwandfrei definierten sporangium-bildenden Gattungen erzeugten normalen Sporangium darin,

dass

1. Die letzteren in einer frühen Wachstumsstufe kleine 5 Sporangien bilden, welche im Verlauf der Zeit reifen, und

2. die gewöhnlichen Sporangien in der Regel nicht von einem viskosen Material bedeckt sind.

Krassilnikov und Tsi-Shen haben 1961 die neue Gattung Actinosporangium innerhalb der Familie Actinoplanaceae i o (später übertragen in die Familie Streptosporangiaceae) für den Mikroorganismus vorgeschlagen, der eine Sporenmasse bildet, die dem Sporangium sehr ähnlich ist; vgl. Isv. Akad.

Navk. UdSSR, Ser. Biol. ( 1961 ), Seiten 113 bis 116. Später wurde gefunden, dass der sporangiumartige Körper eine zähe, sporen-15 bildende Masse darstellt und sich vom wirklichen Sporangium unterscheidet. Die Gattung Actinosporangium wurde aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften und der zur Gruppe vom Typ I gehörenden Zellwandzusammensetzung in die Familie

Streptomycetaceae eingereiht.

Auf der Grundlage sämtlicher verfügbaren Merkmale ist der Stamm C-36,145 somit als eine neue Art des Genus Actinosporangium anzusehen. Es sei jedoch festgestellt, dass in der Literatur nur zwei Arten der Gattung Actinosporangium erwähnt werden und dass diese Gattung daher noch nicht voll bestätigt wurde; vgl. H. Prauser, «Die Aktinomycetalen», Int. Symposium der Systematik, 1968, Veb. Gustav Fischer Verlag, Jena (1970), Seiten 329 bis 335.

Die vorliegende Erfindung beschränkt sich nicht auf die Verwendung des speziellen Stammes C-36,145 oder auf Mikroorganismen, welche völlig mit der vorstehenden Beschreibung übereinstimmen. Insbesondere sollen andere Bohemsäure bildende Stämme oder Mutanten dieses Mikroorganismus miteinbezogen sein, welche aus dem beschriebenen Mikroorganismus durch verschiedene Methoden, wie Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV-Licht, Behandlung mit Stickstoff-Senfgasen oder Einwirkenlassen von Bakteriophagen, erzeugt werden können.

Tabelle I

Kulturmerkmale des Stammes C-36,145 Wachstum rückseitige Farbe Luftmyzel diffundierbares Pigment

Rohrzucker/Nitrat-Agar Glukose/Asparagin-Agar Glycerin/Asparagin-Agar anorganisches Salz/Stärke-Agar Tyrosinagar gut

Nähragar schlecht

H efeextrakt/Malzextrakt-Agar gut

Hafermehlagar mässig

Pepton-Hefeextrakt/Eisen- mässig Agar mässig gelblich-rosa gut rötlich-orange bis rot gut rosarot mässig rötlich-orange bis tiefrot spärlich, weisslich üppig, gräuliches Blatt mässig, hellgrau bis blassrosa gering, gräuliches Blatt braun bis tief-purpur-braun gering, gräuliches Blatt farblos tiefrot lebhaftes Rötlich-orange schwarz keines mässig, gräuliches Blatt, teilweise gräulich-rosa mässig, gräuliches Blatt keines keines keines oder rötlich-orange ; keines oder rötlich-rosa

I hellorange, teilweise , hellgelb . dunkelbraun | keines I hellbraun

■ lebhaftes Orange i schwarz

Tabelle II

Physiologische Eigenschaften des Stammes C-36,145

Tests

Reaktionen angewendete Methoden und Materialien

Nitratreduktion in anorganischem Medium

Nitratreduktion in organischem Medium

Magermilchagar

10%ige Magermilchlösung

Gelatineplatte

Melaninbildung

Wachstumstemperatur

N aCl-V erträglichkeit stark positiv stark positiv

üppiges Wachstum; negative Hydrolyse; tief gelblich-rotes bis tief rötlich-purpurnes Myzelpigment bräunliche Brühenfarbe; rötlich-oranges Ringwachstum; weder Peptonisierung noch Koagulierung rasche und vollständige Verflüssigung stark positiv optimales Wachstum bei 28 °C; mässiges Wachstum bei 20 bis 37 °C; langsames Wachstum bei 15 °C; kein Wachstum bei 10 °C bzw. 43 °C

mässiges Wachstum bei 0,5 bis 4% NaCl; kein Wachstum bei 8% NaCl

Rohrzucker/Nitrat-Brühe nach Czapek

Nitratmedium; 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Glukose, 0,5% KNO3 und 0,1 %CaC03 Leudemann-Medium [Intl. J. Syst. Bacteriol. 21 (1971), Seiten 240 bis 247]

Basalmedium: 0,4% Hefeextrakt, 1,0% Malzextrakt und 0,4% Glukose Tyrosinagar und Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar

Basalmedium: 1 % Hefeextrakt, 2% lösliche Stärke und 1,5% Agar

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Tabelle III

Kohlenhydratverwertung des Stammes C-36,145

D(-)-Arabinose

L(+>Arabinose

+ +

D-Xylose

+ +

D-Ribose

+ +

L-Rhamnose

+ +

D-Glukose

+ +

D(+>Galactose

+ +

D-Fructose

+ +

D-Mannose

+ +

Rohrzucker

+ +

Maltose

+ +

Milchzucker

+ +

D(+)-Melibiose

++*

Raffinose

++*

D(+)-Melezitose

-

lösliche Stärke

+ +

Cellulose

-

Glycerin

+ +

Inosit

+ +

D-Mannit

++*

Sorbit

-

Dulcit

—

Basalmedium : Pridham-Gottlieb-Medium * reiche Bildung eines rötlich-orangen Pigments

Herstellung des Bohemsäurekomplexes

Der Bohemsäurekomplex kann durch Kultivierung eines bohemsäurebildenden Stammes von Actinosporangium sp. mit den Merkmalen von A.T.C.C. 31127 oder eines Mutanten davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium erzeugt werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, enthält. Spezielle Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Rohrzucker, Milchzucker, Maltose, Mannose, Fructose, Glukose, Glycerin und lösliche Stärke. Das Nährmedium soll ferner eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Fischmehl, Pepton, Sojamehl, Erd-nussmehl, Baumwollsaatmehl oder Maisquellwasser (corn steep liquor) enthalten. Man kann dem Medium auch anorganische Nährsalze einverleiben. Beispiele dafür sind beliebige der üblichen Salze, welche dazu befähigt sind, Ionen wie Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor-, Brom-, Nitrat- oder Carbonationen, zu liefern.

Die Herstellung des Bohemsäurekomplexes kann bei einer beliebigen Temperatur erfolgen, welche ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus gewährleistet. Man arbeitet beispielsweise bei 20 bis 37 °C, zweckmässig bei etwa 27 °C.

Das Medium ist normalerweise schwach alkalisch; der genaue pH-Wert kann jedoch in Abhängigkeit vom speziellen verwendeten Medium weitgehend variiert werden.

Die Fermentation (Gärung) kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Labor- oder Industrief ermentern mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden. Wenn die Fermentation in einem Gärbottich erfolgen soll, stellt man zweckmässig ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe her, indem man ein geringes Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform des Mikroorganismus beimpft. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, überträgt man es zur grosstechnischen Herstellung der Antibiotika unter aseptischen Bedingungen in das Gärbottichmedium. Das für das vegetative Medium verwendete Inokulum kann dem für grössere Fermentationen verwendeten Medium entsprechen, obwohl man auch andere Medien verwenden kann.

Wie es bei aeroben Submerskulturmethoden üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Das Medium kann mit Hilfe von Bewegungsvorrichtungen bzw. Rührern, wie sie in der Gärtechnik allgemein üblich sind, in Bewegung s gehalten werden.

Eine optimale Bildung des Bohemsäurekomplexes wird im allgemeinen nach Inkubationsperioden von 190 bis 210 h in Rührgefäss- oder Bottichfermentern erzielt. Der Verlauf der Gärung kann dadurch verfolgt werden, dass man das Gärme-io dium von Zeit zu Zeit gegenüber einem für den Bohemsäurekomplex empfänglichen Mikroorganismus, z. B. D. pneumoniae, St. pyogenes oder S. aureus, testet.

Der Bohemsäurekomplex kann aus dem Gärmedium durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organi-i5 sehen Lösungsmittel isoliert werden. Als Lösungsmittel bevorzugt man polare Verbindungen, wie Äthylacetat, Methylisobu-tylketon oder einen höheren Alkohol, wie n-Butanol. Methyliso-butylketon wird besonders bevorzugt. Da die antibiotische Aktivität überwiegend in der Brühe festgestellt wird, kann man so diese vor der Extraktion filtrieren. Nach der bevorzugten Methode extrahiert man jedoch die gesamte Gärbrühe mit dem organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 7,5 bis 8,5. Anschliessend kann man die organische Phase filtrieren und trocknen, wobei man den festen Bohemsäurekomplex 25 erhält. Wahlweise kann der organische Extrakt eingeengt und der feste Komplex durch Verdünnen mit einem geeigneten Nicht-Lösungsmittel, wie Skellysolve B, ausgefällt werden.

Auftrennung und Isolierung von Musettamycin und Marcello-3omycin

Die Auftrennung der Anthracyclin-Antibiotika Musettamycin und Marcellomycin und deren Abtrennung von den übrigen Komponenten des Bohemsäurekomplexes kann durch Chromatographie von Lösungen des Komplexes an Säulen erfolgen, 35 die mit einem geeigneten Adsorbens (z. B. «Sephadex» LH 20; Warenbezeichnung für Dextranderivate, verwendet als Gelfiltrationsmittel in organischen Lösungsmitteln, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) gefüllt ist. Die Bestandteile des Bohemsäurekomplexes werden dann mit Hilfe eines organi-4o sehen Lösungsmittels, wie Chloroform, vom Adsorbens eluiert. Man fängt mehrere Fraktionen auf und bestimmt unter geeigneter Verdünnung deren Extinktionen bei 490 rnji. Man trägt die erhaltenen Werte graphisch gegen die Nummern der entsprechenden Fraktionen auf, um die Peaks für die aus der Säule 45 eluierten Komponenten zu bestimmen. Die auf diese Weise ermittelten richtigen Fraktionen des Elutionsprozesses werden vereinigt und eingedampft. Dabei erhält man die einzelnen Antibiotika in fester Form. Die festen Antibiotika können durch Umkristallisation aus einem organischen Lösungsmittel, so wie Acetontril, Chloroform/«Skellysolve» B oder Methanol, teilweise gereinigt werden.

Die Komponenten Musettamycin und Marcellomycin können nach der in Beispiel 10 und 11 ausführlich beschriebenen Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Methode weiter 55 gereinigt werden. Es wurde gefunden, dass diese Methode extrem reine Proben der beiden Antibiotika liefert.

Der Bohemsäurekomplex oder seine Bestandteile Musettamycin und Marcellomycin können nach an sich bekannten Methoden in die vorstehend beschriebenen pharmakologisch 60 verträglichen Salze übergeführt werden.

Biologische Aktivität 65 Die in-vitro-Mindesthemmkonzentration (MHK) von Musettamycin und Marcellomycin wird nach der Standard-Röhrenverdünnungsmethode für mehrere Mikroorganismen bestimmt.

7

630957

Tabelle IV

Antimikrobielles Spektrum von Musettamycin und Marcellomycin

Test-Mikroorganismus

MHK, ng/ml

Marcello

Musetta

mycin mycin

Bakterien:

Streptococcus pneumoniae A-9585

0,03

0,06

Streptococcus pyogenes A-9604

0,03

0,06

Staphylococcus aureus A-9497

1

0,5

Staphylococcus aureus A-9537

1

1

Escherichia coli A-15119

125

>125

Escherichia coli A-21780

32

32

Klebsiella pneumoniae A-9977

125

>125

Proteus mirabilis A-9900

>125

>125

Pilze (Fungi):

Candida albicans A-9540

125

125

Candida tropicalis A-15051

125

63

Candida krusei A-15052

125

125

Cryptococcus neoformans A-1503

125

63

Trichophyton mentagrophytes

A-9870

>125

>125

Der akute intraperitoneale LDso-Wert bei Mäusen beträgt 9,8 bis 21,12 mg/kg für Musettamycin bzw. 6,35 bis 10,56 mg/kg für Marcellomycin.

Die beschriebenen Verbindungen wurden ferner gegenüber verschiedenen transplantierbaren Nagetier-Tumor-systemen getestet. Einzelheiten der angewendeten Methoden sind in «Cancer Chemoth. Reports» 3, Teil 3 (1972), Seiten 1 bis 87 beschrieben.

Die erste Feststellung der tumorhemmenden Wirkungen wurde am Walker-256-Karzinosarkom, das als fester intramuskulärer Tumor bei Ratten implantiert wurde, festgestellt. Die Behandlung der Versuchstiere mit einer den Bohemsäurekomplex enthaltenden Gärbrühe bewirkte eine 73%ige Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu den unbehandelten Tumoren.

Tabelle V zeigt typische therapeutische Wirkungen von teilweise gereinigtem Musettamacin gegenüber zwei lymphatischen Leukämien, d. h. P-388 und L-1210, Mäusen. Im Falle der Leukämie P-388 ist eine signifikante Tumorhemmung über einen 16fachen Dosisbereich festzustellen.

Tabelle V

Wirkung von Musettamycin gegenüber transplantierten Mausleukämien

Dosis, mg/kg

P-388 (ascitisch)

mittlerer Gewichtsunterschied (B-V), g

B/V prozentuale MÜD

überlebende Tiere am 5. Tag

L-1210 (ascitisch)

mittlerer Gewichtsunterschied (B-V), g

B/V prozentuale MÜD

überlebende Tiere am 5. Tag

6,4 -3,4 160 6/6 -2,5 140 6/6

3,2 -3,0 145 6/6 -2,5 120 5/6

1,6 -2,8 145 6/6 -1,3 133 6/6

0,8 -2,0 140 6/6 -1,1 107 6/6

0,4 -1,6 135 6/6 -

0,2 -2,1 120 6/6 -

Behandlung: einzelne intraperitoneale Injektion am 1. Tag

Auswertung: B/V prozentuale MÜD = mittlere Überlebensdauer (in Tagen) der behandelten Tiere/mittlere Überlebensdauer der Vergleichstiere x 100; B/V > 125 wird als signifikante Verlängerung der Überlebensdauer des Versuchstieres angesehen.

Gereinigtes Musettamycin und Marcellomycin (hergestellt nach den in den Beispielen 10 und 11 beschriebenen Methoden) werden gegenüber Mausleukämie L-1210 getestet. Tabelle VI zeigt die Ergebnisse. Aus den Werten geht hervor, dass Marcellomycin bezüglich der Hemmwirkungen gegenüber diesem Tumor etwa viermal so stark als Musettamycin ist.

Die erfindungsgemäss hergestellten antibiotischen Verbindungen, wie der Bohemsäurekomplex, seine Komponenten

Musettamycin und Marcellomycin sowie deren Salze und Gemische, besitzen sowohl antimikrobielle als auch Antitumor-Aktivität. Arzneimittel können mindestens eine der genannten antibiotischen Substanzen zusammen mit einem verträglichen, so pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Derartige Arzneimittel können auch andere antibakterielle und/oder Antitu-mor-Wirkstoffe enthalten. Man kann die Arzneimittel in jeder beliebigen pharmazeutischen Form zubereiten, die sich für den beabsichtigten Verabreichungsweg eignet. Beispiele für solche 55 Mittel sind Festpräparate für orale Zwecke, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver oder Granulate, Flüssigpräparate für orale Zwecke, wie Lösungen, Suspensionen, Sirups oder Elixiere, sowie Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen.

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Tabelle VI

Wirkung von Bohemsäureprodukten gegenüber L-1210-Leukämie

Verbindung

Dosis,

Tag der

Injek

MÜD,

Wirkung mittlere

überleben

mg/kg/Tag

Verab tionen

Tage auf MÜD,

Gewichts de Tiere

reichung insge

% B/V

änderung,

am 5. Tag

samt

g

Musettamycin

12,8

1

1

10,5

150

-0,6

6/6

6,4

1

1

10,0

143

+0,5

6/6

3,2

1

1

9,0

129

+0,3

6/6

1,6

1

1

9,0

129

+0,3

6/6

0,8

1

1

8,5

121

+ 1,2

6/6

0,4

1

1

8,0

114

+ 1,3

6/6

Musettamycin

6,4

1-—5

5

6,0

86

"1,5

5/6

3,2

1—5

5

11,0

157

-1,3

6/6

1,6

1-5

5

10,0

143

+0,3

6/6

0,8

1-5

5

9,5

136

+0,4

6/6

0,4

1-5

5

9,0

129

+0,6

6/6

0,2

1-5

5

9,0

129

+ 1,8

6/6

Marcellomycin

12,8

1

1

10,0

143

-0,7

3/6

6,4

1

1

11,0

157

"0,7

6/6

3,2

1

1

11,0

157

-0,7

6/6

1,6

1

1

10,0

143

+0,1

6/6

0,8

1

1

10,5

150

0

6/6

0,4

1

1

9,0

129

-0,8

6/6

Marcellomycin

6,4

1-5

4

toxisch toxisch toxisch

0/6

3,2

1-5

5

6,0

86

"1,2

3/6

1,6

1-5

4

6,0

86

-0,1

5/6

0,8

1-5

5

10,0

143

-0,2

6/6

0,4

1-5

5

9,0

129

0

6/6

0,2

1-5

5

9,0

129

-1,1

6/6

Vergleich

Kochsalz

1-5

5

7,0

—

+3,0

10/10

lösung

Inokulum: 106 ascitische Zellen, i. p. in weibliche Mäuse BDFi

Behandlung: i. p. in 0,5 ml Volumen

Bewertung: MÜD = mittlere Überlebensdauer in Tagen: % B/V = mittlere Überlebensdauer der behandelten Tiere/mittlere Überlebensdauer der Vergleichstiere x 100

Kriterium: B/V >125 ist als signifikante Tumorhemmung (Verlängerung der Überlebensdauer des Versuchstieres) anzusehen

Für antibakterielle Zwecke werden die Präparate zweckmässig derart verabreicht, dass die Konzentration des Wirkstoffs höher als die Mindesthemmkonzentration für den jeweils behandelten Organismus ist. Zur Verwendung als Antitumor-mittel bei Warmblütern werden beispielsweise eine Dosis von 2,5 bis 10 mg/M2 für eine einzelne intravenöse Injektion von Marcellomycin sowie eine Dosis von 10 bis 40 mg/M2 für eine einzelne intravenöse Injektion von Musettamycin vorgeschlagen.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken, jj, «Styragel», Phe-nyl/«Corasil» und Phenyl/«Porasil» B sind Warenbezeichnungen der Fa. Waters Associates, Inc. für handelsübliche Gelper-meationschromatographie-Füllmaterialien, die durch chemische Bindung von Organosilanen an Siliciumdioxid erzeugt werden. «Sephadex» LH-20 ist die Warenbezeichnung (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) für ein handelsübliches, modifiziertes vernetztes Dextran, das in der Adsorptions- und Gelfiltrationschromatographie eingesetzt wird.

Beispiel 1

Fermentation im Schüttelkolben

Der Mikroorganismus Actinosporangium sp. Stamm C-36,145 (A.T.C.C. 31127) wird an einem Schrägagarmedium gezüchtet, das aus 2 g D-Glukose, 20 g Hafermehl, 2 g Sojapep-40 ton und 2 g Agar (aufgefüllt auf 1000 ml mit destilliertem Wasser) besteht. Nach mindestens 6 Tage langem Wachstum bei 27 °C werden die gebildeten Sporen in einen 500-ml-Erlen-meyer-Kolben übertragen, der 100 ml eines sterilen Mediums aus 30 g D-Glukose, 10 g Sojamehl, 10 g «Pharmamedia» (Tra-45 ders Oil Mill Co., Fort Worth, Texas, USA) und 3 g CaC03 (ausgefüllt auf 1000 ml mit destilliertem Wasser) enthält. Diese vegetative Kultur wird bei 27 °C an einem Kreisel-Reihenschüt-telapparat (Modell G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.), der auf 210/min eingestellt ist und einen Kreis mit 5,1 cm so Durchmesser beschreibt, inkubiert. Nach 48 h überträgt man 4 ml der Kultur in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums aus 50 g Glycerin, 20 g Sojamehl, 10 g Erdnussmehl und 10 g Ca03 (aufgefüllt auf 1000 ml mit destilliertem Wasser) enthält. Die Kultur wird 144 h lang 55 bei 27 °C an einem auf 230/min eingestellten Schüttelapparat inkubiert. Anschliessend wird im Kulturfiltrat und Myzel antibiotische Aktivität festgestellt, die auf den Bohemsäurekomplex zurückzuführen ist.

60 Beispiel 2 Fermentation im Rührgefäss

Der Bohemsäurekomplex wird in Rührgefäss-Fermentern unter Verwendung einer 48 h alten vegetativen Kultur (wie in Beispiel 1 beschrieben) hergestellt. Man überträgt 400 ml der 65 Kultur in 101 des in Beispiel 1 beschriebenen sterilen Produktionsmediums, das 0,01 % eines Silikon-Schauminhibitors («Hodag» Fl ; Hod.ag Chemical Corp., Skokie, III., USA) enthält und sich in einem 14-1-Rührgefäss befindet. Das Rührgefäss ist

9

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in eine Fermenter-Antriebseinrichtung (Modell FS-614, New Brunswick Scientific Co., Inc., New Brunswick, N.J., USA) eingefügt. Die Temperatur wird bei 27 °C gehalten. Die Geschwindigkeit des Luftstroms beträgt 61/min und der Rührer wird auf 300/min eingestellt. Der Schauminhibitor («Hodag» Fl) wird nach Bedarf zur Schaumregelung automatisch zugeführt. Nach etwa 210 h ist die Inkubierung beendet. Im Kulturfiltrat und Myzel wird der Bohemsäurekomplex festgestellt.

Beispiel 3

Fermentation im Gärbottich

37,81 eines in einem Gärbottich vorgelegten, sterilen Produktionsmediums (vgl. Beispiel 1) werden mit 1,891 einer vegetativen Kultur (hergestellt gemäss Beispiel 1) beimpft, mit einem Impellerrührer bei 300/min gerührt und mit einem Durchsatz von 851/min belüftet. Die Inkubierung erfolgt während 190 h bei 27 °C. Anschliessend wird im Kulturfiltrat und Myzel der Bohemsäurekomplex festgestellt.

Beispiel 4

Fermentation im Gärbottich

30281 eines in einem Gärbottich vorgelegten Produktionsmediums (vgl. Beispiel 1) werden mit 1521 einer vegetativen Kultur (hergestellt gemäss Beispiel 1) beimpft, mit einem Impellerrührer 155/min gerührt, mit einem Durchsatz von 141,61/min belüftet und 190 h lang bei 27 °C inkubiert. Anschliessend ist das Vorhandensein des Bohemsäurekomplexes im Kulturfiltrat und Myzel feststellbar.

Beispiel 5

Isolierung des Bohemsäurekomplexes

Die gesamte Gärbrühe (71) wird beim Ernte-pH-Wert 8,1 20 bis 30 min lang mit etwa dem gleichen Volumen Methylisobu-tylketon verrührt. Anschliessend setzt man eine grosse Menge Kieselgur-Filterhilfe zu und mischt diese durch gründliches Rühren ein. Danach filtriert man das Gemisch unter Absaugen auf eine Filterhilfe. Das Filtrat trennt sich in zwei Phasen auf, von denen man die untere (wässrige) Phase verwirft. Die organische Phase wird im Vakuum stark eingeengt (bis auf 50 bis 100 ml) und mit «Skellysolve» B (Skelly Oil Co.; Warenbezeichnung für eine Petrolätherfraktion vom Kp. 60 bis 68 °C, welche im wesentlichen aus n-Hexan besteht) verdünnt. Dabei fällt ein dunkelroter Feststoff aus, der im Vakuum getrocknet wird und 1,9 g Bohemsäurekomplex liefert.

Beispiel 6

Isolierung des Bohemsäurekomplexes im grosstechnischen Massstab

Die gesamte Gärbrühe (30001) wird bei einem pH-Wert von 8,0 bis 8,5 auf 25 °C abgekühlt und 30 min lang bei 20 bis 30 °C so kräftig mit 30001 Methylisobutylketon verrührt. Dann versetzt man die Emulsion mit 360 kg Filterhilfe und rührt das Gemisch eine weitere Stunde lang gründlich. Nach etwa 30 min langem Absitzenlassen dekantiert man 2300 bis 25001 organische Phase und kühlt sie auf 0 bis 10 °C ab. Das Gemisch wird 20 min 55 lang mit weiteren 8001 Methylisobutylketon verrührt. Nach 30 min langem Absitzenlassen dekantiert man die organische Phase neuerlich und versetzt sie mit der gekühlten ersten Fraktion, so dass man ein Gesamtextraktvolumen von 3300 bis 34001 erhält. Nach Klarfiltration erhält man schliesslich 3100 bis 32001 von Feststoffen und unlöslicher wässriger Phase freien Methylisobutylketonextrakt. Der organische Extrakt wird im Vakuum bei 0 bis 10 °C auf ein Endvolumen von 61 eingeengt. Man fügt 601 «Skellysolve» B bei 20 bis 25 °C unter Rühren zu, filtriert die ausgefallenen Feststoffe an einer Nutsche ab und wäscht mit 101 «Skellysolve» B. Durch Trockensaugen erhält man 900 bis 1000 g eines etwas öligen, dunkelroten, amorphen Produkts. Man verrührt dieses mit viel Äther, filtriert durch einen Büchner-Trichter und spült mit weiterem Äther. Nach Trockensaugen und Vakuumtrocknung erhält man 351 g amorphen, dunkelroten Bohemsäurekomplex.

> Beispiel 7

Fraktionierung des Bohemsäurekomplexes

68 h lang mit Chloroform getränkte «Sephadex» LH-20 wird als Aufschlämmung in eine «Pharmacia» SR 25/100-Säule (25 mm Innendurchmesser, 100 cm Höhe), die an den Enden

> jeweils mit einstellbaren Teflonplättchen ausgestattet ist, gegeben. Die Säule wird so gepackt, dass sie von Plättchen zu Plättchen vollständig gefüllt ist und eine effektive Betthöhe von 90 bis 95 cm aufweist. Man löst 500 mg Bohemsäurekomplex in

10 ml Chloroform und gibt die Lösung auf die Säule auf. ■ Anschliessend entwickelt man im Abwärtsstrom mit Chloroform bei einer Abflussgeschwindigkeit von 1 ml/m. Das Eluat wird in 6-ml-Anteilen in einem Fraktionssammler aufgefangen. Die in den Röhrchen mit geraden Nummern aufgefangenen Proben werden mit Chloroform auf das 80fache verdünnt und 1 in einem Bausch and Lomb «Spektronik» 20-Colorimeter bei 490 mjx untersucht. Es werden vier ausgepräte Banden von Anthracyclinpigmenten wie folgt festgestellt:

25

30

35

Röhrchen-Nr.

Gewichtsmenge nach dem Verdampfen, mg

1 bis 4

5 bis 11

erste Bande

66

12 bis 14

-

15 bis 21

zweite Bande

36

22 bis 35

-

36 bis 44

dritte Bande

18

45

-

46 bis 57

vierte Bande

48

58 ff.

40

60

65

Die erhaltenen Feststoffe werden an Brinkmann 60F254-Kieselgel-Dünnschichtplatten unter Verwendung von Toluol/ Methanol (80:20) als Lösungsmittelsystem chromatographiert. Die erste eluierte Bande erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie als komplexes, inaktives Gemisch. Die zweite Bande ergibt eine charakteristische rosarote Zone bei einem RrWert von etwa 0,75. Diese Fraktion ist ebenfalls inaktiv; es wird festgestellt, dass sie hauptsächlich t|-Pyrromycinon enthält. Die dritte eluierte Fraktion ergibt eine einzelne Zone mit einem RrWert von ~0,3. Es wird festgestellt, dass es sich um Musettamycin handelt, da es sich beim Test gegenüber den Mausleukämiesystemen L-1210 und P-388 als hochwirksam erweist. Die letzte eluierte Bande ergibt eine Zone bei einem Rp Wert von etwa 0,3 und besteht hauptsächlich aus Marcellomycin. Auch diese Komponente zeigt beim Test gegenüber den beiden Mausleukämien eine hohe Wirksamkeit. Obgleich sowohl Musettamycin als auch Marcellomycin bei der Dünnschichtchromatographie RpWerte von etwa 0,3 aufweisen, wandert Musettamycin etwas rascher. Wenn Musettamycin und Marcellomycin im Gemisch vorliegen, erfolgt eine Auftrennung in zwei sehr nahe beieinanderliegende Farbzonen.

Beispiel 8

Fraktionierung im grosstechnischen Massstab

Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 15,24 cm und einer Höhe von 195,6 cm wird an der Basis mit einem nichtver-stopfbaren Filter ausgestattet, auf weichen eine Glaswolleschicht und anschliessend eine kreisförmige Polyäthylenfritte aufgelegt werden. Die Fritte wird auf einen Durchmesser von 14,92 cm zugeschnitten, um eine Quellung in Chloroform zu ermöglichen. Man rührt 8,73 kg «Sephadex» LH-20 3 h lang

630957

10

Chloroform, filtriert, schlämmt den festen Rückstand neuerlich in Chloroform auf und lässt die Aufschlämmung 16 h lang stehen. Dann wird das Gemisch 15 min lang gerührt und danach auf die Säule aufgegeben. Eine 30-g-Probe des gemäss Beispiel 6 hergestellten Bohemsäurekomplexes wird 15 min lang mit 1,51 Chloroform erhitzt und anschliessend 16 h lang gerührt. Durch Filtration werden 7,5 g ungelöstes Material mit einer gewissen Aktivität abgetrennt (bei späteren Versuchen wird festgestellt, dass sich die Probe in 30 bis 40%igem Äthanol vollständig löst; die Ergebnisse der Chromatographie sind gleich wie bei diesem Versuch). Man gibt das Filtrat auf die Säule auf und beginnt mit der Entwicklung mit Chloroform in Abwärtsstrom. Während des gesamten Versuchs wird am Ablass eine Fliessgeschwindigkeit von 16 ml/min aufrechterhalten. Anfänglich fällt ein Eluatvolumen von 1,445 ml an, bevor die Farbe den Boden des Gelbettes erreicht. Wenn dies der Fall ist, wird das Auffangen von 100-ml-Fraktionen begonnen und so lange fortgesetzt, bis die Flüssigkeit wieder relativ hell wird (nach insgesamt 906 Fraktionen). Aliquote Anteile jeder fünften Fraktion werden verdünnt und analysiert, wie in Beispiel 7 beschrieben ist. Es zeigt sich, dass die folgende Auftrennung von vier Komponenten stattgefunden hat:

Fraktion Beschreibung

Gewichtsmenge nach dem Eindampfen

1 bis 20 erste Komponente, Gemisch*,

6,74 g inaktiv

21 bis 44 zweite Komponente, Gemisch,

4,18 g inaktiv**

45 bis 53 verworfen

385 mg

54 bis 70 dritte Komponente, einzelne

Verbindung (Musettamycin),

1,45 g aktiv

71 bis 75 verworfen

198 mg

76 bis 110 vierte Komponente, hauptsächlich

Marcellomycin enthaltendes

Gemisch aktiv

4,03 g

111 bis 200 Nachlauf

1,72 g

* bestimmt durch Dünnschichtchromatographie ** hauptsächlich t|-Pyrrimicinon

Beispiel 9

Teilweise Reinigung von Musettamycin

Der aus der dritten Komponente von Beispiel 8 erhaltene Feststoff (421,4 mg) wird in überschüssigem siedendem Chloroform gelöst. Die Lösung wird heiss durch geriffeltes Filterpapier filtriert. Man engt das Filtrat am Dampfbad bis auf weniger als 20 ml ein, versetzt die warme Lösung tropfenweise mit «Skellysolve» B bis zum Trübungspunkt und fügt anschliessend einige Tropfen Chloroform hinzu. Dann lässt man das Gemisch auf Zimmertemperatur abkühlen und stellt es über Nacht in einen bei -20 °C gehaltenen Gefrierschrank. Danach werden die erhaltenen tiefroten Kristallplättchen isoliert und im Vakuum getrocknet. Man erhält 358 mg Musettamycin vom Fp. 162 bis 163 °C.

Beispiel 10

Reinigung von Musettamycin

Rohes, mit Äthylendiamintetraessigsäure (ÄDTA) gewaschenes Musettamycin wird durch eine Reihe von vier Säulen mit n «Styragel» (Waters Associates, Inc.; Warenbezeichnung für ein Gelfiltrationsmittel, das sich als Säulenfüllmaterial für die Gelpermeationschrömatographie eignet, bestehend aus kleinen Perlen mit einem Durchmesser von 8 bis 10 n.m aus stei-5 fen, vernetzten Polymeren von Styrol-Divinylbenzol) (500-100-100-100X 10~10 m geleitet. Als mobile Phase verwendet man Chloroform mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,7 ml/min für eine anfängliche Reinigung. Es werden neun Chargen von jeweils 100 mg gefahren. Die Elution wird mit Hilfe eines Bre-io chungsindex-Messgerätes (Waters Associates) überwacht. Bei jeder Charge wird die den Hauptpeak aufweisende Fraktion, die nach 37,5 bis 45 min eluiert wird, aufgefangen. Man vereinigt die Hauptfraktionen der neun Durchgänge und dampft im Vakuum zur Trockene ein. Der erhaltene dunkelrote, amor-i5 phe Feststoff (660 mg) wird in 22 ml eines 45:55-Lösungsmittel-gemisches aus Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH-Wert 4,0) gelöst. Man zentrifugiert eine geringe Menge von suspendiertem Material vom Gemisch ab und überträgt den klaren Überstand in eine verschliessbare Penicillinampulle. Ein Teil 20 (1,25 ml, etwa 37 mg) der dunkelroten Lösung wird in eine U6K-Spritze (Waters Associates, Inc.) gegeben. Anschliessend wird die Probe auf die Säule aufgegeben. Man chromatographiert die Probe an einer Säule aus rostfreiem Stahl (Höhe 1 m, Innendurchmesser 4,6 mm), die mit Phenyl/«Porasil» B (Waters Asso-25 ciates, Inc.; Warenbezeichnung für ein gebundenes Phasenmaterial für die Verteilungschromatographie bestehend aus einem vollständig porösen SÌO2 mit daran chemisch gebundenem, flüssigem Diphenyldichlorsilan) (Korngrösse 37 bis 75 jj,m) gefüllt ist. Die mobile Phase besteht aus einem 35:65-Gemisch von 3o AcetonitriI/0,01 m Natriumacetat(pH-Wert 4,0); die Fliessgeschwindigkeit beträgt 1,9 bis 2,0 ml/min. Die Elution wird mit Hilfe eines Brechungsindex-Messgerätes überwacht. In Abständen von jeweils 75 Sekunden werden Fraktionen mit Hilfe eines automatischen Fraktionssammlers (Scientific Manufactu-35 ring Industries) aufgefangen. Es werden 120 Röhrchen gesammelt. Die Säule wird bei einer Fliessgeschwindigkeit von 3 ml/min 15 min lang mit Methanol, 15 min lang mit Wasser und 15 min lang mit einem 35:65-Gemisch von Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH-Wert 4) gewaschen. Anschliessend 40 verringert man die Fliessgeschwindigkeit auf 2,0 ml/min und lässt das System vor der anschliessenden Einspritzung während 5 min ins Gleichgewicht kommen. Man chromatographiert jeweils 25 [il des Eluats in jedem fünften Röhrchen mit Hilfe eines analytischen Systems, um die Zusammensetzung vor der 45 Vereinigung des Inhalts der Röhrchen zu prüfen. Das analytische System besteht aus einer Säule aus rostfreiem Stahl (61 cm Höhe, 2,1 mm Innendurchmesser), die mit Phenyl/«Corasil» (Waters Associates, Inc.; Warenbezeichnung für ein gebundenes Phasenmaterial für die Verteilungschromatographie, beste-50 hend aus einer festen Glasperle, die mit einer einzigen Schicht von SÌO2 mit daran gebundenem Diphenyldichlorsilan überzogen wurde) (Korngrösse 37 bis 50 n.m) gefüllt ist. Als mobile Phase dient ein 45:55-Gemisch von Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH-Wert 4,0); die Fliessgeschwindigkeit 55 beträgt 0,7 ml/min. Das Eluat wird mit Hilfe eines UV-Messge-räts (LDC) bei 254 nm überwacht. Die Röhrcheninhalte werden auf der Grundlage der analytischen Chromatogramme vereinigt. Es wird festgestellt, dass die Röhrchen 61 bis 120 das gewünschte Musettamycin enthalten. Man vereinigt deren fio Inhalt und dampft im Vakuum bei 45 °C ein. Die dunkelroten Rückstände werden mehrmals mit Methanol und zweimal mit jeweils 100 ml Methylenchlorid gespült. Man reibt den Rückstand mit 100 ml Chloroform an und filtriert die anorganischen Salze ab. Anschliessend dampft man unter wasserfreiem Stick-65 stoff zur Trockene ein und trocknet im Hochvakuum über P2O5. Das in der vorstehend beschriebenen Weise gereinigte Musettamycin weist folgende Merkmale auf:

Beschaffenheit: dunkelrotes, kristallines Pulver.

11

630957

Summenformel: C36H45O14N.

Molekulargewicht: 715,76.

Analyse:

ber. C 60,41 H 6,34 N 1,95%

gef. C 60,27 H 6,59 Nl,99%

korrigiert für 0,83 H2O und 0,83 Rückstand:

C 60,27 H 6,50 N 1,99

IR-Spektrum: Das IR-Absorptionsspektrum von Musettamycin (KBr-Pellet) zeigt Hauptbanden bei folgenden Wellenlängen: 3480,2970,2930,2820,2770, 1735,1600,1450,1320,1295, 1220,1160,1010 und 990 cm"1.

UV-Spektrum: Bei einer Konzentration von 0,013 g/1 in Methanol zeigt Musettamycin folgende Maxima und Extinktionen: 233 m|i, 57,7 ; 256 m|i, 33,2; 284 mja., 14,5; 466 mjj, 14,3; 490 m|i, 17,4;510 mji, 14,6;524mjx, 12,9 und 570mjo,,3,3.

Kernresonanzspektrum (NMR-Spektrum):

a) 100-mHz-PMR-Spektrum: Bei einer Konzentration von 25 mg/0,5 ml in CDCh zeigt das Spektrum folgende chemische Verschiebungen in ppm undTermsymbolen: 7,66,s; 7,32,s; 7,21,s (CDCh); 5,50, m; 5,24, m; 5,0, m; 4,48, Quartett; 4,10, s; 3,68, s; 4,2 bis 3,4, überlappende m; 2,16, s; 2,5 bis 1,3, überlappende m und 1,3 bis 0,9 überlappende Dubletts und Tripletts [s = Singulett; m = Multiple«].

b) 25-mHz-CMR-Spektrum: Bei einer Konzentration von 200 mg/ml in CDCh zeigt das Spektrum folgende chemische Verschiebungen und Intensitäten:

Nr. Relative Intensität Frequenz, Hz ppm

Hochdruck-Flüssigkeitschromatogramm: Die Retentions-zeit für Musettamycin beträgt 11 min 20 s bei Verwendung von Modularkomponenten (Waters Associates, Inc.) und Anwendung folgender Bedingungen: 61 cmx2,l mm, Phenyl/«Cora-5 sil»-Trägersäule; 45:55-Gemisch aus Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat(pH-Wert4),0,7 ml/min Fliessgeschwindigkeit; 254 mjx UV-Messgerät.

Schmelzpunkt: 210 bis 212 °C.

Löslichkeit: In den meisten organischen Lösungsmitteln 10 löslich; kristallisiert aus Methanol in höheren Konzentrationen bei 20 °C aus; in Wasser, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Äther unlöslich.

Beispiel 11 15 Reinigung von Marcellomycin

Rohes, mit Äthylendiamintetraessigsäure gewaschenes Marcellomycin wird einer anfänglichen Reinigung mit Hilfe einer Reihe von vier Säulen mit ^ «Styragel» (Waters Associates, Inc.; Handelsbezeichnung für ein in der Gelpermeations-20 Chromatographie als Säulenfüllmaterial eingesetztes Gelfiltrationsmittel, bestehend aus kleinen Perlen mit einem Durchmesser von 8 bis 10 (im aus steifen, vernetzten Polymeren von Sty-rol-Divinylbenzol) (500-100-100-100x 10~10 m). Als mobile Phase dient Chloroform. Die Fliessgeschwindigkeit für diesen 25 Trennprozess beträgt 0,6 bis 0,7 ml/min. Die Elution wird mit Hilfe eines Brechungsindex-Messgeräts (Waters Associates, Inc.) überwacht. Es werden zehn Chargen von jeweils 100 mg gefahren; in jedem Falle wird die den Hauptpeak aufweisende Fraktion, die bei 36 bis 32 min eluiert wird, aufgefangen. Die bei 30 den zehn Durchgängen aufgefangenen Hauptfraktionen werden vereinigt. Man dampft im Vakuum zur Trockene ein und unterteilt den erhaltenen dunkelroten, amorphen Feststoff in 25 Fraktionen von jeweils 30 bis 35 mg. Die Fraktionen werden jeweils in 1 ml eines 45:55-Lösungsmittelgemisches von Aceto-35 nitrii und 0,01 m Natriumacetat (pH-Wert 4,0) gelöst. Die Lösung wird auf ein Chromatographiesystem aufgegeben, das aus einer Säule aus rostfreiem Stahl (Höhe 1 m, Innendurchmesser 4,6 mm) besteht, die mit Phenyl/«Porasil» B (Waters Associates, Inc.; Warenbezeichnung für ein gebundenes Pha-40 senmaterial für die Verteilungschromatographie, bestehend aus einem vollständig porösen SÌO2, an das eine flüssige Phase von Diphenyldichlorsilan chemisch gebunden ist (Korngrösse von 37 bis 75 Jim) gefüllt ist. Als mobile Phase dient ein 45:55-Gemisch aus Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH-Wert 45 4,0); die Fliessgeschwindigkeit beträgt 3,0 ml/min. Die Elution wird mit Hilfe eines Differential-Brechungsindex-Messgerätes (Waters Associates, Inc.) überwacht. In Abständen von jeweils 1 min werden mit Hilfe eines SMI-Fraktionssammlers (Scientific Manufacturing Industries) Fraktionen aufgefangen. Es wer-50 den 95 Röhrchen gesammelt. Danach wird die Säule bei einer Fliessgeschwindigkeit von 4,0 ml/min mit Acetonitril und hierauf 15 min lang mit der mobilen Phase gewaschen, bevor die anschliessende Einspritzung erfolgt. Das in jedem fünften Röhrchen befindliche Eluat wird an einem analytischen System s5 chromatographiert, bevor man die Röhrcheninhalte vereinigt. Das analytische System besteht aus einer Säule aus rostfreiem Stahl (Höhe 61 cm, Innendurchmesser 2,1 mm) von Phenyl/ «Corasil» (Waters Associates, Inc.; Warenbezeichnung für ein gebundenes Phasenmaterial für die Verteilungschromatogra-60 phie, bestehend aus einer festen Glasperle, die mit einer einzigen Schicht von SÌO2 mit chemisch gebundenem Diphenyldichlorsilan überzogen wurde) (Korngrösse 37 bis 50 |im). Die mobile Phase besteht aus einem 45:55-Lösungsmittelgemisch von Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH-Wert 4,0); die 65 Fliessgeschwindigkeit beträgt 0,68 bis 7,0 ml/min. Das Eluat wird mit Hilfe eines UV-Messgerätes bei 254 nm überwacht. 25-nl-Elytionsmittel werden in das System eingespritzt. Die Röhrcheninhalte werden auf Basis der analytischen Chromato-

1

34

4777,66

189,816

2

34

4654,38

184,918

3

60

4303,11

170,962

4

57

4076,06

161,941

5

39

3980,33

158,138

6

45

3961,43

157,387

7

57

3578,36

142,168

8

44

3327,79

132,213

9

52

3299,86

131,103

10

32

3269,30

129,889

11

36

3258,97

129,478

12

32

3021,49

120,043

13

42

2875,63

114,249

14

42

2816,92

111,916

15

37

2812,68

111,747

16

30

2548,48

101,251

17

42

2489,88

98,923

72

1967,51

78,169

78

1935,57

76,900

72

1903,47

75,624

18

27

1852,56

73,602

19

87

1797,79

71,426

20

36

1791,56

71,178

21

34

1775,10

70,525

22

33

1716,43

68,193

23

31

1670,07

66,351

24

30

1649,89

65,550

25

29

1548,63

61,527

26

33

1431,42

56,870

27

64

1318,54

52,386

28

69

1074,95

42,708

29

18

847,88

33,686

30

23

819,21

32,547

31

29

805,76

32,013

32

17

722,16

28,691

33

42

449,34

17,852

34

56

418,12

16,612

35

60

165,37

6,570

630957

12

gramme vereinigt. Im allgemeinen enthalten die Röhrchen 18 Nr. bis 35 ausschliesslich das gewünschte Marcellomycin. Die

Inhalte dieser Röhrchen werden vereinigt. Man dampft bei g

45 °C im Vakuum zur Trockene ein und spült den Rückstand g mehrmals mit Methanol und zweimal mit jeweils 100 ml Methy- 5 jq lenchlorid. Dann reibt man den Rückstand mit 75 ml Methy- ^ ^

lenchlorid an und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum bei 45 °C ^

zur Trockene eingedampft. Der dunkelrote Rückstand wird j ^

dann im Hochvakuum über P2O5 getrocknet. ^

Das in der vorstehend beschriebenen Weise gereinigte 1 " Marcellomycin weist folgende Merkmale auf:

Beschaffenheit: dunkelrotes, amorphes Pulver.

Summenformel: C42H55NO17.

7

15

16

17

18

Molekulargewicht: 845,90. .

Analyse: ^

ber.: C 59,64 H 6,55 N 1,65 0 32,15% ??

gef.: C 56,32 H 6,64 N 1,47 ^

korrigiert für H2O und Rückstand :

C 58,77 H 6,77 Nl,82% £4

IR-Spektrum: Das IR-Absorptionsspektrum von Marcello- 20 25 mycin (KBr-Pellet) zeigt Hauptbanden bei folgenden Wellen- „fi längen: 3450,2960,2940,2820,2790,1730,1615,1600,1450,1260, 1095,1010 und 800 cm-1. 2g

UV-Spektrum: Bei einer Konzentration von 0,013 g/I in 2g

Methanol zeigt Marcellomycin die folgenden Maxima und 25 Extinktionen: 233 mja., 47,5; 256 trip. Schulter, 24,7 ; 284 mjj.

Schulter, 10,6; 490 rnji, 15,8; 410 mjj. Schulter, 3,4; 465 mjj. Schulter, 13,2; 480 mp. Schulter, 14,7 ; 510 m|X Schulter, 12,5 ; 524 mji Schulter, 10,6 und 580 m|i Schulter, 1,1.

Kernresonanzspektrum: 30

a) 100-mHz-PMR-Spektrum : Bei einer Konzentration von 3 ^ 25 mg/5 ml in CD2CI2 zeigt das Spektrum folgende chemische ^ Verschiebungen in ppm und Termsymbolen: 7,63, s; 7,24, s; 5,52, „ m; 530, m; 5,33, m (CD2CI2); 4,94, m; 4,50, Quartett; 4,30 bis 3,90, 34 überlappende m; 3,69, s; 270 bis 0,09, überlappende m; und 2,19, 35 ^ s [s = Singulett, m= Multiplett]. 2g b) 25-mHz-CMR-Spektrum: Bei einer Konzentration von 60 ^7 mg/2 ml in CD2CI2 zeigt das Spektrum folgende chemische Ver- gg Schiebungen und Intensitäten: oQ

40 M 40

Nr.

Relative Intensität

Frequenz, Hz ppm

1

38

3454,09

137,574

2

31

3331,45

132,727

3

56

2964,01

118,088

4

37

2739,81

109,156

5

49

2642,13

105,264

6

37

2627,41

104,678

Relative Intensität

Frequenz, Hz ppm

52

2246,11

89,487

30

1995,14

79,488

46

1969,58

78,469

38

1926,64

76,759

35

1918,43

76,432

37

1682,08

67,015

26

1543,35

61,488

32

1489,08

59,326

29

1484,44

59,141

45

1213,98

48,366

51

1195,68

47,636

55

1155,94

46,053

50

768,18

30,605

54

516,93

20,595

91

455,17

18,134

64

444,15

17,695

43

433,12

17,256

49

378,19

15,067

54

348,77

13,895

50

339,07

13,509

57

305,61

12,176

63

303,14

12,077

49

206,56

8,229

53

96,91

3,861

67

54,60

2,175

136

27,27

1,087

175

0,01

0,000

165

- 27,03

- 1,077

67

- 54,44

- 2,169

103

-264,55

-10,540

40

-478,75

-19,074

38

-491,67

-19,589

50

-514,78

-20,509

47

-533,08

-21,238

32

-610,57

-24,326

49

-899,27

-35,828

67

-918,94

-36,611

80

-926,83

-36,926

79

-1202,93

-47,926

Hochdruck-Flüssigkeitschromatogramm: Die Retentions-zeit für Marcellomycin beträgt 10 min 24 s bei Verwendung 45 von Modularkomponenten (Waters Associates, Inc.) und Anwendung folgender Bedingungen: 61 cmx2,l mm, Phenyl/ «Corasil»-Trägersäule; 45:55-Gemisch aus Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH-Wert 4), 0,68 bis 7 ml/min Fliessgeschwindigkeit; 254 mji, UV-Messgerät.

so Schmelzpunkt: Erweicht bei 134 bis 135 °C; wird allmählich viskoser, schmilzt jedoch bis 300 °C nicht.

G

Claims (7)

1. 630957

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen antibiotischen Verbindungen in Form eines Musettamycin und Marcellomycin der Formel

   CH3CH2.

   COOCH

   worin R bei Musettamycin Wasserstoff und bei Marcellomycin die Gruppe der Formel

   I OH

   OH

   bedeutet, enthaltenden Bohemsäurekomplexes, und von dessen pharmakologisch verträglichen Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Bohemsäure bildenden Stamm von Actino-sporangium sp. mit den Charakteristika von A.T.C.C. 31127 in einem assimilierbaren Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthaltenden wässrigen Nährmedium unter submersen, aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge des Bohemsäurekomplexes durch den Mikroorganismus im Kulturmedium züchtet und den Komplex aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenenfalls zu pharmakologisch verträglichen Salzen umwandelt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bohemsäure bildenden Stamm Actinosporangium sp. A.T.C.C. 31127 verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Bohemsäurekomplex durch Extraktion der gesamten Gärbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel isoliert.
4. 4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die einzelnen Antibiotika Musettamycin und Marcellomycin vom isolierten Komplex abtrennt und gegebenenfalls zu pharmakologisch verträglichen Salzen umwandelt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antibiotika Musettamycin und Marcellomycin durch Gelfiltrationschromatographie vom Komplex abtrennt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

   dass man in einer zusätzlichen Stufe das Marcellomycin und Musettamycin durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie reinigt, wobei man als Adsorptionsmittel ein durch chemische 35 Bindung von Organosilanen an Siliziumdioxid erhaltenes gel-permeationschromatographisches Füll-bzw. Packungsmaterial verwendet.
7. 7. Nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellte, neue antibiotische Verbindungen.

   40