DE1814735C3

DE1814735C3 -

Info

Publication number: DE1814735C3
Application number: DE1814735A
Authority: DE
Inventors: Eiichi Tokio Akita; Norio Ezaki; Taro Yokohama Niida; Tomizo Niwa; Takashi Shomura; Takashi Tsuruoka
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1967-12-18
Filing date: 1968-12-14
Publication date: 1973-10-04
Also published as: YU32708B; IL31223A; IL31223A0; DK122405B; US3661892A; NL162135B; NL162135C; DE1814735A1; YU297468A; DE1814735B2; NL6818105A; CH545849A; GB1254883A; ES361544A1; NO128662B; MY7400158A; FR1603553A; BE725674A; SE355378B; AT290013B

Description

HOB

NH,

OH

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum, welches als SF-733 bezeichnet wird und welches durch Kultivie^rung eines bestimmten Stammes der Art Streptomyces hergestellt werden kann.

Dieses Antibiotikum besitil eine starke wachstumshemmende Wirkung gegen Mikroorganismen verschiedenster Art, wie grampositive und gramnegative pathogene Bakterien und säurebeständige Bakterien.

Der das Antibiotikum SF-733 bildende Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in Tsu City, MIE Prefecture, Japan, gesammelt wurde; der Mikroorganismus wurde als Streptomyces thermoflavus, neuerdings als Streptomyces ridosidificus. SF-733 bezeichnet und bei der »American Type Culture Collection« in Washington D. C./USA unter der ίο Bezeichnung ATCC Nr. 21 294 hinterlegt.

Zur Erläuterung der Erfindung sind Zeichnungen beigefügt, in diesen Zeichnungen bedeutet

F i g. 1 das Ultraviolenspektrum der amorphen Substanz SF-733,

Fig. 2 das Infrarotspektrum der amorphen Substanz SF-733 (KBr-Tablette),

F i g. 3 das Papierchromatogramm der amorphen Substanz SF-733 sowie der mit dieser Substanz verwandten Antibiotika,

F i g. 4 das Ultraviolettspektrum der kristallinen Substanz SF-733 in Form der freien Base,

F i g. 5 das Infrarotspektrum der kristallinen Substanz SF-733 in Form der freien Base.

Streptomyces thermoflavus SF-733 weist folgende 2s Charakteristika auf:

I. Unter dem Mikroskop

1. Reichlich gebildetes, offen spiralförmiges Luftmycel,

2. Sporen: oval bis elliptisch, Oberflächenstruktur stachlig, Größe 0,8 bis 1.0 χ 1,1 bis 1,4 Mikron.

II. Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Kulturmedium	Wachstum	Luflmycel	Lösliches Pigment
Sucrose-Czapek-Agar (bebrütet bei 28° C)	dick, gut, faltig, in das Medium ein dringend, gelbliche Cremefarbe, Rück seite hell bräunliche Cremefarbe	sehr schwach, leicht gelblichweiß	nichts
Glycerin-Czapek-Agar (bebrütet bei 28° C)	dick, gut, faltig, in das Medium ein dringend, leicht gelblichbraun	schwach, weiß bis cremefarben	nichts
Krrinskys Glukose- Asparagin-Agar (bebrütet bei 28° C)	gut, in das Medium eindringend, dunkle Cremefarbe, Rück seite bräunlichgelb	schwach, cremefarben bis leicht gelblichweiß	nichts
Ushinskys Glukose- Asparagin-Agar (bebrütet bei 28° C)	gut, in das Medium eindringend, bräun lichgelb mt Grün stich	sehr starkes Wachstum, pulverförmig, grün lichgelb, allmählich von graustichig auf gräulichbraun über gehend, Bildung von grünlichgelben Tupfen	leicht Gelb
Calciummalat-Agar (bebrütet bei 28° C)	nicht gut, leicht gelblich- cremefarben	schwach, weiß	nichts
Glycerin-Calciummalat- Agar fbebrütet bei 28° C)	Gelb, Kolonien	nichts bis schwach, leichte Gelbfarbe	nichts

Fortsetzung

Kulturmedium	Wachstum	Luftmycel	Lösliches Pigment
Stärke synthetischer Agar	gut, in das Medium	sehr starkes Wachstum,	leicht Gelb
(bebrütet bei 28° C)	eindringend, Gelb,	pulverförmig, grün
	der Innenteil der	lichgelb, allmählich in
	Kolonie Braun mit	gräulichbraun über
	Grünstich	gehend
Bouillon-Agar	Kolonien, in das Me	nichts bis schwach,	nichts
(bebrütet bei 28°C)	dium eindringend,	hellgelb
	dunkle Cremefarbe,
	Rückseite bräunlich
	gelb
GIukose-Bouillon-Agar	fein faltig,	schwach, cremefarben	•nichts
(bebrütet bei 28° C)	gelblichbraun
Kartoffelpfropf	erhaben, fein faltig,	schwach, weißlichgrau	nichts
(bebrütet bei 28° C)	leicht bräunlich-
	crempfarber.
Karottenpfropf	Kolonien,	nichts	nichts
(bebrütet bei 28° C)	dunkle Cremefarbe
Tyrosin-Agar	tief in das Medium	grau	nichts
(bebrütet bei 28° C)	eindringend,
	dunkle Cremefarbe
Ei (bebrütet bei 37° C)	Kolonien, leicht	nichts	nichts
	bräunlichgelb
Loefflers koaguliertes	dunkle bräunlichgalbe	nichts	nichts
Serum	Farbe .
(bebrütet bei 37° C)
Bacto-Nitratbriihe	als Bodensatz,	nichts	nichts
(bebrütet bei 28° C)	farblos
Magermilch	gelblichorangefarbener,	nichts	leicht bräunliche
(bebrütet bei 37° C)	das Glas an der		Orangefarbe;
	Oberfläche berühren		Reaktion des Me
	der Ring, Haupt		diums: pH-Wert 5,5
	menge am Boden
	abgesetzt
Gelatine	farblos ois cremefarben	nichts	nichts
(bebrütet bei 20° C)
Cellulosemedium	kein Wachstum
(bebrütet bei 28° C)

III. Physiologische Eigenschaften

Bildung von Schwefelwasserstoff... negativ

Bildung von Tyrosinase negativ

Bildung von Nitrit positiv

Koagulierung von Magermilch .... negativ

(28° C, 37⁰C) Peptonisierung von Magermilch ... positiv

(37° C) Peptonisierung von Magermilch ... negativ

(28° C)

Hydrolyse von Stärke positiv

Verflüssigung von Gelatine negativ

Auflösung von Loefflers koagu-

liertem Serum positiv

(schwach, 37⁰C)

IV. Ausnutzung der Kohlenstoffquellen

(Pridham-Gottliebs Basalmedium,
bebrütet bei 27^C C)

1. Verwendet: Arabinose, Rhamnose, Glukose, Mannose, Galaktose, Saccharose, Laktose, Raffinose, Dextrin, Inulin, Stärke, Glycerin, Sorbit, Mannit, Maltose.

2. Zweifelhaft: Inosit, Natriumeitrat.

3. Nicht verwendet: Xylose, Fructose, Dulcit, Natriumacetat, Natriumsuccinat, Salicin, Cellulose.

V. Optimale Temperatur

40⁰C (gemessen mit einem Temperaturgradient-Inkubator).

Die Eigenschaften des Stammes Streptomyces thermoflavus SF-733 können wie folgt zusammengefaßt

werden: Spiralbildung im Luftmyccl: Sporen mit stacheliger Struktur; cremefarbenes bis gclblichbrauncs Wachstum auf synthetischen Medien, gelblichgrünes bis gräulichbraunes Luftmycel. Fehlen eines löslichen Pigmentes im allgemeinen, jedoch hellgelbes Pigment auf Glukose-Asparagin-Agar (U s h i η s k y) und Stärke-synthetischcr-Agar, crcmefarbigcs bis gelblichbrauncs Wachstum, dünnes Luftmyccl und kein lösliches Pigment auf organischen Medien. Das hervorstechendste Merkmal des Stammes Streptomyces thermoflavus SF-733 ist darin zu sehen, daß die optimale Wachstumstemperatur mit 40" C verhältinsmäßig hoch liegt. Aus den vorstehenden Eigenschaften kann geschlossen werden, daß dieser Stamm SF-733 der flavus-Reihc der Gattung Streptomyces nahe verwandt ist. In dieser Reihe können Streptomyces flavus, Strcplomyces flaveolus, Streptomyces flavovircus, Streptomyces flavogriseus. Streptomyces alboflavus, Streptomyces parvus, Streptomyces parvullus, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces griseoflavus und Strcptomyces celluloflavus als nahe verwandte Stämme genannt werden. Unter diesen Arten sind Streptomyces kanamyceticus. Streptomyces flavogriseus. Streptomyces alboflavus und Streptomyces celluloflavus von dem Stamm SF-733 klar unterschieden, weil die Luftmycelicn der crstercn keine Spiralen bilden, während in den Mycelicn der letzteren große Mengen typischer offener Spiralen vorkommen. Streptomyces parvullus, welches Sporen vom glatten Typ bildet, unterscheidet sich von dem Stamm SF-733 insofern. aN di<* Ohcr- in fläche der Sporen des letzteren stachelig ist. Streptomyces parvus und Streptomyces griseoflavus unterscheiden sich deutlich von dem Stamm SF-733. weil sie auf einem C'cllulosemedium gut wachsen. Streptomyces flavus. Streptomyces flaveolus und Strcptomyces flavovircus. welche als die typischen Stämme der flavus-Reihc angesehen werden können, sind dem Stamm SF-733 am nächsten verwandt, und zwar im Hinblick auf die verschiedenen F.igenschaften auf verschiedenen Kulturmedien.

Diese drei Organismen unterscheiden sich jedoch von dem Stamm SF-733 in den folgenden Punkten: Die Sporen von Streptomyces flaveolus weisen eine haarige Oberfläche auf: im Gegensat? dazu haben die Sporen des Stammes SF-733 eine stachelige Oberfläche. Die Luftmycelien von Streptomyces flavus und Streptomyccs flavovireus sind im wesentlichen gerade und bilden nur in einigen Fällen offene Spiralen, während das Luftmyccl von SF-733 große Mengen offene Spiralen bildet. Darüber hinaus erzeugt Streptomyces flavovireus grünlichgelbe lösliche Pigmente auf synthetischem Agarmedium. wogegen der Stamm SF-733 kein lösliches Pigment bildet. Streptomyces flavus produziert kein Nitrat und seine optimale Kultivierungstemperatur beträgt 25 C, der Stamm SF-733 erzeugt dagegen Nitrat und seine optimale Kultivierungstemperatur liegt mit 40^c C verhältnismäßig hoch. Der Stamm SF-733 unterscheidet sich also deutlich von den vorstehend genannten drei Organismen, und zwar im Hinblick auf verschiedene wichtige Charakteristika.

Die neue antibiotische Substanz SF-733, die von dem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 ge bildet wird, ist ein typisches wasserlösliches basisches Antibiotikum mit einem breiten antibakteriellen Wir kungsspektrum; seine optische Drehung ist ( + ). Unter den bekannten Antibiotika gehören Neomycin, Paromomycin, Kanamycin, Gentamicin und Tene- mycin in dieselbe Gruppe. Der Stamm SF-733 sollte daher im Hinblick auf die mykologische Verwandtschaft mit den Stämmen verglichen werden, die die genannten Antibiotika erzeugen. Es existieren zwei Gentamicin erzeugende Stämme, nämlich Micromonospora chinosspora und Micromonospora purpurca. Diese beiden Stämme gehören nicht zur Gattung Streptomyces, wodurch sie sich bereits deutlich von dem Stamm SF-733 unterscheiden. Weitere Neomycin erzeugende Stämme sind: Streptomyces fradiae, Streptomyces albogriscolus; ein Paromomycin erzeugender Stamm ist Streptomyces rimosus forma paromomycine; ein Kanamycin erzeugender Stamm ist Streptomyces kanamyceticus; ein Tenemycin erzeugender Stamm ist Streptomyces tcnebrarius; alle sind von dem Stamm SF-733 deutlich unterschieden, und zwar im Hinblick auf ihre morphologischen Eigenschaften, die in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind; die verschiedenen Stämme unterscheiden sich sowohl von dem Stamm SF-733 als auch untereinander.

Vergleich zwischen dem Stamm SF-733 und bekannten Streptomyces-Artcn, die rechtsdrehende wasserlösliche basische Antibiotika bilden

Antibiotika	Stumme	—. — . _ _ 1 iiflmycel	Oberfläche der Sporen
Substanz SF-733	Stamm SF-733	Spiralen	stachelig
Neomycin	Streptomyces fradiae	gerade, flexibel, keine Spiralen	glatt
	Sireptomyees albogri- seolus	Spiralen	haarig
Paromomycin	Streptomyces rimosus forma paro- momycinus	gerade, gelegent lich offen oder geschlos sen, spi ralig	glatt
Kanamycin	Streptomyces kanamyce ticus	gerade	glatt
Tenemycin*)	Streptomyces tenebrarius	Spiralen	glatt

*) (Seventh Interscience Conference on Antimicrobial Agent and Chemotherapy. 25 bis 27. Oktober 1967. in Chicago.^

Auf Grund der vorstehenden mykologischen Prüfung konnte festgestellt werden, daß der Stamm SF-733 eü* ^neuer Mikroorganismus ist, welcher ein wasserlösliches basisches Antibiotikum bildet; der Mikroorganismus kann taxonomisch als neuer Stamm der flavus-Reihe eingeordnet werden; er wurde als Strep-

tomyces thermoflavus nov. sp. bezeichnet. (Die Eigenschaften der zum Vergleich herangezogenen Streptomyces-Arten wurden dem Werk von Waksman »Actinomycetes«, Bd. 2, 1961, entnommen.)

Die Eigenschaften des Stammes SF-733 sind leicht veränderlich, wie dies auch bei anderen Streptomyces-Arten l'i_ beobachten ist. So lassen sich beispielsweise mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie Ultraviolettstrahler!, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiven Strahlen und Chemikalien künstliche Varianten und Mutanten von SF-733 erhalten. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zu Streptomyces thermoflavus gehören und die Fähigkeit zur Bildung der Substanz SF-733 besitzen, können für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.

Erfindungsgemäß kann der Stamm SF-733 in einem Kulturmedium gezüchtet werden, welches Nährstoffe enthält, die zur Züchtung üblicher Mikroorganismen verwendet werden. Als Nährstoffe können die für die Züchtung von Streptomyces üblicherweise eingesetzten Nährstoffe verwendet werden. Glukose, Stärke, Glycerin, Dextrin oder Sucrose sind beispielsweise als Kohlenstoffquclle geeignet. Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe. Maisquellwasser. Schlempe, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat sind als Stickstoffqueilc geeignet. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Calciumcarbonat, gewöhnliches Kochsalz. Kaliumchlorid oder -phosphat zugesetzt werden. Weiterhin können organische und anorganische Materialien, die das Wachstum des Stammes SF-733 unterstützen und die Bildung der Substanz SF-733 erleichtern, zugesetzt werden. Für die Züchtung des Stammes SF-733 hat sich die flüssige Kultur, insbesondere unter submersen aeroben Bedingungen als am günstigsten erwiesen. Für die Züchtung sind Temperaturen zwischen 25 und 4O⁰C geeignet; am besten liegt die Temperatur nahe bei 35° C Die Bildung der Substanz SF-733 erreicht in 2 bis 5 Tagen ein Maximum, und zwar sowohl bei der Schüttelkultur als auch bei der Tankkultur.

Für die Prüfung von SF-733 können Mycinassay-Agar (pH-Wert 7,8) als Medium und Bacillus sublilis ATCC Nr. 6633 als Testorganismus verwendet werden.

Eine lineare Beziehung '.wischen dem Logarithmus der Konzentration der Substanz SF-733 und dem Durchmesser der Hcmmzone gegen den Testorganismus konnte bei einer Konjentration von 1 bis 25 y/ml beobachtet werden; die Durchmesser der Hemmzone betrugen unter dieser Bedingung jeweils 15 bis 25 mm (Plattentest).

Die Substanz SF-733 ist ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, was ;;ich klar auf Grund der nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ergibt; die Substanz kann aus der Kulturbrühe mit Hilfe beliebiger bekannter Verfahren, wie sie üblicherweise für die Gewinnung bekannter wasserlöslicher basischer Antibiotika, wie Kanamycin oder Neomycin, angewandt werden, abgetrennt werden.

Die Substanz SF-733 kann leicht an Aktivkohle im alkalischen Bereich adsorbiert und mit wäßrigem Alkohol oder wäßrigem Aceton im sauren pH-Bereich wirksam eluiert werden.

Die Substanz SF-733 kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes als Adsorbens gereinigt werden. Ein geeignetes Ionenaustauscherharz ist beispielsweise ein Kationenaustauscherharz wie »AmberlitelRC-50« vom NH₄ ⁺-, Na ⁺ - oder H ⁺ -Typ. Dh Eluierung wird üblicherweise: mit wäßriger Säure-Alkali- oder Salzlösung vorgenommen. Die Substan; SF-733 kann auch in Form eines Säureanlagerungs salzcs gefällt werden, indem man ein mit Wassei mischbares organisches Lösungsmittel zu einer wäßri gen Lösung gibt, die das Säureanlagerungssalz dci Substanz SF-733 enthalt.

Die so erhaltene rohe puiverförmige Substanj

ίο SF-733 kann durch Ionenaustausch-Chromatographie mit »Dowex 1 χ 2« (OH -Typ) oder »Amberlitc CG-50« (NH₄ ⁺-TyP) weiter gereinigt werden; nach der Reinigung liegt ein weißes amorphes Pulver vor welches die Substanz SF-733 in Form der freien Base darstellt; die Reinheit und Einheitlichkeit des Produktes wurde durch Papierchromatographie, Hochspannungs-Papierelektrophorese und Dünnschichtchromatographie des N-Acetylderivates sichergestellt. Die amorphe freie Base der Substanz SF-733 ist im neutralen und alkalischen Bereich beständig, aber kaum beständig im sauren Bereich.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz SF-733 werden im folgenden beschrieben. Die amorphe freie Base der Substanz SF-733 zersetzt sich unter Aufschäumen bei 178 bis 185"C; sie besitzt keinen definierten Schmelzpunkt. Die freie Base ist leicht löslich im Wasser, wenig löslich in Methanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Butanol, Äthylacetat. Benzol, Hexan und Äther. Rei dor Elektrophorese bewegt sie sich bei einem pH-Wert von 1,8 gegen die Kathode; aus der Titrationskurve kann nicht auf die Existenz von sauren Gruppen geschlossen werden. Diese Tatsachen beweisen, daß die freie Base eine basische Substanz ist. Ihr Ultraviolettabsorptionsspektrum ist in F i g. I dargestellt. Es konnte keine spezifische Absorption festgestellt werden. Ihr Infrarotabsorptionsspektrum ist in F i g. 2 dargestellt. Die Absorptionsbande, welche Tür Aminozucker-Antibiotika eigentümlich ist, konnte beobachtet werden.

Die spezifische optische Drehung der Substanz SF-733 (amorphe freie Base) in wäßriger Lösung [«]'' ist 4 42 . Die Reaktionen gegen Ninhydrin, Molisch-Reagenz und Anthron sind positiv, die Reaktionen gegen Fehling- und Benedict-Lösung, Ferrichlorid, Maltol, Biuret, Tollens- und die Sakaguchi-Reaktion*) sind negativ. Das Molekulargewicht (geschätzt nach der Dampfdruck-Gleichgewichtsmethode) liegt bei 475; dieser Wert wird durch den Wert ge-

stützt, der aus der Titrationskurve geschätzt werden kann (452 als viersäurige Base).

Bei der Elementaranalyse einer Probe der Substanz SF-733, die über Phosphorpentoxyd im Vakuum bei 110' C 20 Stunden getrocknet worden war, erhielt man folgende Werte: C = 44,16%, H = 7,55%. N = 11,92%, O = 36,21%; die Summenfonnel ist demnach C₁₇H₃₄N₄O₁₀ (theoretische Werte: C = 44,93%, H = 7,54%, N = 12,33%, O = 35,20%, Molekulargewicht: 454,49). Die Untersuchungen hinsichtlich der chemischen Struktur haben ergeben, daß die Substanz SF-733 ein O-^-D-Ribofuranosyl-

*) Bei der Sakaguchi-Reaktion werden S ml der zu prüfenden Lösung mit 1 ml I0%iger NaOH versetzt Anschließend fügt man I ml einer 0.02%igen wäßrigen Lösung von 8-Hydroxychinolin sowie mehrere Tropfen einer Lösung von Br₂ in 100 ml 5%iger NaOH zu. Beim Auftreten einer kräftigen Orangefärbung ist die Reaktion positiv.

(Γ-->5)- O-[«-2,6-diamino-2,6-dideoxy- n-glucopyranosyl - (1—»4)] - 2 - deoxystreptamin der Formel

NH₂

HOH₂C

NH₂

OH

Bei der absteigenden Papierchromatographie unter Verwendung von n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4:1:3, Entwicklung 4Tage) und n-Butanol, welches mit 2% p-Toluolsulfonsäure enthaltendem Wasser gesättigt ist (Entwicklung 25 Stunden), Färbung mit Ninhydrin und Bioautographie unter Verwendung von Bacillus subtilis zeigt die Substanz SF-733 in jedem Lösungsmittelsystem einen einzigen

Fleck bei 8 cm bzw. 14,8 cm, gemessen vom Ausgangspunkt. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese (3300 V, pH-Wert = 1,8, 15 Minuten) bewegt sich die Substanz SF-733 ebenfalls 15 cm zur Kathode und zeigt einen einzelnen Fleck. Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1), n-Butanol/ Essigsäure/Wasser (3:1:1) und n-Butanol/Pyridin/ Wasser (6:4:3)sowie80%igem wäßrigem Methanol als

ίο Entwickler zeigt das N-Acetylderivat der Substam SF-733 einen einzelnen Fleck bei R_r0,40, 0,16, 0,5C bzw. 0,70. Aus dieser Tatsache ergibt sich ebenfalls deutlich die Reinheit und Einheitlichkeit der Substanz SF-733.

Wie aus den vorstehenden Erläuterungen hervorgeht, ist die Substanz SF-733 ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches sich bei der Prüfung der optischen Drehung als rechtsdrehend erweist, Von den bekannten Antibiotika sollen Neomycin.

Paromonycin, Kanamycin, Gentamicin, Destomycin und Actinospektacin mit der Substanz SF-733 verglichen werden.

Die Substanz SF-733 wird mit diesen bekannten Antibiotika hinsichtlich ihrer optischen Drehung (Tabelle I) und der Papierchromatographie (Tabelle II und F i g. 3) verglichen.

In den Tabellen III und IV sind die R_rWerte der Substanz SF-733 sowie des N-Acetylderivates derselben im Dünnschichtchromatogramm an Kieselsäuregel aufgeführt.

• Tabelle I

Substanzen	Spezifische optische Drehung
	(in wäßriger Lösung)
SF-733	+ 42°
Neomycin A	+ 123°
Neomycin B	+ 58°
Neomycin C	+ 82°
Paromomycin I	+ 64°
Paromomycin II	+ 78°
Kanamycin A	+ 121°
Kanamycin B	+ 135
Kanamycin C	+ 126°
Gentamicin A	+146
Gentamicin C₁	+ 158°
Gentamicin C₂	+ 160°
Destomycin A	+ 7°
Destomycin B	+ 6°
Hygromycin B	+19,2°
Actinospectacin	+7,6°
Kasugamycin	+ 120°
Capreomycin II	+24°

Literatur

Umezawa u. a. »Index of Antibiotics from Actinomycetes« (Tokyo University Publishing Society, 1967), S. 453

desgl., S. 454
desgl., S. 455
desgl., S. 492
desgl., S. 492

Kondo, »Journal of Antibiotics«, Reihe B, S. 262,1961 desgl.,
desgl.

Umezawa u. a. »Index of Antibiotics from Actuiomycetes« (Tokyo University Publishing Society. 1967), S. 3G8

desgl.
desgl.
desgl., S. 250

Umezawa u. a. »Index of Antibiotics from Actinomycetes« (Tokyo University Publishing Society, 1967), S. 250

desgl., S. 335
desgl., S. 105
desgl., S. 365
desgl., S. 192

11

Tabelle II Tabelle IV

Substanzen

Substanz SF-733
Kanamycin

A Base

B Base

C Base

Neomycin

A Base

B Base

C Base

Paromomycin
I Base

II Base

Gentamicin

C Base

Lösungsmi Entfernung vom Original- piinkl (cm)	tclü R 733*)	l.ösungsini Γ.η ι fern Ii η μ VIII¹' Original punkt (cm)
8,0	1	14,8
8,0 6,0 8,5	1 0,75 1,06	10,0 18,5 14,4
7,7 3,4 3,5	0,96 0,43 0,41	19.2 17.6 17,5
4.1 4,6	0,56 0,58	10,8 10.0
12.0	1,50	25,0

Rf-Werte des N-Acctyldcrivatcs der Substanz SF-733 im Dünnschichtchromatogramm an Kieselsäuregel

R 733')

Lösungsmillelsyslem

t-Butanol — Essigsäure—Wasser (2:1:1)

,o n-Butanol — Essigsäure--Wasser (3:1:1)

n-Butanol -Pyridin--Wasser(6:4:3) . .

80% Methanol

R,-Werte

0,40
0,16
0.50
0,70

Bemerkungen:

Lösungsmittel A:

n-Butanol gesättigt mit Wasser, enthaltend 2% p-Toluolsulfon-

säure, absteigindc Methode, Entwicklung Tür 25 Stunden. Lösungsmittel B:

r. Bülanoi/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4: I : 3), absteigende

Methode. Entwicklung für 4 Tage. Prüfung:

Papierchromatographie mit Bacillus subtilis.

*) Verhältnis der Entfernung bezogen auf SF-733. Tabelle 111

R_f-Werte der Substanz SF-733 im Dünnschichtchromatogramm an Kieselsäuregel

Lösungsmiltclsysicm

Äthanol -NH₄OH-Wasser(8:1:1)...

10% wäßriges Ammoniumacetat -- Methanol (1:1)

Rf-Wet ic

0,5

0.6 festgestellt als dunkelbrauner Fleck beim Besprühen mit 10%iger Schwefelsäure und anschließendem Erhitzen.

Die Substanz SF-733 kann von der Kanamycin-Gruppe (A, B, C) der Gentamicin-Gruppe (A, C₁, C₂), Neomycin A, Destomycin A, B, Hygromycin B, Actinospectacin. Kasugamycin und Capreomycin im Hinblick auf die spezifische optische Drehung wie in Tabelle I angegeben und von Neomycin B, C, Paromomycin I, II, Gentamicin C und Kanamycin A, B im Hinblick auf die R_f- Werte bei der Papierchromatographie (Tabelle II, Fig. 3) klar unterschieden werden. Die Substanz SF-733 läßt sich weiterhin deutlich unterscheiden: von Capreomycin II, welches ein Ultraviolettabsorptionsmaximum aufweist, von Actinospectacin durch den analytischen Slickstoffwert, von Destomycin A, B und Hygromycin B durch Eigenheiten des aiuibäkiericüen Wirkungsbereiches und deren höhere Toxizität. Von Tenemycin (Seventh Interscience Conference on Antimicrobial agent and chemotherapy, 1967, 25. bis 27. Oktober in Chikago) unterscheidet sich die Substanz SF-733 deutlich, weil der [α] ο -Wert des N-Acetylderivates des Tenemycins + 95 bis +130° ist, während der des N-Acetylderivates der Substanz SF-733 +40° ist. Aus dem vorstehenden Vergleich geht wiederum deutlich hervor, daß die Substanz SF-733 ein neues Antibiotikum ist, welches nicht mit anderen bekannten An*<biotika übereinstimmt.

Das antibakterielle Wirkungsspektrum der Substanz SF-733 gegen verschiedene Mikroorganismen ist im folgenden zusammengestellt.

Minimale inhibierende Konzentration nach der Brühe-Verdünnungsmethode

Testorganismen

Mindesthemmkonzenlrat ion	Kulturmedium
mcg/ ml
0,39	Bouülonmedium
6,25	desgl.
3,125	desgl.
3,125	desgl.
3,125	desgl.
0,39	desgl.
0,19	desgl.
100,0	desgl.
12,5	desgl.
12,5	desgl.
12,5	desgl.
3,125	desgl.

Bacillus subtilis ATCC 6633 ...

Bacillus cereus

Staphylococcus aureus 209-P .. Staphylococcus aureus 52-34...

Staphylococcus aureus 193

Staphylococcus aureus Smith .. Staphylococcus aureus Terajima

Sarcina lutea

Aerobacter aerogenes

Escherichia coli IAM 1253

Escherichia coli IAM 1239

Escherichia coli K-12

Fortsetzung

Tesiorganismen

Escherichia coli Chloramphenicol-resistant

Escherichia coli Streptomycin-resistent .

Escherichia coli Streptothricin-resistent

Escherichia coli Kanamycin-re.sistent

Shigella dysenteriae

Sbigella flexneri (Sireptomycin-TetracyclinKesistent

Salmonella typhi

Salmonella 'yphi paratyphi A

Salmonella typhi paratyphi B

Klebsieila pneumoniae

Proteus vulgaris

Pseudomonas aeruginosa

Mycobacterium smegmates 607

Mycobacterium phlei

Candida albicans

Torula utilis

Sai-charomyces cerevisiae

Aspergillus niger

Aus der vorstehenden Tabelle geht klar hervor, daß die Substanz SF-733 einen breiten Wirkungsbereich besitzt und sowohl gegen gram-positive als auch gramnegative und säurebehandelte Bakterien wirksam ist.

Bei Versuchen zur Bestimmung der akuten Toxizitat durch intravenöse Injektion bei Mäusen konnte festgestellt werden, daß die Toxizität der Verbindung SF-733 sehr niedrig ist; der LD₅₀-Wert beträgt 1000 mg/kg für die freie Base und 500 mg/kg für das Sulfat der Verbindung; ein abnormer Verlauf nach der Injektion konnte nicht beobachtet werden.

Die amorphe freie Base der Substanz SF-733 kann durch folgendes Verfahren in kristalline Form übergeführt werden.

Die amorphe freie Base wird in Wasser gelöst und die so gewonnene Lösung wird zur Trockne eingedampft, wobei man Äthanol zufügt und das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt; die Lösung kann auch zunächst zu einem Sirup eingeengt werden, dann mit Äthanol versetzt werden, so daß sich ein Niederschlag bildet, und erst dann zur Trockne eingedampft werden, wobei weiteres Äthanol zugesetzt und das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt wird; auf diese Weise erhält man die Substanz SF-733 als weiße feste Substanz in Form eines Äthanolsolvates. Das weiße feste Äthanolsulvat der Substanz SF-733 zeichnet sich gegenüber der vollständig dehydratisierten amorphen freien Base und der kristallisierten freien Base der Substanz SF-733 (die im folgenden erwähnt wird) durch seine höhere Löslichkeit in Methanol aus.

Das weiße, feste Äthanolsolvat der Substanz SF-733, das wie vorstehend beschrieben erhalten worden ist, wird in einer ausreichenden Menge Methanol gelöst. Die Lösung wird abgestellt, wobei schnell Kristalle gebildet werden. Die gewünschte kristalline freie Base der Substanz SF-733 kann gewonnen werden, indem man die Kristalle abfiltriert, mit wenig Methanol wäscht und zunächst bei Raumtemperatur im Va-Mindesthemmkonzentraiion
mcg/ml

',56
12,5
50
>100

5,25
12,5

3,125
115
115

6,25
25,0

> 100.0

115
6,25

> 100.0

> 100,0

> 100.0

Kulturmedium

Bouiilonmedium

desgl.

desgl

desgl.

desgl.
Glycennmedium

desgl.
Sabouraub

desgl.

kuum und dann noch in einem Glasexsikkator ebenfalls im Vakuum bei 6O⁰C 19 Stunden über Phosphorpenloxyd als Trockenmittel trocknet, um das an den Kristallen anhaftende Methanol zu entfernen.

Das Pulver, welches durch Gefriertrocknen einer wäßrigen Lösung der amorphen freien Base der Substanz SF-733 erhalten worden ist und eine ausreichende Menge Wasser absorbieren konnte, weist eine höhere Löslichkeit in Methanol auf als das vorstehend erwähnte weiße feste Äthanolsolvat, aber selbst wenn man dieses Pulver in Methanol löst und sich selbst überläßt, bildet sich nur eine kleine Menge eines Niederschlages, ohne daß Kristalle der freien Base der Substanz SF-733 erhalten werden können. Für die Kristallisation der freien Base der Substanz SF-733 muß das vorstehend beschriebene Verfahren angewandt werden, gemäß welchem das zu kristallisierende Material das Äthanolsolvatstadium durchlaufen muß, welches für die Kristallisation wesentlich ist.

In der kristallinen Erscheinungsform besteht die freie Base der Substanz SF-733 aus weißen Nadeln oder kurzen Stäbchen, die unter Zersetzung und Aufschäumen bei 192 bis 195° C schmelzen.

Die Elementaranalyse ergab folgende Werte: C = 44,19%, H = 7,39%, N = 11,60%, O (aus der Differenz) = 36,82%. Das Molekulargewicht beträgt nach der Dampfdruck-Gleichgewichtsmethode in wäßriger Lösung 440, während der nach der Titrationsmethode in wäßriger Lösung ermittelte Wert bei 470 liegt. Die Summcnformei der freien Base der Verbindung SF-733 in kristalliner Form ist C₁₇H₃₄N₄Oi₀ (theoretische Werte: C = 44,93%, H = 7,54%, N = 12,33%, O = 35,20%. Molekulargewicht454,49); die chemische Struktur der Verbindung entspricht dem bereits erwähnten O-/M>Ribofuranosyl-(l—>5)-O - [«- 2,6 - diamino - 2,6 - dideoxy - π - glucopyranosyl-(1— >4)]-2-dcoxystreptamin. Die kristalline freie Base der Substanz SF-733 ist dieselbe Verbindung wie die

(O

imorphe freie Base der Substanz SF-733; die beiden Produkte unterscheiden sich nur durch die äußere Erscheinungsform.

Die kristalline Form der freien Base der Substanz SF-733 ist rechtsdrehend und ihr [«]? beträgt +42'C (C = 1, H₂O). Eine wäßrige Lösung der Base ist alkalisch. Bei der Analyse lassen sich aus der Titrationskurve keine sauren Gruppen ermitteln. Die vorliegende Substanz ist sicher basisch.

Das Ultraviolettspektrum der kristallinen freien Base der Substanz SF-733 in wäßriger Lösung (0,102%) ist in F i g. 4 dargestellt. Es konnte kein Absorptionsmaximum beobachtet werden mit Ausnahme der Endabsorption. In der Figur bedeuten die Zahlen an der Abszisse Wellenlängen (ηΐμ) und die Zahlen an der Ordinate das Maß der Absorption. Das Infrarotspektrum mit KBr-Tablette ist in F i g. 5 dargestellt. Es ist die für aminoglycosidische Antibiotika eigentümliche Absorption zu beobachten. In der Figur bedeuten die Zahlen an der Abszisse Wellenzahlen pro 1 cm und die Zahlen an der Ordinate den Transmissionsgrad (⁰O).

Die kristalline freie Base der Substanz SF-733 ist in Wasser leicht löslich, in Methanol kaum löslich und in Äthanol sehr schwer löslich. Sie ist praktisch vollständig unlöslich in n-Propanol. n-Butanol. Aceton, Äthylacetat, Petroläther und Chloroform.

Die Reaktionen gegen Molisch-Reagenz. Anthron, Ni'ihydrin und /f-Naphtholschwefelsäure (Aldopentose-Reaktion) sind positiv; die Reaktionen gegen Anthron unter definierten Bedingungen (Hexose-, 6-Deoxyheiose-Reaktionen — vgl. Methods of Carbohydrate Chemistry, Bd. I, S. 490, 1963, Academic Press), Fehlingsche Lösung (kalt). Ferrichlorid. Brady-Reagenz (Reaktion mit 2.4-Dinitrophenylhydrazin), Biuret, die Sakaguchi- und Maltol-Reaktion, sind negativ. Die kristalline freie Base der Substanz SF-733 kann in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure carbonisiert werden; sie reduziert Kaliumpermanganatlösung bei Raumtemperatur.

Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel G (Handelsprodukt der Firma Merck & Co.) läßt sich bei der Färbung mit Ninhydrin oder mit 10%iger Schwefelsäure (Carbonisierung beim Erhitzen) ein einzelner Fleck feststellen, der fast am Ausgangspunkt liegt, wenn als Lösungsmittelsystem Äthanol'konzentriertes Ammoniak-Wasser/Wasser (8:1:1) und 10%ige wäßrige Ammoniumacetatlösung,' Methanol (1:1) verwendet werden; die R_r-Werte liegen dann bei 0,5 bzw. 0,6. Bei der Papierchromatographie unter Verwendung von Bacillus subtilis beobachtet man einen einzelnen Fleck bei 8 cm und 14,8 cm vom Ausgangspunkt, wenn man als Lösungsmittelsysteme n-Butanol/Pyridin/ Essigsäure/Wasser (6:4:1:3) (absteigende Methode; 4 Tage) bzw. n-Butanol, welches mit 2% p-Toluolsulfonsäure enthaltendem Wasser gesättigt ist (absteigende Methode; 25 Stunden), verwendet. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese bewegt sich die kristalline freie Base der Substanz SF-733 15 cm auf die Kathode zu und zeigt einen einzelnen Fleck 3300 V, pH 1,8,15 Minuten, Ninhydrin-Färbung, Bioautographie mit Bacillus subtilis). Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung des N-Acetylderivates der freien Base von SF-733 Hißt sich ein einzelner Fleck feststellen, wenn zum Färben 10%ige Schwefelsäure verwendet svird (Carbonisierung durch Erhitzen); die R_r-Werte liegen bei 0.40.

0,16, 0,50 bzw. 0,70. wenn als Lösungsmittelsysteme tert.-Butanol Essigsäure/Wasser (2:1:1), -Butanol/Essigsäure Wasser (3:1:1). n-Butanol/Pyridin/Wasser (6:4:3) und 80%iges Methanol verwendet werden. Die antibakterielle Aktivität der kristallisierten Substanz SF-733 und das antibakterielle Wirkungsspektrum derselben sind in Tabelle I dargestellt; diese gelten auch für die amorphe Substanz SF-733. Auch ihre Beständigkeit und Toxizität sind im wesentliehen die gleichen.

Gegenüber den bekannten Antibiotika Kanamycin. Dihydrostreptomycin und Aminosidin weist die ernndungsgemäße Verbindung folgende Vorteile aul.

Tabelle V

Wirkungsspc rum und Toxizität von Antibiotikum SF-733 im ergleich zu Kanamycinsulfrt (KM).

Dihydrostreptomycin (DHSM)

und Aminosidin (AMS)

1. Antibakterielle Wirkung in vitro

Beim Vergleich der antibakteriellen Wirkung von Antibiotikum SF-733 mit der von K M bei in vitro-Versuchen mit 40 Stämmen von 12 Bakterien, 32 Stämmen von 9 Eumyceten und 23 Trichomonas vaginalis zeigte sich, daß die antibakterielle Wirksamkeit und das antibakterielle Spektrum von Antibiotikum SF-733 etwa der von KM entsprechen.

2 Antibakterielle Wirkung in vivo

Beim Vergleich der antibakteriellen Wirkung von Antibiotikum SF-733 mit der von KM bei in vivo-Versuchen gegen Pneumococcus, Pneumobacillus unter anderem konnte festgestellt werden, daß die therapeutische Wirkung von KM etwa gleich der des erfindungsgemäßen Antibiotikums ist.

3. Störwirkungen auf das Gehör

durch AntibiotikuirTsF-733, AMS und KM

Die Versuche wurden mit Gruppen mit je 10 Meerschweinchen durchgeführt.

A. 400 mg/kg Körpergewicht der Base von SF-733 und AMS wurden 60 Tage lang verabreicht. Bereits nach 2 Wochen war bei AMS eine Gehöi störung zu beobachten; bei 3F-733 zeigte sich auch nach der vollen Behandlungszeit keine Gehörstörung.

B. 400 bzw. 600 bzw. 800 mg je kg Körpergewicht der Substanz SF-733 und 400 mg je kg Körpergewicht KM wurden 60Tage lang verabreicht; bei der KM-Behandlung zeigte sich in allen

Fällen nach 18 Tagen eine Störung; bei der Behandlung mit SF-733 zeigte sich auch bei einer Dosis von 600 bzw. 800 mg pro kg Körpergewicht nach der vollen Zeit von 60 Tagen keine Gehörstörung.

Zusammenfassung

Das Antibiotikum SF-733 besitzt in vitro und in vivo etwa die gleichen antibakteriellen Eigenschaften wie KM und AMS, jedoch eine deutlich geringere Toxizität als diese.

Die vorliegende Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

15 1 eines flüssigen Mediums (pH-Wert 7.0). welches 2,5% Glukose. 3,5% Sojabohnenmehl. 1,0% lösliches Pflanzenprotein und 0.25% NaCl enthielt, wurde mit einem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 geimpft; die Züchtung erfolgte durch Schüttelkultur in einer Rütteifermentiervorrichtung bei 28^UC in 3 Tagen. iO 1 des Kulturfiltrates (200 WmI), die durch Filtrieren der Kulturbrühe bei pH-Wert = 4,0 erhalten worden waren, wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine Kolonne gegossen, die mit 1 1 »Amberlite IRC 50« (NH₄ ⁺-TyP) gefüllt war. um die aktiven Bestandteile an dem Ionenaustauscherharz zu adsorbieren. Nach Waschen mit Wasser wurde die Kolonne mit 0.5 normalem wäßrigem Ammonaik eluier't. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt und dei Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 5.9 g eines rohen Pulvers, welches in 10 ml Wasser gelöst wurde: die Lösung wurde auf ei.i.·. Kolonne gegeben, die mit 400 ml »Dowex 1 χ 2« (OH -Typ) gefüllt war, und chromatographisch mit Wasser entwickelt; man erhielt auf diese Weise eine aktive Fraktion von 250 ml, die im Vakuum eingeengt wurde, so daß 2,1 g der Substanz SF-733 in Form eines hellgelben Pulvers erhalten wurden. 2 0 g des Pulvers wurden in 3 ml Wasser gelöst, auf eine Kolonne gegeben, die mit 100 ml »Amberlite CG 50« (NH₄ ⁺-Typ) gefüllt war. mit Wasser gewaschen und mit 0,2 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Es wurden 400 ml aktive Fraktion aufgefangen, die im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen wurde; man erhielt so 600 mg der freien Base der Substanz SF-733 in Form eines weißen Pulvers. Dieses Pulver wurde in etwa 5 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde zu einem Sirup eingeengt und mit etwa 50 ml Äthanol versetzt. Die Mutterlauge und dei weiße Niederschlag, die auf diese Weise gebildet worden waren, wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft. 650 mg des dem Äthanolsolvat entsprechenden weißen Pulvers wurden in 6,5 ml Methanol gelöst. Die Lösung wurde unmittelbar nach dem Auflösen der Substanz trübe, worauf sich allmählich Kristalle ausschieden. Die Lösung wurde verschlossen und bei 30⁰C über Nacht abgestellt; nach dieser Zeit wurden die Kristalle auf einem Glasfilter aufgefangen und mit etwa 1 ml Methanol gewaschen. Die Kristalle wurden über Calciumchlorid als Trockenmittel bei Raumtemperatur im Vakuum gehalten und danach anschließend noch über Phosphorpentoxyd als Trockenmittel bei 6O⁰C 19 Stunden im Vakuum getrocknet; auf diese Weise erhielt man 440 mg kristalline freie Base der Substanz SF-733; Ausbeute: 73%.

Beispiel 2

55

401 eines flüssigen Mediums (pH-Wert 7,0), welches 4,0% Stärke, 2,5% Sojabohnenmehl, 1,0% Weizenkeime und 0,25% NaCl enthielt, wurde mit dem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 geimpft und in einer Rütteifermentiervorrichtung bei 35⁰C 2 Tage unter Schütteln kultiviert. 301 des Kulturfiltrats (Wert 350 y/ml), die durch Filtrieren der Kulturbriihe beim pH-Wert 9,0 erhalten worden waren, wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine Kolonne gegeben, die mit 3 1 »Amberlite IRC 50« (Na ⁺ -Typ) gefüllt war; an dem Harz wurden 97% der aktiven Bestandteile adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wurde mit 0,5 n-HCl elu.ert. 6 2 I der aktiven Fraktion wurden mit »Amberl.te IR 45« (OH -Typ) neutralisiert und unter Rühren m.t 90 g Aktivkohle versetzt, wodurch fast alle aktiven Bestandteile an de. Aktivkohle adsorbiert wurden. Die Aktivkohle wurde dann mit Wasser gewaschen und zweimal mit je 3 1 70%igem wäßrigem Aceton gewaschen, der mit ChlorwaJrstoffeäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt war· das Eluat wurde neutralisiert, eingeengt und dei Gefriertrocknung unterworfen. 8,4 g des pulverTormi^en Hydrochloride;; der rohen SüDstanz SF-733 wurden in 12 ml Wasser gelöst: die Lösung wurde au! eine Kolonne gegeben, die mit 700 ml »Dowex 1 χ 2« (OH"-Typ) gefüllt war; die Kolonne wurde chromatographisch mit Wasser entwickelt 650 ml aktive Fraktion wurden aufgefangen, die im Vakuum eingeenet und dann der Gefriertrocknung unterworien wurden⁷ auf diese Weise erhielt man 4,2 g eines he.loelben Pulvers, bei welchem es sich um die Substanz SF-733 in Form der freien Base handelte. 4,1 g diese? Pulvers wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst und dann auf eine Kolonne gegeben, die mit 100 ml »Amberlite CG 50« (NH₄ ⁺-TyP) gefüllt war; man erhielt auf diese Weise 3,4 g der freien Base der Substanz SF-733 in Form eines weißen Pulvers.

Dieses Pulver wurde in 100 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde im Vakuum unter Zugabe von Atha nol eingeenet, wobei schließlich das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt wurde. 3.8 gder weißen, dem Äthanolsolvat entsprechenden festen Substanz wurden in 38 ml Methanol gelöst: die Lösung wurde fest verschlossen über Nacht bei Raumtemperatur abge stellt damit sich Kristalle abscheiden. Die Kristalle wurden abliltrierf, mit 10 ml Methanol gewaschen und entsprechend der im Beispiel ' beschriebenen Methode getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 2,4 g der kristallinen freien Base der Substanz SF-733; Ausbeute: 71%.

Beispiel 3

Zu 10 ml der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe wurde ein Filtrierhilfsmittel gegeben, worauf das Mycel abfiltriert wurde. 81 des Filtrates wurden auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,5 eingestellt und mit Aktivkohle in einer Menge (80 g) versetzt, die 1 % des Filtrates ausmachte; das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, wobei fast alle aktiven Bestandteile an der Aktivkohle adsorbiert wurden. Die Aktivkohle wurde dann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 1,21 70%igen wäßrigem Methanol suspendiert, welches mit 4 η-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt worden war. Es wurde 30 Minuten gerührt, um die aktiven Bestandteile zu extrahieren. Das FiI-trat wurde nach dem Abfiltrieren der Aktivkohle im Vakuum eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wurde, so daß man 28 g der rohen pulverförmigen Substanz SF-733 erhielt. Diese wurde in 35 ml Wasser gelöst, die Lösung wurde mit 4 η-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 bis 4,5 eingestellt und auf eine Kolonne gegeben, die mit 35 g pulverförmiger Aktivkohle gefüllt war; das Eluieren wurde mit 0,03 n-Schwefelsäure vorgenommen. 300 ml aktive Fraktion wurden aufgefangen, mit »Amberlite IR 45« (OH"-Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, im Vakuum eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen; auf diese Weise erhielt man 6,5 g rohes pulverförmiges Sulfat der Substanz SF-733.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:
Antibiotikum SF-733 der Formel

CH₂NH₂
J—O

NH₁

OH