DD140477A5

DD140477A5 - Verfahren zur herstellung von a-40104-antibiotika und derivaten davon

Info

Publication number: DD140477A5
Application number: DD78209625A
Authority: DD
Inventors: Karl H Michel; Calvin E Higgens
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-12-08
Filing date: 1978-12-08
Publication date: 1980-03-05
Also published as: JPS5498701A; IE47532B1; IE782420L; US4129721A; NZ189081A; CH643298A5; EP0002589A1; LU80617A1; DK147659C; DE2861930D1; ES475853A1; IT7830656A0; PH14843A; IT1100672B; ZA786871B; GB2009739A; ATA871478A; FI59420B; BE872488A; EP0002589B1

Description

A-40104-Antibiotikumkomplex, der die wirksamen -Faktoren A, B, C und D enthält, wird durch submerse aerobe Fermentation von · Clitopilus pseudo-pinsitus hergestellt. Die einzelnen Faktoren A, B und C sind isoliert worden. A-40104-Fäktor C ist das bekannte Antibiotikum Pleuromutilin. A-40104-Faktoren A und B sind neue Antibiotika, die Pleuromutilin nahestehen. A-40104-Faktor A, der überwiegende neue Faktor, ist das D-Xyloseacetalderivat von Pleuromutilin. A-40104-Faktoren A und B, ihre 19,20-Dihydroderivate und die Per-(C₂-Cg)-alkanoylderivate von Faktor A und B und ihren 19,20-Dihydroderivaten sind gegen grampositive und gramnegative Bakterien, anaerobe Bakterien und Mycoplasma aktiv.

Das Antibiotikum Pleuromutilin ist von Kavanagh et al. /Proc. Natl. Acad. Soc. 37, 570-574 (1951J_/ isoliert worden. Später wurde nachgewiesen, daß Pleuromutilin folgende Struktur hat:

Q-COCKsOH

Die alkalische Hydrolyse von Pleuromutilin führt zu einer Verbindung, die als Mutilin bekannt ist und folgende Struktur hat:

Eine große Anzahl von Pleuromutilinderivaten ist hergestellt worden /CH-PS 572 894 (Derwent No, 26553X); NL-PS 69 11083 (Derwent No. 40 642); US-PS 3 716 579; US-PS 3 919 290; US-PS 3 949 079; US-PS 3 979 423; US-PS 3 987 194; US-PS 4 032 530; K. Riedl, "Studies on Pleurornutiiin and Some of Its Derivatives," J. Antibiotics 29, 132-139 (1976); H. Egger und H. Reinshagen,

"New Pleuromutilin Derivatives with Enhanced Antimicrobial Activity. I. Synthesis," J. Antibiotics 29, 915-922 (1976) und "II. Structure-Activity Correlations," ibid., 923-927 (1976); F. Knauseder und E. Brandl, "Pleuromutilins: Fermentation, Structure and Biosynthesis," J. Antibiotics 29, 125-131 (1976); J. Drews et al., "Antimicrobial Activities of 81 723 hfu, a New Pleuromutilin Derivative", Antimicrob. Agents and Chemotherapy 7, 507-516 (19752,/. ·

Es wurden nun zwei Antibiotika gefunden, die neue Mitglieder der Fami_flie der Pleuromutilinantibiotxka sind. Ferner wurde ein neues Verfahren zur Herstellung von Pleuromutilin gefunden. .

Darlegung des Wesens del Erfindung

Die vorliegende Erfindung macht neue Antibiotikum A-40104-Faktoren A, B und D und ein neues Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum A-40104 Faktoren A, B, C und D zugänglich. Diese Faktoren haben ein sehr gutes antibiotisches Spektrum,-das nicht nur eine Anzahl grampositiver und -negativer Bakterien und anaerober Bakterien umfaßt, sondern auch Mycoplasmaorganismen. Es sind neue Mittel für die Behandlung von Mycoplasmaerkrankungen von Geflügel, Schweinen und Rindern und von durch Treponema hyodysenteriae verursachter Schweinedysenterie gefunden worden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer A-40104-Antibiotikamischung, die die Faktoren A, B, D und Pleuromutilin enthält, von Antibiotikum A-4O1O4-ⁱFaktor A, 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor A, der Tetra-(C₂-Cg)-alkanoylderivate von A-40104-Faktor A und von 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor A, von Antibiotikum A-40104-Faktor B, 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor B, und der Tri-(C₂-C₆)-alkanoylderivate von A-40104-Faktor B und von 19,20-Dihydro-A-40104-Fak~ tor B, von Pleuromutilin und Antibiotikum A-40104-Faktor D,-dadurch gekennzeichnet, daß

a) Clitopilus pseudopinsitus NRRL 11179 oder eine A-4O1O4 erzeugende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen gezüchtet wird, bis antibiotische Aktivität in beträchtlichem Umfang gebildet ist,

b) gegebenenfalls die A-40104-Antibiotikummischung von dem Kulturmedium abgetrennt wird,

c) gegebenenfalls Antibiotikum A-40104-Faktor A, Antibiotikum A~40i04~Faktor B, Pleuromutilin bzw. Antibiotikum A-4O1O4-Faktor D aus der Antibiotikumiuischung isoliert werden,

d) gegebenenfalls Antibiotikum A-40104-Faktor A oder Antibiotikum A-40104-Faktor B zu 19,2O-Dihydro~A-4O1O4-Faktor-A bzw. 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor B hydriert wird,

e) gegebenenfalls Antibiotikum A-40104-Faktor A, 19,20-Dihydro-A~40104-Faktor A, Antibiotikum A-40104-Faktor B oder 19,20-Dihydro~A-40104~Faktor B zu dem Tetra-(C„~C,)-alkanoylderivat von A-40104-Faktor A oder 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor A oder dem Tri-(C₀-C,)-alkanoylderivat von A-40104-Faktor B oder 19,20-Dihydro-A-40104-Fak-

tor B acyliert wird.

Infrarotabsorptionsspektren der folgenden A-40T04-Faktoren (in KBr-Scheibe) sind in den beigefügten Zeichnungen dargestellt:

Figur 1 . - . A-40104-Faktor A Figur 2 - A-40104-Faktor B

-5- η η Q / *> s?

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche A-4O1O4-Antibiotikumkomplex enthält wenigstens 4 einzelne Faktoren, die Faktoren A, B, C und D, und dieser Komplex wird durch submerse aerobe Züchtung von Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 erzeugt. A-40104-Faktor A und B sind neue Antibiotika und bilden Teil der Erfindung.

Die 19,20-Dihydroderivate von A-40104-Faktor A und B und die Per-(C₂-C₆)alkanoylderivate von A-40104-Faktor A und B und ihren 19,20-Dihydroderivaten bilden gleichfalls Teil der Erfindung.

A-40104-Faktor A und B sind untereinander und A-4O1O4-Faktor C dem bekannten Antibiotikum Pleuromutilin strukturell nahestehend. Während der Fermentation werden wenigstens 4 antibiotische Faktoren gleichzeitig gebildet, wodurch der Antibiotikum A-40104'-Komplex gemäß der Erfindung erhalten wird. Pleuromutilin und A-40104-Faktor A können durch extraktive Maßnahmen aus der filtrierten Fermentatonsmaische abgetrennt werden. A-40104-Faktor B, ein untergeordneter Faktor, kann durch chromatographische Methoden abgetrennt und isoliert werden. Der andere untergeordnete Faktor, A-40104-Faktor D kann durch Chromatographie abgetrennt werden, ist bisher jedoch noch nicht in zur Charakterisierung ausreichender Menge isoliert worden.

In den folgenden Absätzen sind die physikalischen und Spektraleigenschaften von A-40104-Faktor A und B beschrieben.

A-40104-Faktor A

A-40104-Faktor A kristallisiert aus Chloroform und hat einen Schmelzpunkt von etwa 117 bis 120 ⁰C. Dieser Faktor hat

die empirische Formel Cp₇H₄POQ, bestimmt durch Elementaranalyse, und ein Molekulargewicht von 510, bestimmt durch FeIddesorptionsmassenspektrometrie.

Das Ultraviolettabsprotionsspektrum von A-40104-Faktor A in Trifluorethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei .284 nm (epsilon = 32).

Das Circulardichroismus-Spektrum von A-40104-Faktor A in Trifluorethanol zeigt die folgenden Maxima;

Delta epsilon = +2,84 bei 200 nm Delta epsilon = +1,72 bei 295 nm

A-40104--Faktor A hat folgende spezifische Drehung:

OK

/alpha./" = -14° (c 1,0, C₂H₅OH).

Die elektrometrische Titration von A-40104-Faktor A in 66-prozentigem wäßrigem Dimethylformamid zeigt, daß keine titrierbaren Gruppen vorhanden sind.

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von A-40104-Faktor A in KBr-Scheibe ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Die bedeutendsten Absorptionsmaxima treten bei den folgenden Frequenzen (cm ) auf:

3590, 3500, 3450 (breit), 3280 (breit), 2990) 2980, 2960, 2940, 2920, 2890, 2860, 1755, 1735, 1645, 1465, 1447, 1420, 1380, 1330, 1310, 1274, 1240, 1220, 1160, 1117, 1093, 1070, 1060, 1040, 1014, 984, 955, 940, 921, 905, 865, 760, 742, 698, 674, 603, 530 und 442.

^J*

A-40104-Faktor A ist in Alkoholen, wie Methanol und Ethanol, löslich, in Chloroform teilweise löslich und in Wasser unlöslich.

Aufgrund der physikalischen und chemischen Eigenschaften von A--40104-Faktor A wird angenommen, daß es sich dabei um das ßjD-Xylopyranosylacetalderivat von Pleuromutilin mit folgender Struktur handelt:

• QH

«Ν -β

Q-COCH Ö

CH₃

A-40104-Faktor B

A-40104-Faktor B ist eine weiße amorphe Verbindung, die als untergeordneter Faktor in dem Antibiotikum A-40104-Komplex vorkommt. Sie macht derzeit nur 0,01 bis 0,1 % der Aktivität des Antibiotikum A-40104-Komplexes aus. Bei der Elektronenstoßmassenspektrometrie von A-40104-Faktor B hat sich gezeigt, daß er ein Molekulargewicht von 394 hat. Die Peak-Entsprechung des Molekularions und einiger der Fragmentionen

zeigt an, daß A-40104-Faktor B die empirische Formel C_2?H^₄O_fi hat. Ein Peak bei m/e 318 (^C2o^H30°3^ ^^{m Massen}~ spektrum von Faktor B ist einem Peak bei m/e 302 im Pleuromutilin-Spektrum analog, was anzeigt, daß sich der zusätzliche Sauerstoff* in Faktor B in dem Ring und nicht an der Seitenkette befindet. Das Fragment-m/e 163 ist Faktor B und Pleuromutilin gemeinsam. Ein kleiner Peak bei m/e 245 (C₁₇H₂₁-O) im Pleuromutilin-Spektrum ist im Spektrum von Faktor B nach m/e 261 (C₁₇H₂₁-O₂) 'verschoben. Ά-4Ο1Ο4 Faktor B enthält drei Hydroxylgruppen, die sich acylieren lassen. Beispielsweise bildet A-40i04~Fak"tor B bei Behandlung mit Pyridin und Essigsäureanhydrid ein Triacetylderivat, eine Verbindung der Zusammensetzung C^oH. O_q (Molekulargewicht 520), woraus sich ergibt, daß die zusätzliche Sauerstoffunktion in A-40104-Faktor B eine Hydroxylgruppe ist.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von Ä-401G4-Faktor B, in KBr-Scheibe, ist in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen

dargestellt. Die bedeutendsten Absorptionsmaxima treten

— 1

bei den folgenden Frequenzen (cm ) auf: 3430 (breit),

2940, 2880, 1735, 1660, 1452, 1385, 1375, 1305, 1280, 1233, 1152, 1094, 1020, 997, 967, 933, 912, 888, 752 und 660.

Aufgrund seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften kann angenommen werden, daß es sich bei A-40104 Faktor B um eine Verbindung mit folgender angenäherter Struktur handelt:

+0H

Wie festzustellen ist, enthält sowohl A-40104-Faktor A als auch Faktor B eine Vinylgruppe, die durch übliche Arbeitsweisen unter Bildung der entsprechenden^C19,20-Dihydroderivate reduziert werden kann. Die 19,20-Dihydroderivate von A-40104-Faktor A und B sind gleichfalls wirksame antibakterielle Mittel und bilden Teil dieser Erfindung.

Sowohl A-40104-Faktor A und B als auch ihre 19,20-Dihydroderivate enthalten. Hydroxylgruppen, die sich nach üblichen Methoden acylieren lassen (vier Hydroxylgruppen in den Faktor-A-Verbindungen und drei Hydroxylgruppen in den Faktor-B-Verbindungen). Es ist offensichtlich, daß die-erhaltenen peracylierten Derivate dieselbe Acylgruppe in jeder acylierbaren Stellung tragen (d. h. vier bei den Faktor-A-Verbindungen und drei bei den Faktor-B-Verbindungen) . Diese peracylierten Derivate sind gleichfalls antibakterielle Mittel. Die Per-(C₂-Cg)-alkanoylderivate von A-40104-Faktor A und B und der 19,20-Dihydroderivate von A-40104-Faktor A und B stellen innerhalb dieser Gruppe bevorzugte Verbindungen dar.

Die vier einzelnen Faktoren des A-40104-Komplexes können durch chromatographische Methoden voneinander getrennt und identifiziert werden. Beispielsweise können die Faktoren durch Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Kieselgel (Merck, Darmstadt), von CHCl₃ICH₀OH (9:1) als Lösungsmittelsystem und Micrococcus luteus als Bioindikator getrennt werden. Die R_f-Werte der A-4O1O4^- Faktoren A bis D in diesem System sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle

A-40104-Faktor'

A 0,21

B „°'³⁶

C 0,52

D . 0,67

Die Faktoren können auch durch'Papierchromatographie unter Verwendung von unbehandeltem Papier (Whatman No. 1), mit Butanol gesättigtem Wasser als Lösungsmittelsystem und Micrococcus luteus als Nachweisorganismus getrennt werden. Die R_f-Werte der A-40104-Faktoren A bis D in diesem System sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

A-40104-Faktor ^Kf.

A 0,64

B 0,51

C 0,37

D 0,31

Herstellung des Antibiotikum A-40104-Komplexes

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum A-40104-Komplexes und damit auch auf ein Verfahren zur Herstellung von Ä-40104-Faktor A und Bund des bekannten Antibiotikums Pleuromutilin. Bei diesem Verfahren wird ein A-40104 erzeugender Stamm des Basidiomyceten

Clitopilus pseudo-pinsitus unter submersen aeroben Bedingungen in einem Nährmedium bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet. Der Antibiotikumkomplex und die einzelnen Antibiotika werden mit Hilfe verschiedener allgemein bekannter Isolierung?- und Reinigungsverfahren gewonnen.

Der für die Erzeugung der A-40104-Antibiotika verwendete Stamm von Clitopilus pseudo-pinsitus entstammt einem Organismus, der vom Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) in den Niederlanden erhalten wurde. Die CBS-Kultur (CBS 270.36) war als Octojuga pseudo-pinsita klassifiziert. In der vorliegenden Beschreibung wird der mit Octojuga synonyme Name Clitopilus zur Bezeichnung des Organismus verwendet. Die Fähigkeit dieser Kultur zur Bildung von Antibiotika war nicht bekannt. Ihre Fähigkeit, die A-40104-Antibiotika zu erzeugen, ist erst nach Durchführung umfangreicher Ausleseverfahren gefunden worden.

Ein für die Erzeugung der A-40104-Faktoren-A und B und des Pleuromutilins verwendbarer Stamm von Clitopilus pseudopinsutus ist in der Kulturensammlung von Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt worden und ist dort unter der Nummer NRRL 11179 für jedermann erhältlich.

Wie dies auch bei anderen Organismen der Fall ist, unterliegen die Eigenschaften der A-40104 erzeugenden Kultur Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 gewissen Schwankungen. So können beispielsweise durch Behandlung mit verschiedenen allgemein bekannten mutagenen Mitteln, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten WeLlen, radioaktiven Strahlen und Chemikalien künstliche Varianten und Mutanten des Stamms NRRL 11179 erhalten werden.

Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten mit im wesentlichen den gleichen Identifizierungseigenschaften wie Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 und der Fähigkeit, die A-40104 Antibiotika zu bilden, können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Das zur Züchtung von Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 verwendete Nährmedium kann ein beliebiges aus einer Anzahl verschiedener Medien sein. Im Hinblick auf eine möglichst wirtschaftliche Erzeugung, die Erzielung möglichst hoher Ausbeuten-und eine möglichst einfache Isolierung des Produkts sind jedoch bestimmte Nährmedien bevorzugt. So sind beispielsweise die bei Fermentationen im großen Maßstab bevorzugten Kohlehydratquellen Glucose, Tapiocadextrin, Stärke und Maisöl, doch können auch Glycerin, Maltose, Fructose und ähnliche Stoffe verwendet werden.. Oleate, Laurate und Lecithin sind weitere brauchbare Kohlenstoffquellen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind geschrotete oder gemahlene Sojabohnen oder eine Kombination aus Hundetrockenfutter und Hefe. Zu weiteren brauchbaren Stickstoffquellen gehören Hefe, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Fleischpepton und Hundetrockenfutter. Für das Wachstum und die Antibiotikumerzeugung sind anorganische Salze zwar nicht wesentlich, doch können lösliche Salze, die Ionen von Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlor, Carbonat, Sulfat, Nitrat und dergleichen liefern können, zugesetzt werden. Beispielsweise wird durch den Zusatz von 0,05 % MgSO..7H₂O-und 0,2 % CaCO₃ zu dem Medium die Antibiotikumerzeugung gefördert.

Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus nötig sind, sollen in das Nährmedium aufgenommen werden. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die zur Deckung der Wachstumsbedürfnisse des Organismus genügen.

"* * Λ*» SoJf

Es kann erforderlich sein, geringe Mengen (zum Beispiel O,2 ml/1) eines Schaumverhütungsmittels, wie Polypropylenglykol, Fermentationsmedien beim Arbeiten in großem Maßstab zuzusetzen, wenn die Schaumbildung Schwierigkeiten bereitet-.

Zur Erzeugung der A-40i04~Antibiotika in beträchtlichen Mengen ist die submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen der A-40104-Antibiotika können in Schüttelkoibenkulturen erhalten werden. Wegen der zeitlichen Verzögerung der Antibiotikumbildung, die gewöhnlich bei der Beimpfung großer Tanks mit kleinen Mengen der Kultur auftritt, ist es vorzuziehen, ein vegetatives Inokulum zu verwenden, das größere Mengen von Zellen in ativ wachsendem Zustand enthält. Das vegetative Inokulum wird durch Beimpfen eines geringen Volumens Nährmedium mit Mycelfragmenten des Organismus hergestellt, wodurch eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegatative Inokulum wird dann in einen größeren Behälter oder Tank überführt. Als Medium für die Züchtung des vegetativen Inokulums kann das gleiche verwendet werden, wie es für Fermentationen in größerem Maßstab eingesetzt wird, doch können auch andere Medien eingesetzt werden.

Der A-40104 erzeugende Clitopilus pseudo-pinsitus kann bei Temperaturen zwischen 20 und 33 ⁰C gezüchtet werden. Eine optimale A-4O1O4-Erzeugung erfolgt allem Anschein nach bei Temperaturen von etwa 30 ⁰C.

Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird sterile Luft durch das gerührte oder geschüttelte Nährmedium geleitet. Zur Erzielung eines guten Wachstums des Organismus sollen Belüftung und Bewegung der Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von möglichst nahe an 80 % angepaßt werden. Bei geringeren Werten an gelöstem Sauerstoff wird die Erzeugung der A-40104-Faktoren A und C unterdrückt, wobei sich dies besonders stark auf den Faktor A auswirkt.

Während des Verlaufs der Fermentation wird zuerst A-4O1O4-Faktor C gebildet, und A-40104-Faktor A erscheint erst später. Deshalb beläuft sich die bevorzugte Inkubationsdauer für die Erzeugung von A-40104-Faktor A auf etwa 12 Tage. Durch Zugabe von Maisöl zu dem Medium wird die Umwandlung von Faktor C in Faktor A während der Fermentation gefördert. Bei Anwendung von Bedingungen, die für die Erzeugung von A-40104-Faktor A am günstigsten sind, macht der Faktor A 70 bis 90 % der erzeugten Antibiotika aus. '

Nach ihrer Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen können die oben beschriebenen A-40104 Antibiotika nach allgemein bekannten Methoden aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Die Bildung der antibiotischen Aktivität bei der Fermentation erfolgt hauptsächlich in der Brühe. Eine maximale Gewinnung der A-40104-Antibiotika wird daher durch eine Kombination von Verfahrensschritten, wie Filtrieren, Extrahieren der filtrierten Brühe und Absorptionschromatographie, erzielt. Eine besonders bevorzugte Methode besteht darin, die filtrierte Brühe zuerst mit Toluol und dann mit Chloroform zu extrahieren. A-40104-Faktor C wird aus dem Toluolextrakt und A-40104-Faktor A wird aus dem Chloroformextrakt isoliert. A-40104-Faktor B, der in geringerer Menge vorhandene Faktor, wird durch Absorptionschromatographie bei der Reinigung von A-40104-Faktor A abgetrennt.

Als Ausgangsmaterial für die A-40104-Antibiotika können aber auch Kulturfeststoffe, hauptsächlich Mediumbestandteile· und Mycel, ohne Extraktion oder Abtrennung, aber vorzugsweise nach Entfernung von Wasser verwendet werden. Beispielsweise kann das Kulturmedium nach der Erzeugung von Antibiotikum A-40104-Aktivität einer Gefriertrocknung unterworfen und direkt in Futtervormischungen eingemischt werden.

Bei einer anderen Ausführungsform kann nach Erzeugung von A-40104-Aktivität im Nährmedium und Abtrennung des Mycels die filtrierte Brühe einer Gefriertrocknung unterworfen werden, wodurch der Antibiotikum A-40104-Komplex in einer Form erhalten wird, in der er direkt für Futtervormischungen verwendet werden kann.

Während der Erzeugung de-r A-40104-Antibiotika und der Isolierung und Trennung der einzelnen Antibiotikumfaktoren wird der Verlauf der Erzeugungs- und Trennverfahren vorzugsweise durch chromatographische Maßnahmen verfolgt. Eines der hierfür bevorzugten TLC-Systeme ist beispielsweise ein solches unter Verwendung von CHC1-:CH-OH (9:1) als Lösungsmittelsystem, Kieselgel als Absorbens und Micrococcus luteus als Bioindikator.

Aktivität der A-40104-Antibiotika

Der A-4O1O4 Antibiotikum-Komplex und die einzelnen A-4O1O4-Faktoren A und B inhibieren das Wachstum gewisser pathogener Organismen, insbesondere von grampositiven Bakterien. A-40104-Faktor A ist ein besonders gutes "antibakterielles Mittel. Die minimalen inhibierenden Konzentrationen (MIC), in welchen A-40104-Faktor A bei üblichen Agarverdünnungstests bestimmte Bakterien inhibiert, sind in Tabelle III zusammengestellt.

Testorganismus

Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 3074 Streptococcus faecalis Bordetella bronchiseptica

T a b e	lie III
MIC	(mcg/ml)
	A-4O1O4- Faktor A

<0,5 <0,5

< 0,5

σι

XFt

~ 17 —

Große Bedeutung kommt dem Merkmal dieser Aktivität zu, daß nämlich die A-40104-Antibiotika das Wachstum von Organismen inhibieren, die gegen andere Antibiotika resistent sind. In Tabelle IV sind die Ergebnisse einer standartisierten Scheiben-Platten-Aktivitätsprüfung der A-40104-Faktoren A und B gegen verschiedene Organismen zusammengestellt. Aktivität wird als der Durchmesser (mm) der beobachteten Inhibitionszone bestimmt; der Durchmesser der verwendeten Scheibe beträgt in jedem Fall 6,35 mm.

Tabelle IV

Zonendurchmesser (mm)

Testorganismus

Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 3074' Staphylococcus aureus 3074' Staphylococcus aureus 3130" Staphylococcus aureus 313O~

4 Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes

Konz. mcg./Scheibe

100

10 100

A-4O1O4- Faktor A	A-4*0104- Faktor B
31,2	27,1
27,2	18,9
29,2	25,4
25,4:	13,5
34,0	29,5
29,2	19,0
27,0	23,0
21,0	19,0

Tabelle IV ' (Fortsetzung)

Zonendurchmesser (mm) Testorganismus

Streptococcus sp. 9960' Streptococcus sp. 9960* Diplococcus pneumoniae Diplococcus pneumoniae

Kon ζ. meg./Scheibe

100 10

A-40104- Faktor A	A-4O1O4- Faktor B	I
8,7	0	i
0	0
20,0	17,0
14,0	12,0

Penicillin-G-empfindlich 'Penicillin-G-resistent Methicillin-resistent Gruppe A 'Gruppe D

Aus Tabelle V ergibt sich, daß A-40104-Faktor A bei einem Vergleich mit Ampicillin bei einer Reihe von iri-vitro-Tests unter Anwendung 'der Gradienten-Plattenagar-Verdünnungsmethode günstig abschneidet.

a b e 1 1 e

MIC (mcq/ml).

Testoraanismus

ococcus pyocfenes Streptococcus sp. X-66 (Gruppe D) Streptococcus- sp. 996 0 (Gruppe D) Neisseria gonorrhea Neisseria gonorrhea Sand. Neisseria gonorrheei Lind, ileinophilus influenzae Brun llemophilus influenzae Dick.

Homophilus inf luenzae Laiv.

llemophilus inf luenzae 251

IIeinophilus inf luenzae 259

llemophilus in£luenzae 260

A-4O1O4- Faktor A	Ampicillin
<o₇oi	. <o₇oi
0,5	0,8
70	.0,6
0,5	0,5
0,07	0,07
0,5	0,5
2	0,5
2	0,5
4	0,5
0,7	70
0,7	70
0,7	70

A-40104~Faktor A und 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor A (Dihydro-A-4O1O4A) haben in vivo antimikrobielle Aktivität gegen experimentelle bakterielle Infektionen gezeigt. Bei der Verabreichung v©n zwei Dosen dieser Verbindungen an Mäuse bei beispielhaften Infektionen wird die beobachtete Aktivität als EDj-_n-Wert bestimmt (wirksame Dosis in mg/kg für 50 % der Testtiere; vergleiche Warren Wick, et al., J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961^/. Die· für diese Verbindungen festgestellten ED₁- -Werte sind in den Tabelle VI und VII aufgeführt.

Tabelle VI

Aktivität von A-40104-Faktor A

Testorganismus

Anwendungsart ED₅ x2 Infektion hervorgerufen durch

Staphylococcus aureus 3055

Streptococcus pyogenes C2O3

s.c

S .C. 15,7 3,6

1260 χ LD₅ (i.p.)

195 χ LD₅₀ (i.p.)

Streptococcus pneumoniae Park I s.c, 21,5

1280 χ LD₅₀ (i.p.)

Tabelle

VII

Aktivität von Dihydro-Ä-40104A

Testorganismus

Test Organism Staphylococcus aureus 30 55 Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 305 5 Streptococcus pyogenes C20 Streptococcus pneuinoniae BI-343 Streptococcus pneuinoniae BI-492

Anwendungs	ED₅₀X₂	Infektion
art	ED₅₀X₂	hervorgerufen durch
Route	<_4₇4	Infecting Challenge
SC	28	69,5 χ LD₅₀ (ip)
oral	27 . .	3-400 χ LD₅₀ (ip)
oral	5,8	500 χ LD₅₀ (ip)
SC	35	1 690 X LD₅₀ (ip)
SC	15,2	30 χ LD₅₀ (ip)
se	340 χ LD (ip)

ti S?

Die A-40104-Antibiotika inhibieren auch das Wachstum mehrerer verschiedener anaerober Bakterien. In Tabelle VIII sind die Aktivitäten von A-40104-Faktor A zusammengestellt.

Tabelle VIII

Testöraanismüs MIC	: (mcg/ml)*	4
Actinomvces israelii	<0 5
Clostridium perfringens	8	£0,5
Clostridium septicurn	8
Eubacterium aerofaciens ·	16
PeOtococcus
asaccharolytxcus	£0,5
Peptococcus prevoti	<0,5 '
Peptostreptococcus
anaerobius	2
Peptostreptococcus
intermedius	_< 0 j 5
Bacteroides fragilis 111	8
Bacteroides fragilis 1877	8
Bacteroides.fragilis 1936B	8
Bacteroides thetaiotaomicror	ι 2
Bacteroides melaninogenicus
1856/28 Bacteroides	4
melaninooenicus 27 35	4
Bacteroides
vulgatis Bacteroides	4
corrocens	8
Fuscbacterium
svrnbiosum
Fusobacterium
necrophoruxn

*Die MIC ist durch die Agarverdunnungsmethode bestimmt worden. Die Endpunkte wurden nach 24 Stunden Bebrütung abgelese-n.

Ein besonderer Vorteil der A-40104-Antibiotika liegt darin, daß sie vergleichsweise nichttoxisch, sind. Beispielsweise liegt der LD₅ -Wert für A-40104-Faktor A und das Tetraacetylderivat von A-40104-Faktor A bei der intraperitonealen Injektion in Mäuse über 300 mg/kg.

Die Wirksamkeit gegen Mycoplasma ist ein besonders wichtiges Merkmal der antimikrobiellen Aktivität der A-40104-Antibio- tika. Mycoplasmaspecies sind für Menschen und verschiedene Tiere pathogen. Gegen Mycoplasmen wirksame Mittel werden besonders zur Verhütung und Behandlung von mycoplasmalen Erkrankungen von Geflügel, Schweinen und Rindern benötigt.

Die minimalen inhibierenden Konzentrationen (MIC) von A-40104-Faktor A, 19,20-Dihydro~A40104-Faktor A und dem Tetraacetylderivat von A-4O1O4A für verschiedene Mycoplasmaspecies, bestimmt durch in vitro-Brüheverdünnungs-Untersuchungen, sind in Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle

IX

Testorganismus

Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma synoviae Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma hyopneumoniae

A-4O1O4- Faktor A	Dihydro- A-4O1O4A	Tetraacetyl- A-4O1O4A
< 0,78	0,195	12,5
<O,78	0,195	50,0
1,56	0,195	25,0
0,195	0,097	12,5

Die erfindungsgemäß erhältlichen A-40104-Antibiotika eignen sich zur Behandlung von Schweinedysenterie. Es_ ist bekannt, daß Pleuromutilin mit guter Wirkung zur Behandlung von Schweinedysenterie herangezogen werden kann (vergleiche US-PS 4 041 175). Es wurde gefunden, daß die A-40104.-Antibiotika, die nach dem erfindungsgemäßen· Verfahren erhalten werden, auch gegen Treponema hyodysenteriae, den mit Schweinedysenterie am häufigsten vorkommenden Organismus wirksam ist. Die Aktivität wurde unter Verwendung eines in vitro-Tests bestimmt, wobei die Verbindung in Mengen von 50, 5,0, 0,5 und 0,05 mcg/ml in Trypti'case-Sojaagarplatten eingebracht wurde, die 5 % defibriniertes Rinderblut enthielten. Die Agaroberfläche wurde mit 0,1 ml einer 10 Verdünnung einer Suspension von T. hyodysenteriae beimpft. Die Platten wurden unter anaeroben Bedingungen 4 Tage bebrütet und dann auf Gegenwart oder Abwesenheit von Wachstum von hämolytischem Treponema untersucht. Bei diesem Test inhibieren A-40104-Faktor A und 19,20-Dihydro-A-40104-Faktör A das Wachstum von T. hyodysenteriae bei den Agarkonzentrationen von 50, 5,0 und 0,5 mcg/ml.

Bei Verwendung zur Behandlung von Schweinedysenterie können die A-40104-Antibiotika mit dieser Krankheit infizierten Schweinen in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern oder dgl.. oral verabreicht werden. Aus einem inerten Bestandteil und einem A-40104-Antibiotikum als aktivem Bestandteil kann ein Tierheilmittel hergestellt werden. Eine bevorzugte Art der Verabreichung besteht jedoch darin, das A-40104-Antibiotikum dem Futter für die Schweine einzuverleiben.

Für die Veterinärmedizin ist ferner die Wirksamkeit der erfindungsgemäß erhältlichen A-40104-Antibiotika gegen Pasteurellespecies von Bedeutung. So ist beispielsweise P. multocida ein Verursacher von Infektionen der Atmungswege

29 - . $> 09 6 2.

bei Rindern, Geflügel und Schweinen. P. hemolytica ist einer der Hauptverusacher von Erkrankungen der Atemwege bei Rindern. Die Wirksamkeit.von A-40104-Faktor A und seinem Dihydroderivat gegen Pasteurella, bestimmt durch standartisierte Prüfungen in vitro, ist in Tabelle X angegeben.

Testorganismus

T a	bell	e	A	X
MIC	(mcg/ral)
A-401	04-Faktor

Dihydro-A-40104A

Pasteurella multocida (Rind)

6,25

Pasteurella multocida (Truthahn)

Pasteurella hemolytica

12,5

25,0

12,5

16,5

Eine pharmazeutische Zubereitung aus einem inerten Bestandteil und einem A-40104-Antibiotikum als Wirkstoff kann für die Verabreichung an Menschen gegen empfindliche pathogene Organismen hergestellt werden. Auch die Wirksamkeit der erfindungsgemäß erhältlichen A-40104-Antibiotika gegen Spiroplasmaorganismen ist von großer Bedeutung. Spiroplasma citri ist der Verursacher der Citrusversprödungskrankheit. Eine andere Spiroplasmaspecies, Maishemmspiroplasma, beeinträchtigt das Wachstum von Mais. Bei in-vitro durchgeführten Tests gegen Spiroplasma citri inhibieren A-4O1O4-Faktor A und sein Dihydroderivat S. citri bei einer Anwendung von nur 0,01 ppm.

Die Ä-40104-Antibiotika sind auch gegen Pflanzenpathogene wirksam. Beispielsweise wirkt A-40104 Faktor A bei Verwendung als Laubsprühmittel oder als Bodentränkmittel gegen Pulvermeltau. Bei Prüfungen mit Bohnen- und Gerstenpflanzen wird eine Bekämpfung von Pulvermeltau mit einem Bodentränkmittel von A-40104-Faktor A in einer Konzentration von 100 ppm erzielt, woraus sich ergibt, daß diese Verbindungen Systemwirkung entfalten. Die Systemwirkung dieser Antibiotika ist bei der Bekämpfung von pflanzenpathogenen oder Spiroplasma-Species von besonderem Vorteil.

Ausfuhr unp; s b e i s pi.e_le

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter

erläutert. · .

-. 32 -

Beispiel A. Schüttelkolbenfermentatiön

Eine reife Schrägagarkultur von Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 wird mit einem sterilen Instrument abgeschabt und aseptisch auf Schrägagar mit folgender Zusammensetzung überführt:

Bestandteil Menge

Saccharose dunkle Melasse Maisquellwasser Malzextrakt K₂HPO₄

Enzymatisch hydrolyiertes-Casein*

25	g ·
36	g
6	g
10	g
2	g
10	g
25	g
1	Liter

gewaschener Agar

entionisiertes Wasser q.s.

*N-Z Case, Humko Sheffield, Norwich, N.Y., USA

Die beimpfte Schräge wird etwa 14 Tage bei etwa 30 ⁰C bebrütet. Die reife Schrägkultur wird mit einem sterilen Instrument abgeschabt, und die aufgequollenen Mycelien von etwa 5 cm² der Agaroberflache werden zum Beimpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung verwendet:

10	g
10	g
10	g
5	g
1	Liter

Bestandteil ' Menge

Glucose Tapicfcadextrin* Sojahydrolysat-Pulver** Brauereihefefraktionen***

Leitungswasser q.s.

pH des Mediums etwa 5,3; Einstellung auf pH 6,9 mit

5n NaOH

*Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, 111., USA **HySoy T, Humko Sheffield, Norwich, N. Y., USA ***Amber BYF300, Amber Laboratories, Juneau,- Wise, USA

Das beimpfte vegetative Medium wird in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben 96 Stunden bei etwa 25 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung mit einer Rotation durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser von 2 50 Umdrehungen je Minute bebrütet.

Das so erhaltene bebrütete vegetative Medium kann direkt zum Beimpfen des vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann es aber auch, und dies ist bevorzugt, für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden, indem die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff gehalten wird. Die Kultur wird für eine derartige Aufbewahrung folgendermassen in vielen kleinen Phiolen vorbereitet: In jede Phiole werden 4 ml bebrüteten vegetativen Mediums und. 2 ml einer Glycerinlactoselosung folgender Zusammensetzung eingebracht:

Bestandteil Menge

Glycerin 300 g

Lactose 150 g

entionisiertes Wasser q. s. 1 Liter

-.34 - £ ν ?

Die so erhaltenen Suspensionen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

1 ml der so hergestellten aufbewahrten Suspension wird zum Beimpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung wie sie oben für das vegetative Medium beschrieben wurde verwendet. Das beimpfte vegetative Medium der ersten Stufe wird in einen 250 ml Erlenmeyer-Weithalskolben bei 25 ⁰C etwa 4 Tage auf einer Schüttelvorrichtung mit einer Rotation durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser von 250 Umdrehungen je Minute bebrütet.

B. Tankfermentation

Zur Erzielung eines größeren Volumens an Inoculum v/erden 10 ml des oben beschriebenen bebrüteten vegetativen Mediums der ersten Stufe zum Beimpfen von 400 ml eines' Mediums für das vegetative Wachstum der zweiten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium verwendet. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1 Erlenmeyer-Weithalskolben bei 25 ⁰C etwa 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit einer Rotation durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser von 250 Umdrehungen je Minute bebrütet.

800 ml des wie oben beschrieben hergestellten, inkubierten vegetativen Mediums der zweiten Stufe werden zum Beimpfen von 100 1 sterilem Produktionsmedium mit folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil . . Menge

Glucose · 15 g/l

Glycerin 5 g/l

Tapiocadextrin 30 g/l

Hundetrockenfutter* 25 g/l

Hefeextrakt 5 g/l

KCl 1 g/l

MgSO₄.7H₂O 0,5 g/l

FeSO₄.7H₂O 0,1 g/l

q. s. 1 Liter

Bestandteil MnCl₂.4H₂O ZnSO₄.7H₂O CaCO₃

entionisiertes Wasser

pH mit 4n HCl auf 5,0 eingestellt

*Purina Dog Chow, Ralston Purina Co., St. Louis, Mo 63188, USA

Das beimpfte Produktsionsmedium wird in einem 165 1 fassenden Fermentationstank bei einer Temperatur von etwa 30 ⁰C etwa 12 Tage der Fermentation überlassen. Es wird mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von etwa 80 % belüftet.

Beispiel 2

Die Fermentation wird wie in Beispiel 1 beschrieben, jedoch unter Verwendung eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung' durchgeführt:

Bestandteil Dextrose Galactose Glycerin lösliche Stärke Hefeextrakt

Hundetrockenfilter* Sojabohnenöl • Maisöl KH₂PO₄ MgSO₄.7H₂O FeSO..7H₀O CaCO^

Bestandteil Menge

ZnSO..7H₂O 0,05 g/l

deionisiertes Wasser q. s. 1 Liter

Medium-pH etwa 5,7; Einstellung mit 4n HCl auf pH 5,0 *Purina Dog Chow.

Beispiel 3

Die Fermentation wird unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, jedoch unter Verwendung eines Fermentationsmediums mit folgender Zusammensetzung durchgeführt:

Bestandteil Menge

Glucose 50 g/l

Sojabohnenschrot 7,5 g/l

MgSO₄.7H₂O 1,0 g/l

CaCO₃ 2,0 g/l

entionisiertes Wasser q.s. 1 Liter

pH etwa 7,4; Einstellung auf pH 6,5 mit 4n HCl

Beispiel 4 Isolierung der Ä-40104 Faktoren A und C

4540 1 der nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren erhaltenen Gesamtgärmaische werden unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-cel, eine Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert, wodurch 3640 1 Filtrat

erhalten werden. Der Mycelrückstand wird mit entionisiertem Wasser gewaschen, wodurch weitere 1820 1 Fiitrat erhalten werden. Die vereinigten Filtrate (54 60 1) werden bei ihrem EigenpH 1 Stunde lang mit der Hälfte ihres Volumens an Toluol extrahiert, wodurch 2500 1 Toluolextrakt erhalten werden. Dieser Toluolextrakt enthält hauptsächlich A-4.0104 Faktor C (Pleuromutilin). Der Toluolextrakt wird auf ein Volumen von etwa 23 1 eingeengt. Eine erste Ausbeute an A-40104 Faktor C kristallisiert aus und wird durch Filtrieren gewonnen. Es werden 1943 g erhalten. Die Mutterlauge wird auf ein Volumen von etwa 8 1 eingeengt, worauf eine zweite Ausbeute an Faktor C abgetrennt wird (282 g). Die Mutterlauge wird wiederum auf ein Volumen von etwa 6 1 eingeengt und 72 Stunden bei etwa 4 ⁰C gehalten, wodurch weitere 158 g Faktor C erhalten werden. Die Mutterlauge von dieser dritten Ausbeute wird bis zu einem viskosen öl eingeengt. Dieses öl wird in 6 1 Diethylether gelöst, und die Lösung wird 72 Stunden bei 4 ⁰C gehalten, wodurch eine vierte Ausbeute von 112 g A-40104 Faktor C erhalten wird.

Die nach der Toluolextraktion zurückgebliebene wäßrige Lösung wird dann 1 Stunde mit der Hälfte ihres Volumens an Chloroform extrahiert. Der erhaltene Chloroformextrakt wird auf ein Volumen von etwa 10 1 eingeengt und 72 Stunden bei 4 ⁰C belassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und getrocknet, wodurch 588 g A-40104 Faktor A erhalten werden.

Beispiel5

Isolierung von A-40104-Komplex und des Einzelfaktors B

214 1 der nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltenen Gesamtgärmaische v/erden unter Verwendung einer FiI-terhilfe filtriert, wodurch 119 1 Fiitrat erhalten werden.

Der Mycelrückstand wird mit Wasser gewaschen, wodurch v/eitere 80 1 Filtrat erhalten werden. Die vereinigten Filtrate (199 1) werden zweimal bei einem pH-Wert der Maische mit je 80 1 Et.hylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden im Vakuum bis auf ein Volumen von etwa 2 1 eingeengt. Durch Zugabe von etwa 20 1· Hexan wird, der Wirkstoffkomplex gefällt. Der gefällte Antibiotikakomplex wird'abfiltriert, in etwa 300 ml Ethylacetat wieder gelöst und dann wiederum mit Hexan gefällt.» Der Niederschlag wird mit Hexan gewaschen und getrocknet, wodurch 27,3 g A-40104 Antibiotikakomplex (enthaltend die Faktoren A, B und C) erhalten werden. -

5 g dieses Komplexes werden in 40 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird filtriert, und das Filtrat wird in . einer offenen Säule aus Glas (5,6 χ 28 cm) an Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Die· Säule war unter Verwendung von Chloroform mit einer Aufschlämmung gefüllt worden und wird mit Chloroform bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/Minute eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 20 ml aufgefangen werden. Bei der Fraktion Nr. 7 wird das Elutionslösungsmittel durch CHCl₃ICH₃OH (95:5), und bei der Fraktion Nr. 28 wird das Lösungsmittel durch CHCl₃ICH₃OH (9:1) ersetzt. Die Fraktionen Nr. .72 bis 120 werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wodurch 4 g eines trockenen Pulvers erhalten werden.

Zusätzliche Anteile der Gärmaische werden in der gleichen Weise behandelt, wodurch weitere 6 g dieses Stoffs erhalten werden. 100 ml Chloroform werden zu den 10 g ausmachenden vereinigten Proben gegeben, und das in Chloroform unlösliche Material, 1,6 g A-40104 Faktor A, wird abfiltriert. Das-Filtrat wird in einer offenen Glassäule (5,8 χ 48 cm) an Kisselgel (Woelm) chromatographiert. Die Säule wird

mit Chloroform gefüllt und gewaschen und dann mit CHCl₃^H₃OH (97.,5:2,5) eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 20 ml bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml/Minute aufgefangen werden. Die Fraktionen Nr. 156 bis 190 werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst, und zur Fällung des Produkts wird Hexan zu der erhaltenen Lösung gegeben. Durch Äbfiltrieren und Trocknen des Niederschlags werden 99 mg A-40104 Faktor B erhalten.

Beispiel 6

Herstellung von 19,20-Dihydro-Ä-40104-Faktor A

10,15 g (0,0199 Mol) des Antibiotikum A-40104 Faktor A werden in 188 ml Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung wird mit 2,5 g 5 % Pd/C versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden bei Zimmertemperatur hydriert und dann durch einen Glassintertrichter mit einer Celiteschicht filtriert. Das FiI-trat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Ethylacetat/Methanol (2:1) umkristallisiert, wodurch 7,0447 g (0,01375 Mol, Ausbeute 69 %) 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor A erhalten werden.

Beispiel 7 Herstellung von 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor B

Durch Hydrieren von A-40104-Faktor B nach der in Beispiel 6 beschriebenen Arbeitsweise wird 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor B erhalten.

-⁴⁰' "9 09 -AOK

Beispiele

Herstellung von Tetraacetyl-A-40104-Faktor A

2 g A-40104 Faktor A werden in -5 ml trockenem Pyridin gelöst und mit 5 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Die erhaltene klare Lösung wird 120 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann wird sie zu 20 ml Ethanol gegeben, und die gebildete Lösung wird im Vakuum eingedampft, bis die letzten Spuren von Pyridin und Essigsäure entfernt sind, wodurch 2,1 g des Tetraacetylderivats von A-40104 Faktor A erhalten werden: /alpha/' -22,2° (c 1 ,0, 0_οΗ_κ0Η); empirische Formel

C^j-Hc₀ ⁰I ο ^un<3· Molekulargewicht 678,325 durch Peakanpassungsmassenspektrometrie.

Analyse C^rH^O.,:

berechnet: C 62,00; H 7,40; 0 30,60; gefunden: C. 62,06; H 7,32; 0 30,19;

Beispiele 9-14

Das Triacetylderivat von A-40104 Faktor B wird nach der in Beispiel 8 beschriebenen Arbeitsweise aus A-40104 Faktor B hergestellt.

Das Tetraacety!derivat von 19,20-Dihydro-A-40104 Faktor A wird durch Umsetzung von 19,20~Dihydro-A-40104 Faktor A nach dem der in Beispiel 8 beschriebenen Weise hergestellt.

Das Triacetylderivat von 19,20-Dihydro~A-40104 Faktor B wird durch Umsetzung von 19,20-Dihydro-A-40104 Faktor B nach der in Beispiel 8 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.

Tetra-(n-butyryl)-derivat von A-4O1O4· Faktor A wird durch Umsetzung von A-4O1O4 Faktor A mit n-Buttersäureanhydrid nach der in Beispiel 8 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.

Das Trxpropxonylderivat von A-4O1O4 Faktor B wird durch Umsetzung von A-40104 Faktor B mit Propionsäureanhydrid nach der in Beispiel 8 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.

Das Tetra-(n-valeryl)-derivat von 19,20-Dihydro~A-40i04 Faktor A wird durch Umsetzung von 19,20-Dihydro~A-40i04 Faktor A mit Valeriansäureanhydrid nach der in Beispiel 8 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.

Claims

Erfindungsanspruch.

1. Verfahren zur Herstellung einer A-40104-Antibiotikamischung, die die Faktoren A, B, D und Pleuromutilin enthält, von Antibiotikum A-40104-Faktor A, 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor A, der Tetra-(C₉~C_S)-alkanoylderivate von A-40104-Faktor A und von 19,20-Dihydro.-A-40104-Faktor. A, von Antibiotikum A-40104-Faktor B, 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor B und der Tri-(C„-C₆)-alkanoylderivate von A-4O1O4-Faktor B und von 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor B, von Pleuromutilin und Antibiotikum A-40104-Faktor D, dadurch gekennzeichnet , daß

a) Clitopilus pseudopinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen gezüchtet wird, bis antibiotische Aktivität in beträchtlichem Umfang gebildet ist,

b) gegebenenfalls die A-40104-Antibiotikummischung von dem Kulturmedium abgetrennt wird,

c) gegebenenfalls Antibiotikum A-40104-Faktor A, Antibiotikum A-40104-Faktor B, Pleuromutilin bzw. Antibiotikum A-4O1O4-Faktor D aus der Antibiotikummischung isoliert werden,

d) gegebenenfalls Antibiotikum A-40104-Faktor A oder Antibiotikum A-40104-Faktor B zu 19,20-Dihydro-Ä-40104-Fak-· tor-Α bzw. 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor B hydriert wird,

e) gegebenenfalls Antibiotikum A-40104-Faktor A, 19,20-Dihydro-A-40104-Faktor A, Antibiotikum A-40104-Faktor B oder 19,20-Dihydro-A~40104-Faktor B zu dem Tetra-(-C₂-Cg alkanoylderivat von A-40104-Faktor A oder 19,20-Dihydro A-40104-Faktor A oder dem Tri--(C₃-C₆)-alkanoylderivat von A-40104-Faktor B oder 19,20-Dihydro-A-40104-Fak-. tor B acvliert wird.
2. Verfahren zur Herstellung einer die Faktoren

A, B, D und Pleuromutilin enthaltenden A-40104 Antibiotikamischung, dadurch gekennzeichnet

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter subitiers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet und

b) die A-40104 Antiobiotikamischung von dem Nährmedium abgetrennt v/ird.
3. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika A-40104 Faktor A, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-4O1O4 Antibiotikamischung von dem Nährmedium abgetrennt und

c) Antibiotikum A-40104 Faktor A aus der Antibiotikamischung isoliert wird. . .
4. Verfahren zur 'Herstellung von Antibiotikum A-40104 Faktor B, dadurch gekennzeichnet,

daß · ·

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet, t

b) die A-40104 Antibiotikamischung von dem Nährmedium abgetrennt und

c) Antibiotikum A-40104 Faktor B aus der Antibiotikamischung isoliert wird.
5. Verfahren zur Herstellung von Pleuromutilin,

dadurch gekennzeichnet, daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine

A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-4O1O4 Antibiotikamischung von dem Nährmedium abgetrennt und .

c) Pleuromutilin aus der Antibiotikaini schung isoliert' wird.
6. Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum A-40104 Faktor D, dadurch gekenhzeichn et,-daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmediurn, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheb-J.ichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-40104 Antibiotikamischung von dem Nährmedium abge-. trennt und

c) Antibiotikum A-40104 Faktor D aus der Antibiotikamischung isoliert wird.
7. Verfahren zur Herstellung von 19,2O-Dihydrq-A-4O1O4

Faktor A, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-40104 Antibiotikamischung von dem Nährmedium abgetrennt,

c) Antibiotikum A-40104 Faktor A aus der Antibiotikamischung isoliert und

d) Antibiotikum A-40104 Faktor A hydriert wird.
8. Verfahren zur Herstellung der Tetra-(C₂-Cg)-al kanoylderivate.von A-40104 Faktor A, . · d a d u r c h . gekennzeichnet , daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus·NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium,-das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-40104 Antibiotikamischung von dem Nährmedium abgetrennt,

c) Antibiotikum A-40104 Faktor A aus der Antibiotikamischung isoliert und

d) Antibiotikum A-40104 Faktor A acyliert wird.
9. Verfahren zur Herstellung von Tetra-(C₀-C,)-alkanoylderivate von 19,20-Dihydro-A-40104 Faktor A, d a durch gekennzeichnet, daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält,'unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-4O1O4 Antibiotikamischung von dem Nährmedium abgetrennt,

c) Antibiotikum A-40104 Faktor A aus der Antibiotikamischung isoliert,

•

d) Antibiotikum A-40104 Faktor A hydriert und

e) 19,20-Dihydro-A-40104 Faktor A acyliert wird.
10. Verfahren zur Herstellung von 19,20-Dihydro-A-4O1O4 Faktor B, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben

• Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-40104 Antibiotikamischung aus dem Nährmedium abgetrennt,

c) Antibiotikum A-40104 Faktor B aus der Antibiotikamischung isoliert und

d) A-40104 Faktor B hydriert wird.
11. Verfahren zur Herstellung der Tri-(C,-C_c)-al-

Zo

kanbylderivate von A-40104 Faktor B, dadurch gekennzeichnet , daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 odör eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-40104 Antibiotikamischung aus dem Nährmedium abgetrennt,

c) Antibiotikum A-40104 Faktor. B aus der Antibiotikamischung isoliert und -

d) Antibiotikum A-40104 Faktor B acyliert wird.
12. Verfahren zur Herstellung der Tri-(C₃-C₆)-alka-

noylderivate von 19,20-Dihydro-A-40104. Faktor B, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 oder eine A-40104 erzeugende Mutante davon in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische .Salze liefernde Stoffe enthält, unter submers aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer erheblichen antibiotischen Aktivität gezüchtet,

b) die A-40104 Antibiotikamischung aus dem Nährmedium abgetrennt,

c) Antibiotikum A- 40104 Faktor B aus der Antibiotikamischung isoliert,

d) Antibiotikum A-4O1O4 Faktor B hydriert und

e) 19,20-Dihydro-A-40104 Faktor B acyliert wird.

%riy.