DE2641908A1

DE2641908A1 - Antibiotisch wirksame substanzen, mimosamycin und chlorocarcin a, b und c und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2641908A1
Application number: DE19762641908
Authority: DE
Inventors: Tadashi Arai
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-09-19
Filing date: 1976-09-17
Publication date: 1977-03-24
Also published as: DK141783B; JPS5238094A; JPS5753075B2; CH622823A5; DK421676A; ATA697376A; NL7610443A; AT349629B; DK141783C; GB1508949A; FR2324310A1; FR2324310B1

Description

SCHIFF ν. FUN ER STREHL SCHÜBEL-HOPF EßBINGHAUS

MARJAHILFPLATZ 2 & 3, MÜNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MDNCHEN 95

DIPL. CHEM. DR. OTMAR OITTMANN (t1976)

KARL LUOWIQ SCHIFF

DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER

DIPL. ING. PETER STREHC

DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF

DIPL. ING. DIETER EBBINGHAUS

TELEFON (O89) 48 SO 6*

TELEX 5-23 565 AURO D

TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN

17. September 1976 (DADASHI ARAI DA-12 266

Priorität : 19. September 1975, Japan, Er. 113289/75

Antibiotisch wirksame Substanzen, Mimosamycin und Chlorocarcin A, B und C und Verfahren zu Ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika oder antibiotisch wirksame Substanzen, Himosamycin und die Chlorocarcine A, B und C, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen.

Bisher wurde über die Isolierung von etwa 2000 verschiedenen Arten antibiotisch wirksamer Substanzen berichtet und es ist auf diesem Fachgebiet schwierig geworden, eine neue antibiotisch wirksame Substanz aufzufinden. Es besteht jedoch ein steigendes Bedürfnis nach neuen Antibiotika wegen des Auftretens von Mikroorganismen, die gegen konventionelle Antibiotika resistent sind, sowie wegen des Ausbrechens neuer Infektionskrankheiten, welches durch die weit verbreitete Anwendung von Antibiotika mit breitem antibakteriellem Spektrum, von Steroidhormonen, Antitumormitteln oder Immunsuppressoren verursacht wird.

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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe augrunde, neue Antibiotika zur Verfügung zu stellen, die einen breiteren Anwendungsbereich als die bisher bekannten Antibiotika haben und gegen resistente Mikroorganismen wirksam sind.

Der Erfindung liegen Untersuchungen über ein Verfahren zur verbesserten Erzeugung tob amtibiotisch wirksamen Substanzen zugrunde, welche durch einen MikrοOrganismus als Nebenprodukt in geringer Menge gebildet werden, der eine bekannte antibiotiseh wirksame Substanz bildet.Erfindungsgemäß wurden die Züchtungsbedingungen dieses Mikroorganismus verbessert waä dabei festgestellt, daß ein Mikroorganismus, Streptomyees lavendulae,der befähigt ist, das bekannte antibiotisch wirksame Streptotricin zu bilden _$ außerdem neue und wirksame Antibiotika, nämlich die Ghlorocarcine A₉ B und C und Mimosamycin bilden kann und daß insbesondera Streptomyces lavendulae Stamm ITr«. 314 besonders hohe Konzentrationen, bezogen auf Aktivitätseinheiten, dieser neuen antibiotisch wirksamen Substanzen bilden kann.

Gegenstand der Erfindung sind somit die neuer» Antibiotika Mimosamycin, welches antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien, insbesondere säurefeste Bakterien aufweist _g und die Chlorocarcine A, B und C sowie deren Säureadditionssalze _g die Antitumoraktivität zeigen«

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung der antibiotisch wirksamen Substanzen MimosamyciB und der Chlorocarcine A. B und G sowie deren Säureadditionssalze·, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 züchtet, einen Komplex aus Chlorocarcinen und Mimosamycin aus dem Kulturmedium gewinnt und danach Mimosamycin und Chlorocarcin A, B und C aus dem Komplex von Ghlorocareinen isoliert.

Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Mimosamycin, welches dadurch gekennzeichnet ist_a daß man Streptomyces lavendulae Stamm Hr. 314 züchtet und Mimosamycin aus der Kulturbrühe gewinnt₉ sowie ein Verfahren zur Herstellung der Chlorocareine A₃ B imä G sowie deren Säureadditionr·-

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salze, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces Iavendulae Stamm Hr. 314 züchtet, einen Komplex von Chlorocarcinen aus der Kulturbruhe gewinnt, danach den Komplex von Chlorocarcinen unter Gewinnung der Chlorocarcine A, B und C trennt und gegebenenfalls die entsprechenden Säureadditionssalze bildet.

Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus, Streptomyces Iavendulae Stamm Sr. 314, wurde aus einer bei Kyoto gewonnenen Bodenprobe isoliert und gehört dem Gemis streptomyces an. Dieser Stamm ist unter der Hicterlegungsnummer 3218 bei dem Technical Research Institute of Hicr-obial Industry, Agency of Industrial Science and !Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan und unter der Hinterlegungsnummer HRRL-11002 bei dem northern Regional Research Laboratory, northern Central Region, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture in Peoria«, Illinois, USA, hinterlegt worden.

Die Beobachtung der luftmycels und der Sporen von Streptomyces lavendulae Stamm 2Tr. 314 erfolgte durch Züchtung des Stammes auf den Medien entsprechend den Empfehlungen des International Streptomyces Project (ISP) (Shirling. Ξ.Β. & D. Gottlieb; International J. Systematic Bacteriol. 16, 313 - 340, 1966); nämlich durch Züchtung auf Agarplatten mit einem Hefe-Stärke-Agar-Medium, anorganische Salze enthaltendem Stärke-Agar-Medium und Maltose enthaltendem Grundmedium für die Bestimmung des Kohlenstoffquellen-Ausnutzungsschemas (Agarmedium nach Pridham-Gottlieb) bei 27⁰C während 1 bis 2 Wochen. Außerdem wurde die Färbung des Kycels mit reifen Sporen, des vegetativen Mycels und anderer entsprechend der Earbstreifennummer bestimmt, v/ie "Descriptive Color Harne Dictionary", Container's Corporation of America, 1950 uwl ⁵ⁱColor Harmony Manual", Container's Corporation of America, 1958, angegeben ist.

Der Stamm Hr. 314 entwickelt'ein wellenförmig gefaltetes Luftmycel mit langer Verästelung in einem Durchmesser von etwa 0,6

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Ms 1,0 u mit zahlreichen zylindrischen Sporen. Die Sporen haben eine Größe von 0,6 bis 1,0 u χ 0,8 bis 2,0p. Nach dem Standard gemäß ISP -wird ein Stamm mit den vorstehend angegebenen morphologischen Eigenschaften in die Abteilung Rectiflexibiles eingeordnet. Die Lufthyphen haben jedoch Schleifen oder unvollständige oder langgestreckte Spiralen, die in Form von Spulen mit 1 bis Windungen aufgewickelt sind. Der Stamm Nr. 314 wurde daher morphologisch in die Abteilung Retinaculiaperti eingeordnet. Wenn die Sporenoberfläche auf diesen Medien unter dem Elektronenmikroskop beoachtet wird, so zeigt sich, daß die Sporen des Stammes eine glatte Oberfläche haben. Die Haupteigenschaften des Stammes Nr. 314 bestehen darin, daß die Lufthyphen morphologisch der Abteilung Retinaculiaperti entsprechen, die Färbung der Lufthyphen mit reifen Sporen rosa bis lavendelfarben auf verschiededenen Medien ist, die Färbung des vegetativen Mycels manchmal blau bis bläulich braun auf einem synthetischen Medium ist und daß die Bildung von Melaninpigment positiv ist. Bei einem Vergleich mit den Stämmen des Genus Streptomyces, die in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Vol. 2, 1959 und "Bergey's Determinative Bacteriology", 8. Auflage, 1974» beschrieben sind, wurde angenommen, daß der Stamm weitgehende Ähnlichkeit mit Streptomyces lavendulae hat. Der Stamm Nr. 314 wird in ein übliches Medium zur Bildung einer antibiotisch wirksamen Substanz eingeimpft und die Schüttelkultur wird bei 27⁰G während einer Züchtungsdauer von 18 bis 72 Stunden durchgeführt. Dabei wird ein Kulturfiltrat erhalten, welches hohe Aktivität gegen coliforme Bazillen hat. Das so erhaltene FiItrat wird unter alkalischen Bedingungen mit Aktivkohle behandelt, mit angesäuertem Aceton eluiert oder an einem schwachen Kationenaustauscherharz, beispielsweise Amberlite IRC-50 (Warenzeichen der Rohm & Haas Co., USA) adsorbiert und mit 0,1 η Chlorwasserstoffsäure desorbiert, wobei eine gegen coliforme Bazillen wirksame antibakterielle Substanz erhalten wird. Die so erhaltene Substanz wird dann durch Chromatographie, beispielsweise an Amberlite CG-50 (Warenzeichen der Rohm & Haas Co.) gereinigt und in Form ihres Reinecke-Salzes oder Picrats kristallisiert, wonach, diese Substanz als Streptothricin identifiziert werden kann.

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Außerdem wurde ein Vergleich der Kultureigensehaften und physiologischen Eigenschaften unter Verwendung von Streptomyces lavendulae IPM 1031, eines Streptothricin-bildenden Stammes, Streptomyces racemoehromogenes IPM 1081, der als identisch mit Streptomyces lavendulae angesehen wird und zur Bildung von Streptothricin befähigt ist, und des erfindungsgemäßen Stammes zur endgültigen Identifizierung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in !Tabellen 1, 2 und 3 zusammengefaßt. Dabei zeigte sich, daß der Stamm Fr. 314 in jeder charakteristischen Eigenschaft, die zur Zeit zur Identifizierung eines Stammes des Genus Streptomyces herangezogen wird, mit Streptomyces lavendulae identisch ist, wenn auch geringe Unterschiede in mancher Hinsicht beobachtet werden beispielsweise im Hinblick auf die Ausnutzung von L-Arabinose und dergleichen. Der Stamm wurde daher als Streptomyces lavendulae identifiziert. Auch Streptomyces race moehromogenes kann Streptothricin bilden, dieser Stamm Äst jedoch aufgrund des vorher beschriebenen Vergleichsergebnisses offensichtlich verschieden von dem Stamm Mr. 314, der ein Streptomyces lavendulae-Stamm ist.

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T a bei 1 e

Medium

Stamm Nr.

S. lavenciulae
1031

S. racemochromogenes IFM 1081

CD CO CO

Saecharose-Nitrat-Agar

(Medium nach .Czapek)

reichlich, ausgebreitet, helloliv (1 1/2 ie)*

IM reichlich, weiß "bis elfenbein (2db) alt Lavendel-Tönung (5 ge "bis 4 ig)

LP keines bis s braun reichlich ausgebreitet, farblos bis
schwach braun

2?eieh3ieh, weiß bis
©Ifenbein (2 db) mit
X-avendel-Ton (5 ge

"bis 4 ig)

schwach braus

schwach braun bis purpurbraun (11

reichlieh, elfenbein (2 de) bis grau (5 de)

schwach braun

G-luc os e-AsparagiiQ" Agar

l/H reichlich„

tetj farblos bis

oliv

(1 1/2 ie)

reichlich ₉ g^u rosa (5 eo) mit dl reichlichρ ausgebreitet _g gräulieh-blau

el3!on

(5 ge bis 4 ig)

EP keines bis'sehwash reichlichρ weiß,
ter in rötlich-grau
mit La^endel-Son über=
g@h@ad (5 ge)

"bis schwach

reichlich ₉ ausgebreitet , braun bis blau (10 pn)

reichlieh, rötlichgrau mit Lavendel-Ton 15 ge)

keines bis schwach braun

(ISP)

V.U <J!» W «1, Vn Li ^Lt ^41» Λ.Α ρ ^SJjtAj©^¹^? feicltt ^Λ νΰ ϋη ώ>νΛν UXgJUwLI^ ^* ti Θ Kj^ McS* \» da U> (AUXih w JU \=*Λλ·Α· V ^ do J»/ fie jT^ f

farblos tet, dtmkeloliv (1 l/2pn)

7,-M mäßigoschwach bräiralichgrau mäßig-schwach teäunlichgrau mäßis.silbersxau

(2 fe) bis silbergrau (3fe) (2 Ie)DIs silbergrau (3 fe) (3 ί§3 ^^

X-P keines hellbraun , schwach olivbraun

T, JT ο s Im-

Wl so!eliIioft, ausgebreitet ,,schwach braun bis senfbraun (2 ni)

X-M reichlich, rötlich-grau (7 ge) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig) reichlich, ausgebreitet, sehwach braun bis senfbraun ( 2 ni)

reichlich, rötlich-grau (7 ge) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig)

keines bis schwach braun keines bie schwach braua

CaI cium-Hydroxy«
succinat-Agar

VM reichlich, ausgebreitet, schwach braun bis dunkeloliv (l nl)

IM mäßig, dünn, pulverig, weiß, später in musehelfarbig übergehend (3 ba)

LP keines bis schwach braun sehwach olivbrauiL reichlich, ausgebreitet, bläulich-braun (3 pn)

keines reichlich, ausgebreitet, senfbraun (2 ni)

reichlich, rötlichgrau (7 ge)

keines bis schwach braun

reichlich, ausgebreitet, bläulich-braun ( 3 pn)

keines

schwach

Anorganische
Salze enthaltender Stärkeagar (ISP)

VM mäßig, farblos

LM reichlich, ausgebreitet, gelblich-grau (3 de) g₉ farblos bis schwarzoliv (2 pn)

reichlich, ausgebreitet, gelblich-grau (3 de)

dunkelollν (2 po)

reichlich, grau (3 de), bläulich-grau (13 ee)

LP keines

schwach braun

Nähragar

VM reichlich, ausgebreitet, glänzende Oberfläche, kamelfarben (3 ie)

LM keines
LP braun

reichlich, ausgebreitet, glänzende Oberfläche,
kamelfarben ( 3 ie)

keines braun

reichlich, ausgebreitet, £r glänzende Oberfläche, ^ kamelfarben (3 ie) __.

keines schwach braun

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

(ISP)

VM reichlich, ausgebreitet, stark gefaltet, farblos bis schwach braun

IM reichlich, gräuliehrosa (5 ec) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig)

IP eichenbraun (4 pi) reichlich, ausgebreitet,
farblos bis schwach braun

reichlich, gräulich-rosa
(5 ec) mit Lavendel-Ton
(5 ge bis 4 ig)

eichenbraun (4 pi)

gefaltet, schwach braun

reichlich, rötlichgrau (5 ge)

dunkelbraun (4 pi)

Hafermehl-Agar
(ISP)

TM mäßig, farblos

IM mäßig, gräulich-rosa (5 ec) mit Lavendel-Ton (5 ge bis 4 ig) mäßig, staubig-blau
(15 ni)

mäßig, rosenholz mit
Lavendel-Ton (5 ge
bis 4 ig)

bläulich-braun (15 ni)

mäßig, rosenholz (3 ca)

LP keines

keines bis bläulichbraun

keines bis schwach braun

Ei-Medium

VM ausgebreitet, stark gefaltet, schokoladenbraun (4 pn)

IM keines

LP sclra-ach-braun bis schokoladenbraun (4 pl)

ausgebreitet, stark
gefaltet, schokoladenbraun (5 pn)

keines

schwach-braun bis schokoladenbraun (4 pl)

stark gefaltet, schokoladenfarben (4 pl)

wenig bis keines s ch okoladenfarb en

VM : Vegetatives Eyeel;

IiM : luftmycel;

ΠΡ : lösliches Pigment

* Code nach Color Harmony Manual

tabelle 2

Physiologische Eigenschaft

Stasm ITr» 314 S. lavendulae S. racemo-

IEM 1031 chromogenes Ii¹M 1081

Nitratreduktion (14

Yerflüssigung von Gelatine (1δ^δ0, 21 iEage)

!Lösliches Pigment

braun

"braun

Hydrolyse von Cellulose (21 Tage)

lackmusmilch Koagulation

Peptonisierung pH

-H-8,0

7,8

7,8

Melanin-Bildung

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5? a b e I₁ 1 e 5

ter Stämme

Ii-Rhamnose*

D-Pructose* Saccharose* Lactose Maltose Raffinose* Mannit* i-Inosit* Satriuinacetat Natriumc itrat Hatriumsuccinat

Kontrollversuch

Eohleastoffquelle Stam Er. 314 S₀ laven&ulae S_e racemochro-

Bogenes IPM 1031 ■ UM 1081

D-Xylose* - £

HI-

* In ISP beschriebene K©hleastoffquelle

Der Chlorocarcin-Kompies nnä Mimosanycin_P gebildet werden, sind bisher noch nicht aus einer vorstehend angegebenen "belcannten Mikroorganismen myces lavendulae isoliert worden_o

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-VL-

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden der Chlorocarcin-Komplex und Mimosamycin durch Züchtung von Streptoinyces lavendulae Stamm Ur. 314 hergestellt.

Die Züchtung kann prinzipiell nach üblichen Kulturverfahren für einen Mikroorganismus durchgeführt werden, es ist jedoch gewöhnlich günstig, eine Submerskultur in einem flüssigen Medium durchzuführen. Als Medium, welches sich für die Zwecke der Erfindung eignet, kann jedes beliebige Medium eingesetzt werden, welches die ITährstoffe enthält, die der Stamm Nr. 314 des Genus Streptomyces ausnutzen kann. Genauer gesagt, lassen sich synthetische, halbsynthetische oder natürliche Medien einsetzen und als Beispiele für die Bestandteile des Mediums sind folgende Substanzen 32U erwähnen : Eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Maltose, Fructose, Xylose, Stärke, Glycerin und dergl.; eine Stickstoffquelle, wie Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenöl, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumehlorid, Harnstoff und andere organische oder anorganische Stickstoffquellen, Carbonate, Phosphate oder andere Metallsalze können zusätzlich dem Medium einverleibt werden. Falls während der Züchtung übermäßiges Schäumen beobachtet wird, ist es vorteilhaft, dem Medium ein Antischaummittel zuzusetzen, wie ein Pflanzenöl, beispielsxveise Sojabohnenöl, oder ein Siliconöl, Polyoxyalkylene oder deren Derivate, Mineralöle und dergl.

Me Züchtungstemperatur liegt gewöhnlich innerhalb eines Bereiches von 27 bis 30⁰O. Da das Yolumen des Mediums sich erhöht, Ist es vorteilhaft, eine Impfkultür anzulegen und danach die in ein Medium einzuimpfen. Die Züchtungsdauer beträgt

'Ji"i3l±e!i atwa 18 Stunden bis etwa 24 Stunden.

Sie Törs
keit YQY; -ei

angegebenen Kulturbedingungen können in Abhängigur Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika verwendeten Mikroorganismen im Hinblick auf optimale Ergebnisse ausgewählt und angewendet werden.

Sie "3-si fl⁼e^:™ei3 Verfahren in der Kulturbrühe angereicherten anti-Motig'30 wirksamen Substanzen befinden sich gewöhnlich innerhalb

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- Jl? -

des Mycels und in der Kulturflüssigkeit und werden aus dem durch Zentrifugieren oder Filtration gewonnenen Myeel und dem so erhaltenen Filtrat extrahiert. Dabei können im einzelnen die erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen Substanzen mit Hilfe üblicher Verfahrensweisen isoliert, gewonnen und gereinigt werden, die gewöhnlich zur Herstellung eines Naturprodukts angewendet werden, beispielsweise durch Ausnutzung der Löslichkeit und der Iiöslichkeitsunterschiede in geeigneten lösungsmitteln, der Abtrennbarkeit und des Unterschiedes der Abtrennungsrate aus einer Lösung, der Differenz in der Adsorption an und der Affinität gegenüber verschiedenen Adsorptionsmitteln, der Differenz in der Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen und dergl. Diese Verfahren können gewünschtenfalls jeweils einzeln oder wahlweise in Kombination mehrerer Verfahren oder auch wiederholt angewendet werden. Ein beispielhaftes Verfahren wird nachstehend erläutert.

Mach Beendigung der Züchtung wird die Kulturbrühe filtriert, um die Mycelien von dem 3?iltrat abzutrennen. Das Filtrat wird mit 10 η Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Das Piltrat kann vorher auf die Hälfte bis ein Drittel seines Volumens konzentriert werden, um eine bessere Extraktionswirksamkeit bei der Extraktion mit einem Lösungsmittel zu erreichen. Bei der vorstehend erwähnten Lösungsmittelextraktion verbleiben basische wasserlösliche Antibiotika, beispielsweise Streptothricin, welches gleichzeitig durch den Stamm Hr. 314 gebildet wird, in dem Filtrat, während der Chlorocarcin-Komplex, Mimosamycin und dergl. in die Lösungsmittelphase extrahiert werden. Die Lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert, das Konzentrat wird in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst, die Lösung wird nacheinander mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat und Natriumhydroxid geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt, wobei die sauren Substanzen in die wässrige Phase übergehen. Die Lösungsmittelphase wird mit 1 η Chlorwasserstoffsäure extrahiert, mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Diese Stufe wird mehrere Male wiederholt und die lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene

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- V

eingedampft, wobei eine rolle basische Komponente erhalten wird, welche den Chlorocarein-Komplex und Mimosamycin enthält. Dieser Bestandteil wird der Säulenchromatographie an Silicagel mit Hilfe eines Gemische aus Benzol und Äthylacetat unterworfen, wobei eine überwiegend Chlorocarcin A enthaltende Fraktion erhalten wird. Bei der Entwicklung mit Äthylacetat wird dann eine überwiegend Mimosamyein enthaltende !Fraktion erhalten. Diese !Fraktionen werden durch mehrfache Chromatographie an Silicagel weiter gereinigt, wobei öhlorocarcin A als gelber Sirup und Mimosamyein in Form gelber Kristalle erhalten werden. \

Die zuerst eluierte Chromatograpliiekolaniie wird mit einem Gemisch aus Ithylacetat und Aceton weiter elniert, wobei eine überwiegend die Cblorocareine B und, C enthaltende Praktion gewonnen wird. Diese fraktion wird zur Trockene eingedampft und das Eonssntrat, ein Gemisch der Chlorocarcine B und C, wird weiter durch Chromatographie an Silicagel gereinigt, wobei Chlorocarcin B und Chlorocarcin G in ü?orm gelber Pulver erhalten werden.

Mimosamycin

Rohes Miraosamycin wird aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Äthyläther umkristallisiert, wobei die reinen gelben Kristalle erhalten werden.

Die nach der Extraktion mit 1 η öhlorwasserstoffsäure zurückbleibende Äthylacetatschicht wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in einer geeigneten Menge Methanol gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurde Wasser in ausreichender Menge gegeben, so daß ein Wassergehalt von 10 Volura-^ erzielt wurde. Die wässrige lösung wurde mit η-Hexan extrahiert, um Verunreinigungen mit geringerer Polarität zu entfernen. Der Extrakt wurde zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst. Die so erhaltene lösung wurde nacheinander mit 1 η Chlorwasserstoffsäure und 1 η Natriumhydroxid gewaschen und danach zur Trockene eingedampft, wobei als Rückstand die rohen neutralen Komponenten erhalten wurden. Momosamycin wird aus den Komponenten in gleicher Weise wie vorstehend isoliert und gereinigt.

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-TA-

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A Physikalisch-chemische Eigenschaften von Mmosamycin

1) Farbe und Zustand : Gelbe Prismen

2) Schmelzpunkt : 227 bis 231⁰C

3) Elementaranalyse :

C : 61,51 fo, H s 4,79 $, Ή i 5,87 $>

4) Molekulargewicht (Massenspektrum ) ; 233

5) Empirische Formel : C₁₂H₁₁HO.

6) UV-Absorptionsspektrum (wie in Fig. 1 gezeigt) %

nm (log ε) : 230 /·

(Schulter) (4,16)
(4,14), 396 (3,56) :
_λ Methanol ^ _{(log ε)} . ₂₇7 (3,78), 370

(3,53)

7) Infrarot-Absorptionsspektrum (wie in Fig_e 2 geseigt) ;

-⁰¹^mS ⁰^^{1 %} ¹⁶⁸⁵» ¹⁶55, 1635

1585

8) liiyiR-Spektrum (GI)Ol₅) (wie in Fig» 3 gezeigt)

: 2,10 (3H, s_e)_s 3,69 (3H_P s_o),
4,20 (3H, s.), 7,12 (IH₁, So),
8,28 (IH, s.)

9) Rotationsdisperaionsspektrum ( C = 4_S37 x 10~^_s MeOH)

(nm) ϊ -1601 (50O)₅ -1373(490) _s

»1373 (480), »1144 (470;_r -1144 (460),

»1144 (450 - 39Ο)_ΰ -1373 (380),

-1144 (370 - 350)_P

-1373 (340)_s -=1831 (33c;

-2288 (320), °2288 (3IC. -

-1831 (300), »1601 (290}.

-2059 (28O)₉ -2517 (27Oj.

-3661 (260), -5492 (250),

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10) Löslichkeit

leicht löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform, Estern,

Aceton

mäßig löslich in Äthyläther, n-Hexan unlöslich in Wasser

11) Farbreaktion

Ehrlich-Reaktion : positiv (orange) Einhydrin- und Dragendorff-Reaktion : negativ

Diese Substanz hat die biologische Eigenschaft, in bestimmtem Ausmaß aktiv gegenüber grampositiven Bakterien, Jedoch nicht ^! wirksam gegen grainnegative Bakterien und IPungi in einer Konzentration von 50 Ug/xnl zu sein.

Me Substanz ist insbesondere aktiv gegen säurefeste Bakterien und "wirksam gegen Streptomyein-hochresistente Stämme von menschlichen Tuberkelbazillen wie auch gegen normale Stämme von Tuberkelbazillen.

Die inhibierenden Mindestkonzentrationen für Myeobacterium tuberculosis werden nach 4-wöchiger Inkubation bei 57⁰C auf Sauton-Medium bestimmt und sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Tuberkelbazillen

Geprüfter Mikroorganismus inhibierende Mindest

konzentration (MIC), (pg/ml)

Myeobacterium tuberculosis

H37 R₇ 1,56

Mycobacterium bovis ITr. 10 6,25

Myeobacterium tuberculosis SMR 1,56

Mycobacterium smegmatis ATCC6O7 25,0

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Anmerkungen^ Nähragar, 37⁰C, 48 Stunden für M. smegmatis.

Flüssiges Medium nach Sauton, 37⁰C, 4 Wochen für die anderen drei Stämme.Die Stämme SMR und Matsudo sind resistent gegen Streptomycin in Dosen von 1000 ug/ml oder mehr.

Mäuse (18 bis 20 g) tolerierten die intravenöse Injektion von 50 mg/kg Mimosamycin.

Durch die vorstehend angegebenen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften wurde nachgewiesen, daß diese Substanz eine neue antibiotisch wirksame Substanz ist, die spezifische Wirksamkeit gegen Tuberkelbazillen zeigt.

Mimosamycin kann für therapeutische Zwecke als antimikrobielles Mittel oder Antituberkulosemittel in Form verschiedener pharmazeutischer Zubereitungen angewendet werden, wie in Form von Tabletten, Pulver, Suspensionen oder Sirupen zur oralen Verabreichung, Kapseln, Lösungen oder Suspensionen zur Injektion usw. Diese Zubereitungsformen können in einfacher Weise unter Verwendung des Antibiotikums nach üblichen Methoden hergestellt werden. Das Antibiotikum kann auf oralem oder parenteralem Weg, in typischer Weise durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion, verabreicht werden. Die zu verabreichende Dosis kann unter jeder gegebenen Bedingung variiert v/erden, hängt jedoch im allgemeinen von der Schwere der Krankheit und dem Alter und Körpergewicht des Patienten usw. ab. Gewöhnlich liegt die Tagesdosis für Erwachsene innerhalb des Bereiches von 200 mg bis 2 g und kann in einer einzigen oder in mehreren Dosen verabreicht werden.

Chlorocarcine A₁ B und C

Die Chlorocarcine A, B und C sind sämtlich basische antibiotisch wirksame Substanzen und befähigt, die entsprechenden Säureadditionssalze zu bilden. Zu typischen Beispielen für solche Salze gehören Salze mit anorganischen oder organischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure und dergl. Wie zu erwarten, zeigen diese Salze den gleichen Grad der antibiotischen Aktivität wie die freien antibiotischen Substanzen,

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wenn auch gewöhnlich einige Unterschiede im Hinblick auf ihre Aktivität und Löslichkeit beobachtet werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Chlorocarcine A, B und C werden nachstehend aufgeführt.

B Physikalisch-chemische Eigenschaften von Chlorocarcin A

1) Farbe und Zustand ϊ Gelber Sirup (freie Base)

2) Schmelzpunkt : 140 bis 144°C (ECl-SaIz, Zersetzung)

3) Elementaranalyse (als HGl-SaIz)

0 : 45,74 fo_t H : 4,73 f_t Έ : 6,94 ^, Cl : 16,14 $

4) Molekulargewicht (Massenspektrum) :

5) Empirische !Formel :

2HCl.H₂O

6) Spezifische Drehung :

£*&ψ = -4° (C = 1,0, Methanol)

7) ÜY-Absorptionsspektrum (gezeigt in Pig. 4, worin die ausgezogene Linie das UlT-Spektrum in KeOH and die gestrichelte Linie das W-Spektrum in 0,1 η HCl-MeOH zeigt).

nm (log ε) = 268 (3,83) nm (log 6) = 238 (3,68)

(log 8) = 263 (3,85)

(log ε) = 234 (3,68)

8) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 5 gezeigt)

IR V™?5¹3 cm"¹ : 1685, 1665, 1610

9) HMR (CDCl₃) (in Fig. 6 gezeigt)

6 x 1,23 (3H, s.)

1,95 (3H, s.,J=7Hz)

2,26 (3H, d.,J=7Hz)

4,05 (3H, s.)

6,70 (IU, s.)

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XS

10) löslichkeit

leicht löslich in Äthyläther, Estern, Chloroform, Aceton,

Alkoholen, 0,1 η HCl

mäßig löslich in n-Hexan, 0,1 β 3STaOH unlöslich in Wasser

11) !Farbreaktion

Bragendorff-Reaktion s positiv

Fitihydrin-, FeCl₃- und Anthron-Heaktioa ; negativ

C Physikalisch-chemische Eigenschaften τοώ Chlorocareiia B, freie Base

1) Farbe und Zustand : Gelbes Pulver

2) Schmelzpunkt : 78 bis 81°C

3) Elementaranalyse:

C .: 60,89 1o, H σ 6,20 $₉ Έ s' ß_s71 fo_s Cl s 5,20 <fo .

4) Molekulargewicht (Massenspektr-um) :

5) Empirische Formel ϊ

C₂₉H₃₂O₆F₃Cl . 5/4 H₂O

6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (In Mg. 7 geneigt, in der die ausgezogene linie das W-Spektrum in MeOE und die gestrichelte Linie das UV-Spektrum in.0,1 η HGl-MeGH zeigt).

^{ε) : 2€8}'⁵ C4,25)₅ 370 (3,38) _xMethanol _nm (_log g). ₂34 (3,99)_s 338 (3,34)

^HC1"^Me0H nm (log ε) : 262 (4,18), 380 (3,34)

^Xmin ^{n HC}^^Me0H im (log _€) : 231 (3,95), 354 (3,52)

7) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Pig* 8 gezeigt)

IR^^¹^ cm"¹ : 1715, 1683, 1655, 1612

III CtA,

8) HI-IR-Spektrum (CDCl₃) (wie in Eig* 9 gezeigt)

6 : 1,28 (3H, m.), 1,92 (3H, S.), 2,04 (3H, s.), 2,27 (3H, s.), 2,50 (3H, s.)_f 4,04 (3H, s.),

7098Ί2/Ί091

IH

4,08 (3H, s.), 4,42 (IH, s.), 6,84 (IH, d., J = 8Hz)

9) Zirkular-Dichroismus-Spektrum

(C = 8,63 x 10~⁵, Methanol) : δ ε(ηΐη) : -2,45 (360) (negatives Maximum) : -0,352 (320) (positives Maximum) : -13,0 (2,78) (negatives Maximum)

10) löslichkeit :

leicht löslich in niederen. Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol, itthylester ^/

mäßig löslich in n-Hexan unlöslich in Wasser

11) Farbreaktion :

Dragendorff- und Meyer-Reaktion : positiv Hinhydrin- und Ehrlich-Reaktion : negativ

3) Physikalisch-chemische Eigenschaften von Ghlorocarein G

1) Farbe und Zustand : Gelbes Pulver

2) Schmelzpunkt : 79 bis 84⁰G

3) Elementaranalyse :

G : 60,88 %₉ H : 6,11 #, H : 6,54 %, Cl : 6,71

4) Molekulargewicht (Massenspektrum) :

5) Empirische Formel

^C3O^H34°6^N3^G1 * ^{3/2 H}2°

6) ültraviolett-Absorptionsspektrum (in Pig. 10 gezeigt, in der ausgesogene Linien das TJV-Spektrum in MeOH und gestrichelte das ÜT-Spektrum in 0,1 η HCl-MeOH darstellen).

^ (i_{og 6}) : 268 (4,26), 368 (3,34) n nm (logg) : 231 (3,91) 1 η HOl-HeQH _{nm (log t}) _:. 262,5 (4,22), 380 (3,40)

7 0 9 8 12/1091

iS

0,1 η HCl-MeOH ^ _{(logg }} . _{228j5 (3>87)>} 7) Infrarot-Absorptions-Spektrum (in Pig. 11 gezeigt)

?23 cm"¹ : 1718, 1683, 1655, 1618 max

8) HMR-Spektrum (Pig. 12)

Oi 1,42 (3H, s.)_? 2₅01 (3H, s.),

2,15 (3H, s.), 2,35 (3H, s.),

2,59 (3H, s_e), 3,59 (3H, s.),

4,05 (3H, s.), 4,07 (3H, s.),

6,71 (IH, ά., J=8Hz)

9) Zirkular-Dichroismus-Spektrum

(C = 9,38 χ 10~⁵, Methanol ) iA£(nm) ι -3,88 (360) (negatives Maximum) : -2,26 (310) (positives Maximum) : -24,5 (273) (negatives Maximum)

10) Löslichkeit :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol, Ithyläther
. mäßig löslich in n-Hexan
unlöslich in Wasser

11) Farbreaktion

Dragendorff-Reaktion und Meyer-Reaktion : positiv Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion : negativ

Die Chlorocarcine A, B und C zeigen antibakterielle Wirkung und Antitumor-Wirkung und eignen sich daher als Arzneimittel. Das antimikroMelle Spektrum der Chlorocarcine A, B und C ist in !Ta belle 5 zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß die Antibiotika hauptsächlich antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien zeigen, jedoch nur geringe antibakterielle Wirkung gegen die meisten gramnegativen Bakterien aufweisen. Die Chlorocarcine A, B und C zeigen zytostatische Aktivität gegen die Leukämie L 1210 der Maus, die zum Ausdruck kommt durch 100 ?oige Zellabtötung in einer Suspensionskultur bei Konzentrationen von 0,05 ug/ml, 10 pg/ml bzw. 10 pg/ml.

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it

lab e 11 e 5

Cestorganismus

Inhibierende Mindestkonzentration (pg/ml)

Chlorocarcin Clalorocarcin Chlorocarcin ABC

Staphylococcus aureus 209 P	0,1	12,5	12, 5
Staphylococcus aureus Smith	0,02	12,5	12,5
Staphylococcus albus	0,1	50	50
Staph7^1ococcus citreus	0,1 ·	25	25
Streptococcus haemolyticus Coock Streptococcus hemolyticus 090R Streptococcus sälivarius	6,25 50 6,25	6,25 100 50	6,25 100 50
Streptococcus faecalis	25	>100	>100
Bacillus	0,2	25	25
subtilis PCI 219	50	50	50
Bacillus	0,003 0,003	0,05 0,39	0,05 0,39
cereus	12,5	50	50
Corynebacterium diphtheriae Coryjiebacteriuni ■xerosis	25	50	50
Lactobacillus
arabinosus	Ί00 70981 2/ 1	>100 091	>100
Nocardia
asteoides
Myjcobacterium
smegmatis ATCC 60?

Mycobacterium phlei

Mycobacterium

avium

Bscherichia coli

Shigella dysenteriae

Salmonella typhimurium

Klebsiella

pneumoniae

Serratia marcescens

jPseudomonas aeruginosa

Brucella abortus

Candida albicans

Saccharomyces cerevisiae

Tolura rubra Penicillium

Asperprillus

Aspergillus pryzae

Mucor inucedo

Trichophyton mentagrrophytes

100	>100	>100
100	>100	>100
>100	>100	>100
>100	>10Θ	>100
>100	>10©	>100
100	50	50
>100	>10©	>100
>100	>10Θ	>100
>100	>10©	>100
>100	>10©	>100
>100	>10©	>100
>100	>100	>100
>100	>ioo ■	>100
>100	>100	>100
>100	>100	-00
>100	>10©	:·■■·■■ 00
• 100	VS 0©

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18

1 $ Glucose enthaltender ITähragar (3 $ Glycerin enthaltender Nähragar für säurefeste Bakterien, Blutagar für Streptococcus haemolyticus und Bruceila abortus), 37°C, 24 oder 48 Stunden. Dextroseagar nach Sabouraud für Fungi, 27⁰C, 48 Stunden (72 Stunden für Irichophyton mentagrophytes).

Die Chlorocarcine A, B und C haben relativ geringe Toxizität und gute Verträglichkeit bei der Maus, wenn sie Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 18 bis 20 g durch intravenöse Injektion in einer Dosis von 25 mg/kg (A) bzw 250 mg/kg (B und C) verabreicht werden. ι

Die Antitumoraktivität von Chlorocarcin A wird durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung von Ehrlich-Earzinom als Testtumor geprüft. Dabei wurde bei allen Mäusen bzw. bei 60 % der Hause eine Verlängerung der lebensdauer von 30 Tagen oder mehr bei einer Tagesdosis von 80 bzw. 60 |ig/Maus während einer Woche beobachtet.

Prüfung

Die antibakterielle Aktivität während des äüchtungs- und Extraktionsverfahrens wird mit Hilfe der Agarplatten-Scheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 geprüft. Die Prüfung von Streptothricin erfolgt unter Verwendung von Escherichia coli Stamm P-,, da der Stamm ITr. 314 dieses Antibiotikum in großen Mengen bilden kann. Das gleichzeitige Vorliegen von Streptothricin läßt sich leicht durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität gegen E. eoli bestimmen, weil der Chlorocarcin-Komplex, d.h. die mit dem lösungsmittel extrahierte Fraktion, keine Wirkung gegen E. coli zeigt. Mimosamycin wird in ähnlicher Weise geprüft, wobei als Testorganismus Eycobacteriuin smegmatis ATCC 607 verwendet v/ird.

Die Chlorocarcine A, B und C zeigen, wie vorstehend angegeben wurde, Antitumoraktivität und können zur Behandlung von ITeoplasmen bei Warmblütlern angewendet werden. Es v/ird angenommen, daß sie sich als Mittel gegen Neubildungen bzw. Tumoren eignen. Die

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geschätzte wirksame Dosis fite Chlorocarcin A scheint innerhalb des Bereiches von IO mg bis 1 g täglich bei Erwachsenen zu liegen und die Dosierung für die Chlorocarcine B und C beträgt 100 mg bis 10 g täglich* Die Chlorocarcine können in den gleichen pharmazeutischen Zubereitungsformen verabreicht werden, wie sie vorstehend für Mimosainycin beschrieben wurden, und werden vorteilhaft parenteral und in manchen Fällen auf oralem Weg verabreicht«, Gewöhnlich wird die intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung angewendet.

Eine besondere Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der vorstehend angegebenen erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen Substanzen wird durch die nachstehenden Beispiele besserx verdeutlicht _β

Beispiel 1

A Impfkultur

Eine Suspension eines gefriergetrockneten Präparats von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 in physiologischer Kochsalzlösung wurde hergestellt und auf Schrägagar der nachstehenden Zusammensetzung aufgeimpfti

Glucose 10 g

L-Asparagin 5 g

Ki₂PO₄ 5 g

Agar 15 g

Leitungswasser 1000 ml

6,8 - 7,0

Die Züchtung erfolgte während einer Woche bei 27⁰C, wobei eine Impfkultur mit reichlichem Wachstum und zahlreichen Sporen erhalten wurde.

B Kultur

100 Schüttelkolben mit einem Volumen von je 500 ml, die je

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100 ml des nachstehend angegebenen Kulturmediums enthielten, wurden unter aseptischen Bedingungen mit den aus der vorstehend erhaltenen Impfkultur gewonnenen Sporen in einer Menge von 2 Ösenfüllungen pro Kolben beimpft.

Glucose	1.0 g
Stärke	10,0 g
Polypepton (¥ako !Pure Chemical Industries, Ltd., Japan)	10,0 g
Fleischextrakt ( » )	5,0 g
BaCl	3,0 g
Silicon EM 72 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Japan)	10 ml
Leitungswasser	1000 ml
pH	7,0

Die Züchtung erfolgte während 40 Stunden Dei 27°C mit Hilfe einer sich hin- und her bewegenden Schüttelvorrichtung (125 Ausschläge pro Minute, 8 cm Vibration).

Nach Vervollständigung der Kultur wurde der Inhalt der Kolben kombiniert und das I^ycel wurde mit Hilfe eines kontinuierlichen Zentrifugalabscheiders entfernt. Der so erhaltene obenstehende Anteil (10 1) wurde auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und danach 3 mal mit 1/3 Volumen Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert, durch Filterpapier filtriert und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,8 g einer dunkelbraunen festen Substanz erhalten wurden. Eine Lösung der Substanz in 50 ml Äthylacetat wurde nacheinander mit 5 5&Lgem wässrigem Hatriumhydrogencarbonat, 1 η Natriumcarbonat und 1 η Natriumhydroxid in Anteilen von je 25 ml geschüttelt, um saure Substanzen zu entfernen. Die organische Schicht wurde 5 mal mit 25 ml 1 η Chlorwasserstoff säure extrahiert. Die Extrakte wurden Hit der wässrigen Schicht kombiniert und der pH-Wert des Gemisches wurde mit wässrigem Ammoniak auf 9 bis 10 eingestellt und das Gemisch danach 5 mal mit dem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert und zur trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 ml einer 10 folgen wässrigen Lösung von Essigsäure gelöst und mit wässrigem Ammoniak

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auf einen pH-Wert von 9 "bis IO eingestellt und 5 mal mit der gleichen Menge Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 200 mg eines rohen Extraktes erhalten wurden, der den Chloro care inkomplex und Himosamycin enthielt.

Der so erhaltene rohe Extrakt wurde in eine mit Silicagel (70 bis 230 Maschen pro 2,54 cm, Maschenweite 0,21 bis 0,149 mm; Merck & Co., USA) gefüllte Glaskolonne (1,0 cm Durchmesser und 50 cm länge) gegeben. Die Kolonne wurde mit Gemischen von Benzol und Äthylacetat (2:1), (1:1), (1:2) entwickelt, wobei Fraktionen erhalten wurden, die vorherrschend Chlorocarcin A und die vorherrschend Mimosamycin enthielten. Jede Fraktion wurde erneut an einer Silicagelsäule ( 230 Maschen pro 2,54 cm, Merck & Co.) _N chromatographiert, wobei 5,2 g Chlorocarcin A als gelbes Pulver und 2,8 mg Mimosamycin in Form gelber Kristalle erhalten wurden.

Die erste Kolonne wurde außerdem mit Äthylacetat ; Aceton (1:1) entwickelt, wobei Fraktionen (73 mg) erhalten wurden, welche die Chlorocarcine B und C enthielten. Die so erhaltene Fraktion wurde wiederholt an einer Silieagelkolonne (230 Maschen pro 2,54 cm; Merck & Co.) unter Verwendung von Aceton als Entwieklungslösungsmittel chromatographiert. Dabei wurden 28 mg Chlorocarcin B und 7,3 mg Chlorocarcin C erhalten«

Beispiel 2

A Eine Impfkultür wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Abänderung, daß die Züchtung während 24 Stunden durchgeführt wurde.

B Vier Fermentergefässe mit einem Fassungsvermögen von jeweils 20 1, die 15 1 des nachstehend angegebenen Kulturmediums enthielten, wurden unter Druck in üblicher Weise sterilisiert.

Glucose 5_s0 g

Stärke · 5_P0 g

Polypepton (WAKO
PURE Chemical Industries Iitd. ,Japan 10 _s0 g

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Fleischextrakt (WAKO PUEE Chemical Industries Ltd., Japan) 5,0 g

NaCl 3,0 g

Leitungswasser 1000 ml

pH 7,0 - 7,2

Die Kultur wurde während 18 Stunden unter folgenden Bedingungen fortgesetzt:

Impfkultur 1 fo

Kultivierungsteinperatur 27⁰C

Rühren 550 üpm

Strömungsrate der aseptischen 1 Volumen des 1-Ie-Iiuft diums pro Minute

Antischaummittel (Silicon EIi 72) · Palis erforderlich

zugesetzt

Nach Ablauf der vorstehend angegebenen Zeit wurden die Maximalkonzentrationen bzw. Maxinsaltiter des gebildeten Chlorocarcinkoinplexes und von Mimosamyein erhalten und danach fielen die Konzentrationen rasch ab. Der pH-Wert der Kulturbrühe fiel unter 6,0"und stieg danach erneut auf etwa 6,3. Das Myeelvolumen erhöhte sich rasch und die Glucose war zu diesem Zeitpunkt fast verbraucht. Bei der Maximalkonzentration oder dem Kaxisaltiter von Chlorocarcin zeigte die Verdünnungsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als 'Testorganismus 512 Verdünnungseinheiten und die Agarplatten-Diffusionsmethode ergab eine Hemm-2one von etwa 40 mm. Die maximale Bildung von Streptothricin war in etwa 30 Stunden erreicht. Aus der aus den Fermentergefässen erhaltenen und kombinierten Kulturbrühe (etwa 60 1) wurde das Mycel mit Hilfe eines kontinuierlich arbeitenden Zentrifugalabscheiders entfernt und die Kulturflüssigkeit wurde auf 1/3 ihres Volumens konzentriert.

Tmb Konzentrat wurde mit 1 π Natriumhydroxid auf einen pH-¥ert Ton 3,0 eingestellt und 3 mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extr-ahiert. Die Extrakte wurden kombiniert und unter vermindertes Druck konzentriert', wobei 16,4 g eines Gemisches aus Gliloroearcinkoaplex und Mimosaiaycin erhalten wurden. Das

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Gemisch wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung wurde mit 50 ml 5 ^igem wässrigem Natriumhydrogencarbonat und 1 η Natriumcarbonat und danach 4 mal mit 1 η Natriumhydroxid unter Rühren gewaschen. Die Natriumhydroxidschicht enthielt saure inaktive Bestandteile^ insbesondere Stearinsäure« Die Äthylacetatschicht wurde 5 mal mit 60 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure geschüttelt, wobei basische Substanzen in die Säure extrahiert wurden. Die Säureextrakte wurden kombiniert, mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt, 5 mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert und die organische Schicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei rohe basische Substanzen erhalten wurden. Die Substanzen wurden in 60 ml einer 10 ^igen wässrigen Lösung von Essigsäure gelöst und die Lösung wurde mit wässrigem Ammoniak erneut auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und 5 mal mit dem gleichen Volumen ~~ Chloroform extrahiert« Die Extrakte wurden kombiniert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei etwa 0,98 g eines Rohprodukts erhalten wurde, das den Chlorocarcinkomplex und Mimosamycin enthielt.

Die Gesamtmenge des Rohprodukts aus 4 Fermentergefässen (jar fermenters) betrug etwa 0,2 bis 1,5 g.

Die Züchtung wurde I40 mal unter Verwendung von 4 Fermentergefässen (3ar fermenters) mit einer Gesamtmenge an Kulturbrühe von 840 1 wiederholt, wobei 8,67 g des Rohprodukts erhalten wurden.

Das in einer kleinen Menge Benzol gelöste Rohprodukt wurde auf eine Glas-Kolonne mit einem Durchmesser von 5 cm aufgegeben, die mit benzolgetränktem Silicagel (Siebgrösse 70 bis 230 Maschen pro 2,54 cm, Masehenweite 0,21 bis 0,149 mm» Merck & Co., USA) gefüllt war. Die Säule wurde mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (2 s 1 ) entwickelt«, Nachdem die Verunreinigungen eluiert waren, wurden mit dem gleichen Entwicklungslösungsmittel nacheinander die hauptsächlich Chlorocarcin A und die hauptsächlich Mimosamycin enthaltende !Fraktion eluiert. Diese Fraktionen wurden konzentriert und an Silicagel (Siebgrösse 230 Maschen pro 2,54 cm; Merck & Co.) chromatographiert, wobei 42 mg Mimosamycin und 85 mg Chlorocarcin A erhalten wurden.

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Die anfänglich verwendete Säule wxzae mit Äfhylacetat/Aceton (1:1) eliiiert, wobei ein Gemisch der Ciilorocarcine B und C erhalten wurde. Das Gemisch wurde erneut unter Verwendung von Silicagel (Siebgrösse 230 Maschen pro 2,54 cm; Merck & Co.) und mit Hilfe des gleichen Lösungsmittels chromatographiert, wobei 215 mg Chlorocarein B und 52 mg Ghlorooarcin C in reiner Eorra erhalten wurden.

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Leerseite

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Antibiotiseh wirksame Substanz Mimosamycin, gekennzeichnet durch neutrale Reaktion, das Vorliegen in Form gelber Prismen mit einem Schmelzpunkt von 227 bis 231⁰C, eine Zusammensetzung entsprechend 61,51 $ Kohlenstoff_p 4,79 $ Wasserstoff und 5?87 $>- Stickstoff, ein durch das Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht von 233 ₉ die empirische Formel ^12^11^4.' ^^as "*"ⁿ -^S · 1 gezeigte Ultraviolettabsorptionsspektrum OTy(Z!?¹ nm (log ε): 230 (Schulter) (4,16), 317 (4,14), 396 (3,56), OT λ JJ^* nm (log£) σ 277 (3,78), 370 (3,53); das in Pig. 2 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum IR ^ZT^ cm 1685, 1655, 1635, 1585; das in Fig. 3 gezeigte NMR-Spektrum (CI)Cl₃) d: 2,10.(3H, s.), 3,69 (3H, s.), 4,20 (3H, s.), 7,1.2 (IH, s.), 8,28 (IH, s.); ein Rotationsdispersionsspektrum (C= 4,37 x 10"⁷, MeOH) entsprechend ßj²⁰ (nm) : -1601 (500), -1373 (490), -1373 (480), -1144 (470), -1144 (460), -1144 (450 - 390), -1J73 (380), -1144 (370 - 350), -1373 (340), -1831 (330), -2288 (320), -2288 (310), -1831 (300), -1601 (290), -2059 (280), -2517 (270), -3661 (260), -5492 (250);

durch leichte löslichkeit in Methanol, Äthanol, Chloroform, Estern und Aceton, mäßige Löslichkeit in Äthyläther und η-Hexan und Unlöslichkeit in Wasser; positive Reaktion gegen Ehrlich-Reagenz und negative Reaktion gegen Uinhydrin- und Dragendorff-Reagenz.

2. Antibiotisch wirksame Substanz Chlorocarcin A, gekennzeichnet durch basische Reaktion, Vorliegen in Form eines gelben Sirups mit einem Schmelzpunkt von I40 bis 144°C (Zersetzung,

QRiSSiSiAL INSPECTED

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als HCl-SaIz) eine Zusammensetzung in Form des HCl-Salzes entsprecliend 45,74 # Kohlenstoff, 4,73 % Wasserstoff, 6,94 # Stickstoff und 16,14 ^ Chlor; ein durch das Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht von 535, eine empirische Formel

2HC1«H₂O; eine spezifische Drehung von U*]^ = -4° (c = 1,0, Methanol); das in Pig. 4 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum nm (log 2) : 268 (3,83), ÜT»^ nm (logg): 238 (3,68), HCl-MeOH _{nffi ( g)} . _{263 ( 85)} ^MeOH-0,1 η HCl

IXt X Ii

nm (log £): 234 (3,68); das in ]?ig. 5 gezeigte Infrarot-Absopp-

tionsspektrum IR ^^^3 em"¹? 1685, 1665, 1610; das in Pig. 6 gezeigte MtlR-Spektrum (ODOl₅) (f: 1,23 (3H, s.), 1,95 (3H, s., J = 7 Hz), 2,26 (3H, s., J = 7 Hz), 4,05 (3H, s.), 6,70 (IH, s.); durch leichte Löslichkeit in Äthyläther, Estern, Chlor-oform, Aceton, Alkoholen und 0,1 η HCl, mäßige Löslichkeit in n-Hexan und 0,1 η NaOH und Unlöslichkeit in Wasser? positive Reaktion gegenüber Dragendorff-Reagenz und negative Reaktion gegenüber Uinhydrin-, PeOl^₅ und Anthron-Reagenz, und deren Säureadditionssalze. ^x

3. Antibiotisch wirksame Substanz Chlorocarcin B, gekennzeichnet durch basische Reaktion, Vorliegen in Form eines gelben Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 78 bis 81⁰C; eine Zusammensetzung entsprechend 60,89 $> Kohlenstoff, 6,20 $ Wasserstoff, 6,71 % Stickstoff und 5,20 $> Chlor; ein durch das Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht von 553; eine empirische Formel CggH^gOgIUCl^A H₂O; das in Fig. 7 gezeigte Ultraviolett-

Absorptionsspektrum UV λ?¹??⁹ nm (logg) : 268,5 (4,25), 370

(3,38), W^|°^H nm (log 8) : 234 (3,99), 338 (3,34),

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HGl-MeOH _{m (lQg} _£) . _2$2 (_{4fl8)f 380} (3,34),

max

^lmin ^{Ώ HC1}"^Me0H am (log e) ·. 231 (3,95), 354 (3,32)? das in Pig. 8 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum IR $_mas: 3 cm ϊ 1715, 1683, 1655, 1612; das in Pig. 9 gezeigte BM-Spektrum (CDCl₃) d: 1_S28 (3H, m.), 1,92 (3H, s..), 2,04 (3H, s.), 2,27 (3H, s.), 2,50 (3H₉ s.), 4,04 (3H, B.), 4_sO8 (3H, s.), 4,42 (IH, s.), 6,84 (IH, d., J = 8Hz)? durch ein Zirkular-Dichroismus-Spektrum (C = 8,63 X 10~⁵, Methanol) aS(nm) : »2,45 (360) (negatives Maximum) : -O₉352 (320) (positives Maximum) ι -13,0 (2,78) (negatives Maximum); leichte löslichkeit in Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol und Ithyläther, mäßige Löslichkeit in η-Hexan und TJnlöslichkeit in Wasser; positive Reaktion gegenüber Dragendorff- und Meyer-Seagenz und negative Reaktion gegenüber Mnhyärin- ixn& Shrlich-Reagenz; und deren Säureadditionssalze.

4. Antibiotiseli wirksame Substanz Chlorocarein C, gekennzeichnet durch basische Reaktion«, Vorliegen in Porm eines gelben Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 79 bis 84⁰C; eine Zusammensetzung entsprechend 60,88 fo Kohlenstoff, 6,11 fo Wasserstoff, 6,54 io Stickstoff und 6,71 # Chlor; ein durch das Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht von 567I eine empirische Pormel C^₀H₅₄OgIf₅Cl* 3/2 HgO; das in Pig» 10 gezeigte TOtravio2.e\-^: ·- Absorptionsspektrum W^&? ^m (log £) % 268 (4j26)₂ 36β ^f'^ :\ - MeOH __ _fln„ _e\ „ _oxl /^ Q₁^ _τπΓ^0,1 η HCl-MeOH) „,., ,·

262,5 (4,22), 380 (3,40), W^|J ^Ώ HCl-MeOH ^ _(log 228,5 (3,87), 351 (3,36)1 das.in Pig_ö 11 gezeigte Absorptionsspektrum IR V25¹S cm"¹ % 1718, 1683, 1655

max

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das in Fig. 12 gezeigte KMR-Spektrum «f: 1,42 (3H, s.), 2,01 (3H, s.), 2,15 (3H, 3.), 2,35 (3H, s.), 2,59 (3H, s.), 3,59 (3H, s.) 4,05 (3H, s.), 4,07 (3H, s.), 6,71 (IH, d.,J= 8Hz); ein Zirkular-Oichroismus-Spektrum (C = 9,38 χ ΙΟ"-⁵; Methanol) entsprechend Δ € (mn) : -3,88 (360) (negatives Maximum) ; -2,26 (310) (positives Maximum) } -24,5 (273) (negatives Maximum; leichte Löslichkeit in Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol und Äthyläther, mäßige löslichkeit in η-Hexan und TJnlöslichkeit in Wasser; und deren Säureaäditionssalze.

5. "Verfahren zur Herstellung der antiMotisch v/irksamen Substanzen Kimosamyein "nd Ohlorocarcin A, Chlorocarcin B und Ohlorocarcin C und deren Säureadditionssalzen, dadurch g e - κ e β η ζ e i c Ii β e t , daß man Streptomyces lavendulae Stamm ITr ο 314 auf einem üblichen Kulturmedium züchtet, den Komplex der- Chlorocareiiis mid Mimosamycin aus dem KuIturnedium gewinnt rad Mimosanycin nvA die Ghlorocarcine A, B und C isoliert und gegebenenfalls in die Säureadditionssalze überführt.

6. Verfahren nacli Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung durch Submerskultur in einem flüssigen EuItürmedium durchführt.

To ¥er!?fahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch g e k e η η zeichnet ₉ daß man die Züchtung bei einer Temperatur swlseben 27 und 30⁰C durchführt.

S₃ ^'%r<z'uoittelj welches einen Wirkstoff und einen üblichen

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pharmazeutischen Träger sowie gegebenenfalls übliche Adjuvantien enthält, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff eine antibiotisch wirksame Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

9. Arzneimittel, welches einen Wirkstoff und einen üblichen pharnazeutischen !rager sowie gegebenenfalls übliche Adjuvantien enthält, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff eine antibiotisch wirksame Substanz enthält, die nach einem der Ansprüche 5 bis 7 gewonnen wurde.

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