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Verfahren zur Erzeugung und Gewinnung eines Antibiotikums Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines antibiotischen Stoffes.
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Die Züchtung von Bakterien und Pilzen unter genau festgelegten vorgeschriebenen
Bedingungen während der letzten Jahre ergab Stoffwechselprodukte, die als äußerst
wirksam gegen krankheitserregende Organismen erkannt wurden. Es sind dies unter
anderem Penicillin, Streptomycin, Aureomycin und Terramycin.
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Gemäß der Erfindung wird ein Antibiotikum erzeugt, das eine ganz bestimmte
bakteriocide und/oder bakteriostatische Wirkung gegen krankheitserregende Organismen,
und zwar insbesondere gegen solche des Grampositiv und des Grampositiv säurebeständigen
Typs besitzt. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Ausarbeitung eines Verfahrens,
nach welchem die antibiotische Substanz dadurch erzeugt werden kann, daß man einen
aus dem Nährboden isolierten Mikroorganismus präparieH, ein Nährmedium damit impft,
in Gärung versetzt und die antibiotische Substanz aus dem vergorenem Medium extrahiert.
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Das Herstellungsverfahren besteht aus mehreren Stufen, welche untereinander
in Beziehung stehen, deren Merkmale aus der folgenden, ins einzelne gehenden Beschreibung
ersichtlich werden.
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Der Mikroorganismus, welcher das neue Antibiotikum erzeugt, wurde
aus einem Stück Land in Brooklyn, New York, isoliert und mit dem Namen Streptomyces
crystallinus belegt.
Der Mikroorganismus kann aus seinem Nährboden
dadurch isoliert werden, daß man ihn in ein wäßriges Medium einrührt, dann absitzen
läßt, die überstehende Flüssigkeit mit einer Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze
enthaltenden Lösung mischt, auf eine Temperatur unterhalb ioo° erhitzt und einige
Zeit auf dieser Temperatur hält.
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Die Herstellung der antibiotischen Substanz erfolgt dadurch, daß man
ein Nährmedium mit dem aus dem Boden isolierten Mikroorganismus impft. Das Nährmedium
enthält zweckmäßig wichtige Mineralsalze, assimilierbares Kohlehydrat und stickstoffhaltige
Verbindungen. Die Gärung des Mediums wird dann aerob bei einem p11-Wert zwischen
etwa 6 und etwa 8 und zweckmäßig bei etwa 7,5 bei einer Temperatur von etwa 28°
eingeleitet. Man läßt die Gärung mehrere Tage fortschreiten. Wachstum und oberflächliche
Mycelbildung erfolgen bei 24, 32 und 37°, wie an Kartoffeldextrose-Schrägagar bestimmt
wurde. Das Gärungsmedium wird filtriert, wodurch das Mycel entfernt und die antibiotische
Substanz aus dem Filtrat durch eine Extraktion z. B. mit einem mit Wasser nicht
mischbaren Lösungsmittel, wie n-Butanol, sekundäres Butanol und Amylacetat, gewonnen
wird.
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Das Antibiotikum wurde in amorpher und äußerst reiner Form dargestellt.
Das Ausgangsmaterial zur Herstellung des äußerst reinen Stoffes ist für gewöhnlich
ein wie nachstehend beschrieben hergestellter, im Hochvakuum eingefrorener und entwässerter
lyophilisierter Feststoff. Es können jedoch auch unter Vermeidung der Lyophilisierung
drei vereinigte Butanolfiltrate zur weiteren Reinigung verwendet werden. Das Antibiotikum
wird dann in äußerst reiner Form dadurch erhalten,. daß man solche teilweise gereinigten
Präparate einer Adsorption oder einer Trennehromatographie unterwirft. Im folgenden
werden Elementaranalysen von vier Präparaten des erfindungsgemäßen Antibiotikums
angegeben:
| C I H I N |
| I. ................. 53,90 6,30 3,o6 |
| II.................. 53,49 6,64 2,79 |
| III.................. 53,93. 6,14 3'02 |
| IV.................. 53,20 6,16 2,92 |
| berechnet für |
| C21H29N011 ....... 53,6o 6,2o 2,98 |
Präparat I wurde aus einem rohen lyophilisierten Feststoff aus einem Verteilungschromatogramm
hergestellt.
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Präparat II war dasselbe wie I, nur mit der Ausnahme, daß der Stoff
erneut in zwei Lösungsmittelsystemen gelöst und wieder ausgefällt wurde.
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Präparat III wurde aus einem rohen lyophilisierten Feststoff unter
Verwendung eines Verteilungschromatogramms, das von dem zur Herstellung von I verwendeten
leicht verschieden war, hergestellt.
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Präparat IV war dasselbe wie I, nur mit der Ausnahme, daß es noch
einmal durch eine Säule aus aktivierter Tierkohle geschickt wurde-Tabelle I gibt
die Verteilungskoeffizienten für das Antibiotikum in verschiedenen wäßrigen Zweiphasensystemen
an.
| Tabelle I |
| Verteilungskoeffizienten |
| Lösungsmittelsystem Verteilungs- |
| koeffizient |
| n-Butanol - Wasser ................ 1 |
| 5o0/6 n-Butanol und 50% Äthylacetat |
| - Wasser...................... z |
| 20% n-Butanol und 80% Äthylacetat |
| - Wasser ..:..................... 1/4 |
| =0% n-Butanol und go% Äthylacetat |
| - Wasser . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . 1/9 |
| n-Butanol - pH-g-wäßriger Puffer ..... 1/2 |
| 50% n-Butanol und 50% Petroläther - |
| p.-9-wäßriger Puffer . . . . . . . . . . . . . .
1/6 |
| Äthylmethylketon - p,1-g-wäßriger |
| Puffer ........... . ............... 1/5 |
| io% n-Butanol und go°/o Äthylmethyl- |
| keton -Wasser .................. 1/ |
| 2 |
| 250/G n-Butanol und 750/G-Äthylmethyl- |
| keton - Wasser .............. .. 1/2 |
| 50% n-Butanol und 50% Äthylmethyl- |
| keton - Wasser . _.............. 1/3 |
Das neue Antibiotikum ist in Wasser sehr gut löslich (i g oder mehr in i ccm) und
leicht löslich in Methanol und Äthanol (mehr als ioo mg/ccm). . Das Antibiotikum
ist nur etwas schwächer löslich in ß-Methoxyäthanol, 1, 4-Dioxan und n-Butanol (mehr
als 40 mg/ccm) sowie in Formamid und Dimethylformamid (mehr als 3o mg/ccm). Das
Antibiotikum ist in Aceton und Äthyhnethylketon nur schwach löslich (etwa 4 mg/ccm)
und etwas weniger löslich in Diäthylketon und mit Wasser gesättigtem Äthylacetat
(i bis 1,5 mg/ccm). Das Antibiotikum besitzt eine sehr geringe Löslichkeit in Äthylacetat-
(0,4 mg/ccm) und ist in Lösungsmitteln, wie Chloroform, Äther, Benzol, Petroläther
usw., unlöslich. Das Antibiotikum löst sich in heißem Pentanol (mehr als
30 mg/ccm), fällt jedoch beim Abkühlen der Lösung"auf Raumtemperatur aus.
Bei 26° hergestellte Papierchromatogramme ergaben die folgenden R f-Werte.
| Lösungsmittelsystem I RF-Werte |
| 98% Äthylacetat und 2% n-Butanol, mit |
| Wasser gesättigt ... . ............... 0,12 |
| n-Butanol mit Wasser gesättigt . . . . . . . . o,96 |
| n-Hexanol mit Formamid gesättigt ..... 0,25 |
Das Antibiotikum hat sich als verhältnismäßig stabile Verbindung in wäßriger Lösung
erwiesen. Diese Tatsache ist aus Tabelle II zu ersehen.
| Tabelle II |
| Stabilität des erfindungsgemäßen Antibiotikums |
| in wäßriger Lösung bei verschiedenen p11-Werten und |
| Temperaturbedingungen |
| PH Zeit in Std. ° C °% verbliebener |
| Wirksamkeit |
| 3 2 25 94 |
| 7 2 25 >r00 |
| 9 2 25 89 |
| 3 41/s 25 93 |
| 7 41/2 25 >loO |
| 9 41/2 25 >loo |
| 3 1 65 9i |
| 7 1 65 89 |
| 9 1 65 65 |
| 3 3 65 94 |
| 7 3 65 95 |
| 9 3 65 85 |
| 3 1 ioo 96 |
| 7 1 100 $2 |
| 1 ioo 46 |
| 3 3 100 76 |
| 3 ioo 81 |
| 9 3 ioo 48 |
| o,i n-HC1 1 25 89 |
| o, i n-H C1 4 25 94 |
| o,i n-HCl 1 100 0 |
| o, i n-Na O H 1 25 70 |
| o,i n-NaOH 4 25 40 |
| o,i n-NaOH 1 ioo 0 |
Das Ultrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums in einer Mineralölaufschlämmung
zeigt bei etwa den folgenden Wellenlängen Maxima: 3400, 1725, 166o, 162o, 1283,
1215, 1170, 1137, 1070, io28, 964, 9i5, 85o, 816 und 722 cm-'.
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Der im Bereich von 1350 und 650 cm-' liegende charakteristische
Teil des Ultrarotabsorptionsspektrums ist in der Zeichnung dargestellt.
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Tabelle III stellt die Dosierungen des neuen Antibiotikums im Vergleich
mit Aureomycin und Terramycin zusammen, welche zur Erzielung einer wesentlichen
und vergleichbaren Verlängerung der Überlebenszeit behandelter Tiere, verglichen
mit unbehandelten Kontrolltieren, erforderlich sind, wenn die Infektionen tödlich
sind. Die verwendeten Tiere waren für den Salmonellatest Küken und für den M. Tuberculosetest
Mäuse.
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Giftigkeit Das Antibiotikum wurde in wäßriger Lösung verabreicht.
Die Tiere wurden 2 Wochen beobachtet. Bei allen trat jedoch der Tod innerhalb i
Stunde ein. Die Todesfälle wurden als Anzahl toter Mäuse pro Anzahl mit dem Mittel
versehener Mäuse angegeben.
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Intravenös, Dosierung in mg/kg.
LDbp - iiio mg/kg, i9/2o Grenzen, io67 bis 1154 mg/kg.
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Intrapertioneal. Die meisten Todesfälle traten innerhalb 24 Stunden
auf, einige wurden jedoch bis zu io Tagen verzögert. Alle Tiere wurden 2 Wochen
beobachtet.
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Dosierung in mg/kg
LDsö Intraperitioneal wurde wegen der geringen akuten Giftigkeit nicht bestimmt.
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Die Isolierung des Organismus aus seinem Nährboden kann auf die folgende
Weise erfolgen: io g des Bodens werden in io ccm sterilisiertem Wasser sorgfältig
durchgeschüttelt, worauf man etwa io bis 2o Minuten absitzen läßt. Von der überstehenden
Flüssigkeit werden zehn Tropfen abgezogen und mit io ccm einer Natriumchlorid, Kaliumchlorid
und Calciumchlorid in der folgenden Zusammensetzung enthaltenden Lösung vermischt:
Natriumchlorid 3 g, Kaliumchlorid 2 g, Calciumchlorid 2 g, destilliertes Wasser
iooo ccm. Aus der überstehenden Salzsuspension werden fünf Tropfen entnommen und
in einen 25 ccm Kolben eingetragen. Die zurückbleibende Suspension wird etwa 15
Minuten auf etwa 53° erhitzt. Jeweils fünf Tropfen der erhitzten und der nicht erhitzten
Salzsuspension werden in einen 125-ccm-Kolben eingebracht. Jedem Kolben wird genügend
Agar zugegeben, um aus der ersten Verdünnung jeweils eine Platte zu erhalten. Dann
schüttelt man gut und gießt in Petrischalen (Verdünnung Nr. i). Dann gibt man in
dieselben Kolben genug Agar, um jeweils zwei Platten zu erhalten
| Tabelle III |
| Verlängerung der Überlebenszeit |
| Erfindungsgemäßes Aureomycin Terramycin |
| Antibiotikum Hydrochlorid Hydrochlorid |
| Anzahl Menge jeder Menge jeder Anzahl Menge jeder |
| Anzahl |
| ' der Dosierung der Dosierung der Dosierung |
| Dosierungen in mg/kg Dosierungen in mg/kg Dosierungen in mg/kg |
| Körpergewicht Körpergewicht Körpergewicht |
| Salmonella gallinarum .. 4 15 4 65 4 65 |
| Mycobacterium tubercu- |
| losis ................ 15 200 15 >loO 15 ioo |
(Verdünnung Nr. 2, jeweils zwei Platten). Man gibt in dieselben
Kolben eine weitere Agarmenge, mischt und gießt in die Petrischalen (Verdünnung
Nr.3, jeweils eine Platte). Die Platten werden bei einer Temperatur von etwa 28°
etwa q. bis 8 Tage stehengelassen. -Die Organismen werden gesammelt und auf sterilen
Kartoffelschrägagars ausgebreitet und nach 7 bis 8 Tagen wieder gesammelt. Der Agar
kann die folgende Zusammensetzung besitzen: zo g Dextrose, 0,5 g Asparagin, 3,5
g primäres Kaliumphosphat, 0,5 g sekundäres Kaliumphosphat, 2o g Rindfleischextrakt,
30 g Agar, iooo ccm destilliertes Wasser, pH-Wert etwa 6,2.
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Der Organismus, der aus der Brooklyn-Erde isoliert wurde und jetzt
als Streptomyces crystalhnus bezeichnet wird, kann folgendermaßen charakterisiert
werden Auf Gelatine: Häutchen auf der Seite des Glasrohrs. Mycel dunkelbraun. Sporen
stumpfweiß. Es bildete sich eine dunkelbraune, ein Viertel der Höhe nach unten der
Mitte zu absinkender Streifen. Auf der Gelatine fand eine leichte Verflüssigung
statt.
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Auf Dextrosebrühe: Kein Ring oder Häutchen. Gelbbraunes Wachstum am
Boden des Rohres. Rotbraune Flüssigkeit.
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Auf Czapek Dox: Gutes Wachstum. Die Sporen waren weiß. Kein diffuses
Pigment.
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Auf Lackmusmilch: pg 6,5. An der Glaswand haftete ein Ring. Mycel
braun. Sporen weiß. Gelbbraunes Sediment am Boden der Röhre. Braune undurchsichtige
Flüssigkeit.
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Auf Kartoffelagar: Mycel dunkelbraun. Sporen weiß. Mittelbraunes diffuses
Pigment.
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Auf Kartoffelschnitzel: Mycel dunkelbraun. Sporen grau mit hellbraunem
diffusem Pigment.
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Auf Mohrrübenschnitzel: Sehr spärliches Wachstum. Sporen grau, keine
Diffusion.
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Dünne, zarte, braune Hyphae mit einem Durchmesser von x bis 1,5 ,u,
monopodiale Verzweigung; Sporen werden in sporenbildenden Hyphae getragen, Durchmesser
der Sporen i ,u, Spiralen wurden nicht gefunden.
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Kulturen von Streptomyces crystallinus bilden charakteristische Kristallrosetten
in der Nähe des Substrat-Mycels auf den folgenden Medien: Bennett-Agar, Emerson-Agar,
Waksman-Dextroseagar, Dextrose-Nitratagar, Hefeextraktagar, Asparaginagar, Kartoffel-dextrose-Agar
und Gelatine. Die Kulturen bilden diese Kristalle jedoch nicht auf Czapek-Dox-Agar
oder Stärkeagar. Auf synthetischem Agar (Szapek Agar) sind die Conidiophoren manchmal
buschartig, d. h. mit kurzen, in der Mitte befindlichen Conidiophoren, von welchen
eine Anzahl langer Verzweigungen ausgeht, wobei die ganze Struktur 115 ,u hoch oder
höher ist. Man beobachtet auch extrem lange Conidiophoren mit einzelnen und auf
entgegengesetzten Seiten befindlichen Zweigen, wobei die ganze Länge bis zu etwa
66o ,u beträgt. Die Conidien sind zylindrisch und i bis 1,8 ,u lang.
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Natürlich ist man zur Herstellung des Antibiotikums nicht auf diesen
besonderen Organismus oder die Organismen, welche aus dieser besonderen Bodenprobe
gewonnen wurden, oder auf Organismen beschränkt, welche der vorstehenden Beschreibung
vollständig entsprechen. Diese ist vielmehr zur Erläuterung. gedacht. Insbesondere
schließt die Erfindung die Verwendung von Organismen ein, welche Abkömmlinge des
beschriebenen Organismus sind und durch mutierende Einflüsse, z. B. Röntgenbestrahlungen,
Ultraviolettbestrahlungen usw., erzeugt wurden.
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Der antibiotische Stoff wird dadurch erzeugt, daß man den Organismus
auf einem Nährmedium züchtet, das die erforderlichen Mineralsalze, assimilierbares
Kohlehydrat und stickstoffhaltige Stoffe enthält, und daß man eine aerobe Gärung
durchführt. Das Nährmedium kann als Kohlenstoffquelle, z. B. Stärke, Dextrin, Maltose,
Dextrose, Xylose, Galactose und Glycerin, und als Stickstoffquelle, z. B. Aminosäuren,
Kasein oder Kaseinhydrolysate, Sojabohnenmehl, Peptone, z. B. Sojapepton, Körperpepton,
Weizenkeimflüssigkeit, Fleischextrakte und Rückstände der Branntweinherstellung
sowie anorganische Stoffe, wie Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium, welche als
Chloride, Sulfate, Phosphate u. dgl. vorliegen können, enthalten. Die Anwesenheit
verschiedener der sogenannten Spurenelemente, wie Bor, Molybdän und Chrom, kann
ebenfalls erforderlich sein. Diese Spurenelemente werden jedoch nur in solch verschwindend
kleinen Mengen benötigt, daß sie vollständig als Verunreinigungen in den verwendeten
Bestandteilen wohl enthalten sind. Die Gärung kann zweckmäßig in Erlenmeyerkolben
von geeignetem Fassungsvermögen durchgeführt werden, und die Kolben werden zur Belüftung
eine geeignete Zeit auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, wobei die Lösung einen
pH-Wert zwischen 6,5 und etwa 8 und zweckmäßig von etwa 7,5 besitzt.
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Die Belüftung kann so erfolgen, daß man 1/4 bis x Volumen (für gewöhnlich
etwa 1/2 Volumen) sterile Luft/Volumen/Medium/Minute durch die Gärungsmischung schickt.
Eine weitere Bewegung der Mischung kann durch einen mechanischen Rührer od. dgl.
bewirkt werden. Ein das Schäumen verhinderndes Mittel, z. B. i°/, Octadecanol in
flüssigem Schweineschmalz, kann gegebenenfalls zugesetzt werden. Der ganze Prozeß
wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
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Herstellung der Impfstoffe. Kleine Agarstückchen aus einem Schrägagar-Testglas
werden nach einer sterilen Standardmethode in mehrere ioo-ccm-Proben eines jeweils
in 5oo-ccm-Erlenmeyerkolben befindliche Proben sterilen Mediums eingebracht. Der
Inhalt der Kolben wird auf mechanischen Schüttelmaschinen bei etwa 28° während etwa
2 Tagen gekeimt. ioo bis Zoo ccm dieses Primärinoculums werden zur Impfung von etwa
41 in. einer 9-1-Glasflasche befindlichem sterilem Medium verwendet. Die Inkubationszeit
beträgt 2o bis 6o Stunden, in der Regel etwa 30 Stunden, bei einer Temperatur
zwischen etwa 24 bis 35° und zweckmäßig von etwa 28°. Dann werden 6 bis i21, zweckmäßig
etwa 81, des in der Flasche enthaltenen Inoculums zur Impfung von iooo bis 2ooo
1 von in Gärungsbehältern befindlichem sterilem Medium benutzt. Gärungen in großem
Maßstab werden geeigneterweise bei einer Temperatur zwischen etwa 24 und etwa 35,
zweckmäßig bei etwa 28° durchgeführt,
und zwar während etwa 4o bis
8o, insbesondere etwa 6o bis 65 Stunden.
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Als Nährmedium hat sich das folgende zur Erzielung eines guten Wachstums
und einer guten Ausbeute an Antibiotikum als geeignet erwiesen, zumal seine Bestandteile
verhältnismäßig billigundleicht erhältlich sind Medium 1 Dextrose ..............................
i,oo g Saccharose ............................. o,50 g Caseinhydrolysat . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,509 Calciumcarbonat . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 0,5o g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . o,25 g entbitterte, getrocknete Hefe . . . . . . . . . . . .
. o,12 g Leitungswasser bis auf . . . . . . . . . . . . . . . . . . loo ccm Die
pH-Werte liegen zwischen etwa 6,8 und etwa 7,1 vor der Sterilisation bei einem Dampfdruck
von 1,05 at während 3o bis 45 Minuten. Nach der Sterilisation liegen die pH-Werte
bei etwa 7 bis 7,3.
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Als andere Gärungs- oder Nährmedien können die folgenden Zusammensetzungen
verwendet werden. Natürlich wird die Differenz der angegebenen Prozentgehalte auf
Zoo durch Wasser ausgeglichen.
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Medium 2 Sojapepton ............................ 0,50°/0 Hefeextrakt
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o,2o 0/0 Natriumchlorid
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,225 0/0 Maltose ..............................
. l,oo0/0 Dextrose .............................. 0,50 0/0 Calciumcarbonat . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o,5o 0/0 Medium 3 Caseinhydrolysat . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o,5o 0/0 Natriumchlorid .. . ..........
.... .... . . .. o,50 0/0 Dextrose .............................. l,oo 0/0 Rindfleischextrakt
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 0/0 Medium 4 Weizenkeimflüssigkeit.................
... 1,25 0/0 Magermilchpulver . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2,5
0/ a Maltose ................................ 1,oo0/0 Ammoniumphosphat (einbasisch)
(NH4)2HP04 . ... .... . ... .. . . ... . ... . 0,20 0/0 Kaliumphosphat (einbasisch)
KZHPO4 .... o,15 % Kaliumphosphat (zweibasisch) KH2P04 ... 0,05 0/0 Magnesiumsulfat
M9S04 - 7H20 ... . . .. . . 0,0250/0 Medium 5 Getreidestärke ..........................
i,oo g Sojapepton ............................ 1,509
Natriumchlorid . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o,2o g (NH4)2HP04 . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20 g KH,P04 . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 0,159 K2HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 0,059
M9S04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 0,0259
pH 5,12 vor der Sterilisation.
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Man beobachtete, daß nach viertägiger Gärung von Medium 2 der pH-Wert
der Lösung 7,4 bis 7,5 betrug und daß die Lösung 6o Einheiten/ccm enthielt. Die
hier und nachstehend erwähnten Einheiten sind Rohrverdünnungseinheiten. Danach wurde
das Medium filtriert und das Filtrat bakteriologisch auf seine wachstumshemmende
Wirkung getestet und zur Gewinnung des Antibiotikums in verhältnismäßig reiner Form
extrahiert.
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Es sei bemerkt, daß Streptomyces crystallinus offensichtlich noch
mehrere andere Antibiotika außer dem obengenannten erzeugt und daß sowohl das verwendete
Medium als auch andere Gärungsbedingungen einen Einfluß auf das relative Mengenverhältnis
der verschiedenen erzeugten Antibiotika besitzen. Streptomyces hemolyticus, C-203,
hat sich als besonders empfindlich gegenüber dem Antibiotikum erwiesen, und zwar
so stark, daß dieser Organismus als Testorganismus verwendet werden kann. B. subtilis
ist andererseits weniger empfindlich gegenüber dem Antibiotikum. Das umgekehrte
Empfindlichkeitsverhältnis wurde indessen für andere von Streptomyces crystallinus
erzeugte Antibiotika gefunden, und ein wesentlicher Teil des hier beschriebenen
Reinigungsverfahrens bezweckt eine Abtrennung des gewünschten Antibiotikums von
den anderen. Daß das Medium das relative Mengenverhältnis der verschiedenen, von
Streptomyces crystallinus erzeugten Antibiotika wesentlich ändern kann, wird durch
die folgenden Werte angezeigt: Medium Sojapepton ............................
1,509
Getreidestärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l,oo
g (NH4)2HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20 g KH,P04 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,15 g KIHP04 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g M9S04 - 7H20 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,0259
NaCl . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o,--o g Lösung von Spurenelementen
(Wise. A-Z) .. o,lo g Destilliertes Wasser bis auf . . . . . . . . . . . . . . Zoo
ccm Unter Verwendung des obigen Mediums und beim Keimen in kleinen Gefäßen auf rotierenden
Schüttelvorrichtungen bei 28° wurde gefunden, daß der anfängliche Gärungs-pg-Wert
wichtig zur Erzeugung des gewünschten Antibiotikums ist, welches gegen den C-203-Organismus
vorzugsweise wirksam ist im Gegensatz zu den anderen, welche gegen B. subtilis aktiv
sind, und umgekehrt. Testergebnisse typischer Gärungsmedien sind die folgenden
| Anfänglicher PH-Wert Zonenablesungen |
| B. subtilis i C-203 |
| 5 0 8,4 |
| 6 0 6,o |
| 7 4,9 3,6 |
| 8 4,0 4,8 |
Die vorstehend angegebenen Zonenablesungen wurden durch Bestimmung der Zonenbreite
zwischen der Kante der Vertiefung in Agar, in welcher sich die Lösung des Antibiotikums
befand, und der Kante der Zone erhalten.
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Teste haben gezeigt, daß die Gärungsflüssigkeit von Medium 2 das Wachstum
einer Anzahl von
Organismen verhinderte. Die erzielten Ergebnisse
sind im folgenden angegeben:
| 7 Röhren- 15 Röhren- |
| Ver- Ver- |
| dünnungs- dünnungs- |
| ein- ein- |
| heiten/ccm heiten/ccm |
| Micrococcus pyogenes var. |
| Micrococcus aureus Zog pyogenes . . . . . . . . var. . . .
. . -*) -f-**) |
| aureus C .............. - -f- |
| Micrococcus pyogenes var. |
| aureus W .............. |
| Micrococcus pyogenes var. |
| aureus H .............. - |
| Streptococcus haemolyticus - |
| Streptococcus haemolyticus |
| C-203.................. |
| Bacillus subtilis W. ....... -f- -E- |
| Bacillus subtilis P......... - |
| Bacillus subtilis R. ....... - |
| Pneumococcus III ....... - |
| Pneumococcus M . . . . . . . . -f- |
| Streptococcus fecalis |
| (Enterococcus).......... - |
| Streptococcus pyogenes |
| C-203 (Haemolyticus) M - |
| Bacillus Coli B . . . . . . . . . . - |
| Bacillus Coli...... Klebsiella pneumoniae 41 . . |
| Klebsiella pneumoniae B . - |
| Sahnonella typhimurium |
| Salmonella Norwich ...... - |
| Proteus Vulgaris OXig .... - -f- |
| Aerobacter aerögenes B ... - - |
| Pseudomonas aeruginosa |
| Micrococcus L ........... - |
| Mycobacterium smegmatis |
| 607 ................... |
| Bacillus cereus.....:...... - |
| Serratia marcescens ....... `) -.unwirksam |
| `°^) -+- hemmend |
Außer den vorstehenden Organismen hemmt das Antibiotikum, in vitro, Mycobacterium
tuberculosis BCG in einer Verdünnung von 1-: 640 und Myco= bacterium tuberculosis
H 37 rv (gegen Streptomycin beständiger Stamm) in einer Verdünnung von i : 16o.
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Die Extraktion des Antibiotikums kann auf die folgenden Arten erfolgen
Verfahren A Der antibiotische Stoff kann aus der Gärungsflüssigkeit dadurch extrahiert
werden, daß man 41 derselben nimmt, den pH-Wert auf etwa 6,9 bis etwa
7,9, zweckmäßig auf etwa 7,5, einstellt und dreimal jeweils mit 11 eines
mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels extrahiert. Das Lösungsmittel kann n-Butanol,
sek.-Butanol, Aceton, Amylacetat oder Amylalkohol sein. Das Lösungsmittel, z. B.
Butanol, wird abgetrennt und mit einer verdünnten Mineralsäure, z. B. io°/oiger
Schwefelsäure, auf einen pH-Wert von---1,7 bis -3,3, zweckmäßig von etwa 2,2 bis
--#2,5, gebracht.
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ZurAbtrennung des Wassers werden etwa i5oo ccm n-Pentan zu der Butanollösung
zugegeben, worauf etwa 300 ccm einer hellbraunen Wasserlösung in einem Scheidetrichter
abgetrennt werden. An Stelle von n-Pentan kann auch Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff
oder Hexan verwendet werden.
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Das Butanol wird dann mit Zoo ccm destilliertem Wasser. gewaschen,
in einem Scheidetrichter geschüttelt und die Wasserlösung abgetrennt. Diese Lösung
wird bei Räumtemperatur unter einem Ventilator konzentriert. Nach Konzentrierung
auf das io fache werden 'il/, Volumen Aceton zugegeben. Der erhaltene Niederschlag
wird abfiltriert, das Aceton wird verdampft, und die erhaltenen ioo ccm einer hellbraunen
Lösung zeigten einen Gehalt von Zoo Einheiten/ccm.
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Ein anderes Verfahren besteht darin, daß man die Gärungsflüssigkeit
auf einen pH-Wert zwischen etwa 1,7 und etwa 3,3, zweckmäßig auf etwa 2,2, mit einer
Mineralsäure, wie z. B. Schwefelsäure, ansäuert und dann dreimal mit jeweils iooo
ccm n-Butanol extrahiert. In dem Butanol bildet sich ein dunkelbrauner Niederschlag,
welcher abzentrifugiert wird. Die erhaltene dunkelbraune, klare Butanollösung wird
mit einem geeigneten alkalischen Stoff, z. B. Ammoniak oder den Carbonaten, Bicarbonaten
und Hydroxyden von Natrium und Kalium, neutralisiert.
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1500 ccm n-Pentan werden zugegeben, worauf man 300 ccm einer
dunkelbraunen Lösung abtrennt. Das Butanol wird dann mit Zoo ccm destilliertem Wasser
gewaschen. Die beiden. Anteile werden vereinigt, bei Raumtemperatur unten einem
Ventilator eingedampft und auf das 5fache konzentriert. Das Konzentrat wird dann
mit dem 5fachen seines Volumens an Aceton aufgenommen. Es bildet sich ein dunkelbrauner,
schwerer Niederschlag, der abfiltriert wird. Die erhaltenen ioo ccm brauner Flüssigkeit
zeigten einen Gehalt von Zoo Einheiten/ccm.
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Verfahren B Die B. subtilis hemmenden Antibiotika` werden aus wäßriger
Lösung an einem synthetischen, »Magnesol« genannten hydratisierten Magnesiumsilicat
der angenäherten Zusammensetzung MgO - 2,5 S102 - H20 adsorbiert, während das Antibiotikum,
das gegen den C-203-Organismus aktiv ist, nicht adsorbiert wird. Die Reinigung des
.Antibiotikums erfolgt daher bei dem günstigsten piiWert, in dem man die Gärflüssigkeit
mit 0,50/, »Magnesol« verrührt und dann die Suspension unter Verwendung einer Filtrierhilfe
und einer Filterpresse filtriert. Der wirksame Stoff wird dann aus dem »Magnesol«-Filtrat
an aktivierter Tierkohle (z. B. »Norit«) adsorbiert, von wo das Antibiotikum mit
Wasser gesättigtem n-Butanol eluiert werden kann. Obwohl mit Wasser gesättigtes
n-Butanol das bevorzugte Eluierungsmittel ist, können jedoch auch andere verwendet
werden, z. B. mit Wässer gesättigtes Äthylmethylketon, mit Äthylmethylketon
gesättigtes
Wasser, mit Äthylacetat gesättigtes Wasser, Methanol und Aceton. Für eine gute Ausbeute
empfiehlt sich eine mehr als einmalige Eluierung mit Butanol. Die Butanoleluate
werden vereinigt, und die erhaltene Butanollösung wird im Vakuum unter fortlaufender
Zugabe von Wasser konzentriert, bis man ein lösungsmittelfreies Konzentrat erhält.
Dieses Konzentrat kann dann zur Erzielung der rohen, trockenen Feststoffe lyophilisiert
werden.
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Das rohe Produkt kann mittels Adsorption oder Verteilungs- oder Trennchromatographie
weitergereinigt werden. Zur Adsorptionschromatographie haben sich aktivierte Tierkohle
und Aluminiumoxyd als geeignet erwiesen, jedoch waren die Adsorptionssäulen nicht
so günstig als die Verteilungssäulen.
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Für Verteilungs- oder Trennsäulen wurden mit Erfolg inerte Füllstoffe
und aus zwei Phasen bestehende Lösungsmittelsysteme, wie z. B. das System Butanol-Wasser
und Äthylmethylketon-Wasser, verwendet. Diese Säulen ergaben die reinsten Antibiotika.
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Genauer angegeben, wurden zu 3300 1 roher Gärungsflüssigkeit 16,5
kg »Magnesola zugegeben, und die Suspension wurde 1/z Stunde mechanisch gerührt.
Dann gab man 66 kg Filterhilfe zu, und die Mischung wurde durch eine Filterpresse
filtriert, wobei man 30001 Filtrat erhielt.
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Das »Magnesolcc-Filtrat wurde auf einen pH-Wert von 7 bis 7,5 eingestellt,
und man gab 12 kg aktivierter Tierkohle (»Norit A«) zu. Die Suspension wurde
30 Minuten gerührt, worauf man 12 kg Filterhilfe zugab und die Mischung filtrierte.
Das inaktive Filtrat wurde verworfen. Der Filterkuchen wurde mit 12o 1 Wasser gewaschen,
und der unwirksame Anteil wurde wieder verworfen. Dann wurde der Kuchen mit 12o
1 Methanol gewaschen und die Methanol-Waschflüssigkeit verworfen.
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Der gewaschene Filterkuchen wurde dann in 6o 1 mit Wasser gesättigtem
n-Butanol suspendiert, und die Suspension wurde 30 Minuten mechanisch gerührt
und dann filtriert. Diese Eluierung wurde zweimal wiederholt, und die drei Butanol-Eluate
wurden vereinigt, wobei man 1151 einer das Antibiotikum enthaltenden Butanollösung
erhielt.
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Diese Butanollösung wurde im Vakuum zu 6 bis 71, die einen Niederschlag
enthielten, konzentriert. Die Lösung und der Niederschlag wurden aus dem Destilliergefäß
entfernt, und dieses wurde mit 71 Aceton ausgespült. Die Butanol- und Acetonmischungen
wurden vereinigt, und die vereinigte Mischung wurde 1o Minuten durchgerührt und
dann filtriert. Die unlöslichen Stoffe wurden mit Aceton gewaschen, und die Waschflüssigkeit
wurde mit dem Filtrat vereinigt. Die ausgewaschenen unlöslichen Stoffe wurden verworfen.
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Die klare Butanol-Aceton-Lösung wurde unter ständiger Zugabe von Wasser
zu einer lösungsmittelfreien wäßrigen Lösung von etwa 3 1 konzentriert. Diese wäßrige
Lösung wurde mit einem gleichen Volumen Äthylacetat gewaschen, worauf die nicht
wirksame Äthylacetat-Waschflüssigkeit verworfen wurde. Die gewaschene wäßrige Lösung
wurde von Lösungsmitteln befreit und enthielt etwa 24o g des Antibiotikums in 2,68
1. Diese Lösung wurde lyophilisiert und ergab etwa 295 g getrockneter Feststoffe.
Reinigung des Antibiotikums durch Trenn- oder Verteilungs-Chromatographie Methode
I Eine als Filterhilfe dienende Diatomeenerde wurde mit Wasser, Methanol und Aceton
gewaschen und dann in einem warmen Ofen getrocknet. Aus 85 % Äthylacetat und 15
°/o n-Butanol wurde eine Lösungsmittelphase hergestellt. Die Lösungsmittelphase
wurde mit Wasser gesättigt, und man verwendete 1,7 1 davon, um 1,7 kg gewaschene
und getrocknete Filterhilfe anzufeuchten. Die angefeuchtete Filterhilfe wurde dann
in ein Glasrohr mit einem Durchmesser von 7,5 cm unter Erzielung einer 12,5 cm hohen
Säule gepackt.
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8o g des wie vorstehend beschrieben hergestellten lyophilisierten
Antibiotikums wurden in Zoo ccm mit dem Lösungsmittel gesättigtem Wasser gelöst.
Zu dieser Lösung gab man Zoo g trockene Filterhilfe zu und mischte gut durch. Diese
Mischung wurde auf die Säule gegeben. Das Lösungsmittel wurde oben eingeführt und
lief mit einer Geschwindigkeit von etwa 1o ccm/Minuten durch. Das zu durchlaufende
Volumen betrug etwa 3100 ccm. Aufeinanderfolgende Perkolate gaben die folgenden
Teste:
| Total |
| Perkolat Volumen S. hemolyticus, C-203- |
| Nr. in ccm Wirksamkeit in g |
| Standard-Antibiotikum |
| 1 3 100 o,85 |
| 2 3020 o,665 |
| 3 3430 0,405 |
| 4 3100 5,0 |
| 5 3100 1g,8 |
| 6 298o 21,7 |
| 7 2 11o 15,6 |
| 7A 1000 5,9 |
| 8 3100 4,65 |
| 9 5550 o,695 |
| Insgesamt I 30490 I 75265 |
Die Nummern 5, 6, 7 und 7A wurden vereinigt, und die erhaltene Lösung wurde zu einer
trockenen Butanollösung von 60o ccm konzentriert. Diese Lösung wurde mit 12 g einer
entfärbenden Tierkohle entfärbt und die Suspension heiß filtriert. Dann gab man
2 Volumina Petroläther zu, filtrierte die ausgefällten Feststoffe ab und trocknete.
Die Ausbeute betrug 18,9 g. Dieses Produkt ist das vorstehend als Präparat I bezeichnete.
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Methode 1I Ein aus zwei Phasen bestehendes Lösungsmittelsystem wurde
durch Vermischen von 1 Teil Äthylacetat, 5 Teilen Wasser und 9 Teilen n-Butanol
in einem Scheidetrichter, durch Schütteln und Trennung der beiden Schichten, nämlich
einer wäßrigen und einer Lösungsmittelschicht, hergestellt. Zoo g mit der wäßrigen
Phase befeuchtete Filterhilfe (aus Diatomeen
) wurden in ein Glasrohr
mit einem Durchmesser von 3,75 cm gepackt, wobei man eine 75 cm hohe Säule erhielt.
5 g rohes lyophilisiertes Antibiotikum wurden in 15 ccm Wasser gelöst, und diese
Lösung wurde sorgfältig mit 30 g der Filterhilfe vermischt. Die erhaltene Mischung
wurde oben auf die Säule gegeben. Die Säule wurde dann entwickelt, indem man das
Lösungsmittel hindurchlaufen ließ. Das zu durchlaufende Volumen betrug 400 ccm.
Das Perkolat wurde jeweils 5o-ccmweise gesammelt. Die Perkolate 25 bis 40 wurden
vereinigt, in eine lösungsmittelfreie wäßrige Lösung übergeführt und lyophilisiert.
Dieses Produkt ist das vorstehend erwähnte Präparat III.
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Tabelle IV gibt das Spektrum der Antimikrobenwirksamkeit des Antibiotikums
wieder, welches durch »Magnesola-Filtration, Adsorption an aktivierter Kohle (»Norita)
und Eluierung auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten wurde. Die gegen B.
subtilis wirksame Gruppe von Antibiotika wurde so abgetrennt, und die nachstehend
angegebenen Werte geben somit die Wirksamkeit des Antibiotikums an.
| Tabelle IV |
| Spektrum der Antimikrobenwirksamkeit |
| des Antibiotikums |
| mg der Probe, |
| die für eine Zonen |
| vollständige in Agarschalen |
| Test-Oiganismus Wachstums- mit einer Lösung |
| hemmung von 2,5 mg |
| bei einem der Probe |
| Fleischbrühtest pro ccm |
| erforderlich sind |
| Salmonella typhosa . 62,5 kaum |
| Salinonella pullorum . 16,o 4,4° |
| Bacillus cereus ...... 250,0 2,2 |
| Pseudomonas aerugi- |
| nosa ............. 2500,0 0 |
| Klebsiella pneumoniae |
| (Nr. 8) .......... 16,o 9,i |
| Klebsiella pneumoniae |
| (Nr. 28) ......... - 3,8 |
| Alcaligenes sp....... 62,5 1,0 |
| Proteus vulgaris .... 16,o 8,1 |
| Serratia marcescens . 2500,0 kaum |
| Hormodendrum |
| cladosporoides .... - 0 |
| Bacillus subtilis ..... 250,0 3,0 |
| Mycobacterium ranae - 2,4 |
| Mycobacterium |
| Nr.607 ......... - 1,7 |
| Streptococcus hemoly- |
| ticus C-203 ...... 2,0 11,2 |
| Staph. albus ... . ... . 31,0 4,4 |
| Escherichia coli ..... 625,o kaum |
| Candida albicans .... - i,9 |
| Agrobacterium |
| tumefaciens ..... - 9,8 |
| Flavobacterium |
| scraveolus ........ 16,o 4,9 |
| Sahnonella gallinarum 125,0 3,50 |
| Staph. aureus ....... 31,0 4,1 |
| c = Trübe Zone. |
Sowohl bei Mäuse- als auch bei Meerschweinchentesten wurde mit Mycobacterium tuberculosisH37
rv eine ausgesprochene tuberkulosehemmende Wirksamkeit beobachtet.
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Außerdem wurde das Antibiotikum gegen Streptococcus haemolyticus C-203
mit 35 Mäusen getestet, welche alle mit dem Organismus infiziert wurden, Die Dosierung
war io bis 3. io Mäuse wurden als Kontrolltiere gehalten. 5 Mäusen wurden intraperitoneal
Zoo Einheiten, 5 Mäusen wurden ioo Einheiten, 5 Mäusen 50 Einheiten, 5 Mäusen 25
Einheiten und 5 Mäusen z2,5 Einheiten verabfolgt. Die Kontrolltiere waren alle in
weniger als 18 Stunden tot. Nach Infizierung der Mäuse wurde gleich nach der Infektion
1/2 Dosierung verabfolgt. Die nächste Behandlung erfolgte am folgenden Morgen und
Nachmittag. Dies wurde 5 Tage fortgesetzt. Dann wurde die Behandlung abgebrochen.
Nach 44 Tagen waren die Mäuse, welche Zoo und ioo Einheiten täglich erhalten hatten,
noch alle am Leben. Von denen, welche 50 Einheiten täglich erhalten hatten,
waren noch vier am Leben. Eine Maus war in weniger als 18 Stunden tot. Die Mäuse,
welche täglich 25 Einheiten erhalten hatten, waren noch 3 Tage am Leben, eine Maus
war in weniger als 42 Stunden tot, und eine Maus nach 148 Stunden. Von denjenigen,
welche täglich 12i/2 Einheiten erhalten hatten, waren drei in weniger als 18 Stunden
tot, zwei blieben jedoch am Leben. Dementsprechend scheint die wirksame Mindestdosierung
5o Einheiten täglich zu sein. Bei einem zweiten Versuch wurden die folgenden Ergebnisse
erhalten. Von fünf Kontrolltieren waren vier in weniger als 18 Stunden und das fünfte
nach 48 Stunden tot. Die anderen 5 Mäuse bekamen ioo Einheiten nach der Infektion
und während dreier weiterer Tage zweimal täglich ioo Einheiten. Diese 5 Mäuse wurden
nach 33 Tagen seziert. Die Organe zeigten keine krankhaften Veränderungen.
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Die in der Gärflüssigkeit enthaltene antibiotische Substanz, d. h.
das Antibiotikum vor seiner Extraktion, ist bei Raumtemperatur in einem p$-Bereich
von etwa 4 bis etwa 8,2 nicht stäbil, war jedoch dann stabil, wenn es eine Woche
in einem Kühlschrank auf einer Temperatur von mindestens -5' gehalten wurde.
Bei einem p11-Wert zwischen etwa 2 und 3 ist das Antibiotikum auch bei Raumtemperatur
zumindest teilweise stabil.
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Das gereinigte Antibiotikum ist bei Raumtemperatur (2o°) bei einem
p],-Wert von etwa 2,2 bis etwa 7,5 stabil und bei einer Temperatur von etwa 4° sowie
im gefrorenen Zustand sehr stabil.
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Die vorstehend beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen können
Abänderungen erfahren, ohne daß dadurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.
Die vorstehende Beschreibung dient lediglich zur Erläuterung, jedoch nicht zur Beschränkung
der Erfindung.