DE2424707A1

DE2424707A1 - Antibiotikum nr. 1998, seine salze mit saeuren, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel

Info

Publication number: DE2424707A1
Application number: DE2424707A
Authority: DE
Inventors: Sadayuki Horiguchi; Masayuki Mizuno; Yukiko Mizuno; Tadaaki Ohoka; Yukiji Shimojima; Isao Takeda
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1973-05-22
Filing date: 1974-05-21
Publication date: 1975-01-23
Also published as: US3907989A; GB1440288A; JPS5610031B2; FR2230343B1; CH595443A5; JPS505598A; NL7406919A; FR2230343A1; NL156925B

Description

ASAHI KASEI KOGYO KABUSHIKI KAISHA,
Osaka, Japan

"Antibiotikum Mr. 1998, seine Salzemit Säuren, Verfahren zu seiner¹ Herstellung, Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel"

Priorität: 22. Mai 1973, Japan, Nr, 56 29.7/73

Die Erfindung betrifft die als Antibiotikum Nr. 1998 bezeichnete Verbindung und ihre Salze mit Säuren, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel, die das Antibiotikum Nr. 1998 enthalten.

Als Antibiotika, die von Mikroorganismen der Gattung Bacillus gebildet werden, sind Bacitracin, Colistin, Gramicidin, Tyrothricin, Polymixin und Brevolin bekannt. Diese Verbindungen gehören zu den Antibiotika vom Peptid-Typ.

Gegenstand der Erfindung ist das Antibiotikum Nr. 1998 und seine Salze mit Säuren, dessen Hydrochlorid einen Schmelzpunkt von

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142 bis 145 C und ein durch Osmometrie in Pyridin bestimmtes Molekulargewicht von 540 und die Sumitienformel C₀₀H₀-N₀O₀Cl₀ aufweist und 50,1 Prozent Kohlenstoff, 6,3 Prozent Wasserstoff, 24,1 Prozent Sauerstoff, 7,6 Prozent Stickstoff und 12,78 Prozent Chlor enthält und einen spezifischen Drehwert /^Z_n = -89,0 (c = 1% in Athen öl) besitzt.

Ein zur Herstellung des Antibiotikums Nr. 1998 geeigneter Mikroorganismus wurde 1965 aus einer Bodenprobe isoliert; der Mikroorganismus gehört zur Gattung Bacillus. Ss können auch Muten-" ten des Mikroorganismus eingesetzt werden.

Mikrobiologische Eigenschaften:

a) Wuchsformen auf verschiedenen Medien:

1) Nährbouillon: gleichförmige Trübung, keine Haut.

2) Fleischbrühe-Agar: glattflächige Kolonien, manchmal rauh, verstreut, flach, durchscheinend bis durchsichtig, elfenbeinfarben bis weiß oder cremefarben.

3) Glucose-Fleischbrühe-Agar: Besseres Wachstum als auf Fleischbrühe-Agar, gleiche Wuchsform wie bei 2).

4) Gelatine: allmähliche Verflüssigung.

5) Peptonwasser: Wachstum etwas eingeschränkt, unterschiedliche Trübung.

6) Lackmus-Milch: keine Koagulation oder Peptonisierung, Lackmus wird nicht verfärbt.

7) Kartoffel: blaß gelbbraun, verstreut, mit feinen Runzeln.

8) Glucose-Bouillon: kurze Stäbchen, 0,5 bis 0,9 mal 2 bis

5 Mikron, gram-positiv, Sporen elliptisch bis zylindrisch.

b) Physiologische Eigenschaften:

1. Optimale Wachstumsbedingungen: bei einem pH-Wert von 5

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bis 8 und einer Temperatur von 27 bis 40 C unter aeroben Bedingungen.

2. Wachstumsbedingungen: pH 4 bis 9; 5 bis 50 C, aerob.

3. Gr amf är bu ng: po s iti ν

4. Färbung mit sauren Farbstoffen: negativ.

5. Methylrot-Test: positiv.

6. Voges-Proskauer-Test (Bildung von Acetylmethylmethanol): positiv.

7. Indolbildung: negativ.

8. Schwefelwasserstoffbildung: negativ. ' 9. Ammoniakbildung: negativ.

10. Nitratreduktion: negativ.

11. Katalasebildung: positiv.

12. Gelatineverflüssigung: allmählich.

13. Stärkehydrolyse: negativ.

14. Verwertung von Citronensäure: positiv.

15. Milchgerinnung.: negativ.

16. Reduktion von Farbstoffen, wie Lackmus und Methylenblau: negativ.

17. Harnstoffverwertung: negativ.

c) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Bildung von Säure aus Fructose, Saccharose, Glucose und Glycerin; weder Gas noch Säure werden aus Mannose, -' -Methy Iglukos id, Inulin, Inosit, Arabinose, Xylose, Maltose, Salicin, Galactose, Sorbit, Raffinose, Trehalose, Dextrin und Cellulose gebildet.

Die Prüfung dor vorstehend genannten Eigenschaften des Mikroorganismus nach "Sergey's Manual of Determinative Bacteriology,

L- " J

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7. Auflage (1957), ergab, daß die wichtigsten Eigenschaften des Mikroorganismus mit denen eines Stammes der Art Bacillus brevis gut übereinstimmen. Der Hauptunterschied zwischen Bacillus brevis ATCC 8185 und dem erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus liegt darin, daß bei Bacillus brevis ATCC 8185 die Gram-Variation positiv und der Voges-Proskauer-Test negativ verlaufen, während beim Mikroorganismus der Erfindung das Umgekehrte eintritt. Selbst bei Züchtung des. Mikroorganismus Bacillus brovis ATCC 8185 in einem Medium, das für Mikroorganismen geeignet ist, die das Antibiotikum Nr. 1998 bilden, wurde dieses Antibiotikum nicht gebildet. Aus diesen Gegebenheiten wird geschlossen, daß der Mikroorganismus der Erfindung eine Variante der Art Bacillus brevis darstellt. Der Mikroorganismus wird als Bacillus brevis AS 1998 bezeichnet. Der Mikroorganismus wurde beim Northern Regional Research Laboratory (NRRL) unter der Nr. B-8029 hinterlegt. Alle zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismen, die zur Bildung des Antibiotikums 1998 befähigt sind, können im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Nr. 1998 und seiner Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Bildung des Antibiotikums Nr. 1998 besitzt, unter aeroben Bedingungen Temperaturen von 5 bis 50 C in einem Nährmediura mit einem pH-VJert von 4 bis 9 züchtet, das Antibiotikum aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Säure in das Salz überführt.

Die Fermentation und die Isolierung des Antibiotikums werden in

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^: — 5 —

an sich bekannter Weise durchgeführt.

Als Nährstoffe werden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls Vitamine und andere für das Wachstum des Mikroorganismus nötigen Zusätze verwendet. Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Sucrose, Mannit, Tre-halose, Fructose, Glycerin, organische Säuren und Melassen. Stickstoff quellen sind beispielsweise Pepton, Sojabohnenmehl, ' Maisquellwasser, Aminosäuren, Hefee<trakt, Fleischextrakt und Ammoniumsalze. Anorganische Salze sind beispielsweise Natrium-, Kalium-, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat und anorganische Phosphate,

Die Fermentation wird vorzugsweise aeroben Bedingungen in einem Zeitraum von 12 bis 72 Stunden bei Temperaturen von 27 bis 40°C und einem pH-Wert von 5 bis 8 durchgeführt.

Nach Beendigung der Fermentation wird das gebildete Antibiotikum nach üblichen Methoden aus der Kulturbrühe isoliert. Beispielsweise kann ein Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln in Kombination mit Gelfiltration oder Chromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschern oder Adsorbentien angewandt werden. Eine Ausführungsform ist nachstehend angegeben»

Die Kulturbrühe wird mit einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer Base auf einen pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt und anschließend auf eine Säule gegeben, die mit einem Kationenaustau-

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·· D — -

scherharz in der H⁺-Form beschickt ist, wobei das Antibiotikum Nr. 1998 am Austauscherharz adsorbiert wird. Die Austauschersäule wird mit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Mineralsäure eluiert. Fraktionen mit antibiotischer Wirkung gegenüber Staphylococcus aureus werden gesammelt und mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz in der OH~-Form neutralisiert. Die neutralisierte Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt und anschließend mit einem Alkohol mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder Dioxan extrahiert. Nach dem Abtrennen von unlöslichen Bestandteilen wird die erhaltene Lösung konzentriert und auf eine Säule gegeben, die mit einem Molekularsieb, Sephadex LH-20, beschickt ist, das mit einem Alkohol mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen äquilibriert wurde. Die Gelfiltration wird mit diesem Alkohol als Laufmittel durchgeführt, wobei der Wirkstoff durch Eluieren von der Hauptmenge des braunen Produktes getrennt wird. Die Fraktionen des Wirkstoffs werden unter vermindertem Druck konzentriert und anschließend an einer Säule chrotnatographiert, die mit Cellulose, wie Avicel, beschickt ist. Als Laufmittel dient ein Gemisch aus Butanol, Aceton und Wasser (4:5:1), mit dem auch die Säule eingeschlämmt wurde. Die eine antibiotische Wirkung gegen Staphylococcus aureus zeigenden Fraktionen werden gesammelt und konzentriert. Durch Zugabe von Diäthylather zum erhaltenen Konzentrat unter Rühren wird das Antibiotikum als weiße Fällung erhalten. Die Fällung wird mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Man erhält das Antibiotikum Nr. 1998 als weißes Pulver. Das Antibiotikum Nr. 1998 kann durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Apfelsäure oder Weinsäure, in ein Salz überführt

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werden.

Das Antibiotikum Nr. 1998 kann aus der Kulturbrühe durch Extrahieren des Filtrats der Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren niederen Alkohol und anschließendes Abdestillieren des Lösungsmittels als Rohprodukt erhalten werden.

Das Antibiotikum Nr. 1998 ist neu und gehört nicht zur vorstehend genannten Gruppe der Antibiotika vom Peptid-Typ. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie biologischen Wirkungen des Hydrochlorids des Antibiotikums Nr. 1998 sind nachfolgend angegeben.

I. Physikalische und chemische Eigenschaften:

1) weißes Pulver

2) F. 142 bis 145°C

3) Elementaranalyse: C 50,1 %\ H 6,3 %; N 7,6 X; 0 24,1 %; Cl 12,78 %.

4) Molekulargewicht: 540 (osraometrisch)

5) Bruttoformel: C₀-H-.N-O₀Cl₀

Zo OQ ά ο Ζ

6) spezifischer Drehwert: lPjo ⁼ ~89,0 (c = 1% in Äthanol)

7) Löslichkeit: leicht löslich in niederen Alkoholen, wie Methanol, Äthanol und Butanol, sowie in Dioxan; löslich in Aceton und Wasser; mäßig löslich in Äthylacetat .und Chloroform; unlöslich in η-Hexan, Petroläther und Benzol.

8) UV-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 1

9) IR-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 2

10) Stabilität: stabil bei einem pH-V.⁷ert von 3 bis 8, all-

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mähliche Veränderung bei pH 9 und darüber bereits bei Raumtemperatur.

11) Farbreaktioneni

Eisen(III)-Chlorid purpur Erlieh-Reaktion gelb

Natriumnitrosylprussiat rot (alkalisch)

Ninhydrin rosastichig-gelb

Kaliumpermanganat Entfärbung (alkalisch)

Dragendorff-Reaktion negativ Biuret-Reaktion Grünfärbung Molisch-Reaktion negativ.

Silbern!trat negativ

(ammoniakalisch)

12) R_f~Wert im Papierchrornatogramra:

0,65 (Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:5), obere Schicht als Laufmittel

0,81 (Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser 15:10:3:12) 0,40 (Butanol, mit Wasser gesättigt) 0,12 (Wasser)
0,90 (VJ as s er /Aceton 1:1) 0,71 (3 Prozent Ammoniumchlorid in Wasser). Die Feststellung des Antibiotikums erfolgte bioautographisch unter Verwendung von Staphylococcus aureus und an Hand der blaustichig-weißen Fluoreszenz im UV-Licht.

II. Das antibiotische Wirkungsspektrum und die minimale Hemmkonzentration des Antibiotikums sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die Untersuchungen wurden nach der Agar-Strichmethodo

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und auf Fleischbrühe-Agar als Nährboden durchgeführt.

Tabelle I

Mikroorganismus

(Agarstrich-Methode)^ Minimale Hemmkonzentration ( ■ /ml)

Escherichia coli K-12 Vibrio metschnikovii IAM 1039 Pseudomonas aeruginosa Xanthomonas oryzae IFO 3835 Salmonella typhimurium Proteus vulfraris IFO 30^5 Alcaligenes faecalis IFO 3l60 Staphylococcus aureus FDA MJcrococcus flavus IFO 3242 Sarcina Iu te a ·

Serratia marcescens IFO 3046 Bacillus subtilis Corynebacterium sepedonicum IFO 3306 Microbacterium 607 Candida albicans IFO Ο583 6,25 1

100

>100

>100_

>100"

>100 >100 >100 >100 ^100 >100 >100

Akute Toxizität bei Mäusen!

intraperitoneal
oral

50» m/kg

8,7 275

Therapeutische Uirkung bei experimentell hervorgerufenen Infek tionen bei Tieren:

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Tabelle II

Staphylococcus aureus (bei Hausen)

Vibrio metschnikovii ( bei Hähnen)

Subkutan Oral

(CD₅₀, mgAg) (CD₅₀

10,5

3,5

26,5 10,2

₅₀ (dosis curativa) ist die Dosis, bei der 50 Prozent der behandelten Tiere überleben.

Das neue Antiobiotikum Nr. 1998 und seine Salze sind gegen grampositive und -negative Bakterien sehr wirksam und eignen sich zur Behandlung von durch Staphylococcus aureus und Vibrio metschnikovii hervorgerufenen Infektionen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Prozentangaben bedeuten Gewichtsprozent pro Volumprozent.

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- li -

Beispiel 1

Bacillus brevis AS 1998 (NRRL B-8029; FERM P-1989) wird in einem 500 ml fassenden Schüttelkolben auf 100 ml eines vor der Sterilisation auf pH 1 eingestellten Nährmediums überimpft, das 1 Prozent entfettetes Sojabohnenmehl und 1 Prozent Maisquellwasser enthält. Zur Herstellung einer Anzuchtkultur wird die Züchtung 24 Stunden bei 30⁰C auf einer Schüttelmaschine durchgeführt. Anschließend werden.5 Prozent der Anzuchtkultur ' in einen 5 Liter des vorgenannten Nährmediums enthaltenden Glasfermenter überimpft, und die Züchtung wird 16 Stunden unter Belüftung und Rühren (Belüftung 5 Liter/min; 500 U/min) bei 30°C durchgeführt. Der Inhalt des Fermenters wird mit 6 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. In einem kontinuierlich arbeitenden Zentrifugalabscheider wird die KuItürflüssigkeit abgetrennt, die anschließend mit 6 η Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine Säule gegeben wird, die mit 300 ml eines Ionenaustauscherharzes IRC-50 in der H^-Form beschickt ist. Nach gutem Waschen mit Wasser wird die Austauschersäule mit 0,05n Salzsäure eluiert, wobei nur die gegenüber Staphylococcus aureus antibiotisch wirksamen Fraktionen gesammelt werden, die anschließend in einem schwachbasischen Ionenaustauscherharz IR-45 in der OH~-Form neutralisiert werden. Die neutralisierte Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck zu einem Sirup konzentriert, der zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile mit Methanol extrahiert wird. Der erhaltene Extrakt wird konzentriert und auf eine Säule mit einem Molekularsieb (Sephadex LH—20) gegeben, das mit Methanol äquilibriert wurde. Anschließend wird mit Methanol als Laufmittel . eine Gelfiltration durchgeführt. Es werden nur die Fraktionen

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gesammelt, 41· ein· antibiotisch· Wirkung »«igen, und anschliess«nd unter vereindertem Druck konzentriert. Das Konsentrat wird durch Säulenchroaiatographie weiter gereinigt. Dazu wird es auf eine Säule (Innendurchmesser 3,5 cm, Länge 80 cm) gegeben, in die feinkristalline Cellulose (Avicel) mit einem Gemisch aus Butanol, Aceton und Wasser (4rB:l) eingeschlämmt wurde, das auch als Laufmittel diente Jeweils 10 ml des Eluats werden in einem Fraktionenkollektor aufgefangen. Die das Antibiotikum enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mit etwa dem zehnfachen Volumen Diäthylather versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 2 bis 6°C stehengelassen. Die gebildete Fällung wird mit wenig Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Ausbeute etwa 260 mg des Hydrochlorids des Antibiotikums Nr. 1998 in Form eines weißen Pulvers.

Beispiel 2

Bacillus brevis AS 1998 (NRRL B-8029, FERM P-1989) wird in einem 500 ml fassenden Schüttelkolben in 100 ml eines Nährmediums überimpft, das 1 Prozent entfettetes Sojabohnenmehl, 1 Prozent Glucose, 0,2 Prozent Dikaliumphosphat, 0,05 Prozent Magnesiumsulfat, 0,001 Prozent Calciumchlorid und 0,3 Proeent Natriumchlorid enthält und vor der Sterilisation auf pH 7 eingestellt wurde. Die Züchtung wird 24 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C . durchgeführt. Anschließend werden 2 Liter der Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird zweimal mit 700 ml Butanol extrahiert und der erhaltene Extrakt zu einem Sirup konzentriert. Das Konzentrat wird zur Beseitigung von unlöslichen Bestandteilen mit Methanol ex-

,trahiert und der erhaltene Extrakt nach dem Konzentrieren auf

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etwa 10 ml auf eine Säule gegeben, die Mit einem Molekularsieb (Sephadex LH-20) beschickt iit und mit Methanol äquilibriert wurde. Mit Methanol als Laufmittel wird eine Gelfiltration durchgeführt, wobei nur die Fraktionen gesammelt werden, die gegenüber Staphylococcus aureus eine antibiotische Wirkung zeigen· Die vereinigten Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft und ergeben 120 rag des rohen Antibiotikums Nr. 1998 als blaßgelbbraunes Pulver, das nach Beispiel 1 durch Chromatographie an Cellulose weiter gereihigt werden kann·

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Claims

Patentansprüche

LW Antibiotikum Nr. 1998 und seine Salze mit Säuren, dessen . Hydrochlorid einen Schmelzpunkt von 142 bis 145°C und «in durch Osroometrie in Pyridin bestimmtes Molekulargewicht von 540 und die Sumraenformel C₀-H,.N-OqCI₀ aufweist und . 50,1 Prozent Kohlenstoff,
6,3 Prozent Wasserstoff,

24,1 Prozent Sauerstoff,
7,6 Prozent Stickstoff und

12,78 Prozent Chlor

enthält und einen spezifischen Drehwert §tj * « -89,0 (c-- 1* in Äthanol) besitzt.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der unter aeroben Bedingungen die Fähigkeit zur Bildung des Antibiotikums Nr. 1998 besitzt, in einem Nährmedium mit einem pH-Wert von 4 bis 9 züchtet, das Antibiotikum aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls durch Ansetzen mit einer anorganischen oder organischen Säur« in das entsprechende Salz überführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennezeich.net, daß man den Mikroorganismus bei etwa 27 bis etwa 40⁰C in einem Nährraedium mit einem pH-Wert von 5 bis 8 züchtet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus brevis AS 1998 (NRRL B-8029)

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verwendet·
5· Bacillus previs AS 1998 (NRRL B-8029) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2 bis 4.
6. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung nach Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/ oder Hilfsstoffen.

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