DE1814735A1

DE1814735A1 - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums SF-733

Info

Publication number: DE1814735A1
Application number: DE19681814735
Authority: DE
Inventors: Eiichi Akita; Norio Ezaki; Taro Niida; Tomizo Niwa; Takahi Shomura; Takashi Tsuruoka
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1967-12-18
Filing date: 1968-12-14
Publication date: 1969-08-21
Also published as: DK122405B; NL162135B; NL162135C; BE725674A; IL31223A0; SE355378B; GB1254883A; NL6818105A; DE1814735C3; US3661892A; DE1814735B2; MY7400158A; NO128662B; IL31223A; YU32708B; CH545849A; ES361544A1; YU297468A; AT290013B; FR1603553A

Description

18-U735

Anmelders MEIJI SBIKA KAISHA, LSD»

Io. 8, 2-ehome, Kyobashi, Ghuo-ku, Sokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung eirnss neuen Antibiotikums SF-733

Die Priorität aus der japanischen Patentanmeldung Βία. 80601/67 vom 18_e12_o1967 und der japanischen Patentanmeldung Ιο» 74634/68 vom 15.10· 1-968 wird in Anspruch genommene

Die Erfindung bezieht sich auf ein Terfahren zur Herstellung ei-j nes neuen Antibiotikums, welches als SF-733 bezeichnet wird und welches durch Kultivierung eines bestimmten Stammes der Art Streptomyces gewonnen werden kann·

Es wurde jetzt gefunden, daß es möglich ist, ein Antibiotikum! welches eine starke wachsturneverhindernde Wirkung gegen Mikroorganismen verschiedenster Art wie grampositive und gramnegative pathogene Bakterien und säurebeständige Bakterien zeigt, in einer Kulturbrühe herzustellen, welche einen bestimmten Stamm der Art Streptomycee enthält $ die aktive Substanz kann aus der Kulturbrühe gewonnen werden. Diese aktive Substanz wird ale S3P-733 bezeichnet. Für die Zwecke der Erfindung wird ein Streptomyoes-Stamm verwendet, der eine so hohe Aktivität zur Erzeugung von j SF-733 beßitzt, daß diese Substanz aua der Kulturbrühe isoliert , werden kann. ^!

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Der SP-733 erzeugende Mikroorganismus wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung aus einer Bodenprobe isoliert, die in Ssu Gity, MIE Prefecture, Japan, gesammelt wurde j der Mikroorganismus wurde als Streptomyces thermoflavus SP-733 "bezeichnet und "bei der "American Type Culture Collection" in Washington D.C./USA unter der Bezeichnung ATCC Fo. 21294 hinterlegt.

Zur Erläuterung der Erfindung sind Zeichnungen beigefügt? in diesen Zeichnungen bedeuten:

Pig. 1 das Ultraviolettspektrum der amorphen Substanz SP-733»

Pig. 2 das InfrarotSpektrum der amorphen Substanz SP-733 (KBr- !Tablette),·

Pig. 3 das Papierehromatogramm der amorphen Substanz SP-733 sowie der mit dieser Substanz verwandten Antibiotika?

Pig. 4 das Ultraviolettspektrum der kristallinen Substanz SP-733 in Perm der freien Basej

Pig. 5 das Infrarotspektrum der kristallinen Substanz SP-733 in Porm der freien Base.

. Streptomyces thermoflavus SP-733 weL st folgende Charakteristika auf:

I, Unter dem Mikroskops

¹ 1) Reichlich gebildetes, offen spiralförmiges luftmycel,

2) Sporen: oval bis elliptisch, Oberflächenstruktur stachlig, Größe 0,8-1,0 χ 1,1 - 1,4 Mikron.

II. Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien:

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Kulturmedium

Wachstum luftmycei

Sucrose-Özapek-Agar (inkubiert "bei 28°G)

GIyc erin-G zapek-Agar (inkubiert bei 2S°G)

Krrinsky's Glukose-Asparagin-Agar
(inkubiert bei 28⁰C)

Ushinsky's Glukose-Asparagin-Agar
(inkubiert bei 28°0)

GaIc iummalat-Agar
(inkubiert bei 28°G)

dick, gut* faltig,

in das Medium eindringencli

gelbliche Kremfarbe,

Rückseite hell-bräunliche

Kremfarbe

dick, gut, faltig,

in das Medium eindriq^nd;

leicht gelblich-braun

gut, in das Medium eindringend; dunkle Kremfarbe, Rückseite bräunlich-gelb

gut, in das Medium eindringend, bräunlich-gelb mit Grünstich sehr schwach, leietffT gelblich, weiß*

lösliches Pigment nicht»

nichts

nicht gut, leicht gelblich kremfarben

Glycerin-Galciummalat-gelb; Agar (inkubiert bei Kolonien 28⁰G)

schwach;

weiß bis kremfarben

schwach:;

kremfarben bis leicht gelblich-weiß

sehr starkes Wachstum, leicht .gelb pulverförmig; grünlichgelb, allmählich von graustichig auf gräulich-braun übergehend, Bildung von günlichgelben lupfen

schwach; nichts

nichts bis schwach, nichts leichte Gelbfarbe

to Stärke synthetischer

° Agar (inkubiert bei

to ₂₈ö_C)

(O

**** Bouillon-Agar

_w (inkubiert bei 28°G)

good, in das Medium eindrin- sehr starkes Wachs- leichtgelb gend; gelb, der Innenteil turn, pulverförmig, der Kolonie braun mit Grün- grünlich-gelb allmähstich lieh in gräulich-braun

übergehend

Kolonien, in das Medium eindringend, dunkle Kremfarbe, Rückseite bräunlich-gelb nichts bis schwach, hellgelb

nichts

liachstum

-·■ Iuftmycel lösliches Pigment

m	to
D	O
ο	to
33	00
O	to
ψ	trt
	-4

Glukose BoüilioH-Agar (inkubiert bei 28°C)<■

KartofJtelpfrqpf ■■-(infcubi-ert "bei 2O⁰C)

Earottenpfrppf
(inkubiert toi

fein faltig, schwach., kremfartea nichts gerblich, "braun.

erhabea, fein faltig, schwach, weißlich- nichts

leicht "bräunlich kxem- grau.

farben

nichts

Kolonien,

Kremfärbe

dunkle

Eygx _n (iiitoxbiert tei 28⁰C)

Ei -

(inkubiert

bei 37⁰C)

tief in das Medium eirifcingend, dunkle Kremfarbe

Kolonien, leicht bräunlich gelb

grau

nichts

ioeffler¹S koaguliertes dunkle bräunlich- nichts

ι Serum (inkubiert bei ^. 37⁰C)

ι Bacto-ITitratbrühe_ (inkubiert bei 28°C)

Magermilch
(inkubiert bei 37⁰C)

gelbe Farbe

als Bodensatz, farblos

nichts

gelblich orange- nichts farbeaer das Glas an der Oberfläche beruh-' render Ring, nauptmenge am Boden abgesetzt

Gelatine

(inkubiert bei 20⁰C)

Cellulosemedium
(inkubiert bei 28⁰C

farblos ben

bis kremfar-nichts nichts nichts

nichts nichts

nichts

leicht bräunliche Orangef arbeϊ Reaktion des Mediums: pH 5»5

nichts

kein Wachstum

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III Physiologische Eigenschaften:

Bildung Ton Schwefelwasserstoff negatiT

Bildung von fyroeinas® negatiT

Bildung von Nitrit « positiv

Köagulierung tob Magermilch .. ·.. negatiT

(28^σ0, 37⁰C)

Peptanisierung von Magermilch

_β«

positiv

bra).

negativ

Hydrolyse von Stärke .·<>·.«•••«.•e····«···..·· positiv

Verflüssigung von Gelatine .... _{β 0} negativ

Auflösung von Loeffler's koaguliert em-S'erum .. poaitiy

py (schwach, 37⁰G)

IY Ausjamtaiang der Kohlenstoff quellen; (Pridhaa-Q-'ottlieli's Basalmediuia₉ inkabiert 1>ei 27⁰C)

1. YOrwendeti ArabiH,ose_s HJaaamos©, Glukoae, Maimose« Galac

tose, Saccharose, Lactose, Raffinose, Dextrin

Inulin, Stärke, Glycerin, Sorbitol, Mannitol, Maltose.

2. zweifelhaft} Inositol, Natrimcitrat.

3. nicht verwendet: Xylose, Pructose, Dulcitol, Natrium-

acetat, Natriumsuccinat, Salicin, * Cellulose. Λ

Y Optiaale Temperatur:

4-0⁰C (gemessen mit einem Temperaturgradient-Inkubator)

Gemäß Vorstehendem können die Eigenschaften des Stammes SF-733 wie folgt zusammengefaßt werden:

Spiralbildung im Luftmyoel; Sporen mit stacheliger Struktur; kremfarbenes bis gelblich-braunes Wachstum auf synthetischen Medien, g^iblich gründen bis gräulich braunes Luftmyoel, Pehlen

909834/1574 ⁸*^D original

eine· löslichen Pigmentes im allgemeinen, jedoch hellgelbes Pigment auf Glukose-Asparagin-Agar (Ushinsky) und Stärke-synthetischer-Agar kremfarbiges bis giblieh braunes Wachstum, dünnes luftmyeel und kein lösliches Pigment auf organischen Medien. Das Hervorstechenste Merkmal des Stammes SP-733 ist darin ssu sehen, daß die optimale Wachs turns temperatur mit 4O⁰G verhältnismäßig hoch liegt. Aus den vorstehenden Eigenschaften kann geschlossen werden, daß der Stamm SP-733 der flavus-Heihe der Gattung Streptromyces nahe verwandt ist· In dieser Reihe können Streptomyees flavus, Streptomyees flaveolus, Streptomyces flavovireus, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces alboflavus, Streptomyces parvus, Streptomyces parvullus, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyees griseoflavus und Streptomycea eelluloflavus als nah® verwandte Stämme genannt werden. Unter diesen Arten sind Streptomyces kanamycetius, Streptomaces flavogriseus, Streptomyces alboflavus und Streptomyces celluloflavus von dem Stamm SP-733 klar unterschieden, weil die Luftmycelien der ersteren keine Spiralen bilden, während in den Mycelien der letzteren große Mengen typischer offe ner Spiralen vorkommen. Streptomyces parvullus, welohes Sporen vom glatten Typ bildet, unterscheidet sich von dem Stamm SI-733 insofern, als die Oberfläche der Sporen des letzteren stachelig ist. Streptomyces parvus und Streptomyces griseoflavus unterscheiden sich deutlich von dem Stamm SP-733, weil sie auf einem Celluloaemedium gut wachsen. Streptomyces flavus, Streptomyces flaveolus und Streptomyces flavovireus, welche als die typischen Stämme der flavus-Heihe angesehen werden können, sind dem Stamm SP-733 am nächsten verwandt, und zwar im Hinbliok auf die verschiedenen Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien.

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Diese drei Organismen unterscheiden sich jedoch von dem Staun j SP-733 in den folgenden Punkten: Die Sporen von Streptomyees flaveolus weisen eine haarige Oberfläche auf; -im Gegensat* dazu haben die Sporen des Stammes SP-733 eine stachelige Oberfläche. Die Luftmycelien von Streptomyees flavus und Streptoayces flavovireus sind im wesentlichen gerade und bilden nur in einigen Fällen offene Spiralen, während das Luftmycel von SP-733 große Mengen offene Spiralen bildet. Darüber hinaus erzeugt Streptomyces flavovireus grünlich gelbe lösliche Pigmente auf synthetischem Agarmedium, wogegen der Stamm SP-733 kein lösliches Pigment bildet. Streptomyces flavus /^fduziert kein Hitrat und seine optimale Kultivierungetemperatur beträgt 25⁰O; der Stamm SP-733 erzeugt dagegen Nitrat und seine optimale Kultivierungstemperatur liegt mit 4O⁰O verhältnismäßig hoch.

Der Stamm SP-733 unterscheidet sich also deutlich von den vorstehend genannten drei Organismen, und zwar im Hinblick auf verschiedene wichtige Charakteristika.

Die neue antibiotische Substanz SF-733, die von dem Stamm SP-733 erzeugt wird, ist ein typisches wasserlösliches basisches Antibiotikum mit einem breiten antibakteriellen Wirkungsspektrumj seine optische Drehung ist (.+ ). Unter den bekannten Antibiotika gehören Neomycin, Paromomycin, Kanamycin, Gentamycin und Tenemycin u.a. in dieselbe Gruppe. Der Stamm SP-733 sollte daher im Hinblick auf die mykologieche Verwandtschaft mit den Stämmen verglichen werden, die die genannten Antibiotika erzeugen. Es existieren zwei Gentamycin erzeugende Stämme, nämlich Micromonospora echinosspora und Micromonospora purpurea. | Diese beiden Stämme gehören nicht zur Gattung Streptomyces, w^ durch sie sich bereits deutlich von dem Stamm SP-733 unterschä. den. Weitere Neomycin erzeugende Stäme sind: Streptomyces fradiae, Streptomyces albogriseolus; ein Paromomycin erzeugender Stamm ist Streptomyces rimosus forma paromomycinus; ein Kanamycin erzeugender Stamm ist Streptomyees kanamycetieus;

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ein Tenemyοin erzeugender Stamm ist Streptomyces tenebrarius; alle sind von den Stamm SF-733 deutlich unterschieden, und zwar im Hinblick auf ihre morphologiechen Eigenschaften, die in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind; die verschiedenen Stämme unterscheiden sich sowohl von dem Stamm SP-733 als auch untereinander.

Vergleich «wischen dem Stamm SF-733 und bekannten Streptomyces Arten, die rechtedrehende wasserlösliche basische Antibiotika erzeugen

Antibiotika

Stämme

üuftmyeel

Oberfläche der Sporen

Substanz SF-733 Stamm SP-733

Streptomyces fradiae

Neomycin Faroaomyoin

Kanamycin Tenemycin

Streptomyces albogriseolus

Streptomyces rimosus forma paromomycinus

Streptomyces kanuiyoeticus

Streptomyces tenetorarius

Spiralen stachelig

gerade, flexi- glatt bei,keine Spiralen

Spiralen

haarig

gerade, gele- glatt gentlich offen oder geschlossen, apiralig

gerade

Spiralen

glatt glatt

* (Stvtath Interseience Conference on Antimicrobial Agent Ckemotherapy, 25.-27. Oktober, 1967 in Ohikago)

Aufgrund der vorstehenden mykologischen Prüfung konnte festgestellt, daß der Stamm 3Ϊ-733 ein neuer Mikroorganismus ist, welcher »in wasserlösliches basisches Antibiotikum erzeugt;der Mikroorganismus kann tazonomisch als neuer Stamm der flavus-Eeih« eingeordnet werden; er wurde als Streptomyces thermoflavus nov. ·ρ. "bezeichnet. '(Die Eigenschaften der zum Vergleich

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herangezogenen Streptomyees-Arten wurden des Werk von Waksman «Aetinomycetes" Band 2, 1961,

Die Eigenschaften des Stasmaes SP-733 sind leicht veränderlich wie dies auch bei anderen Str@ptoisye<8s=Arten zu beobachten i&% Bo lassen sich beispielsweise mit verschiedenen "bekannten Mutagespm wi© Ultraviolettstrahler, Kömtgenstralilen, HocMrequea* wellen, radioaktiven Strahlen und Gfe©ffiilcali®n künstliche Variant @m und Mutanten von SF-733 ©rfcalten. All© natürlichen und künstliehen Varianten und Mutanten, di® zu Streptomycss thermoflavus gehören und die Fähigkeit ^ή,γ Bildung der Sufeatanz SF-733 besitzen, können für- die -Zwsoke der Erfindung verwendet werden-

irfinduagsgeaäS kana der Stanm. SF=-733 in einem Eulturinedium ge>i suchtet werden, welches lährstoffe enthält, die zur lüehtung üblicher Mikroorganismen verwendet werden« Al© Sfährstoffe können die für die Züehtung von Streptomyeea ütolioherweisa eingesetzten lährstoffe verwendet werden. Glukose, Stärke, Glycerin, Dextrin 5 Sucrose u.a. sind beispielsweise als Kohlenstoff quelle geeignet« Sojabohnenmehl, Weizenk@im@, Fleisehextr^akt, Peptoi^ Srockenhefe, Maisw@iohwa@s@r_f Schlempe, Ammoniumsulfat, Matrlumnitrat u.a. sind als Stickstoffquelle geeignet. Ggfs. können anorganische Salze wie Calciumcarbonate gewöhnliches Salz, Kaliumchlorid oder -phosphat zugesetzt werden. Weiterhin können organische und anorganische Materialien, die das Wachstum des Stammes SP-733 unterstützen und die Bildung der Substanz SF-733 erleichtern, zugesetzt werden. Mr die Züchtung.des Stammes SP-733 hat sich die flüssige Kultut, insbesondere unter Bubmersen aroben Bedingungen als am günstigsten erwiesen. Pur die Züchtung sind Temperaturen zwischen 25 und 4O⁰O geeignet? am besten liegt die !Temperatur nahe bei 35⁰C. Die Bildung der Substanz SP-733 erreicht für 2-5 Tage ein Maximum, und zwar sowohl bei der Schüttelkultur als auch bei der Tankkultur.

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Für die Prüfung von SF-733 können Myeinassay-Agar (pH 7,8) als Medium und Bacillus subtilis ATCC No, 6633. als Testorganisaus verwendet werden.

Eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus der Konzentration der Substanz SF-733 un-d dem Durchmesser des inhibierenden Binges gegen den TestOrganismus konnte bei einer Konzentration Ton 1-25 mcg/ml beobachtet werden; die Durchmeaaerwerte des inhibierenden Ringes betrugen unter dieser Bedingung jeweils 15 - 25 mm (Auf-Platte-Methode).

Die Substanz 81-133 ist ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, was sich klar aufgrund der nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ergibtj. die Substanz kann aus der Kulturbrühe mit Hilfe beliebiger bekannter Verfahren, wie sie üblicherweise für die Gewinnung bekannter wasserlöslicher basischer Antibiotika wie Kanamycin, neomycin usw. angewandt werden, abgetrennt werden.

Die Substanz SF-733 kann leicht an Aktivkohle im alkalischen Bereich adsorbiert und mit wäßrigem Alkohol oder wäßrigem Aveton im sauren pH-Bereich wirksam eluiert werden»

Die Substanz Sf-733 kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauacherharzes als Adsorbens gereinigt werden. Ein geeignetes Ionenauatauscherharz ist beispielsweise ein Kationenaustauscherharz wie Amberlite IEC-50 (ein Handelsprodukt der Firma Rohm & Haas) vom HH₁J" -, JIa⁺ - oder H⁺ -Typ. Die Bluierung wird üblicherweise mit wäßriger Säure-, Alkali- oder Salslösung vor genommen. Die Substanz SF-733 kann auch in Form eines Säureanlagerungssalzes niedergeschlagen werden, indem man ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zu einer wäßrigen Lösung gibt, die das Säureanlagerungssalz der Substanz SF-733 enthält.

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Die so erhaltene rohe pulverförmige Substanz SF-733 kann durch Ionenaustauseh-Chromatographie mit Dowex 1 χ 2 (OH-Typ) (Handeleprodukt der Firma Dow Chemicals) oder "Amberlite CGr-50"
(NHt -Typ) (Handelsprodukt der Firma- Rohm Ä Haas) weitergereinigt werden? nach dtlt Reinigung liegt öin weißes amorphes Pulver vor, welches die Substanz SF-733 in Form der freien Base

darstellt; die Reinheit und Einheitlichkeit des Produktes wur-

dt durch Papierchromatographie, Hochspannungs-Papierelektro- j phorese und Dünnschiehtchromatographie des N-Aeetylderivates ! sichergestellt. Die amorphe freie Base der Substanz SP-733 ist im neutralen und alkalischen Bereich bestätig, aber
schjtetfh beständig im sauren Bereich.

Die physikal-chemischen Eigenschaften der SubstanE S3SF-733 werden im folgenden beschrieben. Di© asorphe freie Base der Sub« stanr SF-733 zereetst sich unt®r Aufschäumen bei 178-185⁰O; sie besitzt keinen definierten Bchmelzpunkt. Die freie Base ist
leicht löslich im Wass@r, wenig löslich in Methanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Aeeton₉ Butanol, Äthylacetat, Benzol, Hexan und Ither. Bei der Elektrophorese bewegt sie sich bti einem pH-Wert von 1,8 gegen, die Kathode; aus der Titrationskurve kann nicht auf die Existenz von sauren Gruppen geschlossen werden. Diese Tatsachen beweisen, daß die freie
Baseline basische Substanz ist. Ihr Ultraviolettabsoptionsspektrum ist in Figur 1 dargestellt. Keine spezifische Absorption konnte festgestellt werden. Ihr Infrarotabsorptionsspektrum ist in Figur 2 dargestellt. Die Absorptionsbande, welche für Aminozucker-jy&tibiötikg, eigentümlich ist, konnte beobachtet werden.

Dia spezifische freie

Drehung der "-Substanz SF-733 (amorph© ²³ ist +42°. Die Reaktfenea

siad positiv, die;

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Reaktionen gegen Fehling- und Benedict-Lösung, Ferrichlorid, Maltol, Biuret, Tollens- und Sakaguehi-Reagenz sind negativ. Das Molekulargewicht (geschätzt nach der Dampfdruck-Gleichgewicht smethode) liegt bei 475 j dieser Wert wi»d durch den Wert gestützt, der aus der Titrationskurve geschätzt werden kann (452 als viersäurige Base).

Bei der Elementaranalyse einer Probe der Substanz SF-733, die über Phosphorpentoxyd im Vakuum bei 110⁰C 20 Stunden getrocknet worden war, erhielt man folgende Werte: 0 44,16$, H 7,55%, ΪΓ 11,92$, 0 36,21$; die Summenformel ist demnach C₁₇H₅₄I₄O₁₀ (theoretische Werte: C 44,93$, H 7,54$, N 12,33$, 0 35,20$, Molekulargewicht: 454,49). Die Untersuchungen hinsichtlieh der chemischen Struktur haben ergeben, daß die Substanz SF-733 ein O-ß-D-Ribofuranosyl- (1 —» 5)-0-£ä-2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyl-(1—♦ 4^]}-2-deoxystreptamin der Formel ist.

CH₂NH₁

OH

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Bei der absteigenden Papierchromatographie unter Verwendung von n-ButanolZPyridinZEssigsäureZWasser (6:4:1:3, Entwicklung 4 Tage) und n-Butanol, welches mit 2$ p-Toluolsulfonsäure enthaltendem Wasser gesättigt ist (Entwicklung 25 Stunden), Färbung mit Ninhydrin und Bioautographie unter Verwendung von Bacillus subtilis zeigt die Substanz SF-733 in federn Lösungsmittelsystem einen einzigen Fleck bei 8 cm bzw. 14,8 cm, gemessen vom Ausgangspunkt. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese (3300 V, pH * 1,8, 15 Minuten) bewegt sich die Substanz SF-733 ebenfalls 15 cm zur Kathode und zeigt einen einzelnen Fleck. Bei der Dtinnsehichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von t-Butanol/EssigsäureZWasser (2:1:1), n-ButanolZEssigsäureZWasser (3:1:1) und n-ButanolZPy*ridinZWasser (6:4:3) so** wie 80jSigem wäßrigen Methanol als Entwickler zeigt das H-Ac etylderivat der Substanz SF-733 einen einzelnen Fleck bei Rf 0,40, 0,16, 0,50 bzw, 0,70. Aus dieser Tatsache ergibt sich ebenfalls deutlich die Reinheit und Einheitlichkeit der Substanz SF-733.

Wie aus den vorstehenden Erläuterungen hervorgeht, ist die Substanz SF-733 ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches sich bei der Prüfung der optischen Drehung als rechtsdrehend erweist. Von den bekannten Antibiotika sollen Heomycin Paromonycin, Kanamycin·, Gentamyein, Destomycin und Actinospek- ■ f tacin mit der Substanz SF-733 verglichen werden.

Die Substanz SF-733 wird mit diesen bekannten Antibiotika hinsichtlich ihrer optischen Drehung (Tabelle I) und der Papierchromatographie (Tabelle II und Figur 3) veig.ichen.

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BAD OBIGlNAt Tabelle I

Substanzen

SP-733
Heomycin A

!eomycin B
Heomycin G
Paromomycin I
Paromomycin II
ι Kanamycin A

*~ Kanamycin B
Kanamycin C
Gentamicin A

Gentamycin C.
Gentamycin Cp
Destomycin A
Destomycin B

Hygromycin B
Actinospectacin
Kasugamycin
Capreomycin II

spezifische optische Drehung (in wäßriger Lösung)

Literatur

+123

+ 58° + 82° + 64° + 78° +121°

+135^C +126^C +146^C

+158 +160⁽

+ 19,2 + 7,6⁽ +120° + 2,5«

Umezawa et al "Index of Antibiotics from Actinomy·· cetes" (Tokyo University Publishing Society, 1967) S. 453 .

-»- S. 454

-»- S. 455

-"- . S. 492

-«- S. 492

Kondο,■"Journal of Antibiotics", Reihe B, S. 1961

TJmezawa et al, "Index of Antibiotics from Actinomycetesⁿ (Toiyo University Publishing Society, 1967), S. 30.8

-^B- . S. 250

Umezawa et al, "Index of Antibiotics from Actino- · mycetes¹¹ (To&yo University Publishing Society 1967)

S. 250

S. S.	335 105	OO _A
S.	365
S.	192	U) cn

Substanzen

Tabelle II Lösungsmittel B

Lösungsmittel A

Entfernung vom Original- R 733* Entfernung rom Originalpunkt (cm) punkt {)

R 733*

Substanz' S3i^l-733
Kanamycin A Base

ti

Neomycin

tr
ti

C
A
B
C

ι Paromomycin I Base
£ » II "
ι Gentamicin C Base

8,0 8,0 6,0 8,5 7,7 3,4 3,5 4,1 4,6 12,0

1	14,8
1	10,0
0,75	18,5
1,06	14,4
0,96	19,2
0,43	17,6
0,41	17,5
0,56	10,8
0,58	10,0
1,50	25,0

0,68

1,25

0,97

1,30

1,18

0,73

0,74

1,69

Bemerkungen: Lösungsmittel A
Lösungsmittel B

n-Butanol gesättigt mit ¥asser, enthaltend 2.Jo p-Coluolsulfonsäure, absteigende Methode, Entwicklung für 25 Stunden.

n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/¥asser (6:4:1:3), absteigende Methode, Entwicklung für 4 Tage.

Prüfung: Bioautographie mit Bacillus subtilis.

*: Verhältnis der Entfernung bezogen auf SlF-733

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Die Substanz SF-733 kann von der Kanamycin-Gruppe (A,B,C), der Gentamioin-Gruppe (1, C^, C₂), Neomycin Ä, Destomycin A, B, Hygromycin B, Actinospedbaein, Kasugamycin und Capreomycin im Hin*· blick auf die spezifische optische Drehung wie in Tabelle I angegeben und von Neomycin- B, C, Paromomyein I, II, Gentamicin C und Kanamycin A, B im Hinblick auf die Ef-Werte bei der Papierchromatographie (Tabelle II) (Figur 3) klar unterschieden werden. Die Substanz SF-733 läßt sich weiterhin deutlich unterscheiden: von Capreomycin II, welches ein Ültraviolettabsorptionsmaximum aufweist, von Actinospectacin durch den analytischen Stickstoffwert, von Destomycin A, B und Hygromycin B durch Eigenheiten des antibakteriellen Wirkungsbereiches und deren höhere Toxizität. Von Tenemycin (Seventh Interscience Conference on Antimicrobial agent and chemotherapy, 1967, 25. - 27. Oktober in Chikago) unterscheidet sich die Substanz SF-733 deutlich, weil der (<JL)_D -Wert des N-Acetylderivates des Tenemycins (+95 - + 130°) ist, während der des N-Acetylderivates der Substanz SF-733 +40° ist. Aus dem vorstehenden Vergleich geht wiederum deutlich hervor, daß die Substanz SF-733 ein neues Antibiotikum ist, welches nicht mit anderen bekannten Antibiotika übereinstimmt.

Das antibakterielle Wirkungsspektrum der Substanz SF-733 gegen verschiedene Mikroorganismen ist im Folgenden zusammengestellt.

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ORIGINAL INSPECTED

Minimale inhibierende Konzentration nach der Brühe-Yerdünnungsmethode

Test-Organismen

minimale inhibierende Konzentration mcg/ml

Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus cereus
Staphylococcus aureus 209-P » » 52-34 ■ " 193 » . . » Smith

^{n n} Terajima Sarcina lutea
Aerobacter aerogenes Escherichia coli IAM 1253 , " " IAM 1239 ^ » " K-12

•ρ- " " Chloramphenicol- resistant ι ^π " Streptomycin-resistant

" " Streptothricin-resistent Escherichia coli Kanamycin-resistent Shigella dysenteriae

Shigella flexneri (iJtreptomycin-Tetracyelin) Salmonella typhi
Salmonella typhi paratyphi A Salmonella typhi paratyphi B Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium smegmates 607

" phlei Candida albicans Torula utilis
Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger 0,39 6,25 3,125 3,125 3,125 0,39 0,19

100,0
12,5 λ r\ τ—

12,5

12,5 3,125 1,56 12,5 50

-resistant

>100

5,25 12,5

3.125 12,5 12,5

6,25 25,0 >100,0 12,5

6,25 >100,0 >100,0

^100*0

KuIturmed ium

Bouillonme d ium

Il

it

Glycerin ⁿ

II

Sabouraub

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Aus der vorstehenden Tabelle geht klar hervor, daß die Substanz Sjf-733 einen breiten Wirkungsbereich besitzt und sowohl gegen gram-positive als auch gram-negative und säurebehandelte Bakterien wirksam ist.

Bei Versuchen zur Bestimmung der akuten Toxizität durch intravenöse Injektion bei Mäusen konnte festgestellt werden, daß die Toxizität der Verbindung SF-733 sehr niedrig ietf der üBcq-Wert beträgt 1000 mg/kg für die freie Base und 500 mg/kg für das Sulfat der Verbindung.} ein abnormer Verlauf nach der Injektion konnte nicht beobachtet werden·

Die amorphe freie Base der Substanz SF-733 kann durch folgendes Verfahren in kristalline Form überführt werden.

Die amorphe freie Base wird in Wasser gelöst und die so gewonnene Lösung wird zur Trockne eingedampft, wobei man Äthanol zufügt und das Wasser durch azecbrope Destillation entfernt} die Lösung kann auch zunächst zu einem Sytup eingeengt werden, dann mit Äthanol versetzt werden, so daß sich ein Niederschlag bildet, und erst dann zur· Trockne eingedampft werden, wobei weiteres Äthanol zugesetzt und das Wasser durch azeobrope Destillation entfernt wird; auf diese Weise erhält man die Substanz SF-733 als weiße feste Substanz in Form eines Äthanolsolvates. Das weiße feste Äthanolsnlyat der Substanz SF-733 zeichnet sich gegenüber der vollständig dehydratisierten amorphen freien Base und der kristallisierten freien Base der Substanz SF-733 (die im Folgenden erwähnt wird) durch seine höhere Löslichkeit in . Methanol aus·

Das weiße feste Äthanolsolvat der SubstanzSF-733» daß wie vorstehend beschrieben erhalten worden ist, wird in einer ausreichenden Menge Methanol gelöst. Die Lösung wird abgestellt, wobei schnell Kristalle gebildet werden. Die gewünschte kristalline freie Base der Substanz SF-733 kann gewonnen werden, indem man die Kristalle abfiltriert, mit wenig Methanol wäscht und zunächst bei Raumtemperatur

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im Vakuum und dann noch in einem Glasexsikkator ebenfalls im Vakuum bei 6O⁰O 19 Stunden über Phosphorpentoxyd als Trockenmittel trocknet, um das an den Kristallen anhaftende Methanol zu entfernen. -

Das Pulver, welches durch Gefriertrocknen einer wäßrigen Lösung der amorphen freien Base der Substanz SF-733 erhalten worden ist und eine ausreichende Menge Wasser absorbieren konnte, weist einefhöhere Löslichkeit in Methanol auf als das vorstehend erwähnte weiße feste Äthanolsolvat, aber selbst wenn man dieses Pulver in Methanol löst und sich selbst überläßt, bildet sich nur eine kiel ne Menge eines Niederschlages, ohne daß Kristalle der freien Base der Substanz SF-733 erhalten werden können. Für die Kristallisation der freien Base: der Substanz SF-733 muß das vorstehend beschriebene Verfahren angewandt werden, gemäß welchem das zu kristallisierende Material das Äthanolsolvatstadbua durchlaufen muß, welches für die Kristallisation wesentlich ist·

In der kristallinen Erscheinungsform besteht die freie Base der Substanz SF-733 aus weißen Nadeln oder kurzen Stäbchen, die unter Zersetzung und Aufschäumen bei 192 - 195⁰O schmelzen.

Die Elementaranalyse ergab folgende Werte: C 44, 19$, H 7,39%, N 11,60$, 0 (aus der Differenz) 36,8256. Das Molekulargewicht beträgt nach der Dampfdruck-Gleichgewichtsmethode in wäßriger Lösung 440, während der nach der Titrationsmethode in wäßriger Lösung ermittelte Wert bei 470 liegt. Die Summenformel der freien Base der Verbindung SF-733 in kristalliner Form ist C₁₇Hj₊ N₄O₁₀ (theoretische Werte: 0 44,93$, H 7,54$, N 12,33$, 0 35,20$, Molekulargewicht 454,49)} die chemische Struktur der Verbindung entspricht dem bereits erwähnten O-fc-w-Ribofuranosyl- , (1—> 5)-0-G^-2,6-(iamino-2,6-dideoxy-_I)-glucopyranosyl (1—fr 4)J -2-deoxystreptamin. Die kristalline freie Base der Substanz SF-" 733 ist dieselbe Verbindung wie die amorphe freie Base der Substanz SF-733j die beiden Produkte unterscheiden sich nur durch die äußere Erscheinungsform.

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Die kristalline Form der freien Base der Substanz-SF-733 ist rechtsdrehend und ihr|JL| J* beträgt +42⁰G (G»1, HgO). Eine wäßrige Lösung der Base ist alkalisch. Bei der Analyse lassen sich aus der Titrationskurve keine sauren Gruppen.ermitteln. Die vorliegende Substanz ist sicher basiash.

Das Ultraviolettspektrum der kristallinen freien Base der Substanz SF-733 in wäßriger Lösung (0,102%) ist in Figur 4 darge*· stellt. Es konnte kein Absorptionsmaximum beobachtet werden mit Ausnahme der Endabsorption. In der Figur bedeuten die Zahlen an der Abszisse Wellenlängen (myu) und die Zahlen an der Ordinate das Maß der Absorption. Das Infrarotspektrummit KBr-Tablette W ist in Figur 5 dargestellt. Es ist die für aminoglycosidische Antibiotika eigentümliche.Absorption zu beobachten. In der Figur bedeuten die Zahlen an der Abszisse Wellenzahlen pro 1 cm und die Zahlen an der Ordinate den Transmissionsgrad (%).

' Die kristalline freie Base der Substanz SF-733 ist in Wasser leicht löslich, in Methanol kaum löslich und in Äthanol sehr sehwer löslich. Sie ist praktisch vollständig unlöslich in n-Propanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat, Petroläther und Chloroform.

Die Reaktionen gegen Molisch-Reagenz, Anthron, Ninhydrin und ß-Naphthol-schwefelsäure (Aldopentose-Reaktion) sind positiv; die Reaktionen gegen Anthron unter definierten B_edingungen (Hexose-, 6-Deoxyhexose-Reaktionen - vgl. Methods of Garbohydrate Chemistry, Bd. I, S. 490, 1963, Academic Press - ), Fehling'sche Lösung (kalt), Ferrichlorid, Brady-Reagenz (Reaktion mit 2,4-Dinitrophe-nylhydrazin), Biuret, Sakaguchi-Reagenz und Maltol sind negativ. Die kristalline freie Base der Substanz SF-733 kann in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure carbonisiert werden; sie reduziert Kaliumpermanganatlösung bei Raumtemperatur.

Bei der Dünnschichtchromatographie an Bilikagel G (Handelsprodukt der Firma Merck & Co.) läßt sich bei der Färhung mit

Mnhydrin

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oder mit 10$iger Schwefelsäure (Carbonisierung beim Erhitzen) ein einzelner Fleck feststellen, der fast am Ausgangspunkt liegt, wenn als lösungsmittelsystem Äthanol/konzentriertes Ammoniak-Wasser/Wasser' (8:1:1) und 1O#ige wäßrige" Ammoniumacetatlösung/Methanol (1:1) verwendet werden; die Rf-Werte liegen dann bei 0,5 bzw. 0,6. Bei der Papierbioautographie un- · ter Verwendung von Bacillus subtilis beobachtet man einen«einzelnen Fleck bei 8 cm und 14,8 cm vom Ausgangspunkt, wenn man als Lösungsmittelsysteme n-Butanol/Pyridin/Essigeäure/Wasser (6:4:1:3); absteigende Methode; 4 Tage) bzw. n-Butanol, welches mit 2% p-Toluolsulfonsäure enthaltendem Wasser gesättigt ist, > (absteigende Methode; 25 Stunden) verwendet. Bei der Hoch- ™ spannungs-Papierelektrophorese bewegt sich die kristalline freie Base der Substanz SF-733 15 cm auf die Kathode zu und zeigt einen einzelnen Fleck (3300 V, pH 1,8, 15 Minuten, Uinhydrin-Färbung, Bioautographie mit Bacillus subtilis). Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung des U-Acetylderiirates der freien Base von SF-733 läßt sich ein einzelner Fleck feststellen, wenn zum Färben 10#ige Schwefelsäure verwendet wird (Carbonisierung durch Erhitzen) j· die Rf-Werte liegen bei 0,40, 0,16, 0,50 bzw. 0,70, wenn als Lösungsmittelsysteme tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1), -Butanol/ Essigsäure/Wasser (3:1:1)» n-Butanol/Pyridin/Wasser (6,14:3) und 80#iges Methanol verwendet werden.

Die antibakterielle Aktivität der kristallisierten Substanz SF-733 und das antibakterielle Wirkungsspektrum derselben sind in Tabelle I dargestellt; diese gelten auch für die amorphe Substanz SF-733. Auch ihre Beständigkeit und Toxizität sind im wesentlichen die gleiche.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert,

Beispiel 1

15 1 eines flüssigen Mediums (pH- 7,0), welches, 2,5 % G-lyqose, 3,5$ Sojabohnenmehl, 1,0j6 lösliches Pflanzenprotein und 0,25S^ *

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NaCl enthielt, wurde mit einem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 geimpft; die Züchtung erfolgte durch Sehüttelfcultur in einer Rüttelfermentiervorrichtung bei 28⁰O in 3 Tagen. 10 1 des Kulturfiltrates (Potenz, 200 mcg/ml), die durch Filtrieren der Kulturbrühe bei pH » 4,0 erhalten worden waren, wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine Kolonne gegossen, die mit 11 Amberlite IHC 50 (NH₄ ⁺-TyP, Böhm & Haas) gefüllt war, um die aktiven Bestandteile an dem Ionenaustauseherharz zu adsorbieren. Nach Waschen mit Wasser'wurde die Kolonne mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt und der. Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 5,9 g eines rohen Pulvers, welches in 10 ml Wasser gelöst wurde; die Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben die mit 400 ml Dowex 1 χ 2 (OH""-*Typ, Dow Chemicals) gefüllt war, und chromatographisch mit Wasser entwickelt; man erhi%t auf diese Weise eine aktive Fraktion von 250 ml, die im Yakuum eingeengt wurde, so daß 2,1 g der Substanz SF-733 in Form eines hellgelben Pulvers erhalten wurden. 2,0 g des Pulvers wurden in 3 ml Wasser gelöst, auf eine Kolonne gegeben, die mit 100 ml Amberlite CG 50 (NH?-Typ) gefüllt war, mit Wasser gewaschen und mit 0,2 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Es wurden 400 ml aktive Fraktion aufgefangen, die im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen wurde; man erhielt so 600 mg der freien Base der Substanz SF-733 in Form eines weißen Pulvers. Dieses Pulver wurde in etwa 5 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde zu einem Syrup eingeengt und mit etwa 50 ml Äthanol versetzt. Die Mutterlauge und der weiße Niederschlag, die auf diese Weise gebildet worden waren, wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft. 650 mg des dem Äthanolsolvat entsprechenden weißen Pulvers wurden in 6,5 ml Methanol gelöst. Die Lösung wurde unmittelbar· n_ach dem Auflösen der Substanz trübe, worauf eich allmählich Kristalle ausschieden. Die Lösung wurde verschlossen und bei 30⁰C über Nacht abgestellt; nach dieser Zeit wurden die Kristalle auf einem Blasfilter aufgefangen und mit etwa 1 ml Methanol gewaschen. Die Kristalle wurden über Calciumchlorid als Trockenmittel bei Raumtemperatur im Vakuum gehalten und danach anschließend noch

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über Phöshorpentoxyd als Trockenmittel bei 60⁰C 19 Stunden im Vakuum getrocknet} auf diese Weise erhielt man 440 mg kri stalline freie Base der Substanz SF-733.

Ausbeute?

Beispiel 2

40 1 eines flüssigen Mediums (pH 7,0), welches 4,0$ Stärke, 2,5$ Sojabohnenmehl, 1,0% Weizenkeime und 0,25% UaCl enthielt, wurde mit einem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 geimpft und in einer Hüttelfermentiervorrichtung bei 35⁰C 2 Tage unter Schütteln kultiviert. 30 1 des Kulturfiltrats (Pftenz 350 mcg/ml), die durch Filtrieren der Kulturbrühe bei pH 9,0 erhalten worden waren, wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine Kolonne gegeben, die mit 3 1 Amberlite IRC 50 (Na⁺-Typ) gefüllt war; an dem Harz wurden 97$ der aktiven Bestandteile adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wurde mit 0,5 η HCIi eluiert. 6,2 1 der aktiven Fraktion wurden mit Amberlite IR 45 (0H~ -Typ) neutralisiert und unter Rühren mit 90 g Aktivkohle versetzt, wodurch fast alle aktiven Bestandteile an der Aktivkohle adsorbiert wurden. Die Aktivkohle wurde dann mit Wasser gewaschen und zweimal mit je 3 1 70#igem wäßrigen Aceton gewaschen, der mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert, von 2 eingestellt war; das Eluat wurde neutralisiert, eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. 8,4 g des pulverförmiger Hydrochlorides der rohen Substanz SF-733 wurden in 12 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die mit 700 ml Dowex 1x2 (OH*" ~ Typ) gefüllt war; die Kolonne wurde chromatographisch mit Wasser entwickelt. 650 ml aktive Fraktion wurden aufgefangen, die im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen wurden; auf diese Weise erhielt man 4,2 g eines hellgelben Pulvers, bei welchem es sich um die Substanz SF-733 in Form der freien Base handelte. 4,1 g dieses Pulvers wurden in>einerAklei-

tr'f " // 'ti' ne.njftenge Wasser gelöst und dann auf eine Kolonne gegeben, die mit 100 ml Amberlite CG 50 (NH^ -typ) gefüllt war; man erhielt auf diese Weise 3,4 g der freien Base der Substanz SF-733 in Form eines weißen Pulvers.

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Dieses letztgenannte Pulver wurde in 100 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde im Vakuum unter Zugabe von Äthanol eingeengt, woe^bi schließlich das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt wurde. 3,8 g der weißen dem Äthanolsolvat entsprechenden festen Substanz wurden in 38 ml Methanol gelöst; die Lösung wurde fest verschlossen über Nacht bei Raumtemperatur abgestellt, damit sich Kristalle abscheiden. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit 10 ml Methanol gewaschen und entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Methode getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 2,4 g der kristallinen freien Base der Substanz SF-733· Ausbeute:

Beispiel 3

Zu 10 1 der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe wurde "Hyflosuper cell" als Piltrierhilfsmittel gegeben, worauf das Mycel abfiltriert wurde. 8 1 des Filtrates wurden auf einen pH-Wert von 8,5 - 9,5 eingestellt und mit Aktivkohle in einer Menge (80g) versetzt, die 1$ des Filtrates ausmachte; das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, wobei fast alle aktiven Bestandteile an der Aktivkohle adsorbiert wurden. Die Aktivkohle wurde dann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 1,2 1 70%igem wäßrigem Methanol suspendiert, welches mit 4 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt worden war. Es wurde 30 Minuten gerührt, um die aktiven Bestandteile zu extrahieren. D_as Filtrat wurde nach dem Abfiltrieren der Aktivkohle im Vakuum eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wurde, so daß man 28 g der rohen pulverförmigen Substanz SF-733 erhielt. Diese wurde in 35 ml V/asser gelöst, die Lösung wurde mit 4 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 - 4,5 eingestellt und auf eine Kolonne gegeben, die mit 35 g pulverförmiger Aktivkohle gefüllt war; das Eluieren wurde mit 0,03 η Schwefelsäure vorgenommen. 300 ml aktive Fraktion wurden aufgefangen, mit Amberlite IH 45 (OH" -Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, im Vakuum eingeengt und der Gefrep.rtrocknung unterworfe*n; auf diese "weise erhielt man 6,5g rohes pulverförmiges Sulfat der Substanz SF-733.

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums mit der Bezeichnung Substanz SF-733, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm Streptomyces thermoflavus in einem wäßrigen Uahrmedium, welches assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff enthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis, sich eine ausreichende Menge der Substanz SF-733 angesammelt hat, und diese dann abtrennt.

2) Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-733 in Form der kristallinen freien Base, dadurch gekennzeichnet, daß man einen % Stamm Streptomyces thermoflavus in einem wäßrigen Bahrmedium, welches assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff enthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis sich eine ausreichende Menge der Substanz SF-733 in Form der amorphen freien Base angesammelt hat, daß man die amorphe freie Base der Substanz SF-733 auffängt und in Wasser löst, die wäßrige Lösung zusammen mit Äthanol zur Irockne eindampft, die feste Substanz in Methanol löst und die Substanz 3F-733 in Form der kristallinen freien Base, die sich aus der Methanollösung abscheidet, abtrennt.

3) Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-733 in Form der kri- ^!j stallinen freien Base, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ■-Stamm Streptomyces thermoflavus in einem wäßrigen Hährmedium, welches assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoffe nthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis sich eine ausreichende Menge der Substanz SF-733 in Form der amorphen freien ' Base angesammelt hat, daß man die amorphe freie Base der Sub- '. stanz SF-733 auffängt und in Wasser löst, die wäßrige lösung unter Zugabe von Äthanol durch Entfernung des Wassers durch , azeotrope Destillation zur Troclcne eindampft, so daß man die ' Substanz SF-733 in Form des festen weißen Ithanolsolvates erhält, das Äthanolsolvat in Methanol löst, die methanolische lö- j sung zur Kristallisation abstellt und die kristalline freie Base der Substanz 3F-733, die sich aus der methanolischen lösung ab-

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geschieden hat, abtrennt

4) Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-733 in Form der kristallinen freien Base, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm Streptomyces thermoflavus in einem wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff enthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis sioh eine aus-

^: reichende Menge der Substanz SF-733 in Form der amorphen freien Base angesammelt hat, daß man die amorphe freie Base der Sub-φ stanz SF-733 auffängt und in Wasser löst, daß man die lösung zu einem Syrup eindampft, den Syrup mit Äthanol versetzt, so . daß sich ein Niederschlag bildet, den niederschlaghaltigen Sy rup unter weiterer Zugabe von Äthanol und unter Abdestillierung dee Wassers durch azeotrope Destillation zur Trockne eindampft, so daß die weiße feste Substanz SE-733 in Form des Äthanolsolvates gewonnen wird, daß man das Äthanolsolvat in Methanol löst, , - die Methanollösung zur Kristallisation abstellt und schließlieh die- kristalline freie Base der Substanz SF-733, die sioh aus der Äthanollösung ausgeschieden hat, abtrennt.

5) Antibiotisch wirkende Substanz, nämlich die kristalline freie Base der Substan SF-733, welche folgende Kennzeichen aufweist:

löslich in Methanol, kaum löslich in Äthanol, im wesentlichen unlöslich in'n-Propanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol, Petroläther und Chloroform, kein Absorptionsmaximum im Ultraviolettspektrum, Erscheinungsform weiße Nadeln oder kurze Stäbchen, Schmelzpunkt unter Zersetzung und Aufschäumen bei 192-195⁰C, positive Reaktion gegen Molisch-Reagenz, Anthron, Ninhydrin und ß-Naphtholschwefelsäure, negative Reaktion gegen Fehling-Iiösung, Ferrichlorid, Brady-Lösung, Biuret, Sakaguchi-LÖsung und Maltol, Elementaranalyse mit Werten von C 44,19$, H, 7,39$, N 11,60$, 0 (aus der Differenz) 36,82$, Summenformel von C₁₇H₅JT,O_1o, Bezeichnung; 0-ß-D-Ribofuranosyl-(1—} 5)-0- ^-2,6-diamino-2,6-äideoxy-D-glucopyranosyl-(1-7> 4)]}-2-deoxystreptamin, Strukturformel

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Bremen, den 6. 12. 1968

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Die Priorität aus der Japanischen Patentanmeldung No. 80601/67 rom 18.12.1967 und der japanischen Patentanmeldung Ho. 74634/68 rom 15·10.1968 wird in Anspruch genommen.

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