DE2209018C2 - Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid und dieses enthaltendes Tierfuttermittel - Google Patents
Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid und dieses enthaltendes TierfuttermittelInfo
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Description
Erfindungsgegenstand ist sowohl das im Anspruch 1 angegebene Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid
wie auch das im Anspruch 2 genannte Tierfuttermittel.
Die rationelle Produktion tierischer Proteine für den menschlichen Verzehr ist in der Landwirtschaft ein
ständiges Problem. Es gibt daher bereits viele Mittel, darunter zahlreiche Antibiotica, die bei ihrer Verwen-
O | 2N- |
J I | |
-CH = C-C-CH = | |
N ι |
|
HN NHR2 C Μ |
|
Il
NH |
dung als Wirkstoffe in Futtermitteln zu einer Steigerung der Gewichtszunahme und Verbesserung der Futterverwertung
bei Nutztieren, insbesondere bei wachsenden Küken und Schweinen beitragen.
Aus DE-PS 12 28 501 ist die Verwendung von antibiotisch wirksamen Bis-(5-nitrofurfuryliden)-acetonguanylhydrazonen
oder deren Säureadditionssalzen, insbesondere deren Hydrochloriden, der Formel
worin Ri ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder eine
niedere Alkylgruppe, R2 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe, X eine saure Gruppe und η die
Zahl 1, 2 oder 3 bedeuten, wobei η für 1 steht, wenn X der Rest einer einbasischen Säure ist, η für 1 oder 2 steht,
wenn X der Rest einer zweibasischen Säure ist, und π für 1, 2 oder 3 steht, wenn X der Rest einer dreibasischen
Säure ist, als mit den üblichen ernährungsmäßig ausgeglichenen Futter- oder Mischfuttermitteln, insbesondere
Geflügelfuttermitteln, oder mit dem Trinkwasser in Mengen von etwa 5 bis 500 mg, insbesondere 10
bis 100 mg, je Kilogramm Futtermittel verabreichbares Beifuttermittel bekannt ist. Ein Wirkstoff gemäß obiger
Formel, worin Ri und R2JeWeUs Wasserstoff bedeutet, η
für 1 steht und X Chlor darstellt, befindet sich als Wachstumsfaktor, der beispielsweise dem Futter von
Hühnern oder Schweinen beigemischt wird, unter der Bezeichnung NITROVIN (PESON oder PAYZONE) im
Handel.
Weitere als Wachstumsfaktoren bei Nutztieren bekannte Antibiotica sind beispielsweise die unter den
Bezeichnungen Monensin. Payzone, Tylosin, Poxarsone oder Bacitracin im Handel erhältlichen Produkte.
Die die bekannten Wachstumsfaktoren enthaltenden Futtermittelzusätze sind bezüglich ihrer Wirksamkeit
jedoch nicht immer befriedigend. Aufgabe der Erfin-
dung ist daher die Bereitstellung eines neuen Antibioticums, das sich im Vergleich zu den bekannten
Produkten durch eine verbesserte Wirksamkeit hinsichtlich der Futterverwertung und der erzielbaren
Gewichtszunahme bei Nutztieren, insbesondere Küken, auszeichnet.
Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das aus den Ansprüchen hervorgehende Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid
und das dieses als Wirkstoff enthaltende Tierfuttermittel gelöst.
Die besondere Wirksamkeit dieses Antibioticums im Vergleich zu den oben erwähnten und als Wachstumsfaktoren
bekannten Antibiotica geht aus der später folgenden Tabelle 111 hervor, deren Daten die mit dem
vorliegenden Mittel bei der Behandlung von Küken
erzielbare wesentlich höhere Gewichtszunahme als mit den bekannten Handelsprodukten deutlich machen.
Das Glycopeptid-Antibioticum-A-4696 wird durch Züchten des Microorganismus Actinoplanes sp. ATCC
23342 in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen erzeugt. Das Antibioticum
wird aus der filtrierten Fermentationsflüssigkeit durch Adsorption an ein aktiviertes Adsorbens und
Eluieren mit einem sauren Lösungsmittel abgetrennt.
Als gereinigte kristalline Substanz laßt sich das Antibioticum-A-4696 durch Adsorption an einem
angesäuerten chromatographischen Adsorbens und Eluieren mit einem sauren Lösungsmittel gewinnen. Das
Antibioticum-A-4696 wird dann in einer wäßrigen Methanollösung in das erfindungsgemiße Hydrochloridsalz
überführt und durch Zusatz von Aceton und Abfiltrieren des entstandenen Niederschlags als reines
kristallines Salz erhalten.
Das Glycopeptid-Antibioticum-A^ege-Hydrochlorid
ist eine fs;t>lose kristalline Verbindung mit einem
Schmelzpunkt von über 2200C. Es ist löslich in Wasser
und unlöslich in Methanol, Aceton, Äther, Chloroform, Pyridin, Benzol und aliphatischen Kohlenwasserstoffen.
Es ist in Lösung über einen pH-Bereich von etwa 1,0 bis etwa 10,0 bei Temperaturen bis zu etwa 27°C sehr
beständig.
Die elektrometrische Titration von A-4696-Hydrochlorid
in Wasser oder in einer Mischung aus Dimethylformamid und Wasser (2:1), ergibt eine
Kurve, die sich im Bereich von pH 6,0 bis 13,0 einer geraden Linie mit einer Steigung von etwa 0,14 nähert.
Ein Mittelwert aus mehreren Microanalysen ergibt für A-4696-Hydrochlorid etwa folgende Elementarzusammensetzung
in %: C 51,33; H 5,79; N 5,46;O 30,96;Cl
6,72. Das aus dem osmotischen Dampfdruck bestimmte Molekulargewicht beträgt 1158.
Der spezifische Drehwert ([alpha]o) von A-4696-Hydrochlorid
bei 25°C beträgt -42,3° (C= 1, H2O). .
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-4696-Hydrochlorid in sauren und neutralen Lösungen zeigt
ein einziges Absorptionsmaximum bei 276 nm mit einem
Extinktionskoeffizienten E J^, von 45. In basischer
Lösung zeigt A-4696-Hydrochlorid ein einziges Absorptionsmaximum bei 300 nm mit einem Extinktionskoeffizienten
E !cn. von 65.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-4696-Hydrochlorid in einer Mineralölanreibung zeigt Fi g. 1 der
beigefügten Zeichnung. Im Bereich von 2,0 bis 15,0 Micron lassen sich folgende Absorptionsmaxima unterscheiden:
3,0. 5,8, 5,9, 6,03, 6,15, 6,28, 6,63, 6,85, 7,27, 7,75,
8,1,8,25,8,9,9,t, 9,9,10,1 Micron.
Das papierchromatographische Profil von A-4696-Hydrochlorid
zeigen die in der folgenden Tabelle I angegebenen Rf-Werte. Die Werte wurden in jedem
Fall mit Whatman-Papier Nr. 1 und dem angegebenen Lösungsmittelsystem erhalten. Dier Lage des Antibioticums
auf dem Chromatogramm wurde durch Bioautographie mit Bacillus subtilis als Testorganismus
ermittelt.
Lösungsmittelsystem
Rr-Werte*)
9
10
11
10
11
0,74 0,87 0,59 0,77
*) Der Rf-Wert ist als das Verhältnis der von dem Antibioticum von der Ursprungsstelle aus zurückgeiegten Strecke zu
der Strecke, die die Lösungsmittelfront von der Ursprjngsstelle
aus zurückgelegt hat, definiert.
Erläuterung der Lösungsmittelsysteme:
1. Mit Butanol gesättigtes Wasser plus 1% p-Toluolsulfonsäure.
2. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 1% p-ToluolsuIfonsäure.
3. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 1 % p-Toluolsulfonsäure und 1 °/o Piperidin.
4. Wasser/Methanol/Aceton (12:3:1). Die Lösung
wird mit NH4OH auf pH 10,5 eingestellt und dann wird mit H3PO4 auf pH 7,5 vermindert.
5. Methanol/0,1 nHCl(3:l).
6. 1% Methylisobutylketon plus 0,;Ί% NH4OH in
Wasser.
7. 7% Natriumchlorid plus 2,5% Methylisobutylketon in Wasser.
8. 10% Propanol in Wasser.
9. Butanol/Äthanol/Wasser (150 : 15 : 13,5)
10. Propanol Pyridin/Essigsäure/Wasser (15:10:3:12)
11. Wasser/Äthanol/Essigsäure (70 : 24 :6).
Papierchromatographie von A-4696-Hydrochlorid
Lösungsmittelsystem
Das neue Antibioticum-Hydrochlorid nach der Erfindung hat hemmende Wirkung auf das Wachstum
vieler Microorganismen, die für Menschen, Tiere und Pflanzen pathogen sind, und ist deshalb zur Unterdrükkung
des Wachstums solcher Microorganismen vorteilhaft. Die Konzentrationen, in denen A-4696-HydrochIorid
das Wachstum verschiedener beispielhafter Microorganismen hemmt, sind unten in Tabelle II
angegeben. Die Hemmkonzentrationen wurden entweder mit dem Agarverdünnungstest oder dem Brüheverdünnungstest
ermittelt und sind als minimale Hemmkonzentration (MIC) in Mcrogramm pro ml (mcg./ml.)
angegeben. (Die angewandte Bestimmungsmethode ist in Tabelle Il durch die Buchstaben »ad« für Agarverdünnungstests
bzw. »bd« für Brüheverdünnungstesl bezeichnet).
Bei dem Agarverdünnungstest wird der Testorganismus auf Agarplatten, die verschiedene Konzentrationen
A-4696-Hydrochlorid in dem Agar enthalten, aufgestri-
chen oder in diese injiziert. Die Testplatten werden 48
Rf-Werte*) Stunden bei 37°C inkubiert. Die MIC entspricht der
Platte mit der niedrigsten Konzentration des Antibioti-
cums, mit der das Wachstum des Testorganismus gehemmt wird.
Bei dem Brüheverdünnungstest wird eine Reihe von Rcagensgläsern, die Nährbrühe und verschiedene
Konzentrationen an A-4696-Hydrochlorid enthalten, mit dem Testorganismus beimpft und 24 Stunden bei
370C inkubierl. Die MIC entspricht dem Reagensglas mit der niedrigsten Antibioticumkonzentr3tion, bei der
kein Wachstum vorhanden ist.
0,88
0,72
0,80
0,59
0,35
0,77
0.80
0,72
0,80
0,59
0,35
0,77
0.80
Testorganismus | Minimale |
Hemmkonzen | |
tration | |
(mcg/ml) | |
Staphylococcus aureus 3055 | 12,5 ad |
6,25 bd | |
Bacillus subtilis | 0,78 ad |
Mycobacterium avium | 0,4 ad |
Streptococcus faecalis | 3,12 ad |
Trichophyton mentagrophytes | 0,2 ad |
Vibrio coü | 12,5 bd |
Mycoplasma gallisepticum | 50,0 bd |
Staphylococcus aureus (penicillin- | 10,0 bd |
resistent) | |
Staphylococcus aureus (methicillin- | 5,0 bd |
resistent) | |
Diplococcus pneumoniae | 3,12 bd |
Clostridium perfringens | 1,25 bd |
Clostridium tetani | 2,5 bd |
Corynebacterium gravis | 1,25 bd |
Lactobacillis casei | >100ad |
Leuconostoc citrovorum | >100ad |
Escherichia coli | >100ad |
Proteus sp. | >100 ad |
Pseudomonas sp. | >100 ad |
Salmonella sp. | >100ad |
Vibrio metschnikovii | >100 ad |
Saccharomyces pastorianus | >100ad |
Candida albicans
>100ad
Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid zeigt bei Verabreichung
an Mäuse durch subcutane Injektion in vivo antimicrobielle Aktivität gegen infektiöse Organismen.
Beispielsweise werden bei Anwendung von zwei Dosen folgende ED50-Werte (wirksame Dosis zum Schutz von
50% der Prüftiere) für beispielhafte Infektionen gefunden: Staphylococcus aureus: 9,2 mg/kg, Streptococcus
pyogenes: 0,68 mg/kg und Diplococcus pneumoniae: 0,76 mg/kg.
Die akute Toxizität von A-4696-Hydrochlorid, angegeben
als LD50, für Mäuse bei intraperitonealer
Verabreichung beträgt 2400 mg/kg.
Der Microorganismus, der ^ui Produktion von
Antibioticum A-4696 verwendet wird, wurde als Stamm einer Species von Acetinoplanes aus der Familie
Actinoplanaceae identifiziert. Die Actinoplanaceae bilden eine neue Familie von Microorganismen der
Ordnung Actinomycetales und wurden erstmals von Dr. John N. N. Couch, lour. Elisha Mitchell Sei. Soc 65,
315-318 (1949); und 66, 87-92 (1950); Trans. New York Acad, ScL, 16, 315-318 (1954); Jour. Elisha
Mitchell Sei. Soc, 71, U8- 155 und 269 (1955); Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 825-829 (1957); und Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc, 79,
53-70 (1963) beschrieben.
Der Actinoplanes-Stamm, der für die Produktion von Antibioticum-A-4696 geeignet ist. wurde bei der
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und ist dort für jedermann ohne Freigabebeschränkung
unter der Nummer ATCC 23342 erhältlich.
Actinoplanes sp. ATCC 23342 ist durch die in den
folgenden Abschnitten angegebenen physikalischen Eigenschaften und Kultureigenschaften gekennzeichnet.
Für die Bezeichnung der Farben wurde das System von Ridgeway, Color Standards and Nomenclature,
(1912) verwendet.
Mikroskopische Morphologie
und allgemeine Kulturmerkmale
und allgemeine Kulturmerkmale
von Actinoplanes sp. ATCC 23342
Mikroskopische Morphologie
Mycel ziemlich spärlich auf Pollen von Liquidambar
(Sweet gum tree; amer. Amberbaum) in Wasser. Die Hyphen sind verzweigt und septiert und haben einer.
Durchmesser von 0,2 bis 1,5 Micron. Die Hyphen füllen das Pollenkorn aus und erstrecken sich bis zu einer
Strecke, die etwa dem Durchmesser des Korns gleich ist, in das Wasser. Sporangiophoren ragen über die
Wasseroberfläche empor; Sporangienstiele, gewöhnlich einzeln, manchmal verzweigt, so daß sie zwei oder
seilen mehr Sporangien an dem gleichen Sporangiophor tragen; Stiele 1,0 bis 1,5 Micron dick, septiert.
Sporangien sind ziemlich klein, Durchmesser 4 bis 11
Micron, angenähert kugelartig, selten kugelförmig, gewöhnlich mit einer unregelmäßigen Wand. Reife
Sporen sind in einer oder mehreren undeutlichen Wendeln in dem Sporangium angeordnet. Das Aufplatzen
und die Entleerung des Sporangiums erfolgt durch Quellung einer Sporenzwischensubstanz, die dazu führt,
daß sich das Sporangium vergrößert und eine fast glatte sphärische Gestalt annimmt. Die Sporen sind beweglich,
Durchmesser etwa 1,0 bis 1,5 Micron; kugelförmig bis angenähert kugelförmig.
Kulturmerkmale auf
Czapek-Agar (S. A. Waksman, The Actinomycetes, (1950). Wachstum gut; die punktförmige Impfstelle hat
nach 8 Wochen einen Durchmesser von etwa 2 cm. Das Mittelstück ist aufgewölbt; der Fleck ist abgeflacht und
hat geringe Unebenheiten. Die Farbe des Myceis ist ein leuchtendes Zinkorange; das Agar ist blaßlederbraun bis
deutlich gelb. Sporangien werden selten gebildet.
Pepton-Czapek Agar (5 g Pepton anstelle von 2 g Natriumnitrit). Ähnliches Wachstum wie auf Czapek-Agar,
Furchen, Grate und Hocker sind jedoch deutlicher als auf Czapek-Agar. Es werden keine Sporangien
gebildet.
Wie erwähnt, kann Actinoplanes sp. ATCC 23342 zur Erzeugung von Antibioticum A-4696 in einem Kultur-
iiicuiülii gcZUCiiLct "werden.
Reihe von verschiedenen Medien verwendet werden. Für eine wirtschaftliche Produktion, maximale Ausbeute
und leichte Isolierung des Antibioticums werden jedoch bestimmte Kulturmedium bevorzugt. So ist beispielsweise
Stärke eine der bevorzugten Kohlenhydratquellen und Sojabohnenmehl eine der bevorzugten Stickstoffquellen.
Zu anderen verwendbaren Kohlenhydratquellen gehören beispielsweise Melasse, Glucose,
Dextrin und Glycerin. Zu weiteren Stickstoffquellen gehören beispielsweise Aminosäuremischungen und
Peptone.
Zu anorganischen Nährsalzen, die die Kulturmedien enthalten sollen, gehören die üblichen Salze, die
beispielsweise Ionen wie Natrium, Kalium, Ammoniak, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat, Acetat, Kohlenhydrat
und dergleichen zu liefern vermögen. Bei der
Produktion von Antibioticum A-4696 können ferner Quellen für Wuchsfaktoren wie Distillers' Solubles und
Hefeextrakte verwendet werden. Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Microorganismen
erforderlich ist, soll das Kulturmedium für die Züchtung des verwendeten Microorganismus Actinoplanes
sp. auch wesentliche Spurenelemente enthalten. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich bei Zugabe
der anderen Bestandteile des Mediums als zufällige Verunreinigungen zugeführt.
Der zur Produktion von A-4696 verwendete Mikroorganismus kann in einem verhältnismäßig breiten
pH-Bereich gezüchtet werden. Es ist jedoch zweckmäßig, das Kulturmedium vor Beimpfen mit dem
Mikroorganismus auf einen Wert zwischen etwa pH 6,5 und pH 7.2 einzustellen. Wie bei anderen Actinomyeeten
verändert sich allmählich der pH-Wert des Wuchsmediums während der Wachstumsdauer. Am
Ende der Fermentationsdauer liegt der pH-Wert gewöhnlich im Bereich von etwa 7,0 bis 7,8.
Für die Produktion von A-4696 werden submersaerobe Kulturbedingungen bevorzugt. Verhältnismäßig
kleine Mengen des Antibioticums können mit Schüttelkolbenkulturen erzeugt werden. Für die Herstellung
großer Mengen wird jedoch eine Züchtung unter submers-aeroben Bedingungen in sterilen Tanks bevorzugt.
Das Kulturmedium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension oder Mycelfragmentsuspension
beimpft werden, wegen der Zeitverzögerung bei Verwendung einer Sporensuspension wird jedoch als
Inoculum die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Indem die Zeitverzögerung in dem Wachstumscyclus
vermieden wird, wird die Fermentationsvorrichtung besser ausgenutzt.
Es ist daher zweckmäßig, ein vegetatives Inoculum des Mikroorganismus durch Beimpfen einer verhältnismäßig
kleinen Menge Kulturmedium mit den Sporen oder Mycelfragmenten des Mikroorganismus zu erzeugen
und, wenn ein junges aktives vegetatives Inoculum entstanden ist, dieses unter aseptischen Bedingungen in
den großen Tank zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum gezüchtet wird, kann das
gleiche Medium sein, das für die Fermentation von A-4696 in großem Maßstab verwendet wird, es
können aber auch andere Medien verwendet werden.
Die A-4696 bildende Actinoplanes-Art, Stamm ATCC
23342, wächst bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 4O0C. Die größten Mengen A-4696 werden offenbar bei
einer Temperatur von etwa 300C erzeugt.
Bei dem submers-aeroben Kulturverfahren wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Das
Luftvolumen, das in das Kulturmedium eingeleitet und darin verteilt wird, reicht von etwa 0,1 bis etwa 1,0
Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium. Wachstum und Antibioticum-Produktion
erfolgen am wirksamsten, wenn das Luftvolumen wenigstens 1/2 Volumenteil Luft pro Minute und pro
Volumenteil Kulturmedium beträgt.
Die Produktionsgeschwindigkeit von A-4696 und die Konzentration an antibiotischer Aktivität in dem
Kulturmedium können während der Wachstumsdauer durch Prüfung von Proben der Fermentationsflüssigkeit
auf antibiotische Aktivität gegen Mikroorganismen, die bekanntermaßen auf das Antibioticum ansprechen,
verfolgt werden. Ein solcher für die erfindungsgemäßen Zwecke geeigneter Testorganismus ist Bacillus subtilis.
Der biologische Test kann nach der üblichen turbidometrischen oder Näpfchenmethode oder mit dem Papierscheiben-Test
uuf Agiirplatten durchgeführt werden.
Im allgemeinen findet bei Fermentationen mit
ScliiUtelkolbenkulturen oder submers-aeroben Kulturen eine maximale Produktion des Antibioticums in
etwa 4 bis 6 Tagen statt.
Antibioticum A-4696 kann durch Adsorptions- und Extraktionsmethoden aus dem Kulturmedium gewonnen
und von anderen Substanzen getrennt werden. Adsorptionsmethoden werden bevorzugt, da bei sol-
K) chen Methoden die Verwendung großer Volumenmengen von Lösungsmitteln vermieden wird, die bei
Extraktionsverfahren erforderlich sind.
Nach der Fermentation ist die antibiotische Aktivität sowohl in der Fermentationsflüssigkeit als auch im
Mycel enthalten. Das Kulturmedium wird zur Trennung der Fermentationsflüssigkeit von dem festen Mycel
filtriert. Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen und dann in Wasser aufgeschlämmt, das mit 5,0 η NaOH
auf pH 10,5 eingestellt ist. 30 Minuten lang intensiv
-'<> gerührt und filtriert. Die beiden Filtrate und das
Waschwasser werden vereinigt und die antibiotische Aktivität wird daraus an einem geeigneten Adsorptionsmittel
adsorbiert, zum Beispiel Aktivkohle, aktiviertes saures Aluminiumoxid, Polyamidharz, Cellulose Kiesel-
2r> gel und dergleichen. Zur Durchführung der Aosorption
kann die antibiotische Aktivität enthaltende Lösung über eine Füllung aus dem Adsorbens geleitet werden
oder das Adsorbens kann der Lösung zugesetzt, 20 bis 30 Minuten gründlich vermischt und von dem
erschöpften Lösungsmittel abfiltriert werden. Das an dem Adsorbens haftende Antibioticum kann durch
übliche Eluiermethoden als unreines A-4696 gewonnen werden.
Das rohe Antibioticum-A-4696 kann durch Herstellung des Picratsalzes und dessen Umwandlung in das
Hydrochloridsalz gereinigt werden. Geeignete Adsorbentien sind beispielsweise Polyamidharz, saures
Aluminiumoxid, neutrales Aluminiumoxid, basisches Aluminiumoxid, Kieselgel, Amberlite XAD-2, Amberlite
XAD-4 und Dowex 50(H+).
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.
A. Schüttelkolbenfermentation
von Antibioticum A-4696
von Antibioticum A-4696
Ein Nähragar-Schrägmedium mit folgender Zusammensetzung
wird mit Mycelfragmenten von Actinoplanes sp. ATCC 23342 beimpft:
Bestandteil
Menge
Vorgekochtes Hafermehl
Hefe
Hefe
K2HPO4
Getrocknete Distiller's Solubles
Czapek's Mineralstammlösung*)
Agar
Agar
Wasser, deionisiert
*) Czapek's Mineralstammlösung:
KCl
MgSO4-7 H2O
FeSO4 ■ 7 H2O
(in 2 ml konz. HCl gelöst)
Wasser, deionisiert
FeSO4 ■ 7 H2O
(in 2 ml konz. HCl gelöst)
Wasser, deionisiert
60g | g |
2,5 | g |
1,0 | g |
5,0 | ml |
5,0 | |
25 g | |
11 | |
100 g | |
100 g | |
2g | |
11
ίο
Das Schrägmedium wird mit ATCC 23342 beimpft und 6 Tage bei 300C inkubiert. Die Kultur sporuliert auf
diesem Medium normalerweise nicht und es ist erforderlich, die Mycelmatte mit einer abgeflachten
geschärften Impfnadel aufzuschließen, um die Zahl von potentiellen Wuchb^cntren zu erhöhen. Die aufgeschlossene
reine Kultur wird mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und zur Gewinnung einer Mycelsuspension
vorsichtig mit einem sterilen Stab abgeschabt.
Die so erhaltene Suspension wird zum Beimpfen von 100 ml eines sterilen vegetativen Mediums mit folgender
Zusammensetzung verwendet:
Bestandteil
Menge
Glucose
Dextrin
Sojabohnenmehl
Hefeextrakt
Calciumcarbonat
Leitungswasser
5,0 g
20,0 g
15,0 g
20,0 g
15,0 g
2,5 g
1,0 g
1 I
Das beimpfte vegetative Medium wird auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung 48
Stunden bei 30°C inkubiert.
100 ml eines sterilen »Zwischenmediums« mit der gleichen Zusammensetzung wie vorher werden mit
10 ml des inkubierten vegetativen Mediums beimpft. Das beimpfte »Zwischenmedium« wird 24 Stunden bei
30°C unter konstantem Schütteln auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung inkubiert.
Anteile eines Produktionsmediums mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung von 100 ml, die in
500 ml Erlenmeyer-Kolben enthalten sind, werden 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und mit 4/10 ml des
inkubierten »Zwischenmediums« beimpft.
Bestandteil
Dextrose
Dextrin
Pepton
Sojabohnenmehl
MgSO4 ■ 7H2O
Zuckerrübenmelasse
Maisquellwasser
Betain
K2HPO4
"Wasser, deionisiert
ad
1,0
3,0
1,5
0,5
0,2
1,5
0,5
0,1
0,05
25 ml
3,0
1,5
0,5
0,2
1,5
0,5
0,1
0,05
25 ml
Am Ende des Fermentationscyclus beträgt der pH-Wert etwa 7,2.
B. 40 1 Tankfermentation von Antibioticum A-4696
Die Herstellung des Inoculums wird wie oben unter Abschnitt A beschrieben bis zur Inkubierung des
»Zwischen«-Mediums durchgeführt. 25 1 eines Produktionsmediums der oben beschriebenen Art mit einem
ίο Zusatz von 0,02% Dow Corning-Entschäumer werden
im Autoklaven 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann in einen 40 1 Fermentationstank gefüllt. Das sterile
Produktionsmedium wird mit 100 ml inkubiertem »Zwischen«-Medium beimpft. Das beimpfte Produktionsmedium
in dem 401 Tank wird 4 Tage bei 30°C fermentiert. Die Fermentationsmischung wird mit
steriler Luft in einer Menge von etwa 1/2 Volumenteil Luft pro Volumenteil Kulturmedium und pro Minute
belüftet. Während der Fermentation wird das Produktionsmedium mit einem Mischer unter Verwendung
eines Propeller-Rührers geeigneter Größe gerührt, der mit entsprechender Umdrehungszahl betrieben wird, so
daß eine angemessene Vermischung der Luft mit dem Medium gewährleistet ist. Der pH-Wert des Kulturmediums
steigt mit fortschreitender Fermentation von einem Anfangswert von etwa 6,9 bis auf etwa 7,2 an.
C. Isolierung von Antibioticum A-4696
Die gesamte Fermentationsflüssigkeit, die aus einer A-4696-Fermentation, wie sie vorher beschrieben
wurde, erhalten wird, wird mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe filtriert. Das Filtrat wird beiseite gestellt.
Der Mycelkuchen wird mit 32 1 Wasser gewaschen und das Waschwasser wird aufbewahrt. Dann wird der
Mycelkuchen in weiteren 32 1 Wasser suspendiert und der pH-Wert der Mischung wird mit 5 η Natriumhydroxidlösung
auf 10,5 eingestellt. Die Mycelkuchen-Wasser-Suspension wird 45 Minuten lang gerührt und die
Mischung wird filtriert. Dieses Filtrat und das Waschwasser werden mit dem ersten Filtrat der
Fermentationsmischung vereinigt und der pH-Wert der vereinigten Filtrate wird mit H2SO4 auf 4,0 eingestellt.
Die angesäuerten vereinigten Filtrate werden durch eine Kohlesäure mit 1 kg Aktivkohle (Pittsburgh,
12x40) geleitet. Die Aktivkohlesäule wird gewaschen,
bis der Abfluß farblos ist. Die A-4596-Aktivität ist an der Kohlesäule adsorbiert. Die A-4696-Aktivität wird aus
der Kohlesäule mit einer lprozentigen H2SO4-Lösung
in Aceton/H2O (1 :1) eluiert. 21 der angesäuerten
Aceton/Wasser-Lösung reichen zum Eluieren der A-4696-Aktivität aus der Kohlesäule aus. Das Eluat, das
die A-4696-Äkiiviiäi ciuhäii, wird ffiii gesäüigier
Bariumhydroxidlösung behandelt, um einen Niederschlag aus Bariumsulfat zu erzeugen und dadurch die
Sulfationen aus der Lösung zu entfernen.
Die Mischung wird filtriert und der Bariumsulfatniederschlag
wird verworfen. Das Filtrat, das die A-4696-Aktivität enthält, wird im Vakuum zur Trockne
eingeengt. Der erhaltene Rückstand '"steht aus etwa 80 g A-4696-Aktivität.
Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Mediums mit 5 η Natriumhydroxidlösung auf 7,5 eingestellt. Nach
dem Sterilisieren beträgt der pH-Wert etwa 6,9.
Die Produktionskultur wird etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von 3O0C auf einer mit 250 UpM
betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung geschüttelt.
D. Umwandlung von A-4696
in rohes A-4696-Hydrochlorid
in rohes A-4696-Hydrochlorid
je A-4696-Aktivität von etwa 80 g wird in einem
Volumen von 5 1 Wasser aufgenommen und dann mit 500 g Aktivkohle (Darco G-60) behandelt. Diese
Mischung wird 1 Stunde lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der Kohlefilterkuchen, der
die A-46%-Aktivität enthält, wird mit 1 1 Wasser gewaschen und das Waschwasser wird verworfen. Dann
wird der Kohlefilterkuchen mit 1 I 0,05 η Salzsäure gewaschen. Die saure Waschlösung wird verworfen.
Der gewaschene Kohlekuchen wird durch 30 Minuten langes Rühren mit 500 ml Salzsäure-Aceton-Lösung
(0,05 η HCI : Aceton [7 :3]) eluiert. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat wird aufbewahrt. Das Eluieren
der Aktivkohle wird viermal in der gleichen Weise wiederholt.
Jedesmal wird das Filtrat aufbewahrt. Die fünf Eluate, die die A-4696-Aktivität enthalten, werden vereinigt.
Die vereinigten Eluate werden dann im Vakuum auf ein Volumen von etwa 100 ml eingeengt. Das wäßrige
Konzentrat, das die A-469b-Aktivität enthält, wird mit 200 ml Methanol versetzt. Zu dieser wäßrigen Methanollösung
werden 2 1 Aceton gegeben. In der wäßrigen Methanol-Aceton-Lösung bildet sich ein Niederschlag
aus rohem A-4696-Hydrochlorid. Nach Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlags werden 60,9 g rohes
A-4696-Hydrochlorid erhalten.
E. Herstellung von
kristallinem A-4696-Hydrochlorid
kristallinem A-4696-Hydrochlorid
25 g des A-4696-Hydrochlorids, das wie unter D beschrieben erhalten wurde, werden in 20 ml Wasser
gelöst. Die A-4696-Hydrochloridlösung wird über eine
mit Wasser gewaschene Füllung aus Polyamidharz geleitet, die in einer Glassäule mit etwa 7 χ 60 cm
enthalten ist. Der Abfluß wird aufbewahrt. Die Polyamidharzsäule wird mit Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von etwa 8 bis 10 ml pro Minute gewaschen. Die antimikrobielie Aktivität des Säulenabflußes
wird nach üblichen Methoden gemessen. Abflüsse, die antimikrobielie Aktivität enthalten, werden
vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in einer Mischung aus 25 ml Wasser
und 50 ml Methanol gelöst. Diese wäßrige Methanollösung von A-4696-Hydrochlorid wird mit 5 η HCI auf pH
2,0 angesäuert. Die wäßrige Methanollösung wird mit etwa 1,5 I Aceton versetzt, um das Hydrochloridsalz von
A-4696 auszufällen. Der A-4696-Hydrochloridniederschlag wird durch Filtrieren der Mischung gewonnen.
Der Filterkuchen, der das A-4696-Hydrochlorid enthält, wird in der Mindestmenge Wasser gelöst. Dann
wird eine Äthanolmenge zugesetzt, die dem doppelten Wasservolumen entspricht und die Mischung wird auf
etwa 60°C erwärmt. Hierauf wird die Mischung abgekühlt, wobei das Hydrochloridsalz von A-4696
auskrislallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es werden etwa 9 g kristallines A-4696-Hydrochiorid
gewonnen.
Reinigung von A-4696 durch Herstellung des
Picratsalzes und dessen Umwandlung
in das Hydrochloridsalz
500 mg rohe:; A-4696, das wie in Beispiel 1 bis
Abschnitt D beschrieben erhalten wurde, werden in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung wird unter Rühren
mit 25 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Picrinsäure versetz1.. Die Mischung wird über Nacht bei
5°C stehen gelassen. Der entstandene Niederschlag wird abzentrifugier: und getrocknet. Der getrocknete
Niederschlag wird in 25 ml Methanol gelöst, der pH-Wert wird mit HCl auf 1,5 eingestellt und es werden
500 ml Diäthyläther zugesetzt, um das A-4696-Hydrochloridsalz abzuscheiden. Das Hydrochloridsalz wird
abzentrifugiert, '.nit Diäthyläther gewaschen und im
Vakuum getrocknet, wodurch etwa 305 mg A-4696-Hydrochlorid als weißes kristallines Salz erhalten werden.
10
15
20
25
30
Vergleichende Wirksamkeit des Antibioticums-A-4696-Hydrochlorids gegenüber als Wachstumsfaktoren bekannten
Antibiotica bei Küken nach 56tägiger Versuchsdauer
Wirkstoff | Wirkstoff menge |
Geschlecht | Anzahl an Küken batterien |
Mittl. Gew.- Zunahme |
Futtermenge | Verhältnis von Futtermenge zu Gew.-Zunahme |
(g/Tonne) | (g) | (g) | ||||
Mnnensin Na | 90 | W | 3 | 1639 | 3761 | 2 294 |
M | 3 | 1959 | 4318 | 2,204 | ||
jew. Mittelwerte | 1799 | 4039 | 2,249 | |||
Antibioticum-A^t696- Hydrochlorid |
5 | W M |
3 3 |
1651 2023 |
3787 4408 |
2,293 2,178 |
jew. Mittelwerte | 1837 | 4097 | 2,235 | |||
Payzone | 10 | W | 3 | 1653 | 3699 | 2,238 |
M | 3 | 2015 | 4380 | 2,174 | ||
jew. Mittelwerte | 1834 | 4040 | 2,206 | |||
Tylosin | 5 | W | 3 | !632 | 3815 | 2,337 |
M | 3 | 1938 | 4175 | 2,154 | ||
iew. Mittelwerte | 1785 | 3995 |
13 | 22 09 018 | 3 3 jew. Mittelwerte |
Mit«. Gew- Zunahme |
14 | Verhi Futte Gew. |
|
Fortsetzung | 3 3 jew. Mittelwerte |
(g) | ||||
Wirkstoff | WirkstoiT- menge |
Geschlecht Anzahl an Küken batterien |
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen | 1625 1988 1807 |
Futtermenge | 2,284 2,169 2,226 |
(g/Tonnc) | 1615 1924 1770 |
(g) | 2,331 2,25' 2,29( |
|||
Poxarsone | 45,4 | W M |
3713 4313 4013 |
|||
Bacitracin MD | 10 | W M |
3777 4338 4057 |
|||
Claims (2)
1. Glycopeptid-Antibioticum-A^egB-Hydrochlorid,
dadurch gekennzeichnet, daß es eine weiße kristalline Substanz ist, die in Wasser löslich
und in Methanol, Aceton, Äther, Chloroform, Pyridin, Benzol und aliphatischen Kohlenwasserstoffen
unlöslich ist, einen Schmelzpunkt von über 2200C
aufweist, eine elektrometrische Titrationskurve in Wasser oder in einer Mischung aus Dimethylformamid
und Wasser (2:1) ergibt, die sich im Bereich von pH 6,0 bis pH 13,0 einer geraden Linie mit einer
Steigung von etwa 0,14 nähert etwa eine Elementarzusammensetzung aus 51,33% Kohlenstoff, 5,79%
Wasserstoff, 5,46% Stickstoff, 30,96% Sauerstoff und 6,72% Chlor hat, ein aufgrund des osmotischen
Dampfdrucks bestimmtes Molekulargewicht von
1158 aufweist, einen spezifischen Dreh wert [alpha] Ό5
von -423 (C=I, H2O) hat, im Ultraviolettabsorptionsspektrum
in sauren und neutralen Lösungen ein einziges Absorptionsmaximum bei 276 nm mit einem
Extinktionskoeffizienten E !^ von 45 und in basischer Lösung ein einziges Absorptionsmaximum
bei 300 nm mit einem Extinktionskoeffizienten E W
von 65 hat und als Mineralölsuspension das Infrarotabsorpiionsspektrum mit folgenden unterscheidbaren
Banden aufweist: 3,0, 5,8, 5,9, 6,03, 6,15, 6,28,6,63,6,85, 7,27, 7,75, 8,1,8,25,8,9,9,4,9,9 und 10,1
Micron.
2. Tierfuttermittel mit einem geeigneten Träger und einem Antibioticum als Wirkstoff, dadurch
gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Glycopeptid-Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid
gemäß Anspruch 1 enthält.
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