DE2641908A1 - Antibiotisch wirksame substanzen, mimosamycin und chlorocarcin a, b und c und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Antibiotisch wirksame substanzen, mimosamycin und chlorocarcin a, b und c und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
SCHIFF ν. FUN ER STREHL SCHÜBEL-HOPF EßBINGHAUS
MARJAHILFPLATZ 2 & 3, MÜNCHEN 9O
POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MDNCHEN 95
DIPL. CHEM. DR. OTMAR OITTMANN (t1976)
KARL LUOWIQ SCHIFF
DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER
DIPL. ING. PETER STREHC
DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF
DIPL. ING. DIETER EBBINGHAUS
TELEX 5-23 565 AURO D
TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN
17. September 1976 (DADASHI ARAI DA-12 266
Priorität : 19. September 1975, Japan, Er. 113289/75
Antibiotisch wirksame Substanzen, Mimosamycin
und Chlorocarcin A, B und C und Verfahren zu
Ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft neue Antibiotika oder antibiotisch wirksame
Substanzen, Himosamycin und die Chlorocarcine A, B und C, sowie
ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen.
Bisher wurde über die Isolierung von etwa 2000 verschiedenen Arten
antibiotisch wirksamer Substanzen berichtet und es ist auf diesem Fachgebiet schwierig geworden, eine neue antibiotisch wirksame
Substanz aufzufinden. Es besteht jedoch ein steigendes Bedürfnis nach neuen Antibiotika wegen des Auftretens von Mikroorganismen,
die gegen konventionelle Antibiotika resistent sind, sowie wegen des Ausbrechens neuer Infektionskrankheiten, welches durch die weit
verbreitete Anwendung von Antibiotika mit breitem antibakteriellem Spektrum, von Steroidhormonen, Antitumormitteln oder Immunsuppressoren
verursacht wird.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe augrunde, neue Antibiotika
zur Verfügung zu stellen, die einen breiteren Anwendungsbereich als die bisher bekannten Antibiotika haben und gegen resistente
Mikroorganismen wirksam sind.
Der Erfindung liegen Untersuchungen über ein Verfahren zur verbesserten
Erzeugung tob amtibiotisch wirksamen Substanzen zugrunde, welche durch einen MikrοOrganismus als Nebenprodukt in geringer
Menge gebildet werden, der eine bekannte antibiotiseh wirksame Substanz bildet.Erfindungsgemäß wurden die Züchtungsbedingungen dieses
Mikroorganismus verbessert waä dabei festgestellt, daß ein Mikroorganismus,
Streptomyees lavendulae,der befähigt ist, das bekannte
antibiotisch wirksame Streptotricin zu bilden $ außerdem neue
und wirksame Antibiotika, nämlich die Ghlorocarcine A9 B und C
und Mimosamycin bilden kann und daß insbesondera Streptomyces
lavendulae Stamm ITr«. 314 besonders hohe Konzentrationen, bezogen
auf Aktivitätseinheiten, dieser neuen antibiotisch wirksamen Substanzen bilden kann.
Gegenstand der Erfindung sind somit die neuer» Antibiotika Mimosamycin,
welches antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien, insbesondere säurefeste Bakterien aufweist g und die
Chlorocarcine A, B und C sowie deren Säureadditionssalze g die
Antitumoraktivität zeigen«
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung
der antibiotisch wirksamen Substanzen MimosamyciB und der
Chlorocarcine A. B und G sowie deren Säureadditionssalze·, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 züchtet, einen Komplex aus Chlorocarcinen und Mimosamycin
aus dem Kulturmedium gewinnt und danach Mimosamycin und Chlorocarcin A, B und C aus dem Komplex von Ghlorocareinen
isoliert.
Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Mimosamycin, welches dadurch gekennzeichnet ista
daß man Streptomyces lavendulae Stamm Hr. 314 züchtet und Mimosamycin aus der Kulturbrühe gewinnt9 sowie ein Verfahren zur Herstellung
der Chlorocareine A3 B imä G sowie deren Säureadditionr·-
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salze, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces Iavendulae
Stamm Hr. 314 züchtet, einen Komplex von Chlorocarcinen aus der Kulturbruhe gewinnt, danach den Komplex von Chlorocarcinen unter Gewinnung der Chlorocarcine A, B und C trennt und gegebenenfalls
die entsprechenden Säureadditionssalze bildet.
Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.
Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus, Streptomyces Iavendulae
Stamm Sr. 314, wurde aus einer bei Kyoto gewonnenen Bodenprobe
isoliert und gehört dem Gemis streptomyces an. Dieser Stamm
ist unter der Hicterlegungsnummer 3218 bei dem Technical Research
Institute of Hicr-obial Industry, Agency of Industrial Science
and !Technology, Ministry of International Trade and Industry,
Japan und unter der Hinterlegungsnummer HRRL-11002 bei dem
northern Regional Research Laboratory, northern Central Region, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture
in Peoria«, Illinois, USA, hinterlegt worden.
Die Beobachtung der luftmycels und der Sporen von Streptomyces
lavendulae Stamm 2Tr. 314 erfolgte durch Züchtung des Stammes auf
den Medien entsprechend den Empfehlungen des International Streptomyces Project (ISP) (Shirling. Ξ.Β. & D. Gottlieb; International
J. Systematic Bacteriol. 16, 313 - 340, 1966); nämlich
durch Züchtung auf Agarplatten mit einem Hefe-Stärke-Agar-Medium,
anorganische Salze enthaltendem Stärke-Agar-Medium und Maltose enthaltendem Grundmedium für die Bestimmung des Kohlenstoffquellen-Ausnutzungsschemas
(Agarmedium nach Pridham-Gottlieb) bei
270C während 1 bis 2 Wochen. Außerdem wurde die Färbung des
Kycels mit reifen Sporen, des vegetativen Mycels und anderer
entsprechend der Earbstreifennummer bestimmt, v/ie "Descriptive
Color Harne Dictionary", Container's Corporation of America, 1950
uwl 5iColor Harmony Manual", Container's Corporation of America,
1958, angegeben ist.
Der Stamm Hr. 314 entwickelt'ein wellenförmig gefaltetes Luftmycel
mit langer Verästelung in einem Durchmesser von etwa 0,6
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Ms 1,0 u mit zahlreichen zylindrischen Sporen. Die Sporen haben
eine Größe von 0,6 bis 1,0 u χ 0,8 bis 2,0p. Nach dem Standard
gemäß ISP -wird ein Stamm mit den vorstehend angegebenen morphologischen
Eigenschaften in die Abteilung Rectiflexibiles eingeordnet. Die Lufthyphen haben jedoch Schleifen oder unvollständige
oder langgestreckte Spiralen, die in Form von Spulen mit 1 bis Windungen aufgewickelt sind. Der Stamm Nr. 314 wurde daher morphologisch
in die Abteilung Retinaculiaperti eingeordnet. Wenn die Sporenoberfläche auf diesen Medien unter dem Elektronenmikroskop
beoachtet wird, so zeigt sich, daß die Sporen des Stammes
eine glatte Oberfläche haben. Die Haupteigenschaften des Stammes
Nr. 314 bestehen darin, daß die Lufthyphen morphologisch der Abteilung Retinaculiaperti entsprechen, die Färbung der Lufthyphen
mit reifen Sporen rosa bis lavendelfarben auf verschiededenen Medien ist, die Färbung des vegetativen Mycels manchmal
blau bis bläulich braun auf einem synthetischen Medium ist und daß die Bildung von Melaninpigment positiv ist. Bei einem Vergleich
mit den Stämmen des Genus Streptomyces, die in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Vol. 2, 1959 und "Bergey's Determinative
Bacteriology", 8. Auflage, 1974» beschrieben sind, wurde
angenommen, daß der Stamm weitgehende Ähnlichkeit mit Streptomyces lavendulae hat. Der Stamm Nr. 314 wird in ein übliches
Medium zur Bildung einer antibiotisch wirksamen Substanz eingeimpft und die Schüttelkultur wird bei 270G während einer Züchtungsdauer
von 18 bis 72 Stunden durchgeführt. Dabei wird ein Kulturfiltrat erhalten, welches hohe Aktivität gegen coliforme
Bazillen hat. Das so erhaltene FiItrat wird unter alkalischen Bedingungen mit Aktivkohle behandelt, mit angesäuertem Aceton
eluiert oder an einem schwachen Kationenaustauscherharz, beispielsweise Amberlite IRC-50 (Warenzeichen der Rohm & Haas Co.,
USA) adsorbiert und mit 0,1 η Chlorwasserstoffsäure desorbiert,
wobei eine gegen coliforme Bazillen wirksame antibakterielle Substanz erhalten wird. Die so erhaltene Substanz wird dann
durch Chromatographie, beispielsweise an Amberlite CG-50 (Warenzeichen
der Rohm & Haas Co.) gereinigt und in Form ihres Reinecke-Salzes oder Picrats kristallisiert, wonach, diese Substanz
als Streptothricin identifiziert werden kann.
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Außerdem wurde ein Vergleich der Kultureigensehaften und physiologischen
Eigenschaften unter Verwendung von Streptomyces lavendulae
IPM 1031, eines Streptothricin-bildenden Stammes, Streptomyces racemoehromogenes IPM 1081, der als identisch mit Streptomyces
lavendulae angesehen wird und zur Bildung von Streptothricin befähigt ist, und des erfindungsgemäßen Stammes zur endgültigen
Identifizierung durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in !Tabellen 1, 2 und 3 zusammengefaßt. Dabei zeigte sich, daß der Stamm Fr. 314 in jeder charakteristischen
Eigenschaft, die zur Zeit zur Identifizierung eines Stammes des Genus Streptomyces herangezogen wird, mit Streptomyces lavendulae
identisch ist, wenn auch geringe Unterschiede in mancher Hinsicht beobachtet werden beispielsweise im Hinblick auf die
Ausnutzung von L-Arabinose und dergleichen. Der Stamm wurde daher
als Streptomyces lavendulae identifiziert. Auch Streptomyces race moehromogenes kann Streptothricin bilden, dieser Stamm Äst jedoch
aufgrund des vorher beschriebenen Vergleichsergebnisses offensichtlich
verschieden von dem Stamm Mr. 314, der ein Streptomyces lavendulae-Stamm ist.
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T a bei 1 e
Medium
Stamm Nr.
S. lavenciulae
1031
1031
S. racemochromogenes IFM 1081
CD CO CO
Saecharose-Nitrat-Agar
(Medium nach .Czapek)
reichlich, ausgebreitet, helloliv (1 1/2 ie)*
IM reichlich, weiß "bis elfenbein (2db) alt
Lavendel-Tönung (5 ge "bis 4 ig)
LP keines bis s braun reichlich ausgebreitet, farblos bis
schwach braun
schwach braun
2?eieh3ieh, weiß bis
©Ifenbein (2 db) mit
X-avendel-Ton (5 ge
©Ifenbein (2 db) mit
X-avendel-Ton (5 ge
"bis 4 ig)
schwach braus
schwach braun bis purpurbraun (11
reichlieh, elfenbein (2 de) bis grau (5 de)
schwach braun
G-luc os e-AsparagiiQ"
Agar
l/H reichlich„
tetj farblos bis
oliv
(1 1/2 ie)
reichlich 9 g^u
rosa (5 eo) mit dl reichlichρ ausgebreitet
g gräulieh-blau
el3!on
(5 ge bis 4 ig)
EP keines bis'sehwash
reichlichρ weiß,
ter in rötlich-grau
mit La^endel-Son über=
g@h@ad (5 ge)
ter in rötlich-grau
mit La^endel-Son über=
g@h@ad (5 ge)
"bis schwach
reichlich 9 ausgebreitet
, braun bis blau (10 pn)
reichlieh, rötlichgrau mit Lavendel-Ton 15 ge)
keines bis schwach braun
(ISP)
V.U <J!» W «1, Vn Li ^Lt ^41» Λ.Α ρ ^SJjtAj©^1^? feicltt ^Λ νΰ ϋη ώ>νΛν UXgJUwLI^ ^* ti Θ Kj^ McS* \» da U>
(AUXih w JU \=*Λλ·Α· V ^ do J»/ fie jT^ f
farblos tet, dtmkeloliv (1 l/2pn)
7,-M mäßigoschwach bräiralichgrau mäßig-schwach teäunlichgrau mäßis.silbersxau
(2 fe) bis silbergrau (3fe) (2 Ie)DIs silbergrau (3 fe) (3 ί§3 ^^
X-P keines hellbraun , schwach olivbraun
T, JT ο s Im-
Wl so!eliIioft, ausgebreitet
,,schwach braun bis
senfbraun (2 ni)
X-M reichlich, rötlich-grau
(7 ge) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig) reichlich, ausgebreitet, sehwach braun bis senfbraun
( 2 ni)
reichlich, rötlich-grau (7 ge) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig)
keines bis schwach braun keines bie schwach braua
CaI cium-Hydroxy«
succinat-Agar
succinat-Agar
VM reichlich, ausgebreitet, schwach braun bis dunkeloliv
(l nl)
IM mäßig, dünn, pulverig, weiß, später in musehelfarbig
übergehend (3 ba)
LP keines bis schwach braun sehwach olivbrauiL
reichlich, ausgebreitet, bläulich-braun (3 pn)
keines reichlich, ausgebreitet, senfbraun (2 ni)
reichlich, rötlichgrau (7 ge)
keines bis schwach braun
reichlich, ausgebreitet, bläulich-braun
( 3 pn)
keines
schwach
Anorganische
Salze enthaltender Stärkeagar (ISP)
Salze enthaltender Stärkeagar (ISP)
VM mäßig, farblos
LM reichlich, ausgebreitet, gelblich-grau (3 de) g9 farblos bis schwarzoliv
(2 pn)
reichlich, ausgebreitet, gelblich-grau (3 de)
dunkelollν (2 po)
reichlich, grau (3 de), bläulich-grau (13 ee)
LP keines
schwach braun
Nähragar
VM reichlich, ausgebreitet,
glänzende Oberfläche, kamelfarben (3 ie)
LM keines
LP braun
LP braun
reichlich, ausgebreitet, glänzende Oberfläche,
kamelfarben ( 3 ie)
kamelfarben ( 3 ie)
keines braun
reichlich, ausgebreitet, £r
glänzende Oberfläche, ^ kamelfarben (3 ie) __.
keines schwach braun
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
(ISP)
VM reichlich, ausgebreitet, stark gefaltet, farblos bis schwach braun
IM reichlich, gräuliehrosa (5 ec) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig)
IP eichenbraun (4 pi) reichlich, ausgebreitet,
farblos bis schwach braun
farblos bis schwach braun
reichlich, gräulich-rosa
(5 ec) mit Lavendel-Ton
(5 ge bis 4 ig)
(5 ec) mit Lavendel-Ton
(5 ge bis 4 ig)
eichenbraun (4 pi)
gefaltet, schwach braun
reichlich, rötlichgrau (5 ge)
dunkelbraun (4 pi)
Hafermehl-Agar
(ISP)
(ISP)
TM mäßig, farblos
IM mäßig, gräulich-rosa (5 ec) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig)
mäßig, staubig-blau
(15 ni)
(15 ni)
mäßig, rosenholz mit
Lavendel-Ton (5 ge
bis 4 ig)
Lavendel-Ton (5 ge
bis 4 ig)
bläulich-braun (15 ni)
mäßig, rosenholz (3 ca)
LP keines
keines bis bläulichbraun
keines bis schwach braun
Ei-Medium
VM ausgebreitet, stark gefaltet, schokoladenbraun (4 pn)
IM keines
LP sclra-ach-braun bis
schokoladenbraun (4 pl)
ausgebreitet, stark
gefaltet, schokoladenbraun (5 pn)
gefaltet, schokoladenbraun (5 pn)
keines
schwach-braun bis schokoladenbraun (4 pl)
stark gefaltet, schokoladenfarben (4 pl)
wenig bis keines s ch okoladenfarb en
VM : Vegetatives Eyeel;
IiM : luftmycel;
ΠΡ : lösliches Pigment
* Code nach Color Harmony Manual
Physiologische Eigenschaft
Stasm ITr» 314 S. lavendulae S. racemo-
IEM 1031 chromogenes Ii1M 1081
Nitratreduktion (14
Yerflüssigung von Gelatine (1δδ0,
21 iEage)
!Lösliches Pigment
braun
"braun
"braun
Hydrolyse von Cellulose (21 Tage)
lackmusmilch Koagulation
Peptonisierung pH
-H-8,0
7,8
7,8
Melanin-Bildung
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5? a b e I1 1 e 5
ter Stämme
Ii-Rhamnose*
D-Pructose* Saccharose*
Lactose Maltose Raffinose* Mannit* i-Inosit*
Satriuinacetat Natriumc itrat
Hatriumsuccinat
Kontrollversuch
Eohleastoffquelle Stam Er. 314 S0 laven&ulae Se racemochro-
Bogenes
IPM 1031 ■ UM 1081
D-Xylose* - £
HI-
* In ISP beschriebene K©hleastoffquelle
Der Chlorocarcin-Kompies nnä MimosanycinP gebildet werden, sind bisher noch nicht aus einer
vorstehend angegebenen "belcannten Mikroorganismen
myces lavendulae isoliert wordeno
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-VL-
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden der Chlorocarcin-Komplex
und Mimosamycin durch Züchtung von Streptoinyces lavendulae
Stamm Ur. 314 hergestellt.
Die Züchtung kann prinzipiell nach üblichen Kulturverfahren für einen Mikroorganismus durchgeführt werden, es ist jedoch gewöhnlich
günstig, eine Submerskultur in einem flüssigen Medium durchzuführen.
Als Medium, welches sich für die Zwecke der Erfindung eignet, kann jedes beliebige Medium eingesetzt werden, welches
die ITährstoffe enthält, die der Stamm Nr. 314 des Genus Streptomyces
ausnutzen kann. Genauer gesagt, lassen sich synthetische, halbsynthetische oder natürliche Medien einsetzen und als Beispiele
für die Bestandteile des Mediums sind folgende Substanzen 32U erwähnen : Eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Maltose, Fructose,
Xylose, Stärke, Glycerin und dergl.; eine Stickstoffquelle,
wie Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenöl, Sojabohnenmehl,
Maisquellflüssigkeit, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumehlorid, Harnstoff und andere organische oder
anorganische Stickstoffquellen, Carbonate, Phosphate oder andere
Metallsalze können zusätzlich dem Medium einverleibt werden. Falls während der Züchtung übermäßiges Schäumen beobachtet wird, ist es
vorteilhaft, dem Medium ein Antischaummittel zuzusetzen, wie ein Pflanzenöl, beispielsxveise Sojabohnenöl, oder ein Siliconöl, Polyoxyalkylene
oder deren Derivate, Mineralöle und dergl.
Me Züchtungstemperatur liegt gewöhnlich innerhalb eines Bereiches von 27 bis 300O. Da das Yolumen des Mediums sich erhöht,
Ist es vorteilhaft, eine Impfkultür anzulegen und danach die
in ein Medium einzuimpfen. Die Züchtungsdauer beträgt
'Ji"i3l±e!i atwa 18 Stunden bis etwa 24 Stunden.
Sie Törs
keit YQY; -ei
keit YQY; -ei
angegebenen Kulturbedingungen können in Abhängigur Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika
verwendeten Mikroorganismen im Hinblick auf optimale Ergebnisse
ausgewählt und angewendet werden.
Sie "3-si fl=e:™ei3 Verfahren in der Kulturbrühe angereicherten anti-Motig'30
wirksamen Substanzen befinden sich gewöhnlich innerhalb
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- Jl? -
des Mycels und in der Kulturflüssigkeit und werden aus dem durch
Zentrifugieren oder Filtration gewonnenen Myeel und dem so erhaltenen
Filtrat extrahiert. Dabei können im einzelnen die erfindungsgemäßen
antibiotisch wirksamen Substanzen mit Hilfe üblicher Verfahrensweisen isoliert, gewonnen und gereinigt werden,
die gewöhnlich zur Herstellung eines Naturprodukts angewendet werden, beispielsweise durch Ausnutzung der Löslichkeit und der
Iiöslichkeitsunterschiede in geeigneten lösungsmitteln, der Abtrennbarkeit
und des Unterschiedes der Abtrennungsrate aus einer Lösung, der Differenz in der Adsorption an und der Affinität gegenüber
verschiedenen Adsorptionsmitteln, der Differenz in der Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen und dergl. Diese Verfahren
können gewünschtenfalls jeweils einzeln oder wahlweise in Kombination mehrerer Verfahren oder auch wiederholt angewendet
werden. Ein beispielhaftes Verfahren wird nachstehend erläutert.
Mach Beendigung der Züchtung wird die Kulturbrühe filtriert, um die Mycelien von dem 3?iltrat abzutrennen. Das Filtrat wird mit
10 η Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Das Piltrat kann vorher auf die Hälfte bis ein Drittel seines
Volumens konzentriert werden, um eine bessere Extraktionswirksamkeit bei der Extraktion mit einem Lösungsmittel zu erreichen. Bei
der vorstehend erwähnten Lösungsmittelextraktion verbleiben basische wasserlösliche Antibiotika, beispielsweise Streptothricin,
welches gleichzeitig durch den Stamm Hr. 314 gebildet wird, in dem Filtrat, während der Chlorocarcin-Komplex, Mimosamycin und
dergl. in die Lösungsmittelphase extrahiert werden. Die Lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert,
das Konzentrat wird in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst, die Lösung wird nacheinander mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat,
Natriumcarbonat und Natriumhydroxid geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt, wobei die sauren Substanzen in
die wässrige Phase übergehen. Die Lösungsmittelphase wird mit 1 η Chlorwasserstoffsäure extrahiert, mit wässrigem Ammoniak auf
einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Diese Stufe wird mehrere Male wiederholt und die
lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene
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- V
eingedampft, wobei eine rolle basische Komponente erhalten wird,
welche den Chlorocarein-Komplex und Mimosamycin enthält. Dieser
Bestandteil wird der Säulenchromatographie an Silicagel mit Hilfe eines Gemische aus Benzol und Äthylacetat unterworfen, wobei eine
überwiegend Chlorocarcin A enthaltende Fraktion erhalten wird.
Bei der Entwicklung mit Äthylacetat wird dann eine überwiegend Mimosamyein enthaltende !Fraktion erhalten. Diese !Fraktionen
werden durch mehrfache Chromatographie an Silicagel weiter gereinigt, wobei öhlorocarcin A als gelber Sirup und Mimosamyein
in Form gelber Kristalle erhalten werden. \
Die zuerst eluierte Chromatograpliiekolaniie wird mit einem Gemisch
aus Ithylacetat und Aceton weiter elniert, wobei eine überwiegend
die Cblorocareine B und, C enthaltende Praktion gewonnen wird.
Diese fraktion wird zur Trockene eingedampft und das Eonssntrat,
ein Gemisch der Chlorocarcine B und C, wird weiter durch Chromatographie
an Silicagel gereinigt, wobei Chlorocarcin B und Chlorocarcin
G in ü?orm gelber Pulver erhalten werden.
Rohes Miraosamycin wird aus einem Gemisch aus Äthylacetat und
Äthyläther umkristallisiert, wobei die reinen gelben Kristalle erhalten werden.
Die nach der Extraktion mit 1 η öhlorwasserstoffsäure zurückbleibende
Äthylacetatschicht wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in einer geeigneten Menge Methanol gelöst. Zu
der erhaltenen Lösung wurde Wasser in ausreichender Menge gegeben, so daß ein Wassergehalt von 10 Volura-^ erzielt wurde. Die wässrige
lösung wurde mit η-Hexan extrahiert, um Verunreinigungen mit geringerer Polarität zu entfernen. Der Extrakt wurde zur Trockene
konzentriert und der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst. Die so erhaltene lösung wurde nacheinander mit 1 η Chlorwasserstoffsäure
und 1 η Natriumhydroxid gewaschen und danach zur Trockene eingedampft, wobei als Rückstand die rohen neutralen Komponenten
erhalten wurden. Momosamycin wird aus den Komponenten in gleicher Weise wie vorstehend isoliert und gereinigt.
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-TA-
13
A Physikalisch-chemische Eigenschaften von Mmosamycin
1) Farbe und Zustand : Gelbe Prismen
2) Schmelzpunkt : 227 bis 2310C
3) Elementaranalyse :
C : 61,51 fo, H s 4,79 $, Ή i 5,87 $>
4) Molekulargewicht (Massenspektrum ) ; 233
5) Empirische Formel : C12H11HO.
6) UV-Absorptionsspektrum (wie in Fig. 1 gezeigt) %
nm (log ε) : 230 /·
(Schulter) (4,16)
(4,14), 396 (3,56) :
λ Methanol ^ (log ε) . 277 (3,78), 370
(4,14), 396 (3,56) :
λ Methanol ^ (log ε) . 277 (3,78), 370
(3,53)
7) Infrarot-Absorptionsspektrum (wie in Fige 2 geseigt) ;
-01^mS 0^1 % 1685» 1655, 1635
1585
8) liiyiR-Spektrum (GI)Ol5) (wie in Fig» 3 gezeigt)
: 2,10 (3H, se)s 3,69 (3HP so),
4,20 (3H, s.), 7,12 (IH1, So),
8,28 (IH, s.)
4,20 (3H, s.), 7,12 (IH1, So),
8,28 (IH, s.)
9) Rotationsdisperaionsspektrum ( C = 4S37 x 10~^s MeOH)
(nm) ϊ -1601 (50O)5 -1373(490) s
»1373 (480), »1144 (470;r
-1144 (460),
»1144 (450 - 39Ο)ΰ
-1373 (380),
-1144 (370 - 350)P
-1373 (340)s -=1831 (33c;
-2288 (320), °2288 (3IC. -
-1831 (300), »1601 (290}.
-2059 (28O)9 -2517 (27Oj.
-3661 (260), -5492 (250),
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641908
10) Löslichkeit
leicht löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform, Estern,
Aceton
mäßig löslich in Äthyläther, n-Hexan unlöslich in Wasser
11) Farbreaktion
Ehrlich-Reaktion : positiv (orange) Einhydrin- und Dragendorff-Reaktion : negativ
Diese Substanz hat die biologische Eigenschaft, in bestimmtem Ausmaß aktiv gegenüber grampositiven Bakterien, Jedoch nicht !
wirksam gegen grainnegative Bakterien und IPungi in einer Konzentration
von 50 Ug/xnl zu sein.
Me Substanz ist insbesondere aktiv gegen säurefeste Bakterien und "wirksam gegen Streptomyein-hochresistente Stämme von menschlichen
Tuberkelbazillen wie auch gegen normale Stämme von Tuberkelbazillen.
Die inhibierenden Mindestkonzentrationen für Myeobacterium tuberculosis
werden nach 4-wöchiger Inkubation bei 570C auf Sauton-Medium
bestimmt und sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Tuberkelbazillen
Geprüfter Mikroorganismus inhibierende Mindest
konzentration (MIC), (pg/ml)
Myeobacterium tuberculosis
H37 R7 1,56
Mycobacterium bovis ITr. 10 6,25
Myeobacterium tuberculosis SMR 1,56
Mycobacterium smegmatis ATCC6O7 25,0
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14
Anmerkungen^ Nähragar, 370C, 48 Stunden für M. smegmatis.
Flüssiges Medium nach Sauton, 370C, 4 Wochen für
die anderen drei Stämme.Die Stämme SMR und Matsudo sind resistent gegen Streptomycin in Dosen von
1000 ug/ml oder mehr.
Mäuse (18 bis 20 g) tolerierten die intravenöse Injektion von 50 mg/kg Mimosamycin.
Durch die vorstehend angegebenen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften wurde nachgewiesen, daß diese Substanz
eine neue antibiotisch wirksame Substanz ist, die spezifische Wirksamkeit gegen Tuberkelbazillen zeigt.
Mimosamycin kann für therapeutische Zwecke als antimikrobielles Mittel oder Antituberkulosemittel in Form verschiedener pharmazeutischer
Zubereitungen angewendet werden, wie in Form von Tabletten, Pulver, Suspensionen oder Sirupen zur oralen Verabreichung,
Kapseln, Lösungen oder Suspensionen zur Injektion usw. Diese Zubereitungsformen können in einfacher Weise unter Verwendung
des Antibiotikums nach üblichen Methoden hergestellt werden. Das Antibiotikum kann auf oralem oder parenteralem Weg, in
typischer Weise durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion, verabreicht werden. Die zu verabreichende Dosis kann unter jeder
gegebenen Bedingung variiert v/erden, hängt jedoch im allgemeinen von der Schwere der Krankheit und dem Alter und Körpergewicht
des Patienten usw. ab. Gewöhnlich liegt die Tagesdosis für Erwachsene innerhalb des Bereiches von 200 mg bis 2 g und kann in
einer einzigen oder in mehreren Dosen verabreicht werden.
Chlorocarcine
A1
B und C
Die Chlorocarcine A, B und C sind sämtlich basische antibiotisch wirksame Substanzen und befähigt, die entsprechenden Säureadditionssalze
zu bilden. Zu typischen Beispielen für solche Salze gehören Salze mit anorganischen oder organischen Säuren, wie
Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Stearinsäure,
Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure und dergl. Wie zu erwarten, zeigen diese Salze den gleichen Grad der antibiotischen
Aktivität wie die freien antibiotischen Substanzen,
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wenn auch gewöhnlich einige Unterschiede im Hinblick auf ihre Aktivität und Löslichkeit beobachtet werden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Chlorocarcine A, B und C werden nachstehend aufgeführt.
B Physikalisch-chemische Eigenschaften von Chlorocarcin A
1) Farbe und Zustand ϊ Gelber Sirup (freie Base)
2) Schmelzpunkt : 140 bis 144°C (ECl-SaIz, Zersetzung)
3) Elementaranalyse (als HGl-SaIz)
0 : 45,74 fot H : 4,73 ft Έ : 6,94 ^, Cl : 16,14 $
4) Molekulargewicht (Massenspektrum) :
5) Empirische !Formel :
2HCl.H2O
6) Spezifische Drehung :
£*&ψ = -4° (C = 1,0, Methanol)
7) ÜY-Absorptionsspektrum (gezeigt in Pig. 4, worin die ausgezogene
Linie das UlT-Spektrum in KeOH and die gestrichelte Linie das W-Spektrum in 0,1 η HCl-MeOH zeigt).
nm (log ε) = 268 (3,83) nm (log 6) = 238 (3,68)
(log 8) = 263 (3,85)
(log ε) = 234 (3,68)
8) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 5 gezeigt)
IR V™?513 cm"1 : 1685, 1665, 1610
9) HMR (CDCl3) (in Fig. 6 gezeigt)
6 x 1,23 (3H, s.)
1,95 (3H, s.,J=7Hz)
2,26 (3H, d.,J=7Hz)
4,05 (3H, s.)
6,70 (IU, s.)
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XS
10) löslichkeit
leicht löslich in Äthyläther, Estern, Chloroform, Aceton,
Alkoholen, 0,1 η HCl
mäßig löslich in n-Hexan, 0,1 β 3STaOH
unlöslich in Wasser
11) !Farbreaktion
Bragendorff-Reaktion s positiv
Fitihydrin-, FeCl3- und Anthron-Heaktioa ; negativ
C Physikalisch-chemische Eigenschaften τοώ Chlorocareiia B, freie
Base
1) Farbe und Zustand : Gelbes Pulver
2) Schmelzpunkt : 78 bis 81°C
3) Elementaranalyse:
C .: 60,89 1o, H σ 6,20 $9 Έ s' ßs71 fos Cl s 5,20 <fo .
4) Molekulargewicht (Massenspektr-um) :
5) Empirische Formel ϊ
C29H32O6F3Cl . 5/4 H2O
6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (In Mg. 7 geneigt, in der
die ausgezogene linie das W-Spektrum in MeOE und die gestrichelte
Linie das UV-Spektrum in.0,1 η HGl-MeGH zeigt).
ε) : 2€8'5 C4,25)5 370 (3,38)
xMethanol nm (log g). 234 (3,99)s 338 (3,34)
HC1"Me0H nm (log ε) : 262 (4,18), 380 (3,34)
Xmin n HC^Me0H im (log €) : 231 (3,95), 354 (3,52)
7) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Pig* 8 gezeigt)
IR^^1^ cm"1 : 1715, 1683, 1655, 1612
III CtA,
8) HI-IR-Spektrum (CDCl3) (wie in Eig* 9 gezeigt)
6 : 1,28 (3H, m.), 1,92 (3H, S.),
2,04 (3H, s.), 2,27 (3H, s.), 2,50 (3H, s.)f 4,04 (3H, s.),
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IH
4,08 (3H, s.), 4,42 (IH, s.), 6,84 (IH, d., J = 8Hz)
9) Zirkular-Dichroismus-Spektrum
(C = 8,63 x 10~5, Methanol) : δ ε(ηΐη)
: -2,45 (360) (negatives Maximum) : -0,352 (320) (positives Maximum)
: -13,0 (2,78) (negatives Maximum)
10) löslichkeit :
leicht löslich in niederen. Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol, itthylester /
mäßig löslich in n-Hexan unlöslich in Wasser
11) Farbreaktion :
Dragendorff- und Meyer-Reaktion : positiv
Hinhydrin- und Ehrlich-Reaktion : negativ
3) Physikalisch-chemische Eigenschaften von Ghlorocarein G
1) Farbe und Zustand : Gelbes Pulver
2) Schmelzpunkt : 79 bis 840G
3) Elementaranalyse :
G : 60,88 %9 H : 6,11 #, H : 6,54 %, Cl : 6,71
4) Molekulargewicht (Massenspektrum) :
5) Empirische Formel
C3OH34°6N3G1 * 3/2 H2°
6) ültraviolett-Absorptionsspektrum (in Pig. 10 gezeigt, in der
ausgesogene Linien das TJV-Spektrum in MeOH und gestrichelte
das ÜT-Spektrum in 0,1 η HCl-MeOH darstellen).
^ (iog 6) : 268 (4,26), 368 (3,34)
n nm (logg) : 231 (3,91)
1 η HOl-HeQH nm (log t) :. 262,5 (4,22), 380 (3,40)
7 0 9 8 12/1091
iS
0,1 η HCl-MeOH ^ (logg } . 228j5 (3>87)>
7) Infrarot-Absorptions-Spektrum (in Pig. 11 gezeigt)
?23 cm"1 : 1718, 1683, 1655, 1618
max
8) HMR-Spektrum (Pig. 12)
Oi 1,42 (3H, s.)? 2501 (3H, s.),
2,15 (3H, s.), 2,35 (3H, s.),
2,59 (3H, se), 3,59 (3H, s.),
4,05 (3H, s.), 4,07 (3H, s.),
6,71 (IH, ά., J=8Hz)
9) Zirkular-Dichroismus-Spektrum
(C = 9,38 χ 10~5, Methanol ) iA£(nm) ι
-3,88 (360) (negatives Maximum) : -2,26 (310) (positives Maximum) : -24,5 (273) (negatives Maximum)
10) Löslichkeit :
leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol, Ithyläther
. mäßig löslich in n-Hexan
unlöslich in Wasser
. mäßig löslich in n-Hexan
unlöslich in Wasser
11) Farbreaktion
Dragendorff-Reaktion und Meyer-Reaktion : positiv Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion : negativ
Die Chlorocarcine A, B und C zeigen antibakterielle Wirkung und
Antitumor-Wirkung und eignen sich daher als Arzneimittel. Das antimikroMelle Spektrum der Chlorocarcine A, B und C ist in !Ta
belle 5 zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß die Antibiotika hauptsächlich antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien
zeigen, jedoch nur geringe antibakterielle Wirkung gegen die meisten gramnegativen Bakterien aufweisen. Die Chlorocarcine
A, B und C zeigen zytostatische Aktivität gegen die Leukämie L 1210 der Maus, die zum Ausdruck kommt durch 100 ?oige Zellabtötung
in einer Suspensionskultur bei Konzentrationen von 0,05 ug/ml, 10 pg/ml bzw. 10 pg/ml.
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it
lab e 11 e 5
Cestorganismus
Inhibierende Mindestkonzentration (pg/ml)
Chlorocarcin Clalorocarcin Chlorocarcin
ABC
Staphylococcus aureus 209 P |
0,1 | 12,5 | 12, 5 |
Staphylococcus aureus Smith |
0,02 | 12,5 | 12,5 |
Staphylococcus albus |
0,1 | 50 | 50 |
Staph7^1ococcus citreus |
0,1 · | 25 | 25 |
Streptococcus haemolyticus Coock Streptococcus hemolyticus 090R Streptococcus sälivarius |
6,25 50 6,25 |
6,25 100 50 |
6,25 100 50 |
Streptococcus faecalis |
25 | >100 | >100 |
Bacillus | 0,2 | 25 | 25 |
subtilis PCI 219 | 50 | 50 | 50 |
Bacillus | 0,003 0,003 |
0,05
0,39 |
0,05 0,39 |
cereus | 12,5 | 50 | 50 |
Corynebacterium diphtheriae Coryjiebacteriuni ■xerosis |
25 | 50 | 50 |
Lactobacillus | |||
arabinosus | Ί00 70981 2/ 1 |
>100 091 |
>100 |
Nocardia | |||
asteoides | |||
Myjcobacterium | |||
smegmatis ATCC 60? |
Mycobacterium
phlei
avium
Bscherichia
coli
Shigella dysenteriae
Salmonella typhimurium
pneumoniae
Serratia marcescens
jPseudomonas
aeruginosa
Brucella abortus
Candida albicans
Saccharomyces cerevisiae
Tolura rubra Penicillium
Aspergillus pryzae
Trichophyton
mentagrrophytes
100 | >100 | >100 |
100 | >100 | >100 |
>100 | >100 | >100 |
>100 | >10Θ | >100 |
>100 | >10© | >100 |
100 | 50 | 50 |
>100 | >10© | >100 |
>100 | >10Θ | >100 |
>100 | >10© | >100 |
>100 | >10© | >100 |
>100 | >10© | >100 |
>100 | >100 | >100 |
>100 | >ioo ■ | >100 |
>100 | >100 | >100 |
>100 | >100 | -00 |
>100 | >10© | :·■■·■■ 00 |
• 100 | VS 0© |
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18
1 $ Glucose enthaltender ITähragar (3 $ Glycerin enthaltender
Nähragar für säurefeste Bakterien, Blutagar für Streptococcus haemolyticus und Bruceila abortus), 37°C, 24 oder 48 Stunden.
Dextroseagar nach Sabouraud für Fungi, 270C, 48 Stunden (72 Stunden
für Irichophyton mentagrophytes).
Die Chlorocarcine A, B und C haben relativ geringe Toxizität und
gute Verträglichkeit bei der Maus, wenn sie Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 18 bis 20 g durch intravenöse
Injektion in einer Dosis von 25 mg/kg (A) bzw 250 mg/kg (B und C) verabreicht werden. ι
Die Antitumoraktivität von Chlorocarcin A wird durch intraperitoneale
Verabreichung unter Verwendung von Ehrlich-Earzinom als Testtumor geprüft. Dabei wurde bei allen Mäusen bzw. bei 60 %
der Hause eine Verlängerung der lebensdauer von 30 Tagen oder mehr bei einer Tagesdosis von 80 bzw. 60 |ig/Maus während einer
Woche beobachtet.
Prüfung
Die antibakterielle Aktivität während des äüchtungs- und Extraktionsverfahrens
wird mit Hilfe der Agarplatten-Scheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 geprüft. Die Prüfung
von Streptothricin erfolgt unter Verwendung von Escherichia coli Stamm P-,, da der Stamm ITr. 314 dieses Antibiotikum in großen
Mengen bilden kann. Das gleichzeitige Vorliegen von Streptothricin
läßt sich leicht durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität gegen E. eoli bestimmen, weil der Chlorocarcin-Komplex,
d.h. die mit dem lösungsmittel extrahierte Fraktion, keine Wirkung gegen E. coli zeigt. Mimosamycin wird in ähnlicher Weise
geprüft, wobei als Testorganismus Eycobacteriuin smegmatis ATCC
607 verwendet v/ird.
Die Chlorocarcine A, B und C zeigen, wie vorstehend angegeben wurde, Antitumoraktivität und können zur Behandlung von ITeoplasmen
bei Warmblütlern angewendet werden. Es v/ird angenommen, daß sie sich als Mittel gegen Neubildungen bzw. Tumoren eignen. Die
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geschätzte wirksame Dosis fite Chlorocarcin A scheint innerhalb
des Bereiches von IO mg bis 1 g täglich bei Erwachsenen zu liegen
und die Dosierung für die Chlorocarcine B und C beträgt 100 mg bis 10 g täglich* Die Chlorocarcine können in den gleichen
pharmazeutischen Zubereitungsformen verabreicht werden, wie sie vorstehend für Mimosainycin beschrieben wurden, und werden vorteilhaft
parenteral und in manchen Fällen auf oralem Weg verabreicht«, Gewöhnlich wird die intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung
angewendet.
Eine besondere Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der vorstehend angegebenen erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen
Substanzen wird durch die nachstehenden Beispiele besserx verdeutlicht β
A Impfkultur
Eine Suspension eines gefriergetrockneten Präparats von Streptomyces
lavendulae Stamm Nr. 314 in physiologischer Kochsalzlösung
wurde hergestellt und auf Schrägagar der nachstehenden Zusammensetzung aufgeimpfti
Glucose 10 g
L-Asparagin 5 g
Ki2PO4 5 g
Agar 15 g
Leitungswasser 1000 ml
6,8 - 7,0
Die Züchtung erfolgte während einer Woche bei 270C, wobei eine
Impfkultur mit reichlichem Wachstum und zahlreichen Sporen erhalten wurde.
B Kultur
100 Schüttelkolben mit einem Volumen von je 500 ml, die je
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100 ml des nachstehend angegebenen Kulturmediums enthielten, wurden
unter aseptischen Bedingungen mit den aus der vorstehend erhaltenen
Impfkultur gewonnenen Sporen in einer Menge von 2 Ösenfüllungen pro Kolben beimpft.
Glucose | 1.0 g |
Stärke | 10,0 g |
Polypepton (¥ako !Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) |
10,0 g |
Fleischextrakt ( » ) | 5,0 g |
BaCl | 3,0 g |
Silicon EM 72 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Japan) |
10 ml |
Leitungswasser | 1000 ml |
pH | 7,0 |
Die Züchtung erfolgte während 40 Stunden Dei 27°C mit Hilfe einer
sich hin- und her bewegenden Schüttelvorrichtung (125 Ausschläge pro Minute, 8 cm Vibration).
Nach Vervollständigung der Kultur wurde der Inhalt der Kolben kombiniert und das I^ycel wurde mit Hilfe eines kontinuierlichen
Zentrifugalabscheiders entfernt. Der so erhaltene obenstehende Anteil (10 1) wurde auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und danach
3 mal mit 1/3 Volumen Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert, durch Filterpapier filtriert und
danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,8 g einer dunkelbraunen festen Substanz erhalten wurden. Eine
Lösung der Substanz in 50 ml Äthylacetat wurde nacheinander mit 5 5&Lgem wässrigem Hatriumhydrogencarbonat, 1 η Natriumcarbonat
und 1 η Natriumhydroxid in Anteilen von je 25 ml geschüttelt, um
saure Substanzen zu entfernen. Die organische Schicht wurde 5 mal mit 25 ml 1 η Chlorwasserstoff säure extrahiert. Die Extrakte
wurden Hit der wässrigen Schicht kombiniert und der pH-Wert des Gemisches wurde mit wässrigem Ammoniak auf 9 bis 10 eingestellt
und das Gemisch danach 5 mal mit dem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert und zur
trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 ml einer 10 folgen
wässrigen Lösung von Essigsäure gelöst und mit wässrigem Ammoniak
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auf einen pH-Wert von 9 "bis IO eingestellt und 5 mal mit der
gleichen Menge Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde unter
vermindertem Druck konzentriert, wobei 200 mg eines rohen Extraktes erhalten wurden, der den Chloro care inkomplex und Himosamycin
enthielt.
Der so erhaltene rohe Extrakt wurde in eine mit Silicagel (70 bis 230 Maschen pro 2,54 cm, Maschenweite 0,21 bis 0,149 mm; Merck
& Co., USA) gefüllte Glaskolonne (1,0 cm Durchmesser und 50 cm länge) gegeben. Die Kolonne wurde mit Gemischen von Benzol und
Äthylacetat (2:1), (1:1), (1:2) entwickelt, wobei Fraktionen erhalten wurden, die vorherrschend Chlorocarcin A und die vorherrschend
Mimosamycin enthielten. Jede Fraktion wurde erneut an einer Silicagelsäule ( 230 Maschen pro 2,54 cm, Merck & Co.) N
chromatographiert, wobei 5,2 g Chlorocarcin A als gelbes Pulver und 2,8 mg Mimosamycin in Form gelber Kristalle erhalten wurden.
Die erste Kolonne wurde außerdem mit Äthylacetat ; Aceton (1:1)
entwickelt, wobei Fraktionen (73 mg) erhalten wurden, welche die Chlorocarcine B und C enthielten. Die so erhaltene Fraktion wurde
wiederholt an einer Silieagelkolonne (230 Maschen pro 2,54 cm; Merck & Co.) unter Verwendung von Aceton als Entwieklungslösungsmittel
chromatographiert. Dabei wurden 28 mg Chlorocarcin B und 7,3 mg Chlorocarcin C erhalten«
A Eine Impfkultür wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt,
mit der Abänderung, daß die Züchtung während 24 Stunden durchgeführt wurde.
B Vier Fermentergefässe mit einem Fassungsvermögen von jeweils
20 1, die 15 1 des nachstehend angegebenen Kulturmediums enthielten, wurden unter Druck in üblicher Weise sterilisiert.
Glucose 5s0 g
Stärke · 5P0 g
Polypepton (WAKO
PURE Chemical Industries Iitd. ,Japan 10 s0 g
PURE Chemical Industries Iitd. ,Japan 10 s0 g
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Fleischextrakt (WAKO PUEE
Chemical Industries Ltd., Japan) 5,0 g
NaCl 3,0 g
Leitungswasser 1000 ml
pH 7,0 - 7,2
Die Kultur wurde während 18 Stunden unter folgenden Bedingungen fortgesetzt:
Impfkultur 1 fo
Kultivierungsteinperatur 270C
Rühren 550 üpm
Strömungsrate der aseptischen 1 Volumen des 1-Ie-Iiuft
diums pro Minute
Antischaummittel (Silicon EIi 72) · Palis erforderlich
zugesetzt
Nach Ablauf der vorstehend angegebenen Zeit wurden die Maximalkonzentrationen
bzw. Maxinsaltiter des gebildeten Chlorocarcinkoinplexes
und von Mimosamyein erhalten und danach fielen die Konzentrationen rasch ab. Der pH-Wert der Kulturbrühe fiel unter
6,0"und stieg danach erneut auf etwa 6,3. Das Myeelvolumen erhöhte
sich rasch und die Glucose war zu diesem Zeitpunkt fast
verbraucht. Bei der Maximalkonzentration oder dem Kaxisaltiter
von Chlorocarcin zeigte die Verdünnungsmethode unter Verwendung
von Bacillus subtilis PCI 219 als 'Testorganismus 512 Verdünnungseinheiten und die Agarplatten-Diffusionsmethode ergab eine Hemm-2one
von etwa 40 mm. Die maximale Bildung von Streptothricin war in etwa 30 Stunden erreicht. Aus der aus den Fermentergefässen
erhaltenen und kombinierten Kulturbrühe (etwa 60 1) wurde das Mycel mit Hilfe eines kontinuierlich arbeitenden Zentrifugalabscheiders
entfernt und die Kulturflüssigkeit wurde auf 1/3
ihres Volumens konzentriert.
Tmb Konzentrat wurde mit 1 π Natriumhydroxid auf einen pH-¥ert
Ton 3,0 eingestellt und 3 mal mit dem gleichen Volumen Chloroform
extr-ahiert. Die Extrakte wurden kombiniert und unter vermindertes
Druck konzentriert', wobei 16,4 g eines Gemisches aus Gliloroearcinkoaplex und Mimosaiaycin erhalten wurden. Das
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Gemisch wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wurde
mit 50 ml 5 ^igem wässrigem Natriumhydrogencarbonat und 1 η
Natriumcarbonat und danach 4 mal mit 1 η Natriumhydroxid unter Rühren gewaschen. Die Natriumhydroxidschicht enthielt saure inaktive
Bestandteile^ insbesondere Stearinsäure« Die Äthylacetatschicht
wurde 5 mal mit 60 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure geschüttelt, wobei basische Substanzen in die Säure extrahiert wurden.
Die Säureextrakte wurden kombiniert, mit wässrigem Ammoniak auf
einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt, 5 mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert und die organische Schicht wurde
abgetrennt und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei rohe basische Substanzen erhalten wurden. Die Substanzen wurden in
60 ml einer 10 ^igen wässrigen Lösung von Essigsäure gelöst und
die Lösung wurde mit wässrigem Ammoniak erneut auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und 5 mal mit dem gleichen Volumen ~~
Chloroform extrahiert« Die Extrakte wurden kombiniert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei etwa 0,98 g eines Rohprodukts
erhalten wurde, das den Chlorocarcinkomplex und Mimosamycin
enthielt.
Die Gesamtmenge des Rohprodukts aus 4 Fermentergefässen (jar
fermenters) betrug etwa 0,2 bis 1,5 g.
Die Züchtung wurde I40 mal unter Verwendung von 4 Fermentergefässen
(3ar fermenters) mit einer Gesamtmenge an Kulturbrühe von
840 1 wiederholt, wobei 8,67 g des Rohprodukts erhalten wurden.
Das in einer kleinen Menge Benzol gelöste Rohprodukt wurde auf eine Glas-Kolonne mit einem Durchmesser von 5 cm aufgegeben, die
mit benzolgetränktem Silicagel (Siebgrösse 70 bis 230 Maschen pro 2,54 cm, Masehenweite 0,21 bis 0,149 mm» Merck & Co., USA)
gefüllt war. Die Säule wurde mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (2 s 1 ) entwickelt«, Nachdem die Verunreinigungen
eluiert waren, wurden mit dem gleichen Entwicklungslösungsmittel nacheinander die hauptsächlich Chlorocarcin A und die hauptsächlich
Mimosamycin enthaltende !Fraktion eluiert. Diese Fraktionen wurden
konzentriert und an Silicagel (Siebgrösse 230 Maschen pro 2,54 cm; Merck & Co.) chromatographiert, wobei 42 mg Mimosamycin
und 85 mg Chlorocarcin A erhalten wurden.
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Die anfänglich verwendete Säule wxzae mit Äfhylacetat/Aceton (1:1)
eliiiert, wobei ein Gemisch der Ciilorocarcine B und C erhalten
wurde. Das Gemisch wurde erneut unter Verwendung von Silicagel (Siebgrösse 230 Maschen pro 2,54 cm; Merck & Co.) und mit Hilfe
des gleichen Lösungsmittels chromatographiert, wobei 215 mg
Chlorocarein B und 52 mg Ghlorooarcin C in reiner Eorra erhalten
wurden.
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Leerseite
Claims (9)
1. Antibiotiseh wirksame Substanz Mimosamycin, gekennzeichnet durch neutrale Reaktion, das Vorliegen in Form
gelber Prismen mit einem Schmelzpunkt von 227 bis 2310C, eine
Zusammensetzung entsprechend 61,51 $ Kohlenstoffp 4,79 $ Wasserstoff
und 5?87 $>- Stickstoff, ein durch das Massenspektrum bestimmtes
Molekulargewicht von 233 9 die empirische Formel
^12^11^4.' ^as "*"n -^S · 1 gezeigte Ultraviolettabsorptionsspektrum
OTy(Z!?1 nm (log ε): 230 (Schulter) (4,16), 317 (4,14),
396 (3,56), OT λ JJ^* nm (log£) σ 277 (3,78), 370 (3,53); das
in Pig. 2 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum IR ^ZT^ cm
1685, 1655, 1635, 1585; das in Fig. 3 gezeigte NMR-Spektrum (CI)Cl3) d: 2,10.(3H, s.), 3,69 (3H, s.), 4,20 (3H, s.), 7,1.2
(IH, s.), 8,28 (IH, s.); ein Rotationsdispersionsspektrum (C=
4,37 x 10"7, MeOH) entsprechend ßj20 (nm) : -1601 (500), -1373
(490), -1373 (480), -1144 (470), -1144 (460), -1144 (450 - 390), -1J73 (380), -1144 (370 - 350), -1373 (340), -1831 (330), -2288
(320), -2288 (310), -1831 (300), -1601 (290), -2059 (280), -2517 (270), -3661 (260), -5492 (250);
durch leichte löslichkeit in Methanol, Äthanol, Chloroform, Estern
und Aceton, mäßige Löslichkeit in Äthyläther und η-Hexan und Unlöslichkeit in Wasser; positive Reaktion gegen Ehrlich-Reagenz
und negative Reaktion gegen Uinhydrin- und Dragendorff-Reagenz.
2. Antibiotisch wirksame Substanz Chlorocarcin A, gekennzeichnet
durch basische Reaktion, Vorliegen in Form eines gelben Sirups mit einem Schmelzpunkt von I40 bis 144°C (Zersetzung,
QRiSSiSiAL INSPECTED
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als HCl-SaIz) eine Zusammensetzung in Form des HCl-Salzes entsprecliend
45,74 # Kohlenstoff, 4,73 % Wasserstoff, 6,94 # Stickstoff
und 16,14 ^ Chlor; ein durch das Massenspektrum bestimmtes
Molekulargewicht von 535, eine empirische Formel
2HC1«H2O; eine spezifische Drehung von U*]^ = -4° (c = 1,0,
Methanol); das in Pig. 4 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum
nm (log 2) : 268 (3,83), ÜT»^ nm (logg): 238 (3,68),
HCl-MeOH nffi ( g) . 263 ( 85) ^MeOH-0,1 η HCl
IXt X Ii
nm (log £): 234 (3,68); das in ]?ig. 5 gezeigte Infrarot-Absopp-
tionsspektrum IR ^^^3 em"1? 1685, 1665, 1610; das in Pig. 6
gezeigte MtlR-Spektrum (ODOl5) (f: 1,23 (3H, s.), 1,95 (3H, s.,
J = 7 Hz), 2,26 (3H, s., J = 7 Hz), 4,05 (3H, s.), 6,70 (IH, s.);
durch leichte Löslichkeit in Äthyläther, Estern, Chlor-oform,
Aceton, Alkoholen und 0,1 η HCl, mäßige Löslichkeit in n-Hexan
und 0,1 η NaOH und Unlöslichkeit in Wasser? positive Reaktion
gegenüber Dragendorff-Reagenz und negative Reaktion gegenüber Uinhydrin-, PeOl^5 und Anthron-Reagenz, und deren Säureadditionssalze.
x
3. Antibiotisch wirksame Substanz Chlorocarcin B, gekennzeichnet
durch basische Reaktion, Vorliegen in Form eines gelben Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 78 bis 810C; eine Zusammensetzung
entsprechend 60,89 $> Kohlenstoff, 6,20 $ Wasserstoff,
6,71 % Stickstoff und 5,20 $>
Chlor; ein durch das Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht von 553; eine empirische
Formel CggH^gOgIUCl^A H2O; das in Fig. 7 gezeigte Ultraviolett-
Absorptionsspektrum UV λ?1??9 nm (logg) : 268,5 (4,25), 370
(3,38), W^|°H nm (log 8) : 234 (3,99), 338 (3,34),
709812/1091
HGl-MeOH m (lQg £) . 2$2 (4fl8)f 380 (3,34),
max
lmin Ώ HC1"Me0H am (log e) ·. 231 (3,95), 354 (3,32)? das in
Pig. 8 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum IR $mas: 3 cm ϊ
1715, 1683, 1655, 1612; das in Pig. 9 gezeigte BM-Spektrum
(CDCl3) d: 1S28 (3H, m.), 1,92 (3H, s..), 2,04 (3H, s.),
2,27 (3H, s.), 2,50 (3H9 s.), 4,04 (3H, B.), 4sO8 (3H, s.),
4,42 (IH, s.), 6,84 (IH, d., J = 8Hz)? durch ein Zirkular-Dichroismus-Spektrum
(C = 8,63 X 10~5, Methanol) aS(nm) : »2,45
(360) (negatives Maximum) : -O9352 (320) (positives Maximum) ι
-13,0 (2,78) (negatives Maximum); leichte löslichkeit in Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol und Ithyläther,
mäßige Löslichkeit in η-Hexan und TJnlöslichkeit in Wasser;
positive Reaktion gegenüber Dragendorff- und Meyer-Seagenz
und negative Reaktion gegenüber Mnhyärin- ixn& Shrlich-Reagenz;
und deren Säureadditionssalze.
4. Antibiotiseli wirksame Substanz Chlorocarein C, gekennzeichnet durch basische Reaktion«, Vorliegen in Porm eines
gelben Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 79 bis 840C; eine Zusammensetzung
entsprechend 60,88 fo Kohlenstoff, 6,11 fo Wasserstoff,
6,54 io Stickstoff und 6,71 # Chlor; ein durch das Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht von 567I eine empirische
Pormel C^0H54OgIf5Cl* 3/2 HgO; das in Pig» 10 gezeigte TOtravio2.e\-: ·-
Absorptionsspektrum W^&? ^m (log £) % 268 (4j26)2 36β f'^ :\
- MeOH __ fln„ e\ „ oxl /^ Q1^ τπΓ^0,1 η HCl-MeOH) „,., ,·
262,5 (4,22), 380 (3,40), W^|J Ώ HCl-MeOH ^ (log
228,5 (3,87), 351 (3,36)1 das.in Pigö 11 gezeigte
Absorptionsspektrum IR V251S cm"1 % 1718, 1683, 1655
max
709812/1091
das in Fig. 12 gezeigte KMR-Spektrum «f: 1,42 (3H, s.), 2,01
(3H, s.), 2,15 (3H, 3.), 2,35 (3H, s.), 2,59 (3H, s.), 3,59 (3H,
s.) 4,05 (3H, s.), 4,07 (3H, s.), 6,71 (IH, d.,J= 8Hz); ein Zirkular-Oichroismus-Spektrum
(C = 9,38 χ ΙΟ"-5; Methanol) entsprechend
Δ € (mn) : -3,88 (360) (negatives Maximum) ; -2,26 (310) (positives
Maximum) } -24,5 (273) (negatives Maximum; leichte Löslichkeit
in Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol und Äthyläther, mäßige löslichkeit in η-Hexan und TJnlöslichkeit in Wasser;
und deren Säureaäditionssalze.
5. "Verfahren zur Herstellung der antiMotisch v/irksamen Substanzen
Kimosamyein "nd Ohlorocarcin A, Chlorocarcin B und
Ohlorocarcin C und deren Säureadditionssalzen, dadurch g e -
κ e β η ζ e i c Ii β e t , daß man Streptomyces lavendulae Stamm
ITr ο 314 auf einem üblichen Kulturmedium züchtet, den Komplex
der- Chlorocareiiis mid Mimosamycin aus dem KuIturnedium gewinnt
rad Mimosanycin nvA die Ghlorocarcine A, B und C isoliert und
gegebenenfalls in die Säureadditionssalze überführt.
6. Verfahren nacli Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Züchtung durch Submerskultur in einem flüssigen EuItürmedium durchführt.
To ¥er!?fahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch g e k e η η zeichnet
9 daß man die Züchtung bei einer Temperatur swlseben 27 und 300C durchführt.
S3 ^'%r<z'uoittelj welches einen Wirkstoff und einen üblichen
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pharmazeutischen Träger sowie gegebenenfalls übliche Adjuvantien enthält, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff
eine antibiotisch wirksame Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
9. Arzneimittel, welches einen Wirkstoff und einen üblichen pharnazeutischen !rager sowie gegebenenfalls übliche Adjuvantien
enthält, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff eine antibiotisch wirksame Substanz enthält, die nach einem
der Ansprüche 5 bis 7 gewonnen wurde.
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8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: STREHL, P., DIPL.-ING. DIPL.-WIRTSCH.-ING. SCHUEBE |
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8141 | Disposal/no request for examination |