NO128662B

NO128662B -

Info

Publication number: NO128662B
Application number: NO05024/68A
Authority: NO
Inventors: T Shomura; N Ezaki; T Tsuruoka; T Niwa; T Niida; E Akita
Original assignee: Meiji Seika Kaisha
Priority date: 1967-12-18
Filing date: 1968-12-16
Publication date: 1973-12-27
Also published as: FR1603553A; GB1254883A; NL162135B; YU32708B; US3661892A; ES361544A1; DE1814735A1; CH545849A; DK122405B; AT290013B; NL162135C; YU297468A; DE1814735B2; BE725674A; MY7400158A; IL31223A; NL6818105A; IL31223A0; DE1814735C3; SE355378B

Description

Nærværende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotikum betegnet SF-733 med den folgende strukturformel og fremgangsmåten er karakterisert ved at en Samme av arten Streptomyces ribosidificus dyrkes i et vandig næringsmedium

som inneholder assimilerbare nitrogen- og karbonkilder under submerse, aerobe betingelser, hvoretter det dannede antibio-tiske stoff utvinnes fra dyrkningsmediet og eventuelt renses.

Antibiotikum SF-733 oppviser en sterk virkning mot mikroorganismer over et utstrakt område, slik som gram-positive og gram-, negative patogene bakterier og syrefaste bakterier.

Den SF-733 produserende mikroorganisme ble isolert fra en jord-prove fra byen Tsu, MIE distrikt, Japan og betegnet Streptomyces ribosidificus SF-733 og er blitt deponert i the American Type Culture Collection, Washington, D.C. under ATCC nr.

21294.

Med henvisning til tegningene vises i

fig. 1 ultrafiolett spektrum av amorft SF-733,

fig. 2 infrarodt spektrum av amorft SF-733 (KBr tablett),

fig. 3 papirkromatogram av amorft SF-733 og dets beslektede

antibiotika,

fig. 4 ultrafiolett spektrum av fri SF-733 base i krystallform,

fig. 5 infrarodt spektrum av fri SF-733 base i krystallform.

Streptomyces ribosidificus SF-733 har folgende karakteristika:

1) Mikroskopisk iakttagelse:

i) Luft - mycelium, åpne spiraler dannet rikelig på syntetisk stivelsesagar, Ushinsky's glukose asparagin-agar og lignende, god sporedannelse, hyfebredde 0,8 mikron, forgrening er monopodial og ingen hvirvler. ii) Sporer, overflatestrukturen er kornet, oval til elliptisk, storrelse 0,8 - 1,0 x 1,1 - 1,4 mikron, sporekjeden viser over 10 sporer. 2) Karakteristika på forskjellige kulturmedia:

IV Utnyttelse av karbonkilder:

(Pridham-Gottlieb's basal medium,

inkubert ved 27 C)

1- Utnytter: arabinose, rhamnose, glukose,

mannose, galaktose, sakkarose,

laktose, rafflnose, dekstrin,

inulin, stivelse, glycerol, sor-

bitol, mannitol, maltose.

2. Tvilsom: inositol, natriumcitrat.

3. utnytter

ikke: xylose, fruktose, dulcitol,

natriumacetat, natriumsuccinat,

salicin, cellulose.

V Optimal temperatur:

AO°C (målt med temperaturgradient inkubator)

Som beskrevet foran kan karakteristika for stammen SF-733 resum-meres som følger:

Spiraldannelfie i luftmycelium. Sporer med kornet struktur.

Krem- til gulaktig brun vekst på syntetiske media, gulaktig grønt til gråaktig brunt luftmycelium, mangler oppløselig pigment generelt, men svakt gult pigment på glukose-asparagin-agar (U-shinsky) og stivelse-syntetisk agar kremfarvet til gulaktig, brun vekst, tynt luftmycelium og intet oppløselig pigment på organiske media. Det mest distinkte karakteristikum for SF-733 er at den optimale temperatur for vekst er ganske hoy, nemlig 40°C.

Fra egenskapene som er beskrevet foran anses SF-733 stammen å være nær beslektet med flavus-seriene av slekten Streptomyces.

Blant disse serier kan nemlig Streptomyces flavus, Streptomyces flaveolus, Streptomyces flavovireus, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces alboflavus, Streptomyces parvus, Streptomyces parvullus, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces griseoflavus og Streptomyces celluloflavus nevnes som nær beslektede arter. Blant disse arter skiller Streptomyces kanamycetius, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces alboflavus og Streptomyces celluloflavus seg klart fra SF-733 stammen fordi luftmycelia for de forstnevnte ikke danner spiral, mens den sistnevnte danner typisk åpne spiraler. Streptomyces parvullus, som danner sporer av jevn type er forskjellig fra SF-733-sporeoverflaten som er kornet. Streptomyces parvus og Streptomyces griseoflavus er klart forskjellig fra SF-733 stammen, fordi forstnevnte vokser godt på cellulosemedium. Streptomyces flavus, Streptomyces flaveolus og Streptomyces flavovireus, som kan sies å være ty-piske stammer av flavus-seriene, er mest nær beslektet med SF-733 stammen med hensyn til forskjellige karakteristika på forskjellige kulturmedia.

Disse tre organismer er imidlertid forskjellige fra SF-733 stammen på folgende punkter: Streptomyces flaveolus, hvis sporer har håraktig overflate skiller seg nemlig fra SF-733 stammen, hvis sporer er kornet. Luftmyceliet for Streptomyces flavus og Streptomyces flavovireus er stort sett rett, men i noen tilfeller danner det åpne spiraler, mens luftmyceliet for SF-733 stammen danner åpne spiraler. Dessuten produserer Streptomyces flavovireus gronlig gule, opploselige pigmenter på syntetisk agar-medium, mens SF-733 stammen ikke produserer opploselig pigment. Videre reduserer Streptomyces flavus ikke nitrat og dets optimale temperatur for dyrkning er 25°C, mens SF-733 stammen reduserer nitrat og dens optimale dyrkningstemperatur er så hoy som 40°C. Som beskrevet foran er SF-733 stammen klart forskjellig fra forannevnte organismer hva angår forskjellige viktige karakteristika .

Det nye antibiotikum SF-733 som produseres av SF-733 stammen

er et typisk vannopploselig, basisk antibiotikum med utstrakt antibakterielt spektrum, og dets optiske rotasjon er (+). Blant de kjente antibiotika horer neomycin, paromomycin, kanamycin, gentamicin og tenemycin og lignende til den samme gruppe. Stammen SF-733 skal derfor sammenlignes med ovennevnte antibiotikum-produserende stammer med hensyn til deres mycologiske forhold. Som gentamicin-produserende arter kjennet* Microinono-

spora echinospora og Micromonospora purprea. De horer ikke til Streptomyces, slik at de er klart forskjellige fra SF-733 stammen. Videre er neomycin-produserende arter. : Streptomyces fradiae, Streptomyces albogriseolus, paromomycin-produserende stamme: Streptomyces rimosus forma paromonycinus, kanamycin-produserende art : Streptomyces kanamyceticus, tenemycin-produserende art : Streptomyces tenebrarius klart forskjellig fra SF-733 stammen hva angår deres morfologiske egenskaper, slik som det vises i folgende tabell, og derfor er de innbyrdes forskjellige organismer.

Sammenligning mellom SF-733 stammen og de kjente

arter av Streptomyces som produserer hoyredreiende, vannopploselige, basiske antibiotika.

(Seventh Inter-science Conference on Antimicrobial

Agent and Chemitherapy, 25-27 oktober 1967 i Chicago).

Som folge av den foran angitte mykologiske undersokelse må SF-733 stammen betraktes som tilhorende en hittil ukjent art

av flavus-seriene og den betegnes Streptomyces ribosidificus nov. sp. (Egenskapene av de sammenlignede arter av Streptomyces basert på Waksman: The Actinomycetes, bind 2, 1961).

Ifolge nærværende oppfinnelse dyrkes SF-733 stammen i et kul-turmedium som inneholder de næringsstoffer som vanligvis brukes ved dyrkning av mikroorganismer. Som næringsmedium kan man benytte de kjente næringsmedia som anvendes ved dyrkningen av Streptomyces. F.eks. er glukose, stivelse, glycerol, dekstrin, sukrose og lignende anvendelige som karbonkilde. Soyabonnemel, hvetekim, kjottekstrakt, pepton, torket gjær, maisutblotnings-væske, "distiller's soluble", ammoniumsulfat, natriumnitrat og lignende er anvendelige som nitrogenkilde. Hvis nodvendig kan uorganiske salter slik som kalsiumkarbonat, vanlig salt, kalium-klorid, fosfat tilsettes. Dessuten kan også organiske og uorganiske materialer som understøtter veksten av SF-733 stammen og letter produksjonen av SF-733 tilsettes. Sbr dyrkningen av SF-733 stanmen er dyrkning i flytende medium, særlig under submerse aerobiske betingelser, mest foretrukket. Egnet fermenterings-temperatur er 25-40°C, mest hensiktsmessig ca. 35°C. Produksjonen av SF-733 når sitt maksimum etter 2-5 dager i enten om-rystet kultur eller tankkultur.

For analyse av SF-733 kan "mycinassay agar" (pH 7,8) anvendes som medium og Bacillus subtilis ATCC nr. 6633 som proveorganis-me.

Lineært forhold mellom logaritmen for konsentrasjon av SF-733 og diameter for hemningsring mot proveorganismen ble iakttatt ved 1-25 mcg/ml, og verdiene for hemningsringens diametre under slike betingelser var 15 - 25 mm. (Platemetoden).

SF-733 er et vannopploselig basisk antibiotikum som det fremgår fra de fysikalsk-kjemiske egenskaper som beskrives nedenfor og kan utvinnes fra kultursuppen etter meget kjente meto-der som er vanlig tilgjengelige for utvinningen av de kjente vannopploselige, basiske aitibiotika slik som kanamycin, neomycin, etc..

SF-733 kan også lett adsorberes på aktivt karbon i det alkaliske område og elueres effektivt med en vandig alkohol eller vandig aceton ved sur pH.

SF-733 kan også renses med ioneutvekslingsharpiks som adsorbe-ringsmiddel. Som ioneutvekslingsharpiks kan f.eks. kationut-vekslingsharpiks, slik som f.eks. "Amberlite IRC-50" i NH^ -, Na - eller H - type brukes med fordel. Elueringen utfores vanligvis med en vandig syre-, alkali- eller saltopplosning. Videre kan SF-733 også effektivt utfelles i form av saltet av en syre ved å tilsette et med vann blandbart organisk opplosningsmiddel til en vandig opplosning av SF-733 saltet.

Et rått pulver av SF-733 oppnådd på denne måte kan ytterl igere renses ved ioneutvekslingskromatografi med "Dowex 1 x 2" (0H~ type) eller "Amberlite CG-50" (NH4<+> type), hvoretter hvitt, amorft pulver av fri base av SF-733 kan oppnås, hvis renhet og ensartethet ble fastslått ved papirkromatografi, papirelektroforese ved hoy spenning, og tynn-skiktskromatografi av dets N-acetyl-derivat. Den amorfe, frie base av SF-733 er stabil i det noytrale og alkaliske område, men er lite stabil i det su-re område.

Fysikalsk-kjemiske egenskaper for SF-733 beskrives i det folgende. Amorf, fri base av SF-733 spaltes under oppbrusning ved 178-185°C og viser ikke noe bestemt smeltepunkt. Den frie base er lett opploselig i vann, litt opploselig i metanol og uopploselig i organisk opplosningsmiddel slik som aceton, butanol, etylacetat, benzen, heksan og eter. Ved elektroforese beveger det seg ved pH 1,8 mot katoden og det kan ikke påvises sure grupper fra titreringskurven. Disse forhold viser at den frie base er et basisk stoff. Dets ultrafiolette absorbsjonsspek-trum er vist i fig. 1. Ingen spesifikk absorpsjon iakttas. Dets infrarode absorpsjonsspektrum er vist i fig. 2. Absorp-sjonsbånd som er særegne for amino-sukker-antibiotika iakttas.

Den spesifikke, optiske rotasjon for SF-733 (amorf, fri base) i vandig opplosning [ « ]^ er +42°. Reaksjonene med ninhydrin, Molisch og antron er positive, og reaksjonene etter Fehling, Benedict, ferriklorid, maltol? biuret , Tollens og Sakaguchi er negative. Molekylvekten bestemt ved damptrykk-likevektsmetoden er 475, som understottes av verdien (452 som tetrasyre-base) bestemt fra titreringskurven.

Elementæranalysen av en prove av SF-733 som ble torket på fosforpentoksyd i vakuum ved 110°C i 20 timer er som folger: C 44,16 %, H 7,55 %, N 11,92 %, 0 36,21 % og derfor er molekylformlen C17<H>34<N>4°10 (teoretisk verdi: C 44,93%, H 7,54 %, N ■ 12,33 %, O 35,20 %, molekylvekt: 454,49). Det er blitt funnet fra studier av kjemisk struktur at SF-733 har den folgende kjemiske struktur for 0-(',-D-r ibof uranos<y> 1- (1 > 5)-0-La - 2,6-diamino-2,6-dideoksy-D-glukopyranosyl-(1 V 4)]-2-deoksystrep-tamin

Ved nedstigende papirkromatografi ved anvendelse av n-butanol-pyridin-eddiksyre-vann (6:4:1:3, utvikling i 4 dager) og n-butanol mettet med vann som inneholder 2% p-toluensulfonsyre (utvikling .i 25 timer), farvning ved ninhydrinreaksjon og bio-auto gr afi ved anvendelse av Bacillus subtilis viser SF-733 materialet i hvert opplosningsmiddelsystem en enkelt flekk ved 8 cm og 14,8 cm fra respektive opprinnelige punkter. Ved papirelektroforese ved hoy spenning (3300 V, pH 1,8, 15 minutter) beveger også SF-733 seg 15 cm til katoden og viser en enkelt flekk. Videre ved tynnskiktskromatografi på silikagel under anvendelse av t-butanol-eddiksyre-vann (2:1:1)., n-butanol-eddiksyre-vann (3:1:1) og n-butanol-pyridin-vann (6:4:3), og 80% vandig metanol som utviklere viser N-acetylderivatet av SF-733 en enkelt flekk ved Rf 0,40, 0,16, 0,50 henholdsvis 0,70. Denne kjensgjerning beviser også klart renheten og ens-artetheten av SF-733.

Som det er klart fra foranstående forklaring er SF-733 et vannopploselig, basisk antibiotikum og dets optiske rotasjon er hoyredreiende. Blant de kjente antibiotika skal neomycin, paromomycin, kanamycin, gentamicin, destomycin, actinospectacin sammenlignes med SF-733.

SF-733 sammenlignes med disse kjente antibiotika med hensyn

til optisk rotasjon (tabell 1) og papirkromatografi (tabell 2 og fig. 3) som folger.

oF-733 skilles klart fra kanamycingruppen (A,B,C), gentamicin-gruppen ( A, C-pCj), neomycin A, destomycin A, B, hygromycin B, actinospectacin, kasugamycin og capreomycin med hensyn til deres spesifikke optiske rotasjon i tabell 1 og fra neomycin B,C, paromoraycin I, II, gentamicin C og kanamycin A, B med hensyn til Rf verdien på papirkromatogram i tabell 2 og fig. 3. Videre kan SF-733 klart skilles fra capreomycin II, som har ultrafiolett absorpsjonsmaksimum, fra actinospectacin ved analytisk verdi for nitrogen, fra destomycin A, B og hygromycin B ved karakteristika for deres antibakterielTe spektrum og deres høyere giftighet. Videre kan SF-733 klart skilles fra tenemycin (seventh Interscience Conference on Antimicrobialagent and chemo-the.rapy, 1967, fra oktober 25. til 27. i Chicago) på grunn av L q verdien for N-acetylderivatet av tenemycin, som er

(+95 - +130°), mens det for N-acetylderivatet for SF-733 er +40°. Således er det klart fra foranstående sammenlikning at SF-733 er et nytt antibiotikum som ikke faller sammen med noe kj.ent antibiotikum.

Det antibakterielle spektrum for SF-733 mot forskjellige mikroorganismer er som følger:

Som det klart fremgår av foranstående tabell er SF-733 over

et vidt område aktiv overfor grampositive bakterier, gramnega-tive bakterier og syrefaste bakterier.

Ifolge prover på akutt giftighet ved intravenos injeksjon til mus, er giftigheten for SF-7 33 meget lav, da LD^Q er lOOO mg/ kg for 'den frie base og 500 mg/kg for sulfatet, og intet unor-malt ble iakttatt etter injisering.

Amorf fri base av SF-733 kan krystalliseres etter folgende metode.

Amorf fri base opploses i vann og opplosningen konsentreres til torrhet under tilsetning av etanol og avdestillering av vann ved azeotropisk destillasjon, eller opplosningen konsentreres forst til sirup og derpå tilsettes etanol for å gi utfelling og konsentreres til torrhet under ytterligere tilsetning av etanol og avdestillering av vann ved azeotropisk destillasjon for å oppnå hvitt fast SF-733 i form av etanolsol-vat. Dette hvite faste etanol-solvat SF-733 karakteriseres ved sin hoyere opploselighet i metanol enn fullstendig dehy-dratisert amorf, fri base av SF-733 og krystallisert fri SF-733 base som nevnt nedenfor.

Det hvite faste etanol-solvat SF-733 oppnådd på denne måte opploses i en egnet mengde metanol og får henstå, hvorved krystaller hurtig skiller seg ut. De onskede frie basekrystaller av SF-733 kan oppnås f.eks. ved å utvinne krystallene ved filtrering, vaskning med litt metanol, torke dem ved romtemperatur i vakuum og ytterligere torke dem i vakuum i en glassdesikkator ved 60°C i 19 timer under anvendelse av fosforpentoksyd som torkemiddel, for å fjerne metanol som hefter til krystallene.

Pulveret som oppnås ved å frysetdrke en vandig opplosning av amorf, fri base av SF-7 33, og som har absorbert en egnet mengde vann har en hoyere opploselighet i metanol enn forannevnte hvite faste etanol-solvat, men selv når dette pulver opploses i metanol og får henstå, dannes bare en liten utfelling, men ingen krystaller av den frie SF-733 base kan oppnås. Således for krystallisasjon av fri SF-733 base er den foreliggende fremgangsmåte, hvor materialet som skal krystalliseres bringes til å passere etanol-solvat-tilstanden på vei til krystallisasjon, vesentlig.

Krystallene av den frie SF-733 base er hvite nåler eller korte stenger som smelter under spaltning og oppbrusning ved 192° - 195°C.

Elementæranalysen: C 44,19%, H 7,39%, N 11,60%, 0 (differanse) 36,82%. Molekylvekten bestemt ved damptrykk-likevektsmetoden i en vandig opplosning er 440, og bestemt ved titreringsmetoden i en vandig opplosning er den 470. Molekylformlen for de frie basekrystaller av SF-733 er ci7H34N4°io (teoretisk verdi: C 44,93%, H 7,54%, N 12,33%, O 35,20%, molekylvekt 454,49), og forbindelsen har den kjemiske struktur for 0-(3-D-ribofuranosyl-(1 > 5)-0- [<x-2,6-diamino-2,6-dideoksy-D-glukopyranosyl- (1 > 4)]-2-deoksystreptamin som nevnt foran. Krystallene av fri base av SF-733 er den samme forbindelse som den amorfe frie SF-733 base, og de skiller seg bare fra hverandre ved at de opptrer i forskjellige tilstander.

Krystaller av fri base av SF-733 er hoyredreiende og [<x]D 23 for denne er +42° (C=l, t^O). En vandig opplosning av denne er alkalisk. Ingen syregruppe iakttas ved analyse av titreringskurven. Det foreliggende stoff er således en base.

Ultrafiolett spektrum for krystaller av fri base av SF-733 i en vandig opplosning (0,102%)- vises i fig. 4. Ingen maksimums absorpsjon iakttas bortsett fra sluttabsorpsjon. I figuren betegner tall på absissen bolgelengde (m/c) og tall på ordinaten betegner absorpsjonsevne. Infrarodt spektrum av dets KBr tablett er vist i fig. 5. Absorpsjon særegen for amino-glykocid-antibiotika iakttas. I figuren betegner tallene på absissen bolgelengde pr. 1 cm, og tallene på ordinaten betegner trans-misjonsgrad (%).

Krystallene av den frie base av SF-733 er lett opploselig i vann, men lite opploselig i metanol og meget lite opploselig i etanol. Videre er den nesten eller fullstendig uopploselig i n-propanol, n-butanol, aceton, etylacetat, benzen, petroleums-eter og kloroform.

Reaksjonene etter Molisch, antron, ninhydrin og (3-naftol-svovelsyre (aldopentosereaksjon) er positive, men reaksjonene med antron under bestemte betingelser [heksose, 6-deoksyheksose-reaksjoner ( Methods of Carbohydrate Chemistry, bind I, s. 490, 1963, Academic Press)], Fehling (kald), ferriklorid,

Brady (reaksjon med 2,4-dinitrofenylhydrazin), biuret, Sakaguchi, maltol er negative. Krystaller av fri SF-733 base kar-boniseres ved å tilsette konsentrert svovelsyre til en vandig opplosning av den ved romtemperatur, og den reduserer kalium-permanganatopplosning ved romtemperatur.

Ved tynnskiktskromatografi på silikagel G (Merck & Co.) iakttas en enkelt flekk ved ninhydrin-farvning eller lO%'s svovelsyre-(karbonisert ved oppvarmning) farvning nesten ved utgangspunkt-tet med et opplosningsmiddelsystem av etanol-konsentrert ammoniakkvann-vann (8:1:1) og 10%'s vandig ammoniumacetatopplos-ning-metanol (1:1) ved Rf verdier på 0,5 henholdsvis 0,6. Ved papirbioautografi ved anvendelse av Bacillus subtilis iakttas en enkelt hemningsflekk ved 8 cm og 14,8 cm fra utgangspunktet ved opplosningsmiddelsystem av n-butanctpyridin-eddiksyre-vann (6:4:1:3) (nedstigende, 4 dager)_henholdsvis n-butanol mettet med vann som inneholder 2% p-toluensulfonsyre (nedstigende, 25 timer). Ved papirelektroforese ved hoy spenning beveger krystaller av fri SF-733 base seg 15 cm til katoden og viser en enkelt, flekk (3300 V, pH 1,8, 15 minutter, ninhydrinfarvning, bioauto-grafi med Bacillus subtilis). Ved tynnskiktskromatografi på silikagel G av N-acetylderivatet av fri SF-733 base iakttas en enkelt flekk ved 10%'s svovelsyre- (karbonisert ved oppvarmning) farvning ved Rf 0,40, 0,16, 0,50 og 0,70 med opplosningsmiddelsystem av tert-butanol-eddiksyre-vann (2:1:1), n-butanol-eddiksyre-vann (3:1:1), n-butanol-pyridin-vann (6:4:3) henholdsvis 80 % metanol.

Antibakteriell aktivitet for krystallisert SF-733 og antibakterielt spektrum for dette, slik som vist i tabell I, er de samme som de for amorft SF-733. Videre er deres stabilitet og giftighet også i det vesentlige det samme.

Nærværende oppfinnelse vil forklares mere detaljert med henvisning til de folgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Streptomyces ribosidificus SF-733 stammen ble inokulert i 15 liter av et flytende medium (pH 7,0) som inneholder glukose 2,5 %, soyabonnemel 3,5%, opploselig vegetabilsk protein 1,0% og NaCl 0,25% og dyrket under omrystning i et fermenteringskar ved 28°C i 3 dager. 10 liter av kulturfiltratet (styrke, 200 mcg/ml) som oppnås ved å filtrere kultursuppen ved pH 4,0, ble justert til pH 7,0 og tilfort til en kolonne fylt med 1 liter "Amberlite IRC 50" (NH^<+> type) for å adsorbere aktive bestand-deler på ioneutvekslerharpiks. Etter vaskning med vann ble ko-lonnen eluert med 0,5 n ammoniakkvann. Aktive fraksjoner ble konsentrert i vakuum og frysetorket. 5,9 g rått pulver som oppnås på denne måte ble opplost i 10 ml vann, tilfort en kolonne fylt med 400 ml "Dowex 1 x 2" (0H~ type) og utviklet kromatografisk med vann og gir 250 ml aktiv fraksjon som ble konsentrert i vakuum, hvorved 2,1 g av et lysegult pulver av SF-733 ble oppnådd. 2,0 g av pulveret ble opplost i 3 ml vann, tilfort en kolonne fylt med 100 ml "Amberlite CG 50" (NH4~ type), vasket med vann og eluert med 0,2 n ammoniakkvann. 400 ml aktiv fraksjon ble samlet opp, konsentrert i vakuum og frysetorket og gir 600 mg hvitt pulver av fri SF-733 base. Dette pulver ble opplost i ca. 5 ml vann og konsentrert til sirup og tilsatt ca. 50 ml etanol. Moderluten sammen med hvit utfelling som danner seg på denne måte ble konsentrert i vakuum til torrhet. 650 mg etanol-solvat, et hvitt pulver, ble oprJbst i 6,5 ml metanol. Opplosningen ble uklar umiddelbart etter opplosning og krystaller skiller seg gradvis ut. Etter tett forsegling og henstand ved 30°C over natten, ble krystallene samlet opp ved hjelp av et glassfilter og vasket med ca. 1 ml metanol. Krystallene ble holdt på kalsiumklorid som torkemiddel ved romtemperatur i vakuum og derpå torket over f osforpentoksyd som torkemiddel ved 60°C i 19 timer i vakuum og gir 440 mg krystaller av fri SF-733 base. Utbytte: 73 %.

EKSEMPEL 2

Streptomyces ribosidificus SF-733 stammen ble inokulert i 40 liter av et flytende medium (pH 7,0), som inneholder stivelse 4,0%, soyabonnemel-2,5%, hvetekim 1,0% og NaCl 0,25% og dyrket under omrystning i et fermenteringskar ved 35°C i 2 dager. 30 liter av kulturfiltratet (potens 350 mcg/ml) som oppnås ved å filtrere næringssuppen ved pH 9,0 ble justert til pH 7,0 og tilfort en kolonne fylt med 3 liter "Amberlite IRC 50" (Na<+ >type) for å adsorbere 97% av aktiv komponent på harpiks. Etter vaskning med vann ble det eluert med 0,5 n HCl. 6,2 liter aktiv fraksjon ble noytralisert med "Amberlite IR 45"(OH~ type) og tilsatt 90 g aktivt karbon under omroring for å adsorbere nesten all aktiv komponent på aktivt karbon. Dette aktive karbon ble vasket med vann og derpå eluert to ganger, hver gang med 3 liter 70% vandig aceton, pH ble justert til 2 med saltsyre, og eluatet ble noytralisert, konsentrert og frysetorket. 8,4 g rått pulver av SF-733 hydroklorid ble opplost i 12 ml vann, tilfort en kolonne fylt med 700 ml "Dowex 1 x 2" (0H~ type) og utviklet kromatografisk med vann. 650 ml aktiv fraksjon ble samlet opp, konsentrert i vakuum og frysetorket og gir 4,2 g av et

lysegult pulver av fri SF—733 base. 4,1 g av dette pulver ble opplost i en liten mengde vann og tilfort en kolonne fylt med 100 ml "Amberlite CG 50" (NH4<+> type) og gir 3,4 g hvitt pulver av fri SF-733 base.

Dette pulver ble opplost i 100 ml vann, ble konsentrert i vakuum under tilsetning av etanol og til slutt ble vannet destil-lert ut ved azeotropisk destillasjon. 3,8 g hvitt etanol-solvat i fast form ble opplost i 30 ml metanol og tett forseglet og fikk henstå ved romtemperatur over natten for å skille ut krystaller. Krystallene ble samlet opp ved filtrering, vasket med 10 ml metanol og torket ved en metode i det vesentlige lik den

i eksempel 1 for å gi 2,4 g krystaller av fri SF-733 base. Ut-

bytte 71 %.

EKSEMPEL 3

Til 10 liter av kultursuppen som oppnås i eksempel 1 ble "Hy-

flusuper cell" tilsatt som filterhjelp og myceliet ble fjernet ved filtrering. 8 liter av dette filtrat ble justert til pH

8,5 - 9,5, og en mengde aktivt karbon (80 g) tilsvarende 1% av filtratet ble tilsatt og rort om i 30 minutter, "hvorved all aktiv komponent ble adsorbert på det aktive karbon. Det aktive karbon ble samlet opp ved filtrering, vasket med vann, suspen-

dert i 1,2 liter 70%'s vandig metanol, pH justert til 2,0 med 4 n svovelsyre og rort om i 30 minutter for å ekstrahere aktiv

komponent. Filtratet, etter fjerning av aktivt karbon ved fil-

trering, ble konsentrert i vakuum og tilsatt aceton, hvorved 28 g rått pulver som inneholder SF-733 ble oppnådd. Det ble

opplost i 35 ml vann, pH justert til 4,0 - 4,5 med 4 n svovel-

syre, tilfort til en kolonne fylt med 35 g aktivt karbonpulver og eluert med 0,03 n svovelsyre. 300 ml aktiv fraksjon ble sam-

let opp, pH justert til 6,0 med "Amberlite IR 45" (0H~ 'type),

konsentrert i vakuum og frysetorket og gir 6,5 g rått pulver av SF-733 sulfat.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotikum 0-p,-D-ribofuranosyl- (1 ) 5) -0- [a - 2, 6-diamino- 2, 6-dideoksy-D-glukopyranosyl-(1 > 4)]-2-deoksystreptamin, betegnet SF-733 og med strukturformlen

karakterisert ved at en stamme av arten Streptomyces ribosidificus dyrkes i et vandig næringsmedium som inneholder assimilerbare nitrogen- og karbonkilder under submerse, aerobe betingelser, hvoretter det dannede antibioti-ske stoff utvinnes fra dyrkningsmediet og eventuelt renses.

2. Fremgangsmåte etter krav 1, karakterisert ved at man anvender stammen Streptomyces ribosidificus ATCC 21294.

3. Fremgangsmåte etter krav 1 for fremstilling av krystaller av fri SF-733 base, karakterisert ved at utvunnet amorf, fri SF-733 base opploses i vann, opplosningen konsentreres til torrhet under tilsetning av etanol, det dannede etanol-solvat opploses i metanol, metanol-opplosningen får henstå for krystallisasjon og de utfelte krystaller av fri SF-733 base isoleres.