DE2513854C2 - Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number
DE2513854C2
DE2513854C2 DE2513854A DE2513854A DE2513854C2 DE 2513854 C2 DE2513854 C2 DE 2513854C2 DE 2513854 A DE2513854 A DE 2513854A DE 2513854 A DE2513854 A DE 2513854A DE 2513854 C2 DE2513854 C2 DE 2513854C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
substance
atcc
water
brown
complex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2513854A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2513854A1 (de
Inventor
Dennis Redhill Surrey Butterworth
Martin Dorking Surrey Cole
John Dick Partridge Green Horsham Sussex Hood
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Original Assignee
BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB filed Critical BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Publication of DE2513854A1 publication Critical patent/DE2513854A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2513854C2 publication Critical patent/DE2513854C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D477/00Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
    • C07D477/10Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D477/12Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
    • C07D477/16Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
    • C07D477/20Sulfur atoms
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07GCOMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G11/00Antibiotics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C12P17/184Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing a beta-lactam ring, e.g. thienamycin
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 902 und ihrer Salze nach Anspruch 1 durch Züchten von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, ATCC 21 380, ATCC 21 381, ATCC 21 382 oder ATCC 31 !26 unter Bildung des Komplexes MM 4550, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des MM 4550-Komplexes chromatographisch in Fraktionen unterteilt, die ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm zeigen, und man die Substanz MM 13 902 oder ihre Salze daraus isoliert
3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Substanz MM 13 902 oder deren Salze nach Anspruch 1.
4. Arzneimittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an Penicillin oder Cephalosporin.
wesentlichen rein ist. Es ist jedoch gefunden worden, daß dies nicht der Fall ist, und daß man aus diesem Produkt in geringer Menge einen Bestandteil isolieren kann, der eine starke antibakterielle Wirksamkeit
besitzt Diese neue Substanz wild als »MM 13 902« bezeichnet, und man nimmt an, daß sie teilweise verantwortlich für die antibakterielle Wirksamkeit bei dem Produkt gemäß der GB-PS 13 63 075 ist, obwohl die Substanz nur zu einem sehr geringen Teil für die
ίο /J-Lactamase-Hemmwirkung verantwortlich ist, die dieses Produkt zeigt. Selbstverständlich umfaßt die vorliegende Erfindung nichts, was in der GB-PS 63 075 hinsichtlich des dort genannten Produkts beansprucht ist. Es sind auch andere ß-Lactamase-
Hemmstoffe bekannt, die durch Streptomyces-Stämme erzeugt werden, wie sie z. B. in der DE-OS 23 40 005 beschrieben sind. Jedoch ist von derartigen bekannten Substanzen nicht gezeigt worden, daß sie eine starke antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, wie sie die
Substanz MM 13 902 besitzt.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist nun diese Substanz MM 13 902 und ihre Salze mit den kennzeichnenden Merkmalen, daß
a) die feste Carbonsäure MM 13 902 in Forr» ihres praktisch reinen Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften besitzt:
aa) leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyl-
äther und Kohlenwasserstoffen;
ab) ein Ultraviolett-Spektrum mit einem Absorptionsinaximum bei etwa 305 nm;
ac) bei einer Menge von 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch hergestellten KBr-Platte ein
Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima
u.a. bei 3450,2950,1750,1620,1510,1400 und 1260 cm-1;
ad) ein NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser mit u. a. einem Paar Niederfeld-Doubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 235 τ und 4,00 τ mit
Kopplungskonstanten von etwa 14 Hz, mit einem Dublett mit dem Zentrum bei etwa 8,55 τ und mit einem scharfen Singulett bei etwa 8,00r;
b) das reine Dinatriumsalz
ba) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit den nachstehenden Systemen die Rf-Werte aufweist: n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumen verhältnis 7 :7 :6, Ri = 0,72;
Isopro»anol/Wasser im Volumenverhältnis 7:3, Rf = 035;
n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 :7 :6, Rt = 031;
n-Propanol/Wasser im Volumenverhältnis
4:1.Rf = 0.75; und
bb) in Form der wäßrigen Lösung Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei etwa 305 und bei etwa 225 nm aufweist.
Nach den Ausführungen in der GB-PS13 63 075 kann man wertvolle p-Lactamase-Hemmstofie durch Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces olivaceus erhalten. Bisher hat man angenommen, daß das in dieser GB-PS 13 63 075 beschriebene Produkt im Man kann die Substanz MM 13 902 auch als Schwefel enthaltendes antibakterielles Mittel charakterisieren, dessen Salze während der Züchtung von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 erzeugt werden.
Für das als MM 13 902 bezeichnete Antibiotikum konnte nachträglich die nachstehende Formel (1) gesichert werden:
HO3SO
S-C
C—NH-CO—CH3
O CO2H
Diese Formel wird durch folgende physikochemische Eigenschaften des Dinatriumsalzes von MM 13 902 bestätigt:
A. IR-Spektrum
Das !R-Spektrum des Dinatriumsalzes von MM 13 902 weist bei 0,4 Gewichtsprozent in einem KBr-Pressling u.a. Absorptionen bei 1750, 1675, 1620 und 1280 cm-l auf, weiche jeweils der /Ϊ-Lactam-Carbonyl-Gruppe, der Amid-Carbonyl-Gruppe, dem Carboxylat-Ion und dem Sulfat-Ion zugeordnet werden können.
B. Elementaranalyse
[', Die Elementaranalyse des Dinatriumsalzes von MM t'i3 902 zeigt, daß es Natrium, Schwefel und Stickstoff im 'Verhältnis2:2:2enthält
C. PMR-Spektrum
Eine sorgfältige Analyse (einschließlich Entkoppelungsversuche) des PMR-Spektrum in Deuteriumoxid und d6-Dimethylsulfoxid zeigt, daß das Dinatriumsalz von MM 13 902 folgende Gruppierungen aufweist:
(a) (b) (C) (d) (e)
I H3C-CH-CH-CH-CH2-
I I I —ο
Π CH3-
— ΗΝ Η
Systems befindet sich bei τ = etwa 5,8 und ist an ein anderes Methinproton gekoppelt, mit einer Kopplungskonstante von etwa 4,5 Hz. Nach diesem Schema ist das X-Proton des ABX-Systems das Methinproton (d), mit einer Kopplungskonstante von etwa 4,5 Hz mit dem Methinproton (c) und Kopplungskonstanten von 9,5 bzw. 10,5 mit der Methylengruppe (e).
Das scharfe Singulett bei r = etwa 8,00 im PMR-Spektrum ist zurückzuführen auf eine isolierte, freistehende Methylgruppe, während das Paar Niederfeld-Dubletten mit Zentrum bei r = etwa 2,85 und τ = etwa 4,00 einer trans-disubstituierten olefinischen Kohlen-'stoffdoppelbindung entspricht. Die Trans-Orientierung läßt sich von der Kopplungskonstante bei etwa 14 Hz ableiten.
Das Spektrum in d6-DimethyIsulfoxid bestätigt die obigen Signale, das Niederfeld-Signal, das auf ein Proton in der trans-disubstituierten Kohlenstoffdoppelbindung zurückzuführen ist, erscheint jedoch als doppelte Dubletten mit Zentrum bei τ = etwa 3,0 und Kopplungskonstanten von etwa 14 bzw. 10 Hz. Das andere Proton in der trans-disubstituierten Kohlenstoffdoppelbindung ergibt ein Dublett mit Zentrum bei τ = etwa 4,1 und einer Kopplungskonstante von etwa 14 Hz. Zusätzlich zu diesen Signalen zeigt sich ein Dublett mit Zentrum bei τ — etwa —0,25 und einer Kopplungskonstante von etwa 10 Hz. Dies deutet darauf hin, daß im Molekül eine substituierte Enaminogruppe
40
Das Dublett mit Zentrum bei τ = etwa 8,55 ist auf die Methylgruppe (a) zurückzuführen. Entkoppeiungsversu- *che zeigen, daß die Methylgruppe an die Methingruppe
(b) gekoppelt ist, mit Zentrum bei τ = etwa 5 und einer > <> Kopplungskonstante von etv/a 7 Hz. Die Lage des Signals bei τ = etwa 5 zeigt, daß ein Sauerstoffatom an 'das Methin-Kohlenstoffatom und daß an das Sauerstoffatom eine Abschirmgruppe gebunden ist. Es kann nachgewiesen werden, daß das Methinproton (b) an eine andere Methingruppe (c) gebunden ist, und /iwar bei τ = etv/a 6,3. Die Kopplungskonstante zwischen (b) und
(c) ist etwa 9 Hz. Die Methingruppe (c) ist außerdem an eine andere Methingruppe gebunden, mit einer Kopplungskonstante von etwa 4,5 Hz.
Ein weiteres Signal des PMR-Spektrums in D2O ist ein Multiple« mit Zentrum bei τ = etwa 6,85, das auf die CH2-Gruppe (e) zurückzuführen ist Dieses Multiplett zeigt eine charakteristische Aufspaltung des AB-Teils eines ABX-Systems. Die Geminalkopplung der Methylengruppe liegt bei etwa 18 Hz, während die Einzelkopplungen der A- und B-Protonen am X-Proton bei etwa 9,5 bzw. 103 Hz liegen. Das X-Proton dieses — ΗΝ
C = C
45
vorhanden ist, mit einer Kopplungskonstante von = CH- NH von etwa 10 Hz.
D. 13C-NMR-Spektrum
Das I3-C-NMR-Spektrum des Dinatriumsalzes von M M 13 902 weist folgende 13 Absorptionen auf:
Verschiebung (ppm)
Zuordnung
178,44
172,05
C = O
Fortsetzung
Verschiebung (ppm)
Zuordnung
169,27
144,66
131,49
128,09
103,03
73,97
57,92
53,98
37,20
22,9S
19,55
C=O
C=
C =
-HC
-HC
-HC
-CH2-
CH3
Eine Summierung der unter Punkt A bis D geschilderten Fragmente ergibt, daß das Dinatriumsalz von MM 13 902 die Molekularformel CnHHN2S2O8Na2 und die der Formel I entsprechende Strukturformel besitzt.
In der Zeichnung bedeutet
F i g. 1 das UV-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 13 902 in wäßriger Lösung;
Fig.2 das IR-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 13 902;
Fig.3 das NMR-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 13 502.
Das Natriumsalz der Substanz MM 13 902 besitzt eine antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche Spezies u. a. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhi und Pseudomonas aeruginosa; und im Gemisch mit Ampicillin eine synergistische Wirksamkeit gegenüber Organismen, wie Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell.
Das reine Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 ist ein jJ-Lactamase-lnhibitor und hat den nachstehend näher erläuterten Iso-Wert zwischen 0,001 μg/ml und 0,0001 μ§/πιΙ gegenüber der /?-Lactamase von Escherichia coli B 11.
Die Substanz MM 13 902 neigt zur Instabilität, wenn sie in Form der freien Säure vorliegt. Demgemäß sind die Salze der Substanz MM 13902 bevorzugt.
Zweckmäßigerweise sind die Salze der Substanz MM 13 902 dibasische Salze. Am gebräuchlichsten werden diese Salze mit pharmakologisch verträglichen Ionen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, in üblicher Weise substituierten Ammoniumionen, und dergleichen, gebildet Besonders bevorzugte Salze sind die Alkalimetallsalze, wie die Natrium- und Kaliumsalze, z. B. das Dinatrium- oder das Dikaliumsalz.
Zweckmäßigerweise weist ein Präparat mit der
Substanz MM 13 902 und ihren Salzen gemäß vorliegender Erfindung einen Reinheitsgrad von mindestens 50 Prozent, besser von mindestens 70 Prozent und vorzugsweise von mindestens 80 Prozent, z. B. von 90 bis 100 Prozent, auf.
Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bilden Arzneimittel, die durch einen Gehalt an der erfindungsgemäßen Substanz MM 13 902 oder deren Salzen gekennzeichnet sind; gegebenenfalls können sie zusammen mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln eingesetzt wer-
jo den.
Am zweckmäßigsten enthalten die erfindungsgemäßen Arzneimittel das Natrium- oder Kaliumsalz der Substanz MM 13 902. z.B. das Dinatrium- oder das Dikaliumsalz der Substanz MM 13 902.
Derartige Arzneimittel können in Form zu einer oralen, lokalen oder parenteralen Anwendung vorliegen, z. B. können sie als Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe, rekonstituierbare Pulver und in sterilen Formen für Injektions- oder Infusionszwecke verwendet werden. Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch verträgliche Substanzen, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Geschmackstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallsmittel und dergleichen in Übereinstimmung mit der üblichen pharmazeutischen Praxis in der bei der Formulierung von Antibiotika, wie Penicillinen und Cephalosporine^ bekannter Art und Weise enthalten.
Die Substanz MM 13 902 oder ihre Salze können in den Arzneimitteln vorliegender Erfindung als einziger
so Wirkstoff oder auch zusammen mit einem 0-Lactam-Antibiotikum vorliegen. Geeignete 0-Lactam-Antibiotika umfassen solche bekannte Substanzen, die gegenüber /J-Lactamasen empfindlich sind und auch eine gewisse eigene Widerstandsfähigkeit gegen /5-Lactamasen besitzen. Beispiele derartiger /J-Lactam-Antibiotika sind Ampicillin, Amoxycillin, Benzylphenicillin, Phenoxymethylpenicillin Propicillin, Cephaloridin, Cefoxitin, Cephalothin, Cephalexin, Carbenicillin, Ticarcillin und in vivo hydrolysierbare Ester solcher Verbindungen, wie die Phenyl-, Tolyl- oder InJanylester von Carbenicillin oder Ticarcillin oder die Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder Phthalidylester von Ampicillin, Benzylpenicillin, Amoxycillin, Cephaloridin, Cephaloglycin und dergleichen.
Das Verhältnis der Substanz MM 13 902 oder ihrer Salze zu dem /J-Lactam-Antibiotikum liegt normalerweise zwischen 10:1 und 1 :10, z. B. zwischen 3 :1 und 1 :3.
Die Gesamtmenge der antibakteriellen Mittel in beliebigen Einzeldosierungen liegt normalerweise zwischen 50 und 1500 mg und gewöhnlich zwischen 100 und 1000 mg.
Bevorzugte Einzeldosierungen nach vorliegender Erfindung können einmal oder mehrere Male täglich, z. B. 2- bis 4mal täglich, zur Behandlung von Erkrankungen der Harnwege, der Atmungswege der Weichteile und dergleichen, verabreicht werden. Die Arzneimittel können zur Behandlung von Erkrankungen, wie Bronchitis, Gonorrhoe, Mittelohrentzündung, Brustentzündungen und dergleichen, verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 13 902 und ihrer Salze durch Züchten von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, ATCC 21 380, ATCC 21 381, ATCC 21 382 und ATCC 31 126 unter Bildung des {Complexes MM 4550, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung des MM 4550-K.omplexes in Fraktionen unterteilt, die ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm zeigen, und man die Substanz MM 13 902 oder ihre Salze daraus isoliert.
Der Ausdruck »ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm zeigen« bedeutet, daß entweder die einzige in dieser Lösung vorliegende antibiotische Substanz die Substanz MM 13 902 oder deren Salze ist oder daß, wenn irgendeine andere antibiotische Substanz vorhanden sein soll, dann diese Substanz in einer geringeren Menge als die Substanz MM 13 902 oder deren Salze vorhanden ist. Zweckmäßigerweise liegt die Substanz MM 13 902 oder ihre Salz in einer Menge von 70 Prozent, noch zweckmäßigerweise in einer Menge von 80 Prozent und vorzugsweise in einer Menge von 90 bis 100 Prozent in der Fraktion vor. Es ist gefunden worden, daß ein anwendbares Verfahren zur Bestimmung, welche Fraktionen hauptsächlich eine Lösung der Substanz MM 13 902 oder deren Salze enthalten, in der Überwachung des UV-Absorptionsspektrums jeder Probe liegt. Derartige Fraktionen, die ein UV-Spektrum ähnlich dem der Fig. 1 zeigen, enthalten normalerweise die Substanz MM 13 902 oder deren Salze im wesentlichen frei von anderen antibiotischen Substanzen, wie der nachstehend beschriebenen Substanz MM 4550. Gewöhnlich weisen diese Fraktionen die gewünschte Reinheit auf.
Normalerweise wird das Herstellungsverfahren zur Isolierung der Substanz MM 13 902 als dibasisches Salz angewendet. Wenn man jedoch die Herstellung eines monobasischen Salzes der Substanz MM 13 902 oder gar die freie Säure wünscht, können diese Verbindungen durch Ansäuern des dibasischen Salzes der Substanz MM 13 902 hergestellt werden, da gewöhnlich die monobasischen Salze der Substanz MM 13 902 und die freie Säure der Substanz MM 13 902 nicht in ausreichendem Maße stabil sind, um aus den Gemischen wie der nachstehend beschriebene MM 4550-K.omplex isoliert zu werden. Diese monobasischen Salze und die freie Säure sind wegen ihrer geringen Stabilität nicht leicht erhältlich.
Wie bereits ausgeführt worden ist, wird angenommen, daß die chromatographische Isolierung der Substanz MM 13 902 am besten unter Verwendung eines Salzes der Substanz MM 13 902, wie des Dinatriumsalzes, durchgeführt wird. Die Salze der Substanz MM 13 902 sind in wäßrigen Lösungsmittelsystemen löslicher als in stark lipophilen Lösungsmitteln, und demzufolge bevorzugt man die Verwendung wäßriger Lösungsmittelsysteme bei der chromatographischen Reinigung.
So haben sich annähernd neutral gepufferte wäßrige Lösungen von Elektrolyten als zweckmäßig zur Verwendung in Verbindung mit polaren Trägermaterialien, wie basischen Ionenaustauscherharzen, gezeigt. Demzufolge kann eine mittels eines üblichen Puffers, wie einem Phosphatpuffer, auf einen ungefähren pH-Wert von 7 gepufferte wäßrige Lösung von Natriumchlorid in Verbindung mit Trägermaterialien verwendet werden, die tertiäre Aminogruppen oder quartäre Ammoniumgruppen enthalten. Es ist gefunden worden, daß basische Celluloseaustauscher und basische Austauscher auf Basis vernetzter Dextrane als Trägermaterialien zv/eckmäßig sind, insbesondere ein vernetztes Dextran, das unter der Bezeichnung »QAE-Sephadex A 25« bekannt ist, wenn das Lösungsmittelsystem aus einer 0,7-m Natriumchloridlösung in einem Phosphatpuffer vom pH 7 besteht.
Es haben sich auch Lösungsmittelsysteme, die aus Gemischen von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie niederen Alkoholen, bestehen, als anwendbar in Verbindung mit inerten Trägermaterialen, wie Silikagel oder Cellulose, erwiesen. Ein besonders zweckmäßiges Lösungsmittelsystem zur Verwendung mit Cellulose ist ein Gemisch aus Wasser und Isopropanol, nämlich ein solches aus 7 Teilen Isopropanol und 3 Teilen Wasser.
Das Produkt nach den vorgenannten Verfahren unter Verwendung von lonenaustauscherharzen enthält jedoch häufig einen sehr hohen Anteil an Natriumchlorid, so daß es vorteilhaft ist, die vereinigten Lösungen zu entsalzen. Das Entsalzen kann dadurch bewirkt werden, daß man die Lösung durch eine Säule leitet, die ein lipophiles Material, an das die Substanz MM 13 902
absorbiert wird, enthält, doch die nicht Natriumchlorid adsorbiert. Zweckmäßige Säulenmaterialien sind Polystyrole, wie »Amberlite XAD 4«. Gegebenenfalls kann eine Gelfiltration unter Verwendung von Filtrier1 .Wsmitteln angewendet werden, wie vernetzte Dex>r e (»Sephadex G-25«), und Polyacrylamidgele (»Biogel P2«). Aus diesen Säulen können die Antibiotika unter Verwendung von Wasser, wäßrigem Methanol oder dergleichen, eluiert werden.
Wenn die gewünschten Lösungen nach dem vorgenannten Verfahren erhalten werden, kann man die dibasischen Salze der Substanz MM 13 902 in fester Form durch Entfernen des Lösungsmittels unter milden Bedingungen erhalten. Es wurde gefunden, daß ein geeignetes Verfahren zum Erhalten der festen Substanz im Eindampfen unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen der vereinigten, die Substanz MM 13 902 enthaltenden Fraktionen besteht.
Gewünschtenfalls kann das Herstellungsverfahren in zwei oder mehreren Stufen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Lösung des MM 4550-K.omplexes in Fraktionen aufgeteilt werden, die die Substanz MM 13 902 oder deren Salze enthalten, welch letztere mit bis zu ihrem eigenen Gewicht mit anderen Antibiotika verunreinigt sind. Die Fraktionen können gefriergetrocknet werden, um ein Material zu liefern, das z. B. zu 50 bis 60 Prozent die Substanz MM 13 902 oder deren Salz enthält, die man dann nochmals chromatographiert, um ein Material zu erhalten, das zu 90 bis 100 Prozent die Substanz MM 13 902 oder deren Salze enthält.
In vorliegender Beschreibung wird der Ausdruck »MM 4550-Komplex« verwendet, um eine Substanz zu beschreiben, die ursprünglich als Substanz MM 4550 in der GB-PS 13 63 075 bezeichnet worden ist. Der MM
4550-Komplex, wie er bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS13 63 075 erzeugt worden ist, ist ein unreines Material, das in unterschiedlichen Anteilen Salze von MM 4550 (wie zuvor angegeben) und Salze der Substanz MM 13 902 sowie erhebliche Mengen anderer Substanzen enthält. Der MM 4550-Komplex zeigt nicht das charakteristische UV-Spektrum der Substanz MM 13 902. Der nachstehend erläuterte !»-Wert des bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS 13 63 075 hergestellten MM 4550-Komplexes liegt gewöhnlich unter 0,0004 μg/ml. Das Verhältnis der Salze von MM 4550 zu den Salzen der Substanz MM 13902 in dem MM 4550-Komplex scheint in hohem Maße variabel und deshalb abhängig von solchen Faktoren zu sein, wie dem verwendeten Organismusstamm und/oder den angewendeten genauen Isolationstechniken, doch ist im allgemeinen gefunden worden, daß der Komplex mehr MM 4550 als die Substanz MM 13 902 enthält Die Herstellung des MM 4550-Komplexes wird nachstehend auch angegeben.
In der Beschreibung wird der Ausdruck »MM 4550« zur Beschreibung der im wesentlichen reinen Substanz verwendet, die eine starke 0-Lactamase-Hemmsubstanz ist und die auch einen gewissen Grad einer antibakteriellen Wirksamkeit besitzt. Die Eigenschaften von MM 4550 sind nachstehend auch näher erläutert.
Ein besonders bevorzugter Organismus zur Verwendung beim Verfahren vorliegender Erfindung ist Streptomyces olivaceus ATCC 31 126.
Der hier verwendete Ausdruck »züchten« bedeutet sorgsames aerobes Wachsen des Organismus in Gegenwart assimilierbarer Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Mineralsalzquellen. Ein derartiges aerobes Wachsen kann auf oder in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Medium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche oder submers stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt sein oder kann chemisch definiert vorliegen. Es wurden Medium gefunden, die komplexe Nährstoffe enthalten, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen, die besonders zweckmäßig sind. Es ist ferner gefunden worden, daß der Zusatz von Kobaltionen, Sulfationen und Calciumcarbonat vorteilhaft ist.
Es ist gefunden worden, daß das Züchten bei einer Temperatur von 28 ± 20C annehmbare Ausbeuten an dem Antibiotikum ergibt und daß man nach 2 bis 3 Tagen nach Beginn der Fermentation die Züchtung gewinnen kann.
Es ist gefunden worden, daß die Bestrahlung von Kulturen von Streptoniyces olivaceus ATCC 21 379 mit anschließender Isolierung des erhaltenen Stammes, Her die ausgedehnteste Aktivitätszone bei der nachstehend beschriebenen KAG-Probe zu erzeugen scheint, zur Isolierung von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 führte, der der bevorzugte Stamm zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung ist.
Für gewöhnlich sollen alle, zum Erhalten der gewünschten Antibiotika angewendeten Isolierungsund Reinigungsverfahren bei nicht erhöhten Temperaturen, z. B. unter 200C und noch zweckmäßiger nicht oberhalb 12° C, stattfinden.
Die gewünschte Substanz wird gewöhnlich in der Hauptsache aus dem Kulturfiltrat erhalten, so daß die bevorzugte Anfangsstufe bei dem Isolierungsverfahren im Entfernen festen Materials aus der Fermentationsbouillon, z. B. durch Filtrieren, ist.
Eine mit Verunreinigungen vermischte Zubereitung der Substanz MM13 902 oder deren Falze kann aus dem geklärten Kulturfiltrat erhalten werden, indem man die Substanz MM 13 902 oder deren Salze an ein aktives Material, wie Aktivkohle oder dergleichen, adsorbiert und danach die gewünschte Substanz von dem aktiven Material unter Verwendung eines Lösungsmittels, wie wäßriges Aceton, eluiert. Üblicherweise wird das Verfahren bei einem dibasischen Salz der Substanz MM 13 902 durchgeführt.
Gegebenenfalls kann man eine verunreinigte Zubereitung der Substanz MM 13902 oder deren Salze aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion unter Verwendung eines lipophilen Ammoniumsalzes und eines mit Wasser
nicht mischbaren Lösungsmittels erhalten. Dies ist häufig wirkungsvoller als das zuvor beschriebene Verfahren. (Die Substanz MM 13 902 kann auch als substituiertes Ammoniumsalz durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck
erhalten werden.) Vorzugsweise wird dann die Ausgangslösung des substituierten Ammoniumsalzes der Substanz MM 13 902 unier Verwendung einer Lrsung eines Alkalimetalljodids, wie Natriumiodid, in die wäßrige Phase zurückextrahiert. Diese letztgenannte Verfahrensvariante führt im allgemeinen zur Herstellung einer wäßrigen Lösung eines unreinen dibasischen Salzes der Substanz MM 13 902.
Streptomyces olivaceus und verwandte Organismen besitzen die nachstehenden Haupteigenschaften:
(a) Sporenbildende Luftmycele entweder in der Grau-Reihe oder in der Gelb-Reihe;
(b) die Morphologie eines Sporenträgers entweder mit rektiflexib'en Sporen oder mit Spiralen;
(c) oberflächlich glatte Sporen und
(d) keine Melanin-Bildung.
Einige diese vorstehenden Eigenschaften besitzende Spezies sind in den Tabellen V bis IX aufgeführt.
Die zuvor beschriebenen verunreinigten Formen der Substanz MM 13 902 oder deren Salze werden der vorgenannten Chromatographie unterworfen, um die reine Substanz zu erzeugen.
Iso-Bestimmung
Der !»-Wert ist diejenige Menge an Substanz, die erforderlich ist, um eine 50prozentige Hemmung der Hydrolyse von Ampicillin durch das /?-Lactamase-En-
zym von Escherichia coli BIl zu erzeugen, einem Organismus, der den die /?-Laciamase steuernden R-Faktor enthält. Diese 0-Lactamase wird als Enzym vom Typ IHa gemäß der Klassifikation von Richmond and Sykes klassifiziert (vgl. Adv. in Microbiol. Physiol. 9 (1973), S. 31).
Die Geschwindigkeit der 0-Lactamase-Hydrolyse von Ampicillin zu seiner Penicillansäure kann mittels der Jodstärke-Probe verfolgt werden, bei der man die Geschwindigkeit der Bildung von Penicillansäure durch
Entfernung des Jodstärke-Komplexes mißt Dieses Verfahren und die Herstellung der ß-Lactamase sind beschrieben in dem Aufsatz von M. Cole, S. Elson und P.D. Fuilbrook in »Biochemical Journal« 127 (1972), S. 295 bis 308. Es wird eine geringfügige Modifikation des vorgenannten Verfahrens angewendet, indem eine Probe des Inhibitors mit dem Enzym 15 Minuten bei 37° C vorbebrütet wird, bevor es dem Ampicillinsubstrat zugegeben wird. Das Verfahren ist wie folgt:
Reagentien:
Puffer
O,üj-m Kaliumphosphatpuffer vom pH 7;
Jodstärke-Lösung
hergestellt gemäß Novick in »Biochemical Journal« 83 (1962), S. 236;
Substrat
40 μg/ml Ampicillin in der Pufferlösung;
ß- Lactamase- Enzym
hergestellt aus Escherichia coli BIl gemäß CoIe und Mitarbeiter »Biochemical Journal« 127 (1972), S. 295. Ein Verdünnen der Enzymzubereitung in der Pufferlösung erfolgt derart, daß man einen Abfall der optischen Dichte-Einheiten von etwa 03 auf 100 Sekunden bei der ungehemmten Reaktion erhält. Andere /?-Lactamase erzeugende Stämme von Escherichia coli können verwendet werden, insbesondere solche, die den R-Faktor enthalten, z. B. »R TEM«.
Bedingungen
Die Reaktionen werden in einer 1 cm-Cuvette bei 37°C in einem »SP 800-Pye-Unicarrw-Spektrophotometer durchgeführt. Dieses Instrument kann 4 Probecuvetten und die entsprechenden Cuvetten für Blindversuche tragen. Die erste Cuvette wird zur Kontrollreaktion verwendet und enthält keinen Inhibitor. Die zweite, dritte und vierte Cuvette werden mit verschiedenen Verdünnungen des Inhibitors eingesetzt.
Reagentien
Jodstärke-Reagens
E. coli-jS-Lactamase
Puffer
Inhibitor des Puffers
Substrat (nach 15minütigem Bebrüten des vorstehenden Gemisches bei 370C zugegeben)
Probe Blindversuch
1,0 ml 1,0 ml
0,1 ml -
0,3 ml 0,4 ml
0,1 ml 0,1 ml
1,0 ml 1,OmI
Im Anschluß daran folgt die Aufzeichnung der Änderung der optischen Dichte bei 590 nm durch Messen der Geschwindigkeit der Reaktion als Änderung der optischen Dichte je 100 Sekunden während eines 3- bis 6minütigen Intervalls. Die Inhibitorprobe wird verdünnt, bis man eine Verdünnung erreicht, die 50 Prozent der bei der keinen Inhibitor enthaltenden Blindprobe gesehenen Reaktionsgeschwindigkeit entspricht.
Die KAG-Probe
(Klebsiella aerogenes-Penicillin G-Probe)
40
Die KAG-Probe ist eine Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von jS-Lactamase-Inhibitor in Fermentationsbouillons oder während der Isolierungsstufen. Der geschmolzene Nähragar wird bei 45°C mit einem geeigneten /i-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsiella aerogenes beimpft und dann mit einer ausreichenden Menge einer sterilen Lösung von Penicillin G vermischt, so daß man eine Konzentration von 6 μg/ml Penicillin G in dem Agar erhält Der Agar 50 Bestandteile
wird dann in eine Petrischale gegossen. Nach seiner
Verfestigung werden unter Verwendung eines Metallbohrers in gleichen Abständen zylindrische Bohrungen in die Schicht gebohrt. Dann werden in die Bohrungen die zu untersuchenden Lösungen eingebracht. Die Schale wird dann bei konstanter Temperatur zwischen 27 und 37°C bebrütet Während der Bebrütungsdauer diffundieren die Inhibitoren in der zu untersuchenden Lösung aus den Bohrungen in den Agar und hemmen dort die Wirkung der durch die Klebsiella-Zellen erzeugten /?-Lactamase. Somit wird das Penicillin G vor dem Abbau durch ß-Lactamase geschützt und liegt in ausreichender Konzentration vor, um das Wachstum von Klebsiella zu verhindern. In denjenigen Teilen des Agars, in die der Inhibitor nicht in ausreichender es Konzentration diffundiert is*, wird das Penicillin G durch die ^-Lactamase abgebaut, wodurch sich ein dichtes Wachstum von Klebsielia entwickelt. Es bilden sich somit klare Ringzonen einer Hemmung des Klebsiella-Wachstums um die den Inhibitor enthaltenden Bohrungen, wobei die Größe jeder Zone von der Inhibitorkonzentration in der zu untersuchenden Lösung abhängt. Die Stärke der Prüflösungen (in beliebigen Einheiten je ml) wird unter Bezugnahme auf die Standardlinie des Logarithmus der Inhibitorkonzentration gegenüber dem Zonendurchmesser erhalten. Diese Versuchsanordnung kann auch für eine Bioautographie verwendet werden.
Herstellung des MM 4550-KornpIexes, der mit dem in der GB-PS13 63 075 vergleichbar ist
Man züchtet Steptomyces olivaceus ATCC 21 379 7 Tage lang bei 280C auf einem festen Schrägagar in einer Röux-Flasche. Der Agar hat die folgende Zusammensetzung:
Menge (g/Liter)
Hefe-Extrakt 10,0
Glucose-monohydrat 10,0
Agar 15,0
Leitungswasser ad 1 Liter
Zur Sterilisation wird das Medium auf pH 6,8 eingestellt. 50 ml steriles entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-Sorbitan-Monooleats werden in die Roux-Flasche mit der Züchtung gegeben und dann die Sporen durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensuspension wird dann als Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmediums in einem 100 Liter fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Bestandteile
Menge (g/Liter)
Sojabohnenniehl 10,0
Glucose-monohydrat 20,0
Leitungswasser ad 1 Liter
Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml eines 10 Volumenprozent eines Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls vor der Sterilisation dem Fennentationsmedium zugesetzt.
Das Medium wird dann in dem Fermenter 20 Minuten bei 1200C durch Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit 340 UpM mittels eines Leitschaufelrührers mit 21,6 cm Durchmesser gerührt und durch eine offenendige Sprüheinrichtung mit 150 Liter steriler Luft/Minute versorgt. Das Züchtungsgefäß ist mit Prallblechen ausgerüstet. Die Temperatur wird auf 28°C eingeregelt. Nach einer 45stündigen Bebrütung unter diesen Bedingungen werden 7,5 Liter dieser Züchtungslösung als Impfstoff zu 150 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einen 300 Liter-Fermenter aus rostfreiem Stahl überführt. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (g/Liter)
Sojabohnenmehl 10,0
Glucose-monohydrai 20,0
Kreide (gefälltes Calciumcarbonat) 0,2
Kobaltchlond (CoCl2 · 6 H2O) 0,001
Leitungswasser ad 1 Liter
Zur Schaumverhinderung werden 300 ml des 10 Volumenprozent des vorgenannten Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls zugegeben. Die Fermentation wird nach 48 Stunden gewonnen und durch Zentrifugieren geklärt Die geklärte Bouillon liefert eine 50prozentige Hemmung bei der Enzymprobe bei einer Verdünnung von 1 in 100000.100 Liter der geklärten Bouillon ■-.erden mit 12 kg einer Ionenaustausch-Cellulose in der Acetatform, feucht berechnet, verrührt, wobei die Cellulose eine mikrokristalline Cellulose mit Diäthylaminoäthyl-Gruppen ist.
Nach dem Filtrieren der Aufschlämmung wird der MM 4550-Komplex mittels 12 Liter einer 0,5-m Kaliumsulfatlösung aus dem Austauscher eluiert. Das Eluat wird in einem aufsteigendem Filmverdampfer unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 300C auf 6 Liter eingeengt. Durch eine Zugabe von 12 Liter Aceton wird der grö3te Teil des Kaliumsulfats ausgefällt. Die Lösung wird filtriert und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 300C auf 200 ml eingeengt. Das Konzentrat wird auf eine Säule von 76 mm · 2 m, die mit einem nichtionischen Polystyrolharz beschickt worden ist, aufgegeben und mit entsalztem Wasser eluiert. Das Eluat wird in 140 ml-Fraktionen gesammelt Die aktiven Fraktionen, die mittels der KAG-Probe festgestellt werden, werden gesammelt (2,2 Liter) und auf 275 ml durch Ultrafiltrieren mittels einer »Amicon UM-05«-Membran von 150 mm Durchmesser unter
einem Stickstoffdruck von 4,20 kg/cm2 eingeengt Das Konzentrat wird gefriergetrocknet Man erhält 2.2 g eines brauen Pulvers vom IwWert 0,004 μg/ml.
1 g dieses Pulvers wird in 1 Liter einer 0,2-m Natriumsuifatlösung gelöst und mit 1 Liter einer 2gewichtsprozentigen Tetra-n-butylammonium-nydrogensulfat-Lösung in Dichlormethan vermischt Die Dichlormethan-Phase wird durch Absitzenlassen abgetrennt, auf -700C gekühlt zur Entfernung von Eis
ίο filtriert und dann durch Eindampfen auf 20 ml eingeengt. Zu dem Konzentrat werden 400 ml Petroläther vom Siedebereich 40 bis 600C gegeben. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in 10 ml Dichlormethan wieder aufgelöst und mit 10 ml Wasser, das 80 mg Bariumjodid
und 70 mg Bariumcarbonat enthält, extrahiert. Die Phasen werden getrennt, wobei die wäßrige Phase filtriert und auf pH 6,5 eingestellt wird. Die Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält ein gelbes Pulver. Das Pulver wird mit Aceton gewaschen, um überschüssiges
Bariumjodid auszuwaschen. Der blaßgelbe Feststoff wird wiederum durch Zentrifugieren gewonnen und dann unter vermindertem Druck getrocknet Ausbeute beträgt 13 mg und der I50-Wert 0.0004 μg/ml.
Darlegung dsr Adsorption des Kulturfiltrats
an Kohle, das zur Gewinnung des in der
GB-PS13 63 075 beschriebenen Materials
vorteilhaft ist
Das nach der vorstehenden Beschreibung erhaltene Kulturfiltrat liefert einen Zonendurchmesser von 17 mm bei einer antibakteriellen Diffusionsprobe mit Bohrungen in einer Agarplatte gegenüber Klebsieila aerogenes, einen Zonendurchmesser von 38 mm bei der KAG-Probe und einen Iso-Wert bei einer Verdünnung von 1 in 100 000. 170 Liter des geklärten Kulturfiltrats werden bei 5°C mittels eines aufwärts gerichteten Stroms durch eine Säule von 22,9 cm Durchmesser, die bis zu einer Höhe von 40,6 cm mit Aktivkohle (einer Korngröße von 0,17 bis 0,25 mm Durchmesser und vorgewaschen mit η-Salzsäure und mit Phosphatpuffer auf pH 6 eingestellt) gefüllt ist, bei einer Fließgeschwindigkeit von 800 bis 1000 ml/Minute perkoliert Die Brühe wird von der Aktivkohle mit 10 Liter entsalztem Wasser ausgewaschen, und die Säule wird bei 200C mit 20 Prozent Aceton eluiert. Die in einer Menge bis zu 10 Liter anfallenden aktiven Fraktionen werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 300C auf 6 Liter eingeengt und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 282 g eines rohen MM 4550-Komplexes mit einem Iso-Wert von 0,05 μg/ml. Die Hemmwirkung des gewonnenen Enzyms beträgt 22 Prozent
Anstelle der aktivierten Kohle liefern auch andere Aktivkohlen die gleichen Ergebnisse.
Darstellung der Chromatographie
des Kulturfiltrats an einem lonanaustauscherharz,
das zur Gewinnung des in der GB-PS13 63 075
beschriebenen Materials vorteilhaft ist
Eine Säule mit 1 cm Innendurchmesser wird bis zu einer Höhe von 6 cm (Bettvolumen 4,7 ml) mit einem lonenaustauscherharz in der Chloridform und einem Teilchendurchmesser von 03 bis 032 mm gefüllt. Das lonenaustauscherharz ist ein Polystyrol-Di vinylbenzol-Harz mit basischen Gruppen. Das Harzbett wird dann 4mal mit etwa 4,7 ml 5prozentigem wäßrigen Methanol und anschließend einmal mit etwa 4,7 ml destilliertem Wasser gewaschen. Es werden 2 Liter Kulturfiltrat
angewendet. Das Harz wird dann mit 50prozentigem wäßrigen Methanol zum Entfernen der Verunreinigungen gewaschen.
Der MM 4550·Komplex wird vom Harz mit 5 Prozent Natriumchlorid enthaltendem 50prozentigen Methanol eluiert. Die nachstehende TabrJle I zeigt die erhaltenen Ergebnisse in Wirkungseinheiten. Der MM 4550-Komplex-Gehalt des Kulturfiltrats wird willkürlich mit 8 Einheiten/ml festgesetzt. Die aus der Säule eluierten Fraktionen werden unter Anwendung der antibakteriellen Diffusionsmethode gegenüber Klebsieila aerogenes geprüft. Die Aktivitätseinheiten werden unter Bezug-Tabelle I
10 nähme auf die Standardlinie berechnet, die durch Aufzeichnen des Zonendurchmessers gegen die Einheiten/ml für verschiedene Verdünnungen des Kulturfiltrats ermittelt worden ist, d. h. daß das Kulturfiltrat als Standard verwendet worden ist
Es ist ersichtlich, daß die Säule einen wirksamen Weg zur Konzentrierung des MM 4550-Komplexes darstellt. Die Fraktionen 2 bis 5 enthalten 60 Prozent der Aktivität in einem Gesamtvolumen von nur 37 ml. Das Gesamttrockengewicht dieser Fraktionen beträgt etwa 210 mg, während 35 g Feststoffe auf die Säule gegeben worden sind.
Ergebnisse der Chromatographie an einem basische Gruppen enthaltenden Polystyrol-Divinylbenzol-Harz
Probe
pH
Kulturfiltrat
Perkolat 1
Perkolat 2
Perkolat 3
Perkolat 4
Eluat 1
Eluat2
Eluat3
Eluat 4
Eluat 5
Eluat 6
Eluat7
Eluat 8
6,5
6,9 7,0 7,0 7,0
7,8 7,8 7,7 7,7 7,6 7,5 7,6 7,6
Volumen Einheiten Insgesamt: Gesamteinheiten
(ml) (ml)
1970 8 15 760
550 <1 <100
525 <1 <100
595 <1 <100
300 <1 <100
7,0 84 588
7,0 328 2 296
8,5 440 3 740
10,0 ?20 2 200
11,5 160 1 840
11,0 80 880
14,2 66 937
20,0 33 660
13 141
Darstellung der lonenpaar- Extraktion
eines Kulturfiltrats, das zur Gewinnung des
in der GB-PS 13 63 075 beschriebenen Materials
vorteilhaft ist
248 g Natriumsulfat werden zu 10 Liter eines geklärten Kulturfiltrats gegeben, das wie vorstehend so angegeben, hergestellt worden ist. Die Lösung wird unter 30nnnütigem Rühren mit 10 Liter 2 Prozent Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat enthaltenden Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und auf 2° C gekühlt. Eine geringe Menge suspendierten Wassers wird durch Filtrieren durch ein »Whatman No, l-PS«-Papier entfernt. Dann wird die Dichlormethan-Lösung durch Eindampfen unter vermindertem Druck und einer Temperatur unter 30° C auf 20 ml eingeengt. Nach Zugabe von 400 ml eines Petroläthers vom Siedebereich 40 bis 60° C fällt eine gummiartige Substanz aus, die den MM 4550-Komplex enthält
Die gummiartige Substanz wird abzentrifugiert, in 50 ml Dichlormethan wieder gelöst und mit 50 ml Wasser, das 1 g Bariumjodid und 1 g Bariumcarbonat enthält, durch 2minütiges Schütteln extrahiert. Die vorhandenen Feststoffe werden abfiltriert, und die beiden Phasen aufgetrennt Die wäßrige Phase mit dem MM 4550-Komplex als Bariumsalz wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und gefriergetrocknet Man erhält 317 mg des rohen MM 4550-Komplexes mit einem Im-Wert von 0,001 μg/ml.
Herstellung eines teilweise gereinigten
antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an
MM 4550 und MM13 902 unter Verwendung von
Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfai
12,5 g eines wie vorstehend angegebenen hergestellten rohen MM 4550-Komplexes werden in 125 ml Wasser wieder aufgelöst und mit 125 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 10 Gewichtsprozent Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensuiiat extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und nochmals mit 100 ml Wasser, das ISO mg Natriumiodid enthält, bei 2°C unter langsamem Rühren und Einstellen der wäßrigen Phase mittels 2prozentiger Natriumbicarbonatlösung auf pH 6,4 extrahiert Die Lösung wird gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit Aceton gewaschen. Die Ausbeute beträgt 88 mg der gemischten Natriumsalze von MM 4550 und MM 13 902 mit einem I50-Wert von 0,0002 μg gegenüber der Escherichia coIi-ji-Lactarnase.
Die Gewinnung der Antibiotika beträgt 70 Prozent.
Die antibakterielle Wirksamkeit von Gemischen aus Ampicillin und der nach diesen Angaben hergestellten
Substanz wird mittels der Reihenverdünnungsmethode in einem Nähragar bestimmt. Die erhaltenen Mindesthcmmkonzentrationen sind in der Tabelle H angegeben.
Tabelle I!
Organismus
Ampicillin Ampicillin + MM 4550-Komplex bei
(allein) 0,1 pg/ml 1 μg/ttll 1
10 μg/ml
E.coliBll
E. coli JT417
E. coli JT 39
ShigeüasonneiS239
Klebsiella aerogenes A
Klebsieila aerogenes IP 282
Proteus mirabilis 889
..Proteus mirabilis 247
''Proteus morganii F
Proteus rettgeri RIlO
/Staph. aureus (Russell)
"Staph.aureus (Rüssel H)
>500
250
>500
>500
>500
>500
>500
250
>500
125
25
50
>500
125
50
125
125
500
250
500
125
5*)
12,5
5,0
25*)
50
50
25*)
25*)
0,5*)
0,5
0,5
0,5
0,25*)
0,25
*) teilweise Hemmung durch den MM 4550-Komplex allein bei diesen Konzentrationen.
Ähnliche synergistische Wirkungen werden bei Gemischen von Amoxyc'illin und dem MM 4550-Komfplex beobachtet.
Herstellung eines teilweise gereinigten
antibiotischen Komplexes mit MM 4550 und MM 13 902 .. unter Verwendung von
ί Cetyl-dimethylbenzyi-ammoniumchlorid
Das vorstehend aus der Aktivkohlesäule mit Aceton und Wasser eluierte gefriergetrocknete Produkt mit dem I5o-Wert von 0,02 μg/ml wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 13 mg/ml gelöst. Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.
100 ml dieser Lösung werden mit dem gleichen Volumen Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,1 Prozent Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid extrahiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt. Die organische Phase wird nochmals mit 100 ml einer 0,05prozentigen Natriumjodidlösung extrahiert Die Phasen werden aufgetrennt, und Dichlormethan in der wäßrigen Phase wird entfernt, indem die Lösung 10 Minuten unter vermindertem Druck gehalten wird.
Die wäßrige Lösung wird gefriergetrocknet Das gefriergetrocknete Produkt wird 3mal mit je 50 ml Aceton gewaschen. Das mit Aceton gewaschene Produkt wird unter vermindertem Druck im Trockenschrank getrocknet. Man erhält 4,3 mg eines schwachbraunen Pulvers mit einem 150-Wert von 0,002 μg/m!.
Herstellung eines teilweise gereinigten
antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an
MM 4550 und MM 13 902
unter Verwendung der Gelfiltration
1 g des vorstehend hergestellten rohen MM 4550-Komplexes mit dem Im-Wert von 0,2 μg/ml wird an einem vernetzten Dextran chromatographiert und unter Verwendung eines Gemisches von Aceton und Wasser im Volumverhältnis von 4:6 eluiert. Die Säulenabmessungen betragen 24 cm · 32 cm. Die Eluierung wird mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/Minute durchgeführt Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 300C eingeengt und schließlich gefriergetrocknet Man erhält 22 mg eines amorphen gelbbraun gefärbten Feststoffes mit einem I5O-Wert von 0,005 μg/ml. Die Ausbeute beträgt 88 Prozent und die Reinigung 4Ofach.
40
45
Herstellung eines gereinigten antibiotischen
Komplexes mit MM 4550 und MM 13 902 unter
Anwendung einer Chromatographie an Cellulose
610 mg des vorstehend hergestellten MM 4550-Komplexes werden an einer Säule von 2,5 cm · 32 cm mit einer Füllung von Cellulose vom Typ »Whatman CC 31« chromatographiert. Die Säule wird mit einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis von 7:3 mit einer Geschwindigkeit von 15ml/Minute
. eluiert. Die antiDakteriell wirksamen Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30°C eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 40 mg eines amorphen braunen Feststoffes eines antibiotischen Komplexes mit einem i5o-Wert von 0,00007 ^g/ml. Der sehr kleine I50-Wert zeigt an, daß die aktive Substanz eine verbesserte Reinheit besitzt
Bei einer Wiederholung der Verfahrensschritte erhält man eine Substanz mit einem Is0-Wert von 0,001 μg/ml. Diese Substanz besitzt eine antibakterielle Wirksamkeit gemäß der Tabelle III, wenn sie mittels der Standard-Mikrotiter-Methode in einer OxokJ-Empfiridlichkeits-Bouillon unter Verwendung schwacher Impfstoffe (1 Prozent einer über Nacht stehengelassenen Bouillon) bestimmt wird.
Tabelle Hl
Antibakterielle Wirksamkeit eines Gemisches von
MM 4550 und MM 13 902 mit einem I50-Wert von
0,001
Organismus
Mindesthemmkonzen (ration in |ig/ml
Staphylococcus aureus (Oxford) 7,5
Staphylococcus aureus (Russell) 7,5
Streptococcus fwcalis 125
Bacillus subtilis 0,9
Escherichia coli (10 418) 3,7
Escherichia coli (B 11) 15
Klebsiella aerogenes 1,8
Enterobacter cloacae 62
Proteuc mirabilis 7,5
Providentia stuartii 7,5
Acinetobacter anitratus 0,9
Pseudomonas aeruginosa 250
Serratia marcescens 7,5
Salmonella typhimurium 15
Shigella sonnei 7,5
Die Substanz MM 4550
Die Substanz MM 4550 kann durch ihre nachstehenden Eigenschaften erkannt werden:
Die Substanz MM 4550 ist ein saurer Feststoff, der in Form des Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften aufweist:
(1) er ist leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;
(2) in wäßriger Lösung besitzt er ein charakteristisches Ultraviolett-Spektrum mit Absorptionsmaxima bei etwa 238 nm und etwa 287 nm;
(3) wenn er zu 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch zubereiteten KBr-Platte vorliegt, hat er ein charakteristisches Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei etwa 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 und 1260 cm-·. Wenn nach etwa 1 Woche seit der Herstellung der KBr-Platte nochmals ein Spektrum aufgenommen wird, zeigt es beträchtliche Änderungen, z. B. wird das zuvor breite Maximum bei etwa 1765cm~' beträchtlich abgebaut oder ist verschwunden;
(4) die Substanz besitzt ein charakteristisches NMR-Spektrum, wenn es in deuteriertem Wasser aufgenommen wird. Dieses Spektrum besitzt u. a.
(a) ein Paar Niederfeld-Dubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,45 t und 3,65 ν mit Kopplungskonstanten bei etwa 15 Hz,
(b) ein Dublett mit dem Zentrum bei etwa 8,55 τ und
(c) ein scharfes Singulett bei etwa 7,95 r;
(5) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose weist die Substanz bei den nachstehenden Lösungsmittelsystemen die sehr angenäherten Rf-Werte auf:
(a) Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7:7:6, einen Rj-Wert von 0,6;
(b) Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7 :3, einen Rr- Wert von 0,7;
(c) n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumverhältnis 7 :7 :6, einen Rt- Wert von 0,7 und
(d) n-Propanol/Wasser im Volumverhältnis 4 :1,
einen Rf-Wert von 0,6;
(6) die Substanz besitzt eine antibakterielle Wirksam-ίο keit gegen zahlreiche Spezies, u. a. gegen Stämme von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens und Shigella sonnei;
(7) die Substanz besitzt eine Enzymhemmwirkung gegen die von zahlreichen Spezies erzeugte /?-Lactamase, u.a. Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Staphylococcus aureus. Sie besitzt einen !»-Wert von unter 0,0001 μg/ml gegen die /f-Lsctamase von Escherichia coli BIl;
(8) wenn die Substanz mii Ampicillin vermischt wird, weist sie eine synergistische Wirksamkeit gegen Organismen auf, wie Stämme von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morgana und Staphylococcus aureus Russell;
(9) die Aminosäuren-Analyse zeigt, daß die Substanz kein Polypeptid oder Protein ist. Nach saurer Hydrolyse findet man keine «-Aminoadipinsäure;
(10) die Substanz reagiert mit Ehrlich-Reagens (300 mg 4-Dimethylaminobenzaldehyd gelöst in einem Gemisch von 54 ml n-Butanol, 9 ml Äthanol und 9 ml konzentrierter Salzsäure), wobei eine blaue Farbe auf dem Papierchromatogramm und auf den Folien des Dünnschichtchromatogramms erzeugt wird;
(11) die Substanz ist kein allgemeines Enzymgift und hemmt nicht die nachstehenden Enzyme bei Konzentrationen, die im Überschuß gegenüber der zur Hemmung der j?-Lactamase von Escherichia coli, Monamin-oxidase, Carbonsäure-anhydrase, Dopadecarboxylase, Trypsin, Chymotrypsin oder Urease erforderlich ist.
Beispiel 1
Herstellung des MM 4550-Komplexes und Auftrennung in die Substanzen MM 4550 und MM 13 902
Die vorstehend irr einzelnen ausgeführten Isolierungsverfahren können bei ihrer Anwendung in verschiedener Weise aufeinanderfolgen. Eine besonders zweckmäßige Reihenfolge ist die Adsorption an Kohle, die Ionenpaar-Extraktion und die Chromatographie an Cellulose, wie es nachstehend beschrieben wird:
Liter des vorstehend erhaltenen Kulturfiltrats werden in aufsteigender Richtung mit einer Geschwindigkeit von 800 bis 1200 ml/Minute durch eine Säule von 22,9 cm Durchmesser und 533 cm Höhe, die mit Aktivkohle gefüllt war, perkoliert. Die Aktivkohle ist zuvor zur Adsorption des MM 4550-Komplexes verwendet worden und anschließend durch Waschen mit folgenden Reagentien regeneriert worden:
0,5-n Natronlauge;
O^-n Natronlauge/Aceton im Verhältnis 3:2;
Wasser;
«-Salzsäure;
Wasser;
Phosphatpufferlösung vom pH 6 und Wasser.
Die Säule wird mit 20 Liter Wasser gewaschen, um das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann durch Abstrom mit einem Gemisch von Aceton und Wasser im Volumverhältnis 2:8 mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 250 ml/Minute eluiert. Das Eluat wird in
1 Liter-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen mit einem Gehalt an dem MM 4550-Kornplex, der durch die antibakterielle Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebsieila aerogenes bestimmt worden ist, werden vereinigt (11 Liter) und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 300C auf ein Volumen von 5,5 Liter eingeengt. Die Gewinnung an MM 4550-Komplex bei dieser Stufe beträgt 20 Prozent.
Das Konzentrat wird auf 2° C gekühlt und dann mit 5,5 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 2 Gewichtsprozent Tetra-n-butylammonium-hydrogensulfat bei -50C versetzt. Die beiden Phasen werden
2 Minuten miteinander vermischt. Dann wird die Dichlormethan-Phase abgetrennt und bei 00C zu 1 Liter einer 0,6prozentigen Natriumjodidlösung gegeben. Die beiden Phasen werden langsam miteinander verrührt, und die wäßrige Phase wird allmählich mittels einer 2prozentigen wäßrigen Bicarbonatlösung auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 eingestellt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumiodid zu lösen. Das Aceton wird vom unlöslichen Rückstand unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 1,1 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-Komplex in dieser Stufe beträgt 10 Prozent. Die auf die gelösten Gesamtfeststoffe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 125fach.
Eine Säule von 2,5 cm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältns von 7 :3 bis zu einer Höhe von 32 cm beschickt. 500 mg des gelbbraunen Pulvers werden in 2 ml eines Gemisches von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis 7 :3 gelöst und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute chromatographiert. Es werden 3 ml-Fraktionen aus der Säule gesammelt. Diejenigen mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm werden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält den MM 4550-Komplex. Frühere Untersuchungen haben ergeben, daß die bei 285 nm absorbierenden Fraktionen eine enzyminhibierende, antibakteriell wirksame Substanz enthalten. Die Ausbeute an dem gefriergetrockneten MM 4550-Komplex beträgt 35 mg der ein amorphes braunes Aussehen und einen !»-Wert von 0,0001 μg/mI besitzt Die Gewinnung der aktiven Substanz bei dieser Stufe beträgt insgesamt 3 Prozent und die Reinigung insgesamt ist 600fach.
Die antibakterielle Wirksamkeit dieser Substanz wird mittels der Standard-Mikrotiter-Methode bei der Oxoid-Empfindlichkeits-Testbouillon unter Verwendung eines schwachen Impfstoffes bestimmt Die erhaltenen Mindesthemmkonzentrationen sind denjenigen in der Tabelle IH beschriebenen ähnlich.
Eine Analyse der Substanz mittels Dünnschichtchromatographie an Cellulose, wobei mit einem Gemisch von n-Butanol-Isopropanol-Wasser im Volumverhältnis 7:7:6 entwickelt wird, liefert eine Auftrennung in zwei aktive Substanzen, von denen die eine einen Rf-Wert von annähernd 0,58, der die Substanz MM 4550 anzeigt und die andere mit einem Rr-Wert von annähernd 0,72 aufweisen, was die Substanz MM 13902 anzeigt. Diese beiden Substanzen werden durch Bioautographie an verschiedenen Organismen bestimmt, z. B. Bacillus subtilis. Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (penicillinresistent), Escherichia coli (penicilunempfindlich und penicillinresistent), Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Klebsieila aerogenes. Einige der erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV zusammengefaßt.
Bei einem weiteren Versuch werden die beiden Substanzen auf einer Cellutosedünnschicht getrennt, die mit einem Gemisch von Isopropanoi und Wasser im Verhältnis 8 :2 entwickelt worden ist, und dann aus der Cellulose mittels Phosphatpuffer extrahiert Jeder Extrakt wird auf eine 0-Lactamase-Hemmung geprüft Beide Substanzen zeigen, daß sie Inhibitoren der Escherichia coli-.ß-Lactamase sind. Beide Substanzen zeigen auch, daß sie mit Benzylpenicillin gegenüber Klebsieila aerogenes synergistisch wirken.
Tabelle IV
Antibakterielle Wirksamkeit von MM 4550 und MM 13 902, bestimmt durch Bioautographie (Dünnschichtchromatographie mit Cellulose und Butanol/lsopropanol/ Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6)
Organismus
Zor.endurchmesser bei Bioautographie
MM 4550-Zone in MM 13 902-Zone in
mm bei Rf = 0,58 mm bei Rf = 0,70
Klebsiella aerogenes 20,0 mm 20,0 mm
Proteus mirabilis 17,5 mm 13,5 mm
Proteus morganii 16,0 mm 9,5 mm
Salmonella typhi 19,5 mm 21,0 mm
Escherichia coli 10 418 20,0 mm 13,5 mm
Escherichia coli BIl 17,5 mm 10,5 mm
Enterobacter aerogenes 6,5 mm keine Zone
Staphylococcus aureus (Oxford) 13,0 mm 4,0 mm
Staphylococcus aureus (Russell) 12,0 mm 4,0 mm
Bacillus subtilis 24,0 mm 15,0 mm
Beispiel 2
Herstellung des MM 4550-Komplexes
und Auftrennung in die Substanz
MM4550 und in die Substanz MM 13 902
1100 Liter Kulturfiltrat aus der Fermentation von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 werden bei einem pH von 6,5 und bei 5° C mit einer Geschwindigkeit von 3,2 Liter/Minute durch eine mit granulierter Aktivkohle gefüllten Säule von 03 ■ 1 m perkoliert. Die Aktivkohle ist bereits einmal zur Adsorption des MM 4550-Komplexes verwendet, aber vor Anwendung durch Waschen mit den nachstehenden Mitteln regeneriert worden:
0,5-n Natronlauge;
0,2-n eines Gemisches von Natronlauge
und Aceton im Verhältnis 3 :2;
Wasser;
n-Salzsäure;
Wasser;
Phosphatpuffer vom pH 6 und
Wasser.
Die Säule wird mit 60 Liter Wasser gewaschen, um das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann mit einem Gemisch aus Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 2 :8 bei 3O0C mit einer Geschwindigkeit von 1,1 Liter/ Minute eluiert. Es werden 60 Liter aufgefangen, gefolgt von 5 10-Liter-Fraktionen. Diese Fraktionen, die den MM 4550-Komplex enthalten, wie sich mittels der antibakteriellen Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebsiella aerogenes bestimmen läßt, werden vereinigt (40 Liter) und unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 300C auf 32 Liter eingeengt. Die Gewinnung des MM 4550-Komplexes in dieser Stufe beträgt 15 Prozent
Das Konzentrat wird auf 5" C gekühlt und dann bei 5° C mit 16 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetyl-dimethylbenzyl-ammoniumchlorid versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und bei 5°C mit 3,75 Liter einer Natriumjodidlösung versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt Dann wird die wäßrige Phase abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit wasserfreiem Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumiodid herauszulösen. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,87 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-Komplex dieser Stufe beträgt 6 Prozent. Die auf die gelösten Gesamtfeststoffe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 160fach.
Eine Säule mit 63 mm Durchmesser wird mit Mikrocellulosepulver in einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser im Volumenverhältnis 7 :3 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. 2,0 g des gelbbraun gefärbten Pulvers werden in 5 ml eines Gemisches von Isopropanol und Wasser im Volumenverhältnis 7 :3 gelöst und dann in dem gleichen Lösungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute Chromatographien. Die Fraktionen, die den MM 4550-Komplex enthalten, wie durch eine Probe gegenüber Klebsiella aerogenes bestimmt worden ist, werdenvereinigt, durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30° C eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 207 mg eines braunen Feststoffs. Die Gewinnung des MM 4550-Komplexes in dieser Stufe beträgt
51 Prozent, und die Reinigung ist 5fach.
Eine Säule mit 16 mm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von n-PropanoI und Wasser im Volumenverhältnis 4 :1 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. Dann werden 198 mg des braunen Feststoffes in einem Gemisch von Wasser und n-Propanol im Volumenverhältnis 1 :1 gelöst und in einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis von 4:1 mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute chromatographiert Es werden 6-ml-Fraktionen gesammelt, die gegen Klebsiella aerogenes geprüft werden. Es werden auch bei jeder Fraktion die UV-Spektren gemessen. Die Fraktionen Nr. 23 bis Nr. 28 mit einem UV-Maximum bei etwa 305 nm enthalten das Dinatriumsaiz der Substanz MM 13 902. Diese Fraktionen werden vereinigt unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet Man erhält 30 mg eines Feststoffes. Diese Substanz zeigt lediglich eine einzige Zone von antibiotischer Wirksamkeit bei einem Rf-Wert von 0,77 bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Celluloseplatten mit einem Gemisch aus n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4:1. Die Zone wird mittels Bioautographie an Bacillus subtilis bestimmt. Die Fraktionen Nr. 29 bis Nr. 40 mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm enthalten die Substanz MM 4550. Diese Fraktionen werden ebenfalls vereinigt unte-- vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 53 mg eines Feststoffes, der ein Salz der Substanz MM 4550 enthält, das mit einer geringen Menge des Salzes der Substanz MM 13 902 verunreinigt ist.
Organismen
Die Eigenschaft, den MM 4550-Komplex zu erzeugen, ist zuerst in den Kulturen der Stämme ATCC 21 379, ATCC 21380, ATCC 21381 und ATCC 21 382 festgestellt worden, die aus Bodenproben isoliert worden sind, die man aus Spanien, Neusee'a·" Südafrika und Israel erhalten hat. Im Laboratorium scheinen diese Kulturen identisch zu sein, und sie wurden sämtlich als Streptomyces olivaceus identifiziert, wobei die 1967 weltweit anerkannte Klassifikation von Hütter (»Systematik der Streptomyceten«, S. Karger, Basel, S. 382 ff.) verwendet worden ist Eine MM 455Ö-Erzeugung ist bisher bei anderen Sireptomyces Spezies gefunden worden, wie dies aus Tabelle IV ersichtlich ist
Streptomyces olivaceus ist zuerst von Waksman 1919
so beschrieben worden (vgl. »Cultural Studies of Species f >f Actinomyces« Soil. Sei. 8 S. 71 bis 215). Anschließend hat im Jahre 1960 eine Gruppe von russischen Forschern eine Spezies mit sehr ähnlichen Eigenschaften beschrieben, doch ist sie als Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis bezeichnet worden (vgl. Kuchaeva und Mitarbeiter, Trud. Inst. Mikrobiol., Akad. Nauk. SSSR. 8 (1960), S. 226 bis 253).
Die Mikroorganismen der Gattung Streptomyces sind außerordentlich variabel in ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaften in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter denen sie wachsen. Beschreibungen von zahlreichen Spezies sind veröffentlicht worden, bevor die Existenz dieser außerordentlichen Veränderlichkeit erkannt worden ist, mit der Folge von Duplikationen und Synonyma. Hütter (1967) führt 25 Spezies auf, die mit Streptomyces olivaceus synonym sind, einschließlich Streptomyces fulvoviridis. Um diese Verwirrung bei der Nomenklatur und der Klassifikation
zu lösen, ist 1962 ein »International Streptomyces Project« begonnen worden (vgl. Shirling und Mitarbeiter, Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (1968), S. 69 bis 189). Mitarbeiter an diesem Projekt haben eine Reihe von Studien durchgeführt, die bei der Erstellung genauer Beschreibungen der Spezies von Streptomyces unter Standardbedingungen hilfreich sind In diesem Schema sind Standardbeschreibungen von typischen Stämmen von über 400 benamten Spezies aufgenommen worden, einschließlich Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis.
Die I. S. P.-Beschreibung von Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvovirid'is unterscheidet sich nur in zwei Eigenschaften:
,(a) In Form der Sporenträger und
(b) der Fähigkeit, Inosit als einzige Kohlenstoffquelle zu spalten.
Streptomyces olivaceus wird wie folgt beschrieben:
Sporenkettenmorphologie: Sektion Spiralen, mit offenen Spiralen, die allmählich in gekrümmte Sporenketten übergehen, die Sektion rektiflexible Sporen andeutend. Die reifen Sporenketten sind gewöhnlich •lang, häufig mit über 50 Sporen je Kette.
Kohlenstoff quellen: D-GIucose, L-Arabinose, D-Xylose. 1-lnosit. D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose werden für das Wachstum benötigt Auf Saccharose und Raffinose findet kein Wachstum oder nur ein spurenweises Wachstum statt.
Streptomyces fulvoviridis wird wie folgt beschrieben:
Sporenkettenmorphologie: Sektion rektiflexible Sporen. Die reifen Sporenketten sind mäßig kurz mit 10 mit 50 Sporen je Kette. Kohlenstoffquellen: D-Glucose, L-Arabinose. D-Xylose, D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose werden für ein Wachstum benötigt. Die Spaltung von Saccharose ist zweifelhaft. Auf I-Inosit oder Raffinose findet kein Wachstum oder nur spurenweises Wachstum statt.
Die Charakterisierung einer Anzahl von Kulturen, die als Streptomyces olivaceus oder Streptomyces fulvoviridis und andere verwandete Spezies benannt oder dami! synonym sind, werden unter Anwendung von Standardmethoden und Mitteln, wie sie in dem »International Streptomyces Project« (I. S. P.) empfohlen worden sind, bestimmt (vgl. Shirling und Mitarbeiter, Int. J. Syst Bacteriol. 16 (1966), S. 313 bis 340).
Die Kulturen leiten sich von verschiedenen Quellen ab. Die Stämme ATCC 21 379.21 380,21 381 und 21 382 wurden aus Bodenproben auf der Basis isoliert, den MM 4550-Komplex zu erzeugen. Die anderen Stämme wurden aus zahlreichen Kultursammlungen für Vergleichszwecke erhalten.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Erzeugung des M M-4550-Komplexes, der Farbe des Luftmycels.die Gestalt der Sporenträger, die Farbe des Mycelsubstrats, lösliche Pigmenterzeugung, Melaninerzeugung und Spaltung von Kohlenstoffquellen sind in den Tabellen IV bis VIII angegeben. Bei allen Stämmen ist die Sporenoberfläche bei Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop glatt.
Aus der I. S. P.-Beschreibung ist es offensichtlich, daß das Spiralenwachstum des Sporenträgers bei Streptomyces olivaceus von unterschiedlichem Charakter ist. Echte Spiralen werden mit unterschiedlicher Häufigkeit bei den typischen Spezies von Streptomyces olivaceus beobachtet, nämlich bei ATCC 3335. Die Mehrzahl der Sporenträger ist lang. Keine echten Spiralen werden bei Kulturen der Spezies ATCC 21 379,21 380,21 381 oder 21 382 beobachtet, obwohl die Sporenträger lang sind und die Neigung zu Spiraien bei einem Hintergrund der rektiflexiblen Arten zeigen. Jedoch bei zwei Streptomyces olivaceus-Stämmen, nämlich NCIB 8238 und NCIB 8509, ist die Mehrzahl der Sporenträger von der rektiflexiblen Art. Beim Stamm NCIB 8230 sind sie mäßig lang, während sie beim Stamm NCIB 8509 lang sind.
Die bei dem Stamm ATCC 15 863 beobachteten Sporenträger, einer typischen Spezies von Streptomyces fulvoviridis, sind kurzer als die von den isolierten Stämmen ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 und 31 126 und stellen lediglich rektiflexible Arten dar. Im Hinblick auf diesen Charakter entsprechen deshalb die isolierten Stämme ATCC 21 379, 21 380, 21 381. 21 382 und 31 126 ziemlich gut, jedoch nicht genau der Beschreibung von Streptomyces olivaceus.
Die reinen Stämme ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 und 31 126 zeigen eine gewisse Variabilität im Hinblick auf die Inositspaltung die ein anderes Unterscheidungsmerkmal gemäß den I. S. P.-Typenbeschreibungen der Spezies zwischen den Spezies Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis sind (vgl. Tabelle VIII). Die Stämme ATCC 31 126 und ATCC 21 380 spalten Inosit, was für Streptomyces olivaceus charakteristisch ist, während die anderen Stämme eine zweifelhafte oder eine negative Spaltbarkeit zeigen. Es wird jedoch nicht als allgemein zufriedenstellend betrachtet, eine Spezies aufgrund seiner Fähigkeit, ein einzelnes Kohlehydrat zu spalten, auseinanderzuhalten. Solch ein Unterschied kann durch eine einzige Genmutation hervorgerufen werden und wird häufig lediglich als Stamnisignifikanz betrachtet. Der Unterschied bei der Zuckerspaltbarkeit bei den Streptomyces olivaceus-Stämmen NCIB 8138, NClB 8509, ATCC 21 549. ATCC 12 019 und ATCC 3335 deutet darauf hin, daß zahlreiche Fachleute sie nicht als signifikantes Merkmal dieser Spezies betrachten. Demzufolge werden die Stämme ATCC 21 379, 21 380, ίο 21 381, 21 382 und 31 126 mit Recht als Streptomyces olivaceus bezeichnet
Die Untersuchung der Kulturfiltrate der Stämme von Streptomyces olivaceus und der verwandten Spezies hinsichtlich der Erzeugung des MM 4550-Komplexes kann wie folgt durchgeführt werden:
Kulturfüiraie der aufgeführten Stämme werden auf Papierstreifen (Whatman No. 1) in einer Menge von 20 μίηβΓ je Ausgangslösung getüpfelt und über Nacht in der Kälte mit einem Gemisch von n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 Chromatographie«. Ein anderer Satz Streifen wird ebenfalls über Nacht in der Kälte mit einem Gemisch von n-Butanol/ Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 12:3:5 Chromatographien. Gleichzeitig läuft eine teilweise gereinigte Probe des MM 4550-Komplexes in den beiden Systemen als Markierungsmittel mit.
Es ist gegebenenfalls möglich, 25 ml der geklärten Bouillon mit 12,5 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetylbenzyl-ammoniumchlorid zu extrahieren, die Phasen zu trennen, die organische Phase beizubehalten und diese mit 2,5 ml einer 0,5prozentigen Natriumjodidlösung zu versetzen, die Lösung zu schütteln, in Phasen aufzutrennen, die wäßrige Phase beizubehalten und diese chromatographisch zu verwenden, indem z. B. 5 μ auf die Dünnschichtchromatographie-Streifen getüpfelt werden, und diese sich in einem Gemisch von n-Butanol/Isopropano!/Wasser im Volumenverhältnis 7 :7 :6 entwickeln.
27
28
Tabelle V
Vermögen der Kulturen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies, den MM 4550-Komplex zu erzeugen
Kultur
Streptomyces olivaceus
Streptornyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces plivaceus
Streptomyces favovirens
Streptomyces flavus
Streptomyces fulvoviridis
Streptomyces argenteolus
Streptomyces sioyaensis
Streptomyces lipmanii
ATCC 21 379 ATCC 31 126 ATCC 21 380 ATCC 21 381 ATCC 21 382 NClB 8 238 NCIB 8 509 ATCC 3 320 ATCC 3 369 ATCC 15 863 ATCC 11 009 ATCC 13 989 NRRL 3 584
MM 4550-Komplex-Erzeugung
(Streptomyces olivaceus ATCC 21 549, ATCC 12 019 und ATCC 3355 erzeugen keinen MM 4450-Komplex; der Stamm ATCC 15 863 wird auch als hinterlegter Stamm RIA 660 bezeichnet.)
Tabelle VI
Farbe und Morphologie des reifen sporenbildenden Luftmycels von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies auf ISP-Medien nach Htägigem Wachstum
' Kultur
SS
YM
GA
OM
Morphologie des Sporenträgers (mittlere Größe)
ATCC 21379 grau grau grau-weiß grau lange RF
ATCC 31 126 grau-braun grau-braun grau grau lange RF
ATCC 21380 grau grau grau grau lange RF
ATCC 21381 grau grau blaß-grau grau-weiß lange RF
ATCC 21382 grau-weiß grau grau grau lange RF
NCIB 8 238 grau-weili grau grau grau mittlere RF
NCIB 8 509 grau grau grau grau lange RF
ATCC 21549 grau grau grau grau lange S
ATCC12 019 grau grau grau grau lange RF/S
ATCC 3 335 grau grau grau grau lange RF/S
ATCC15 863 grau-weiß grau grau-weiß grau mittlere RF
ATCC 3 320 grau-blau grau grau-grün grau lange RF
ATCC 3 369 grau grau grau blaß-grau-braun mittlere RF/RA
ATCC11009 blaß-grau grau-braun grau-weiß grau-grün mittlere RF/RA
ATCC13 898 weiß-grau weiß weiß-gelb grau-weiß kurze S
SS = Anorganische Salze - Stärkeagaf (ISP-Medium Nr. 4). YM = Hefe-Extrakt - Malz-Extrakt-Agar (ISP-Medium Nr. 2). GA = Glycerin - Asparaginsäure-Agar (ISP-Medium Nr. 5). OM = Hafermehl-Agar (ISP-Medium Nr. 3).
RF = rektiflexible Sporen.
RA >= retinaculiaperte Sporen.
S = Spiralen.
29
30
Farbe des Substrats und des Myce's von der Rückseite gesehen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies
Kultur
SS
YM
GA
OM
ATCC 21 379 oliv ohvbraun grau-braun olivgrün
ATCC 31126 olivbraun olivbraun braun olivbraun
ATCC 21 380 oliv olivgrün olivgrün olivgelb
ATCC 21 381 dunkelbraun dunkelbraun olivgrün olivgrün
ATCC 21 382 oliv oliv braun olivgrün
NCIB 8 238 braun oliv-braun braun olivgelb
NCIB 8 509 braun oliv olivbraun olivgelb
ATCC 21 549 braun-gelb-schwarz braun-schwarz braun-schwarz braun-gelb-grau
ATCC 12 019 braun-gelb braun-gelb braun-gelb braun-gelb
ATCC 3 335 braun braun braun grau
ATCC 15 863 braun-grau dunkelbraun < olivbraun olivgelb
ATCC 3 320 gelb-braun oliv-braun oliv-braun orange-braun
ATCC 3 369 braun-gelb-grau gelbbraun braun-gelb-grün gelb
ATCC 11 009 schwarz schwarz-gelb schwarsrgelb grau-grün
ATCC 13 989 orange gelb gelb farblos
Tabelle VIII
Erzeugung von Pigmenten in Kulturmedium durch Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Spezies
Kultur
Lösliche nicht-melanoide Pigmente SS YM
OM
Melanih-
Erzeu-
gung*)
schwach gelb
schwach braun
schwach braun
schwach braun schwach braun
schwach gelb
schwach rotbraun schwach braun
ATCC 21 379
ATCC 31J 26 ATCC 21 380 ATCC 21 381 ATCC 21 382 NCIB 8 238
NICB 8 509 ATCC 21 549
ATCC 12 019 ATCC 3 335 ATCC 15 863 ATCC 3 320
ATCC 3 369 -
ATCC 11009 - +
schwach braun
ATCC 13 989 +
schwach orange
+ = Pigment erzeugt. - = Pigment nicht erzeugt.
*) Untersucht auf einem Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP6), Tyrosin-Agar (ISP17) und in einer Trypton-Hefe-Kulturlösung (ISP1).
schv/ach rosa
Tabelle IX
Spaltung von Kohlenstoffquellen durch Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Spezies
Kultur
Rhamnose
Ra(Tinose
Suprose Inosit Glucose Xylose Fructose Mannit Arabin.ose
ATCC 21 379 +
ATCC 31 126 + - -
ATCC 21 380 + - -
ATCC 21 381 + - -
ATCC 21 382 + + -
NCIB 8 238 + - -
NCIB 8 509 + ± -
ATCC 21 549 - -
ATCC 21 019 + ± +
ATCC 3 335 + - ±
ATCC 15 863 + - -
ATCC 3 320 + - ±
ATCC 3 369 + - ±
ATCC 11 009 + - -
ATCC 13 989 -1-
35
+ = die Verbindung wird gespalten;
- = die Verbindung wird nicht gespalten;
± = die Spaltung ist zweifelhaft oder sehr schlecht.
Beispiel 3
Das bevorzugte Isolierungsverfahren zur Herstellung der Substanz MM 13 902
Ein Vorrat von Sporen von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 wird in Röhrchen mit trockenem Boden in einem geschlossenen Behälter mit einem Trockenmittel bei einer Temperatur von 200C auf Lager gehalten. Eine ao geringe Menge der Bodenprobe (etwa 20 mg) wird aseptisch in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 100 mg des folgenden Mediums enthält:
45
Bestandteile Menge (g/Liter)
Glucose-monohydrat 20,0
Sojabohnenmehl 10,0
Entsalztes Wasser ad 1 Liter
50
Vor dem Sterilisieren wird der pH auf 6,5 eingestellt.
Der Kolben wird etwa 30 Stunden bei 28° C auf einem Rotationsschüttler, der sich mit 240 UpM dreht, bebrütet 2 ml der erhaltenen vegetativen Anzucht werden, dann zur Überimpfung auf einen festen Schrägagar in einer Roux-Flasche verwendet Der Schrägagar hat die folgende Zusammensetzung:
Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt
Die Beimpfung erfolgt über die gesamte Agaroberfläche durch Schütteln der Flasche, die dann aufgerichtet bei 300C bebrütet wird. Nach 2tägiger Bebrütung wird überstehende Flüssigkeit der Flasche mittels einer Pipette abgezogen und die Bebrütung weitere 4 Tage fortgesetzt
Es äst früher gefunden worden, daß eine Entwicklung von Actinophagen in der Schrägkultur unterdrückt wird, wenn man sich dieses Herstellungsverfahren der Kultur in der Roux-Flasche zu eigen macht.
Zu der Kultur in der Roux-Flasche werden dann 50 ml sterilisiertes, entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleats zugegeben. Die Sporen werden durch Schütteln suspendiert Diese Sporensuspension wird dann als . Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmediums in einem 100-Liter-Fermentor aus rostfreiem Stahl gegeben. Die Zusammensetzung des Nährmediums lautet wie folgt:
Bestandteile Menge (g/Liter)
Bestandteile
Menge
Gemüsesaft
Entsalztes Wasser
20,0 ml 20,0 g ad 1 Liter
65 Sojabohnenmehl
Glucose-monohydrat
Leitungswasser
10,0
20,0
ad 1 Liter
Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml Sojabohnenöl mit einem Gehalt von 10 Volumenprozent des bereits genannten Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockplymerisats zu dem Fermentationsmedium vor einem Sterilisieren gegeben.
Das Medium wird 20 Minuten bei 12O0C in dem
Fermenter mit Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit 140UpM mittels eines Leiischaufelrllhrers von 19 cm Durchmesser gerührt und durch einen offenendigen Zerstäuber mit 75 üter je Minute steriler Luft belüftet.
Die Temperatur wird auf 280C eingeregelt. Nach
48stündiger Bebrütung unter diesen Bedingungen wird der Inhalt des Fermenters als Impfstoff zu 1500 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einem 20(K) Liter fassenden, voll mit Prallblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (g/Liter)
Sojabohnenmehl 10,0
Glucose-monohydrat 20,0
Kreide (gefälltes Calciumcarbonat) 0,2
Kobaltchlorid (CoCl2 · 6 H2O) 0,001
Natriumsulfat (wasserfrei) 1,0
Leitungswasser ad 1500 Liter
Vor einem Sterilisieren wird der pH-Wert mit "'■ Natriumhydroxid auf 6,0 eingestellt. Zur Verhinderung ./eines Schäumens werden ebenfalls vor einem Sterilisieren 3 Liter Sojabohnenöl mit einem Gehalt an 5JlO Volumenprozent des bereits genannten Äthylenoxid-' Propylenoxid-Blockpolymerisats gegeben. Nach dem ■Sterilisieren wird der pH-Wert wiederum mit einer sterilen Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt :Die Fermentationslösung wird mit 106 UpM gerührt. iDer Rührschaft ist mit 2 Leitschaufeln mit 483 cm Durchmesser ausgerüstet Die Temperatur wird auf 300C und der Luftstrom auf 1200 Liter/Minute eingestellt Nach 60 Stunden wird die Fermentation gesam- ^- melt und durch Zentrifugieren geklärt.
* Das vorstehend erzeugte Produkt wird willkürlich mit einer Aktivität von 340 Einheiten je ml bezeichnet. Die Proben werden wie vorstehend beschrieben bestimmt
1050 Liter des Kulturfiltrats mit 340 Einheiten je ml ^werden bei 100C und einem pH-Wert von 8 mit ''31O Liter Dichlormethan von 1O0C extrahiert, das 1200 g Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid enthält, indem die beiden Flüssigkeiten bei vorbestimmten Fließgeschwindigkeiten durch Vermischen in den Rohrleitungen gepumpt werden. Die Phasen werden in einer kontinuierlichen Zentrifuge nach vorherigem, . etwa 2minütigen Vermischen getrennt. Die Dichlorme-Uhan-Phase (300 Liter) wird mit wäßrigem Natriumjodid nochmals extrahiert Die abermalige Extraktion wird in 4 Ansätzen unter Verwendung von insgesamt 7 Liter Wasser mit einem Gehalt von 210 g Natriumjodid durchgeführt Die Phasen trennen sich aufgrund der Schwerkraft Die wäßrige Phase wird mittels Salzsäure vom pH 7,7 auf pH 7,0 eingestellt und filtriert Der Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) enthält 21 900 Einheiten je ml.
Es wird eine Ionenaustauschersäule vorbereitet, indem sie mit vernetztem Dextran in einer 0,05-m-Phosphatpufferiösung vom pH 7 mit einem Gehalt von 03 m-Natriumchlorid beschickt wird. Die Glassäule hat einen Durchmesser von 10 cm und eine Höhe von 40 cm. Der Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) wird bei 5° C mit einer Geschwindigkeit von 50rnl/Minute durch den Ionenaustauscher perkoliert. Die Säule wird mit einer 0,05-m Phosphatpufferlösung ebenfalls vom pH 7 mit einem Gehalt von 0,7-m Natriumchlorid bei 50C und einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/Minute eluiert 2 Liter des Eluats werden verworfen und 90 Fraktionen zu 100 ml gesammelt Die Fraktionen werden in einem Ultraviolett-Spektrophotometer genau untersucht, und diejenigen Fraktionen, die ein Absorptionsmaxima bei etwa 305 nm zeigen, werden gesammelt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt Es handelt sich hierbei um die Fraktionen Nr. 50 bis 62, die nach Vereinigen ein Volumen von 1440 ml und eine Wirksamkeit von 71 000 Einheiten je ml haben. Es ist zuvor gezeigt worden, daß diese Fraktionen mit einem Maximum in diesem Bereich die Substanz MM 13 902 enthalten.
Zu den vereinigten Fraktionen wird Natriumchlorid (5 g je 100 ml) gegeben. Die Fraktionen werden bei 5° C mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Minute durch eine Säule von 63 cm perkoliert, die bis zu einer Höhe von 30 cm mit »Amberlite XAD 4«-Harz beschickt ist. Unter diesen Bedingungen adsorbiert die Substanz MM 13 902 an das Harz, während dies anorganische Verunreinigungen nicht tun. Die Substanz MM 13 902 wird bei Raumtemperatur mit 200 ml destilliertem Wasser und anschließend 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert Das Eluat (1 Liter) wird unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 300C auf 70 ml eingeengt auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und gefriergetrocknet Man erhält 1,62 g eines braunen Feststoffes, der das teilweise gereinigte Salz der Substanz MM 13 902 mit einer Aktivität von 37 000 Einheiten je mg darstellt.
1,0 g der teilweise gereinigten Substanz MM 13S02 (37 000 Einheiten/mg) wird an einer Säule von 33 · 30 cm mit einer Beschickung von Mikrocellulose Chromatographie« und dann mit einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis von 4 :1 mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/Minute eluiert 170 ml Eluat werden verworfen und 115 ml-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen, die das Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 enthalten, nämlich die Fraktionen Nr. 37 bis 43, wie durch UV-Absorption festgestellt worden ist werden vereinigt (89 ml), zum Entfernen des n-Propanols bei einer Temperatur unter 300C und unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 219 mg gelblichen Pulvers mit einer Aktivität von 73 000 Einheiten je mg.
Die vorgenannte Substanz zeigt ein UV-Absorptionsmaximum bei etwa 308 nm mit einer Extinktion \*m von etwa 343. Diese Substanz besitzt ein Infrarot- und NMR-Spektrum, wie es aus den F i g. 2 und 3 ersichtlich ist. Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz ist in Tabelle X angegeben. Die Elementaranalyse der Substanz läßt erkennen, daß sie u. a. Stickstoff, Schwefel und
Natrium wahrscheinlich in einem Verhältnis von N : S: Na wie 2:2:2 besitzt. Die positiven und negativen Maxima der kreisförmigen Dichroismus-Kurven für das Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 werden auf einem »Cary-ölÄ-Aufzeichnungsspektropolarimeter bei Konzentrationen von 0,37 mg/ml bei einer Lauflänge von 1 cm bestimmt Man erhäl* folgende Ergebnisse:
Tabelle X
Λ (mn)
EL·
+67,24 X 10"4 -67,24 χ ΙΟ"4
- 3,3 χ ΙΟ"4
- 8,2 x lO"4
Antibakterieile Wirksamkeit des Dinatriumsalzes des MM 4550-Komplexes (Mikrotiter-Methode: starker Impfstoff, 1 Prozent einer über Nacht stehengelassen Bouillon)
Organismus Mindesthemm- Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
«conzentration
(με/ml)
' Bacillus subtihs A 0,15
Staph. aureus Oxford '■ :i0,3
Staph. aureus Russell 0,6
Strep, faecalis 3,1
Enterbacter cloacae N1 25
'E.colil0 418 0,15
E. coli JT410 5
' Kleb, aerogenes A 0,03
Proteus mirabilis 13 0,6
Proteus vulgaris WO 90 0,6
Prov. stuartii 0,07
Ps. aeruginosa A 50
Salmonella typhimurium CT10 0,3
Serratia inarcescens US 39 2,5
Shigella sonnei 0,6-0,3
Haemophilus influenzae P6 0,08
Neisseria genorrhoeae 0,08

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Substanz MM 13 902 und ihre Salze, dadurch gekennzeichnet, daß
a) die feste Carbonsäure MM 13 902 in Form ihres praktisch reinen Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften besitzt:
aa) leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;
ab) ein Ultraviolett-Spektrum mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm;
ac) bei einer Menge von 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch hergestellten KBr-Platte ein Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei 3450, 2950, 1750, 1620, 1510, 1400 und 1260Cm-';
ad) ein NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser mit u. a. einem Paar Niederfeld-Dublet-
! ten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,85 τ und
4,00 τ mit Kopplungskonstanten von etwa 14Hz, mit einem Dublett mit einem Zentrum bei etwa 8,55 τ und mit einem scharfen Singulett bei etwa 8,00 τ;
b) das reine Dinatriumsalz
ba) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit den nachstehenden Systemen die Rf-Werte aufweist: n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 :7 :6, Rf = 0,72; Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:3, Rt = 035;
n-Butanol/Äthanol/WaEser im Volumenverhältnis 7 :7 :6. Rf = 0,81; n-Propanol/Wasser im Volumenverhältnis 4:1,Rf = 0,75;
und
bb) in Form der wäßrigen Lesung Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei etwa 305 und bei etwa 225 nm aufweist
DE2513854A 1974-03-28 1975-03-27 Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel Expired DE2513854C2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB13856/74A GB1489235A (en) 1974-03-28 1974-03-28 Antibiotics
AU45499/79A AU530414B2 (en) 1974-03-28 1979-03-29 Antibiotic mm13902

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2513854A1 DE2513854A1 (de) 1975-10-02
DE2513854C2 true DE2513854C2 (de) 1984-04-19

Family

ID=25627229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2513854A Expired DE2513854C2 (de) 1974-03-28 1975-03-27 Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Country Status (13)

Country Link
JP (1) JPS582675B2 (de)
AT (1) AT345454B (de)
AU (2) AU499459B2 (de)
BE (1) BE827332A (de)
CA (1) CA1050460A (de)
CH (1) CH626628A5 (de)
DE (1) DE2513854C2 (de)
FR (1) FR2265399B1 (de)
GB (1) GB1489235A (de)
LU (1) LU72155A1 (de)
NL (1) NL7503672A (de)
OA (1) OA05204A (de)
SE (1) SE7503536L (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7704040A (nl) * 1976-04-28 1977-11-01 Merck & Co Inc Werkwijze voor het bereiden van nieuwe anti- biotica.
DK487877A (da) * 1976-11-17 1978-05-18 Merck & Co Inc Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotisk stof
US4446146A (en) * 1978-07-26 1984-05-01 Beecham Group Limited β-Lactam containing compounds, their preparation and use
DE2966446D1 (en) * 1978-09-09 1984-01-05 Beecham Group Plc Beta-lactam compounds, their preparation and use
US4530791A (en) * 1979-04-16 1985-07-23 Kowa Co., Ltd. β-Lactam antibiotics
JPS6029668A (ja) * 1983-07-28 1985-02-15 Hino Motors Ltd 経済運転ガイド装置
CN1976747A (zh) * 2004-06-30 2007-06-06 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 包含beta-内酰胺抗生素的产品

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT

Also Published As

Publication number Publication date
CA1050460A (en) 1979-03-13
FR2265399A1 (de) 1975-10-24
LU72155A1 (de) 1975-08-20
NL7503672A (nl) 1975-09-30
AU4549979A (en) 1981-05-14
SE7503536L (sv) 1975-09-29
ATA228475A (de) 1978-01-15
CH626628A5 (en) 1981-11-30
GB1489235A (en) 1977-10-19
OA05204A (fr) 1981-02-28
AU530414B2 (en) 1983-07-14
DE2513854A1 (de) 1975-10-02
FR2265399B1 (de) 1978-08-04
JPS50140692A (de) 1975-11-11
BE827332A (fr) 1975-09-29
JPS582675B2 (ja) 1983-01-18
AT345454B (de) 1978-09-25
AU7959975A (en) 1976-09-30
AU499459B2 (en) 1979-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2560074C2 (de) Verfahren zur Gewinnung von Clavulansäure und deren Salze
DE2552638C3 (de) Thienamycin, Verfahren zu seiner Herstellung und Thienamycin enthaltende Arzneimittel
DE2513855C2 (de) Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
CH630957A5 (de) Verfahren zur herstellung von neuen antibiotischen verbindungen auf basis eines bohemsaeurekomplexes.
DE3036361A1 (de) Antibiotikum u-59 761, verfahren zu seiner gewinnung und isolierung sowie dabei verwendete biologisch reine kultur des mikroorganismus saccharopolyspora hirsuta, stamm 367 (nrrl 12045,dsm 1886)
DE2939333C2 (de)
DE2513854C2 (de) Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
DE2146400B2 (de) Neuer biosynthetischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung und diesen Wirkstoff enthaltende Arzneimittelpräparate
EP0196628B1 (de) Ein neues Ansamycin-Antibiotikum, ein mikrobielles Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel
JPS61148189A (ja) Cl−1577dおよびcl−1577e抗生/抗腫瘍化合物およびそれらの製法
EP0019302A1 (de) Neue tetracyclische Verbindungen, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate
DE2839668C2 (de)
DE2833689C2 (de)
CH631740A5 (en) Process for the preparation of maytansinol and its derivatives
DE2166462A1 (de) 7 beta -(d-5-amino-5-carboxyvaleramido)3-(alpha-methoxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaeure-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und solche verbindungen enthaltende arzneimittel
DE3142400A1 (de) &#34;neuer ss-galaktosidase-inhibitor gt-2558, seine derivate und verfahren zu seiner herstellung&#34;
DE2652677C2 (de) Antibiotica 890A&amp;darr;1&amp;darr; und 890A&amp;darr;3&amp;darr;, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Antibiotika enthaltende antibakterielle Mittel
DE3003359C2 (de)
DE2621690A1 (de) Neues antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung
DE2641908A1 (de) Antibiotisch wirksame substanzen, mimosamycin und chlorocarcin a, b und c und verfahren zu ihrer herstellung
DE2450411B2 (de) Aminoglykoside, xk-88-1, xk-88-2, xk-88-3 und xk-88-5 ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel
EP0660825B1 (de) Entzündungshemmende makrolactame (cyclamenol)
DE3132786C2 (de) Antibiotikum SF-2103A, Verfahren zu dessen Herstellung und antibiotisches Mittel, welches das Antibiotikum enthält
DE2610557A1 (de) Neues naphthacenderivat, seine herstellung und dieses enthaltende zusammensetzungen
DE2444110A1 (de) Neues antibiotikum

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8126 Change of the secondary classification

Ipc: A61K 35/70

8125 Change of the main classification

Ipc: C12P 1/06

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee