NO141343B

NO141343B - Fremgangsmaate till fremstilling av aminoglykosid-antibiotika, betegnet xk-88-1,-2, og -5 (seldomyciner).

Info

Publication number: NO141343B
Application number: NO743760A
Authority: NO
Inventors: Takashi Nara; Seigo Takasawa; Ryo Okachi; Isao Kawamoto; Mitsuyoshi Yamamoto; Seiji Sato; Tomoyasu Sato; Atsuko Morikawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1973-10-24
Filing date: 1974-10-17
Publication date: 1979-11-12
Also published as: CH606425A5; ATA853374A; BE821441A; DE2450411C3; DK139588C; DK555974A; GB1479179A; IN140482B; DE2450411A1; ZA746606B; FR2248850A1; US3939043A; JPS5070590A; NO743760L; FR2248850B1; NL7413859A; JPS5615232B2; CA1032100A; DE2450411B2; DK139588B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

til fremstilling av hittil.ukjente antibiotika, betegnet XK-

88-1, XK-88-2, XK-88-3 og XK-88-5, som senere har fått be-

tegnelsen seldomyciner.

Det er alltid behov for antibiotika som utviser aktivitet overfor et bredt spektrum av bakterier. Til dette for-

mål er en ny mikroorganismeart blitt isolert fra jord i Tajima-

cho, Hofu-shi, Yamaguchi-ken, Japan. Denne nye art produserer,

når den dyrkes, en rekke hittil ukjente antibiotika, XK-88-

rekken, som alle utviser sterk antibakteriell aktivitet overfor forskjellige gram-positive og gram-negative bakterier. I over-ensstemmelse med dette er de antibiotiske stoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen nyttige til rensing og sterilisering av laboratorie-glassutstyr og kirurgiske instrumenter, og de kan også anvendes i kombinasjon med forskjellige såper til sanitetsformål, som ved rengjøring og sterilisering av hospitalsrom og områder som an-

vendes til fremstilling av matvarer.

Figurfortegnelse

Fig. 1 viser det ultraviolette absorpsjonsspektrum

for sulfatet av XK-88-1;

fig. 2 viser det infrarøde absorpsjonsspektrum for

sulfatet av XK-88-1;

fig. 3 viser det ultraviolette absorpsjonsspektrum for

sulfatet av XK-88-2;

fig. 4 viser det infrarøde absorpsjonsspektrum for

sulfatet av XK-88-2;'.

fig. 5 viser det ultraviolette absorpsjonsspektrum

for sulfatet av XK-88-3;

fig. 6 viser det infrarøde absorpsjonsspektrum for sulfatet av XK-88-3;

fig. 7 viser det ultraviolette absorpsjonsspektrum for sulfatet av XK-88-5;

fig. 8 viser det infrarøde absorpsjonsspektrum for sulfatet av XK-88-5;

fig. 9 viser NMR-spektret for den frie base av XK-88-1;

fig. 10 viser NMR-spektret forden frie base av XK-88-2;

fig. 11 illustrerer NMR-sp:ektret for den frie base av XK-88-3;

fig. 12 viser NMR-spektret for den frie base av XK-88-5;

fig. 13 viser C1^-NMR-spektret for den frie base av XK-88-1;

fig. 14 viser C<13->NMR-spektret for sulfatet av XK-88-2; og fig. 15 viser C<13->NMR-spektret for sulfatet av XK-88-5.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles, en hittil ukjent

rekke av beslektede antibiotika, XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 og XK-88-5, ved dyr.king av en mikroorganisme tilhørende slekten Streptomyces>

som er i stand til å produsere antibiotikaene, i et næringsmedium, inntil det påvises vesentlig antibakteriell aktivitet'i dyrkningsvæsken. Ved dyrkningens avslutning utvinnes hvert av antibiotikaene som aktive fraksjoner ved ioneutvekslerharpiks-behandling og isoleres ytterligere som rensede stoffer ved konvensjonelle metoder som benyttes til isolering og rensing.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles de antibiotisk virksomme forbindelser:

XK-88-1 med formelen:

XK-88-2 med formelen:

XK-88-3 med formelen: og XK-88-5 med formelen:

eller syreaddisjonssalter derav, og denne fremgangsmåte er

kjennetegnet ved at man dyrker en mikroorganisme tilhørende arten Streptomyces hofuensis i et næringsmedium inneholdende assimiler-

bare kilder for nitrogen og karbon, hvoretter nevnte forbind-

elser isoleres fra dyrkningsmediet, og eventuelt overføres til syreaddisjonssalter derav.

Arten Streptorayces hofuensis er bestemt til å være

en hittil uidentifisert ny art, og dens typiske stamme ble opp-rinnelig identifisert som Streptomyces sp. MK-88. Denne stamme er deponert i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og er tildelt aksesjonsnummeret ATCC 21970. Stammen er også deponert hos the Permentation Research Institute, Japan, og er tildelt registreringsnummeret FERM-P nr. 2216. MK-88-stammen erkarakterisert vedfølgende egenskaper:

I. Morfologi

Vanligvis viser MK-88-stammen liten vekst. Av de

åtte typer medier som er anført i tabell 1 nedenfor, viser MK-88-stammen kun moderat vekst på tre medier, nemlig havremelagar, stivel-sesagar og gjærekstrakt-maltekstrakt-agar. Luftmyceliet viser enkel forgrening. En sporofor er rett eller buet, og toppen av sporoforéne danner noen ganger en løkke, men aldri en spiral.

Ofte dannes mer enn ti sporer med en vortet eller pigget overflate ved enden av sporoforen.

II. Dyrkningsegenskaper

Vekstgraden og ytterligere egenskaper iakttatt når MK-88-stammen dyrkes på forskjellige'medier, er anført i tabell 1. Fargebetegnelsene er gitt ifølge klassifikasjonene i the Color Harmony Manual, 4. utgave (Container Corporation of America). Egenskapene er bestemt etter dyrking ved 30°C i 2 uker.

Som vist i ovenstående tabell 1 er substratmyceliene fargeløse eller fløtefargede til brune, luftmyceliene er hvite, og det produseres ingen oppløselige pigmenter på noen av mediene.

I The Actinomycetes Vol. 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Co., 1961, og International Journal of Systematic Bacteriology Vol. 18, nr. 2, side 69-189, vol. 18, nr. 4, side 279-392, vol. 19, nr. 4, side 391-512, vol. 22, nr. 4, side 265-39^ ble det søkt etter stammer av arterkarakterisert vedde følgende egenskaper: Enkel forgrening; ingen dannelse av melanoidpigmenter eller oppløselige pigmenter; rette, buede eller krokede sporoforer; vortet eller pigget sporoverflate; hvitt luftmycelium og fargeløst eller gulbrunt substratmycelium, som aldri utviser noen annen bestemt farge. Som resultat ble det bestemt at MK-88-stammen minnet om stammene av Streptomyces craterifer og Streptomycesbluensis, spesielt stammene av den førstnevnte art. Imidlertid har MK-88-stammen egenskaper som er forskjellige fra de ovennevnte to arter som vist i nedenstående tabell 2.

På grunnlag av de ovenstående iakttagelser antas MK-88-stammen å tilhøre en hittil ukjent art og denne art er betegnet Streptomyces hofuensis etter navnet på det sted hvor stammen ble isolert.

I alminnelighet kan konvensjonelle metoder til dyrking av mikroorganismer tilhørende Actinomycetene anvendes ved foreliggende fremgangsmåte. Forskjellige næringskilder kan anvendes i dyrkningsmediet. Som karbonkilde kan f.eks. glukose, stivelse, mannose, sakkarose, melasse og vegetabilsk olje benyttes alene eller i kombinasjon. Dessuten kan karbohydrater, alkoholer og organiske syrer benyttes som karbonkilde avhengig av mikroorga-nismenes evne til utnyttelse. Uorganiske og organiske nitrogenkilder, slik som ammoniumklorid, ammoniumsulfat, urea, ammonium-nitrat og natriumnitrat, og naturlige nitrogenkilder, slik som pepton, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, tørrgjær, maisstøpevann, soyabønnepulver, kasaminosyre og oppløselig vegetabilsk protein, benyttes alene eller i kombinasjon. Dessuten kan slike uorganiske salter som natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumkarbonat og fos-fater tilsettes mediet om nødvendig. Videre kan organiske eller uorganiske materialer som er i stand til å fremme veksten av den bestemte mikroorganisme og således forøke produksjonen av

antibiotikumet, hensiktsmessig tilsettes til mediet.

En væskedyrkningsmetode, spesielt en submers omrørt dyrkningsmetode, er mest egnet til utførelse av' fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Det er ønskelig å utføre dyrkingen ved en temperatur på 26-43°C og ved tilnærmelsesvis nøytral pH-verdi. Antibiotika av XK-88-rekken dannes og akkumuleres i dyrkningsvæsken, vanligvis etter 2-15 dagers dyrkning. Når utbyttet avXK-88 antibiotika idyrkningsvæsken når et maksimum, avbrytes dyrkingen, og det ønskede produkt isoleres fra dyrkningsvæsken og renses, etter at mikroorganismecellene er blitt fjernet, f.eks. ved filtrering.

Isoleringen og rensingen av XK-88 antibiotika fra filtratet utføres ifølge metoder som vanligvis benyttes til dyrking ..log rensing av mikrobielle metaboliske produkter fra dyrkingsvæsker.

Ettersom medlemmene av XK-88-rekken er basiske og

er oppløselige i vann, men tungt oppløselige i alminnelige organiske oppløsningsmidler, kan de ønskede produkter renses ved metoder som vanligvis benyttes til rensing av såkalte vannopp-løselige basiske antibiotika. Nærmere bestemt kan medlemmene av XK-88-rekken renses ved en passende kombinasjon av adsorpsjon og desorpsjon fra kationutvekslerharpikser og aktivkull; søyle-kromatografi under anvendelse av cellulose; adsorpsjon og desorpsjon fra en søyle av "Sephadex" ® LH-20; eller silisiumdi-oksydgelkromatografi.

For eksempel innstilles det cellefrie dyrkningsfiltrat først til en pH-verdi på 7,5 og underkastes deretter adsorpsjon på en kationutvekslerharpiks, "Amberlite"<®>IRC-50 (NHJ-form). Etter vasking med vann utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann. Den aktive fraksjon konsentreres under forminsket trykk. Konsentratet innstilles deretter til en pH-verdi på 7,5 og sendes gjennom en søyle pakket med aktivkull. Søylen vaskes med en liten mengde vann og elueres deretter med 0,5 N svovelsyre. Fargede urenheter elueres nesten ikke. Eluatet innstilles til en pH-verdi på 7,0 med "Dowex"<®>44 (OH -form) og sendes gjennom en søyle av "Amberlite"<®>CG-50 (NH^-form). Etter vasking med vann utføres eluering med 0,2 N ammoniakkvann.

Som et resultat av dette elueres XK-88-l-komponenten først, etterfulgt av XK-88-3-komponenten og deretter XK-88-5- komponenten.- XK-88-2-komponenten kan deretter elueres med 0,5 N ammoniakkvann.

Fraksjonen inneholdende XK-88-1 som hovedkomponent konsentreres. Konsentratet sendes gjennom en søyle av silisiumdioksydgel. Eluering utføres med 50$ vandig metanol. Fraksjoner inneholdende aktivt stoff, som utviser Rf-verdier på 0,58 og 0,31 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi under anvendelse av henholdsvis utviklingsmiddel II (metanol og 10% vandig ammoniumacetat (1:1)) og utviklingsmiddel M (n-butanol, etanol, kloroform og 1756 ammoniakkvann (4:5:2:5)), kombineres og konsentreres. Konsentratet innstilles til en pH-verdi på 7,5 og sendes deretter gjennom en søyle av "Amberlite" ^ CG-50 (NH^-form).. Etter vasking med vann utføres eluering med 0,2 N ammoniakkvann. De aktive fraksjoner konsentreres og konsentratet innstilles til en pH-verdi på 4,5 med svovelsyre. Metanol tilsettes, hvorved det oppnås et hvitt pulver av sulfatet av XK-88-1.

Fraksjonene inneholdende XK-88-3 og XK-88-5 som hoved-komponenter konsentreres. Konsentratet sendes gjennom en søyle av silisiumdioksydgel. Enhver forurensning med XK-88-l-komponenten elueres først med 50% vandig metanol. Deretter elueres XK-88-3-komponenten som utviser Rf-verdier på 0,39 og 0,27 ved silisiumdioksydgel-tynnsj iktskromatograf i under anvendelse av henholdsvis utviklingsmiddel II og utviklingsmiddel M, med en blanding av metanol og 10% vandig ammoniumacetat (1:1). XK-88-5_komponenten som utviser Rf-verdier på 0,20 og 0,50 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi under anvendelse av henholdsvis utviklingsmiddel II og utvilingsmiddel M, elueres deretter. Den aktive fraksjon inneholdende XK-88-3 som hovedkomponent og fraksjonen'inneholdende XK-88-5 som hovedkomponent sendes hver for seg gjennom en søyle

Cr) +

av "Amberlite"^ CG-50 (NH^-form). Etter vasking med vann utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann. Hver av de aktive fraksjoner konsentreres og sendes gjennom en søyle av silisiumdioksydgel. Ved eluering med en oppløsningsmiddelblanding av n-butanol, etanol, kloroform og 175» ammoniakkvann (4:5:2:5) oppnås henholdsvis den aktive fraksjon inneholdende XK-88-3 som eneste komponent og den aktive fraksjon inneholdende XK-88-5 som eneste komponent. Hver av de aktive fraksjoner konsentreres og sendes gjennom en

(r) +

søyle av "Amberlite" w CG-50 (NH^-form). Etter vasking med vann utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann. Hver av de aktive

fraksjoner konsentreres og innstilles til en pH-verdi på 4,5 med svovelsyre. Metanol tilsettes hvorved det oppnås et h<y>itt pulver av henholdsvis sulfatet av XK-88-3 og sulfatet av XK-88-5.

Den aktive fraksjon inneholdende XK-88-2 som hovedkomponent konsentreres. Konsentratet sendes gjennom en søyle av silisiumdioksydgel. Eluering utføres med en blanding av metanol og 10% vandig ammoniumacetat (1:1). Som resultat oppnås fraksjonen inneholdende XK-88-2 som. utviser Rf-verdier på 0,45 og 0,3.8 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi under anvendelse av henholdsvis utviklingsmiddel II og utviklingsmiddel M. Den aktive fraksjon sendes gjennom en søyle av "Amberlite" R CG-50 (NH^+-form).Etter vasking med vann utføres eluering med 0,5N ammoniakkvann. Den eluerte aktive fraksjon konsentreres og sendes gjennom en søyle av silisiumdioksydgel. Ved eluering med en oppløsningsmiddel-blanding av n-butanol, etanol, kloroform og 1755 ammoniakkvann (4:5: 2:5) oppnås den aktive fraksjon inneholdende XK-88-2 som eneste komponent. Den aktive fraksjon konsentreres og innstilles til en pH-verdi på 7,5- Konsentratet sendes deretter gjennom en søyle av "Amberlite"<®>CG-50 (NH^-form). Etter vasking med vann utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann. Den eluerte aktive fraksjon konsentreres og innstilles til en pH-verdi på 4,5 med svovelsyre. Metanol tilsettes hvorved det oppnås et hvitt pulver av sulfatet XK-88-2.

Når det inneholdes fargede urenheter i en XK-88-komponent eller i en blanding av komponenter, kan det foretas en avfarging ved behandling med granulært aktivkull, en porøs harpiks, slik som "Diaion"<®>HP-10, "Amberlite" ® XAD-2 og en anionutvekslerharpiks,

(R) -

slik som "Dowex" ^ 1 x 2 (OH -form). Nærmere bestemt sendes en vandig oppløsning av et medlem av XK-88-rekken eller en blanding derav, som inneholder fargede urenheter, gjennom en søyle av "Diaion" R HP-10. Ved eluering med vann kan det oppnås en vandig oppløsning av et medlem av XK-88-rekken eller en blanding derav, som er fri for de fargede urenheter.

Under det ovennevnte rensingstrinn kontrolleres opp-førselen av medlemmene av XK-88-rekken ved stigende tynnsjiktskromatografi på en plate av silisiumdioksydgel under anvendelse av utviklingsmidlene II (metanol og 10% vandig ammoniumacetat (1:1)) og M (n-butanol, etanol, kloroform og 17% ammoniakkvann (4:5:2:5)).

Utviklingen utføres ved romtemperatur' i. 3-4 timer. Rf-verdiene

for XK-88-1, -2, -3 og -5 på et tynnsj iktskromatogram i.er vist i tabell 3 nedenfor.

Antibiotikaene

XK- 88- 1

Sulfatet av XK-88-1 er et hvitt krystallinsk pulver. Sulfatets smeltepunkt er 200-240°C (dekomponering-). Sulfatets optiske dreiing er (a)^<8>= +77,9° (C = 1,08, H2<D). Ved måling på

et høyoppløsningsmassespektrum bestemmes XK-88-1 (fri base) til å ha en molekylvekt på 454 og en molekylformel på C^ U^^^ O^. En elementanalyse av sulfatet av XK-88-1 gir: C = 29,35%, H 2 6,48%, N = 8,35% (beregnet, for C^H^N^O-^. 2H2S0^3H20: C = 29,23%,

H = 6,35%, N = 8,02%).

Det ultraviolette absorpsjonsspektrum for en vandig oppløsning av sulfatet av XK-88-1 (fig. 1) viser intet krakteristisk absorpsjonsmaksimum mellom 220 og 360 nm, men viser kun en terminal absorpsjon. Det infrarøde absorpsjonsspektrum av den samme for-bindelse (som KBr-tablett) er vist i fig. 2. Som det fremgår av figuren viser XK-88-1 topper ved følgende bølgelengder uttrykt 1 cm : 3355, 2900, 2000, 1610, 1505, 1120, 1025, 615.

Fig. 9 viser det karakteristiske NMR (proton)-spektrum for den frie base av XK-88-1. Fig. 13 viser på den annen sideC1-5-NMR-spektret for den frie base av XK-88-1.

Med hensyn til fargeprøver gir sulfatet av XK-88-1 positive reaksjoner ved ninhydrin-prøven og Rydon-Smith-prøven (H.N. Rydon, Nature 169, side 922, 1952) og gir negative reaksjoner ved Sakaguchi-prøven, maltol-prøven, ferriklorid-prøven, Fehling's prøve og biuret-prøven.

Sulfatet av XK-88-1 er meget oppløselig i vann, tungt oppløselig i metanol og i etanol og uoppløselig i slike organisk oppløsningsmidler som aceton, etylacetat, etyleter og kloroform.

På basis av det.ovenstående antas XK-88-1 å ha følgende kjemiske strukturformel:

XK- 88- 2

Sulfatet av XK-88-2 ér et hvitt pulver. Sulfatets smeltepunkt er 225-250°C (dekomponering). Sulfatets optiske dreiing er (a)^<8>= +74,7° (C = 0,56, H20)._ Ved måling av høy-oppløsnings-massespektrum bestemmes XK-88-2 (fri base) til å ha en molekylvekt på 306 og molékylformelen ci2^26<N4>°5' ^n elementanalyse av sulfatet av XK-88-2 gir: C = 25,47%, H = 6,76%,

N = 9,68%; (beregnet for C12H26N405.2H2S04.3H20: C = 25,90%,

H = 6,52%, N = 10,07%).

Det ultraviolette absorpsjonsspektrum for en vandig oppløsning av sulfatet av XK-88-2 (fig. 3) viser intet karakteristisk absorpsjonsmeksimum mellom 220 og 360 nm, men viser kun en terminal absorpsjon. Det infrarøde absorpsjonsspektrum for sulfatet av XK-88-2 (som KBr-tablett) er vist i fig. 4. Som det fremgår av figuren viser XK-88-2 topper ved følgende bølgelengder uttrykt i cm

3400, 3000, 1605, 1490, 11-15, 1035, 605.

Egenskapene til XK-88-2 bekreftes ytterligere ved C^-NMR-spektret av sulfatet og NMR-spektret av den frie base som vist i henholdsvis fig. 14 og fig. 10.

Med hensyn til fargeprøver gir sulfatet av XK-88-2 positive reaksjoner ved ninhydrin-prøven og Rydon-Smith-prøven og gir negative reaksjoner med Sakaguchi-prøven, malton-prøven, ferriklorid-prøven, Fehling's prøve og biuret-prøven.

Sulfatet av XK-88-2 er meget oppløselig i vann,

tung oppløselig i metanol og etanol og uoppløselig i slike organiske oppløsningsmidler som aceton, etylacetat, etyleter og kloroform.

På basis av det ovenstående antas XK-88-2 å ha følgende kjemiske strukturformel:

XK- 88- 3

Sulfatet av XK-88-3 er et hvitt pulver. Sulfatets smeltepunkt er 215_240°C (dekomponering). Sulfatets optiske dreiing er (o0^<8>= +87,3° (C = 0,53 HO). Ved måling av et høyoppløselig massespektrum bestemmes XK-88-3 (fri base) til å ha en molekylvekt på 453 og molekylformelen C^ H^ N^ Og. En elementanalyse av sulfatet av XK-88-3 gir: C = 26,02%, H .= 6,72%, N = 8,61%; (beregnet for C17H 5N5Og.5/2H2S01|.5H20: C 3 25,89%, H = 6,39%, N = 8,88%).

Det utraviolette absorpsjonsspektrum for en vandig oppløsning av sulfatet av XK-88-3 (fig. 5) viser intet karakteristisk absorpsjonsmaksimum mellom 2 20 og 360 nm, men viser kun en terminal absorpsj on.

Det infrarøde absorpsjonsspektrum for sulfatet av XK-88-3 (som KBr-tablett) er vist i fig. 6. Som det fremgår av figuren viser XK-88-3 topper ved de følgende bølgelengder uttrykt i cm<-1>: 3400, 3000, 1615, 1505, 1125, 1030, 620.

Ytterligere bekreftelse av egenskapene til XK-88-3

fås fra fig. 11 som viser NMR (proton)-spektret for den frie base av XK-88-3-

Med hensyn,til fargeprøver gir sulfatet av XK-88-3 positive reaksjoner ved ninhydrin-prøven og Rydon-Smith-prøven og gir negative reaksjoner ved Sakaguchi-prøven, maltol-prøven, ferri-klorid-prøven, Fehling's prøve og biuret-prøven.

Sulfatet av XK-88-3 er meget oppløselig i vann,

tungt oppløselig i metanol og etanol og uoppløselig i slike organiske oppløsningsmidler som aceton, etylacetat, etyleter og kloroform.

På basis av det ovenstående antas XK-88-3 å ha følgende kjemiske strukturformel:

XK- 88- 5

Sulfatet av XK-88-5 er et hvitt pulver. Sulfatets smeltepunkt er 215-240°C (dekomponering). Sulfatets optiske dreiing er (a)^<8>= +93,9° (C = 0,54, HgO). Ved måling på et høy-oppløsningsmassespektrum bestemmes XK-88-5 (fri base) å ha en molekylvekt på 450 og molekylformelen ci8H38N6^7'Elementanalysen av sulfatet av XK-88-5 gir: C = 25,89%, H = 6,50%, N = 9,74%;

(beregnet for C18<H>38N6°7'3H2S04"6H20: c = 25>35%, H = 6,62%,

N = 9,85%).

Det ultraviolette absorpsjonsspektrum for en vandig oppløsning av sulfatet av XK-88-5 (fig. 7) viser intet karakteristisk absorpsjonsmaksimum mellom 220 og 360 nm, men viser kun en terminal absorpsjon. Det infrarøde absorpsjonsspektrum for sulfatet av

XK-88-5 (som KBr-tablett) er vist i fig. 8. Som det fremgår av fra figuren viser XK-88-5 topper ved følgende bølgelengder, uttrykt i cm"<1>: 3400, 2900, 1600, 1500, 1390, 1110, 1040, 610.

Ytterligere bekreftelse av egenskapene av XK-88-5

fås fra fig. 12 og 15 som viser henholdsvis NMR (proton)-spektret for den frie base og C<1>^-NMR-spektret for sulfatet.

Med hensyn til fargeprøver gir sulfatet av XK-88-5 positive reaksjoner ved ninhydrin-prøven og Rydon-Smith-prøven og gir negative reaksjoner ved Sakaguchi-prøven, maltol-prøven, ferriklorid-prøven, Fehling's prøve og biuret-prøven.

Sulfatet av XK-88-5 er meget oppløselig i vann, tungt oppløselig i metanol og etanol og uoppløselig i slike organiske oppløsningsmidler som aceton, etylacetat, etyleter og kloroform.

På grunnlag av det ovenstående antas XK-88-5 å ha følgende kjemiske strukturformel:

Innenfor oppfinnelsens ramme ligger også fremstill-ingen av de farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter av kom-ponentene av XK-88-rekken, som kan fremstilles ifølge kjente metoder ved nøytralisering av den frie base med den passende syre til en pH-verdi på under 7,0 og fortrinnsvis til en pH-

verdi på fra' ca. 2 til ca. 6. Egnede syrer til dette formål er f.eks. saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, tiocyansyre, fluor-kiselsyre, heksafluorarsensyre, heksafluorfosforsyre, eddiksyre, ravsyre, sitronsyre, kamfersyre, glutarsyre, glykolsyre, ftal-syre, vinsyre,•laurinsyre, stearinsyre og salicylsyre.

Syreaddisjonssaltene fremtrer fysisk som hvite pulvere som er oppløselige i vann og tungt oppløselige eller uoppløselige i de fleste organiske oppløsningsmidler.

Rf-verdiene av antibiotikaene av XK-88-rekken oppnådd ved papirkromatografi og tynnsjiktskromatografi under anvendelse av forskjellige utviklingsmidler, er vist i den etterfølgende tabell 3. Disse verdier er sammenlignet med Rf-verdiene av forskjellige lignende antibiotika utviklet på samme måte.

Utviklingsmiddel I: kloroform/metanol/17% ammoniakkvann (2:1:1

det øvre lag av blandingen).

II: metanol/10?? ammoniumacetat (1:1).

M: n-butanol/etanol/kloroform/17/? ammoniakkvann

(4:5:2:5).

1: 20% vandig oppløsning av ammoniumklorid. 2: vannmettet n-butanol.

3: n-butanol/eddiksyre/vann (3:1:1).

4: vannmettet n-butanol inneholdende 2% (vekt/

vol) p-toluensulfonsyre og 2 vol-% piperidin.

5: kloroform/metanol/17% ammoniakkvann (2:1:1 det nedre lag av blandingen).

Det bakterielle spektrum in vitro av XK-88 antibiotikaene ved agar-fortynningsmetoden (pH 8,0) er vist i følgende tabell 4:

Som det fremgår av den ovenstående tabell 4 utviser alle antibiotika i XK-88-rekken en meget sterk antibakteriell aktivitet overfor et bredt område av gram-positive og gram-negative-bakterier.<*>Spesielt utviser XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 og XK-88-5 en sterk antibakteriell aktivitet overfor Staphylococcus aureus og Escherichia coli, som normalt er resistente overfor forskjellige kjente antibiotika.

En sammenligning av antibiotikaene ifølge oppfinnelsen med forskjellige andre antibiotika viser ytterligere deres nyhet. XK-88-rekken av antibiotika er alle vannoppløselige basiske antibiotika og er venstredreiende forbindelser. De ultraviolette absorpsjonsspektre viser kun terminal adsorpsjon og avslører intet karakteristisk absorpsjonsmaksimum. Molekylvekten av XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 og XK-88-5 (frie"baser) er henholdsvis 454, 306, 453 og 450. Ut fra det foregående betraktes Gentamicin A, Gentamicin B, Gentamicin , Gentamicin C-^, Gentamicin C2, Kanamycin A, Kanamycin B, Kanamycin C, Ribostamycin, Tobramycin, Apramycin, Nebramycin faktor 4, Nebramycin faktor 5 og Sisomycin som anti-biotika, som minner forholdsvis meget om XK-88-1, XK-88-3 og XK-88-5. Neomycin A og NK-1003 synes å ligne XK-88-2 temmelig meget. Rf-verdiene for XK-88-3 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi og papirkromatografi (tabell 3) er meget nær verdiene for Gentamicin B, men Rf-verdiene for andre medlemmer av XK-88-rekken er helt forskjellige fra verdiene for de hittil kjente antibiotika. Molekylvekten for den frie base av XK-88-3 (453) er fullstendig forskjellig fra molekylvekten til den frie base av Gentamicin B (486). Det fremgår også fra tabell 4 at det ikke alltid er fullstendigkryssresistens mellom XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3, XK-88-5 og de nevnte kjente antibiotika. Ut fra det foregående betraktes XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 og XK-88-5 alle som hittil ukjente antibiotika.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen belyses nærmere ved følgende utførelseseksempler.

Eksempel

I dette eksempel anvendes Streptomyces hofuensis MK-88 (FERM-P nr. 2216) (ATCC 21970) som podestamme. En prøve av pode-stammen innpodes i 30 ml av et første podemedium med følgende sammen-setning i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe og dyrkes ved 30°C i 3 dager under rysting:

Deretter innpodes 30 ml av den første podekultur i

300 ml av et annet podemedium i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe forsynt med rører. Sammensetningen av det andre podemedium er den samme som for det første podemedium. Den andre podedyrkning ut-føres ved 30°C i 2 dager under rysting. Deretter innpodes 1,5 liter av den andre podekultur (tilsvarende innholdet av 5 kolber) i 15 liter av et tredje podemedium i en 30 liters gjæringsbeholder av rustfritt stål. Igjen er sammensetningen av det tredje podemedium den samme som for det første podemedium.

Dyrkingen i gjæringsbeholderen utføres ved 30°C i 2 dager med lufting (15 l/min.) og omrøring (350 omdr./min.). Deretter innpodes 15 liter av den tredje podekultur i 100 liter av et fjerde podemedium i en 300 liters' gjæringsbeholder. Sammensetningen av det fjerde podemedium er den samme som for det første podemedium. Dyrkningen i gjæringsbeholderen utføres ved 30°C i 2 dager med luftning (100 l/min.) og omrøring (150 omdr./min.). Endelig innpodes 100 liter av den fjerde podekultur i 1000 liter gjæringsmedium i en 2000 liters gjæringsbeholder. Sammensetningen av gjærings-mediet er som følger:

Dyrkningen utføres ved 30°C i 4 dager med luftning

(400 l/min.) og omrøring (150 omdr./min.).

Etter dyrkningens fullførelse er det akkumulert en blanding av XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 og XK-88-5 i dyrkningsvæsken. Det samlede utbyttet beregnet som antibakteriell aktivitet er

3,5 mg/l beregnet på sulfatet av XK-88-5.

lOOOliter av den oppnådde dyrkningsvæske innstilles til en pH-verdi på 7,5 med konsentrert svovelsyre.

Ca. 10 kg av et filtreringshjelpemiddel med vare-betegnelsen "Radiolite No. 600" tilsettes og mikroorganismecellene og uoppløste materialer fjernes ved filtrering. Filtratet sendes gjennom en søyle pakket med omkring 100 liter av en kationutvekslerharpiks, "Alberlite" ^IRC-50 (NH^-form). Aktive stoffer adsorberes på harpiksen. Etter vasking med omkring 300 liter vann utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann. Eluatets aktivitet bestemmes ved en papirskivemetode på en agarplate under anvendelse av Bacillus subtilis nr. 10707- De aktive fraksjoner kombineres og konsentreres til 6 liter under forminsket trykk. Konsentratet innstilles til en pH-verdi på 7,5 med konsentrert svovelsyre, og bunnfallet fjernes ved filtrering. Filtratet sendes gjennom en søyle pakket med 2 liter "Amberlite"<®>IRC-50 (NH^-form). Etter vasking med 10 liter vann utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann, og de aktive fraksjoner kombineres og konsentreres til ca. 300 ml under forminsket trykk.

Da konsentratet inneholder brunfargede urenheter innstilles det til en pH-verdi på 7,5 med konsentrert svovelsyre og sendes gjennom en søyle pakket med omkring 500 ml granulært aktivkull for å fjerne urenhetene. Eluering utføres med omkring 1 liter vann og deretter med omkring 2 liter 0,-5 N svovelsyre hvorved det meste av de aktive stoffer elueres i en temmelig ren form. De aktive fraksjoner som er oppnådd ved eluering med 0,5 N svovelsyre, nøytraliseres med en anionutvekslerharpiks, "Dowex" 44 (OH -form) og blandes med de aktive fraksjoner oppnådd ved eluering med vann. Blandingen konsentreres deretter under forminsket trykk hvorved det oppnås et rått pulver inneholdende XK-88-rekken. Den totale aktivitet av det således oppnådde pulver tilsvarer omkring 3 g av sulfatet av XK-88-5.

Det rå pulver inneholdende X-88-1, XK-88-2, XK-88-3

og XK-88-5 oppløses i omkring 3 liter vann og innstilles til en pH-verdi på 8,0 med konsentrert svovelsyre. Oppløsningen sendes deretter gjennom en søyle pakket med omkring 500 ml av en kationutvekslerharpiks, "Amberlite"<®>CG-50 (NH^-form). Etter vasking-

av søylen med vann, utføres eluering med 4,5 liter 0,2 N ammoniakkvann og deretter med 0,5 N ammoniakkvann med en hastig-

het på omkring 1 liter pr. time. Eluatet oppsamles i fraksjoner på hver 20 ml. Ved anvendelse av 0,2 N ammoniakkvann elueres XK-88-1 og en blanding av XK-88-3 og XK-88-5, henholdsvis fraksjonene nr. 50-165 og fraksjonene nr. 166-230. Deretter elueres XK-88-2 ved anvendelse av 0,5 N ammoniakkvann.

De aktive komponenter inneholdt i hver fraksjon bekreftes ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi. Utviklingen gjennom-føres ved romtemperatur i 3-4 timer under anvendelse av utviklingsmiddel II (10% ammoniumacetat/metanol, 1:1) og utviklingsmiddel M (n-butanol/etanol/kloroform/17% ammoniakkvann, 4:5:2:5)'Kompo-nentene spores ved slike fargereaksjoner som ninhydrin-reaksjonen og Rydon-Smith-reaksjonen. Komponentenes aktivitet bestemmes ved bioautografi under anvendelse av en agarplate av Bacillus subtilis nr. 10707. Med utviklingsmiddel II viser XK-88-1, XK-88-2,

XK-88-3 og XK-88-5 Rf-ferdier på henholdsvis 0,58, 0,45, 0,39 og 0,20, og med utviklingsmiddel M viser XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3

og XK-88-5 Rf-verdier på henholdsvis 0,31, 0,38, 0,27 og 0,50.

De aktive fraksjoner konsentreres deretter hver for seg under forminsket trykk for å fjerne ammoniakk. Som resultat oppnås et konsentrat inneholdende XK-88-1, et konsentrat inneholdende XK-88-2 og et konsentrat inneholdende XK-88-3 og XK-88-5. Utbyttet av de aktive stoffer inneholdet i hvert konsentrat tilsvarende henholdsvis omkring 250 mg, 200 mg og 1,5 g av sulfatet av XK-88-5.

Den oppnådde aktive fraksjon inneholdende XK-88-1 som hovedkomponent konsentreres. Konsentratet oppløses i omkring 50 ml 50% metanol, og oppløsningen sendes gjennom en søyle pakket med omkring 200 ml silisiumdioksydgel, som i forveien er behandlet med 50% metanol. XK-88-1 elueres først med 50% metanol. Deretter elueres forurensningsspor av XK-88-3 og XK-88-5 med 50% metanol inneholdende 5% ammoniumacetat. Etter at det er be-kreftet ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi under anvendelse av utviklingsmiddel II og utviklingsmiddel M, at den først oppnådde fraksjon inneholder en enkel komponent, XK-88-1, konsentreres fraksjonen under forminsket trykk for å fjerne metanol. Konsentratet innstilles til en pH-verdi på 0,5 med 6 N svovelsyre og sendes gjennom en søyle (omkring 200 ml) pakket med "Amberlite" ^CG-50 (NH^-form). Etter vasking av søylen, med vann utføres eluering med omkring 1 liter 0,2 N ammoniakkvann. For å fjerne ammoniakk, konsentreres den aktive fraksjon til omkring 50 ml under forminsket trykk. Videre innstilles konsentratet til en pH-verdi på 4,5 med 6 N svovelsyre og det tilsettes dråpevis omkring 200 volum metanol under omrøring, hvorved det dannes et hvitt bunnfall. Bunnfallet fraskilles ved filtrering og vaskes med metanol. Etter tørking oppnås omkring 12 g av et renset preparat av sulfatet av XK-88-1.

Alternativt konsentreres den oppnådde aktive fraksjon inneholdende XK-88-1 som hovedkomponent til omkring 50 ml under forminsket trykk. Deretter tilsettes 250 ml metanol og blandingen omrøres i 15 minutter. Etter henstand av blandingen ved 0°C natten over, dannes et bunnfall. Bunnfallet fraskilles med et glassfilter. Da bunnfallet er tungt oppløselig i metanol, vaskes det med metanol. Etter vasking suspenderes bunnfallet i omkring 500 ml metanol og oppløses under oppvarming. Oppløsningen underkastes deretter filtrering og filtratet konsentreres under forminsket trykk. Som resultat dannes et krystallinsk bunnfall. Etter henstand av konsentratet ved 0°C dannes et ytterligere krystallinsk bunnfall. Bunnfallet fraskilles ved filtrering.

Det utføres gjentatte omkrystalliseringer fra metanol. De således oppnådde fargeløse krystaller fraskilles ved filtrering og vaskes med metanol. Etter tørking av de resulterende krystaller under forminsket trykk, oppnås omkring 7 g XK-88-1 (fri base).

Den oppnådde aktive fraksjon inneholdende XK-88-2 som hovedkomponent, konsentreres under forminsket trykk, og til den konsentrerte oppløsning settes en like stor mengde metanol. Blandingen sendes gjennom en søyle pakket med omkring 200 ml silisiumdioksydgel, som i forveien er behandlet med 50% metanol. Etter vasking av søylen med omkring 1 liter 50% metanol, gjennom-føres utviklingen med 50% metanol inneholdende 5% ammoniumacetat. XK-88-2, som utviser Rf-verdier på 0,45 og 0,38 ved silisiumdioksydgel-tynnsj iktskromatograf i under anvendelse av henholdsvis utviklingsmiddel II og utviklingsmiddel M, elueres først. Deretter elueres forurensningsspor av XK-88-3 og XK-88-5. Ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi bekreftes det at den først oppnådde fraksjon inneholder XK-88-2. Den aktive fraksjon inneholdende XK-88-2, konsentreres for å fjerne metanol. Konsentratet sendes deretter gjennom en søyle pakket med 100 ml "Amberlite"<®>CG-50 (NH^-form) for avsalting. Etter vasking av søylen med vann utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann. Den aktive fraksjon konsentreres og sendes gjennom en søyle pakket med omkring 300 ml silisiumdioksydgel. Utviklingen gjennomføres med et oppløsningsmiddel bestående av n-butanol, etanol, kloroform og 17% ammoniakkvann i volumforholdet 4:5:2:5. Den eluerte aktive fraksjon konsentreres for å fjerne organiske oppløsnings-midler og ammoniakk. Konsentratet sendes deretter gjennom en søyle pakket med omkring 100 ml "Amberlite" ® CG-50 (NH^-form). Etter vasking av søylen med vann utføres eluering ved 0,5 N ammoniakkvann. Den aktive fraksjon konsentreres til omkring 3 ml under forminsket trykk for å fjerne ammoniakk. Konsentratet oppløses deretter i omkring 100 ml metanol og oppløsningen innstilles til en pH-verdi på 4,5 med 6 N svovelsyre. Som resultat av dette, dannes et hvitt bunnfall som fraskilles ved filtrering og vaskes med metanol. Etter tørking av bunnfallet under forminsket trykk, oppnås omkring 250 mg av et renset preparat av sulfatet av XK-88-2.

Den oppnådde blanding inneholdende XK-88-3 og XK-88-5 konsentreres til omkring 10 ml. Konsentratet sendes gjennom en søyle pakket med omkring 500 ml silisiumdioksydgel. Utviklingen gjennomføres med et oppløsningsmiddel bestående av n-butanol, etanol, kloroform og 17% ammoniakkvann i volumf orholdet 4 : 5 '• 2 : 5 • Eluatet oppsamles i fraksjoner på hver 20 ml. XK-88-5 og XK-88-3 elueres i henholdsvis fraksjonene nr. 95-121 og fraksjonene nr. 133-158. XK-88-3 inneholdt i de sistnevnte fraksjoner, utviser Rf-verdier på 0,39 og 0,27 ved silisiumdioksydgel-tynnsjikts-kromatograf! under anvendelse av henholdsvis utviklingsmiddel II og utviklingsmiddel M. XK-88-5 inneholdt i de førstnevnte fraksjoner, utviser Rf-verdier på 0,25 og 0,50 ved silisiumdioksydgel-tynnsj iktskromatograf i under anvendelse av henholdsvis utviklingsmiddel II og utviklingsmiddel M. Etter bekreftelse av den aktive komponent inneholdt i hver fraksjoner ifølge de ovenstående Rf-verdier, kombineres fraksjonene inneholdende de samme komponenter .

Den oppnådde aktive fraksjon inneholdende XK-88-3 som hovedkomponent, tørkes under forminsket trykk for å fjerne organiske oppløsningsmidler og ammoniakk. Det resulterende tørre materiale oppløses i 50% metanol og sendes gjennom en søyle pakket med 50 ml silisiumdioksydgel. Søylen vaskes deretter med 50% metanol for å fjerne ethvert forurensningsspor av XK-SS-1. XK-88-3 elueres deretter med 50% metanol inneholdende ammoniumacetat. De aktive fraksjoner kombineres cg konsentreres under forminsket trykk for å fjerne metanol. Konsentratet sendes deretter gjennom en søyle pakket med omkring 50 ml "Amberlite" ® CG-50 (NH^-form), og etter vasking av søylen med vann for å fjerne ammoniumacetat, utføres eluering med 0,5 N ammoniakkvann for å oppnå aktive fraksjoner. De aktive fraksjoner kombineres og konsentreres til omkring 3 ml for å fjerne ammoniakk. Konsentratet innstilles til en pH-verdi på 4,5 med 6 N svovelsyre og tilsettes dråpevis til omkring 100 ml etanol, hvorved det dannes et hvitt bunnfall. Bunnfallet fraskilles deretter ved filtrering, vaskes med etanol og tørkes under forminsket trykk, hvorved det oppnås omkring 60 mg av et renset preparat av sulfatet av XK-88-3.

Den oppnådde aktive fraksjon inneholdende XK-88-5

som hovedkomponent, konsentreres under forminsket trykk. Konsentratet oppløses i et overskudd metanol og innstilles til en pH-verdi på 4,5 med 6 N svovelsyre, hvorved det utfelles et rått pulver av sulfatet av XK-88-5. Bunnfallet fraskilles ved filtrering, vaskes med metanol og tørkes under forminsket trykk, hvorved det oppnås omkring 600 mg av et rått pulver av sulfatet av XK-88-5. Det således oppnådde rå pulver suspenderes i et opp-løsningsmiddel bestående av n-butanol, etanol, kloroform og konsentrert ammoniakkvann i volumforholdet 4:5:2:4. Suspensjonen

sendes gjennom en søyle pakket med omkring 500 ml silisiumdioksydgel og utviklingen gjennomføres med det samme oppløsningsmiddel. Aktive komponenter inneholdt i de eluerte fraksjoner undersøkes med hensyn til Rf-verdiene ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi. De fraksjoner som bare inneholder XK-88-5, kombineres og konsentreres under forminsket trykk for å fjerne organiske oppløsningsmidler og amoniakk. Deretter sendes konsentratet gj.ennom en søyle pakket med 100 ml "Amberlite"<®>Cg-50 (NH^-form). Etter vasking av søylen kan man utføre eluering med 0,5 N ammoniakkvann. Den aktive fraksjon konsentreres til omkring 10 ml under forminsket trykk for å fjerne ammoniakk. Konsentratet oppløses deretter i omkring 200 ml metanol og, innstilles til en pH-verdi på 4,5 med 6 N svovelsyre hvorved det dannes et hvitt bunnfall. Bunnfallet fraskilles ved filtrering og vaskes med metanol. Metanoloppløsningen inneholdende bunnfallet tørkes under forminsket trykk, hvorved det oppnås omkring 400 mg av et renset preparat av sulfatet av XK-88-5.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av de antibiotisk virksomme forbindelser XK-88-1 med formelen:

XK-88-2 med formelen:

XK-88-3 med formelen:

og XK-88-5 med formelen:

eller syreaddisjonssalter derav,karakterisertVed at man dyrker en mikroorganisme tilhørende arten Streptomyces hofuensis i et næringsmedium inneholdende assimiler-bare kilder for nitrogen og karbon, hvoretter nevnte forbindelser isoleres fra dyrkningsmediet, og eventuelt overføres til syreaddisjonssalter derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det som mikroorganisme anvendes Streptomyces hofuensis ATCC 21970.