CH620243A5

CH620243A5 -

Info

Publication number: CH620243A5
Application number: CH492275A
Authority: CH
Inventors: David Glenn Martin; Ladislav James Hanka
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1974-04-17
Filing date: 1975-04-17
Publication date: 1980-11-14
Also published as: SU736875A3; NL7504508A; BE828040A; CA1034524A; JPS50145589A; ZA751855B; SE7504413L; DE2514984A1; GB1458340A; FR2267779A1; US3944562A; FR2267779B1; AU7953875A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums U43 795, dessen Hydrate und der Säureadditionssalze sowie Metall-, Amin- und Ammoniumsalze. Das neue Antibiotikum U43 795 der Formel

®NH_

0

Aus der Bestimmung der absoluten Konfiguration von AT-125 ergab sich, dass es sich um (aS, 5S>a-Amino-3-chlor-2-isoxazolin-5-yl-essigsäure handelt. Wie das Antibiotikum U43 795 ist auch das Antibiotikum AT-125 eine amphotere Verbindung, die je nach dem pH-Wert der Umgebung in unterschiedlichen Ionenformen auftreten kann. Bei niedrigem pH-Wert existiert AT-125 gewöhnlich in Form eines Säureadditionssalzes, bei höherem pH-Wert in Form eines Zwitterions und bei noch höherem pH-Wert in Form eines Metallsalzes.

Das Antibiotikum AT-125 hemmt das Wachstum von Bacillus subtilis, Saccharomyces pastorianus, Pénicillium oxalicum, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli und kann verwendet werden, um das Wachstum dieser Mikroorganismen in verschiedenen Umgebungen zu hemmen.

Das erfindungsgemäss erhaltene Antibiotikum U43 795 kann allein oder in Kombination mit anderen Mitteln gegen Mikroorganismen in unterschiedlichen Umgebungen zur Verhinderung des vorstehenden Bakterienwachstums oder zur Verminderung der Anzahl der Bakterien verwendet werden. Beispielsweise kann es zur Behandlung von Brutstätten der Seidenraupen oder zur Verhinderung oder weitgehenden Verminderung von Infektionen verwendet werden, die durch Bacillus subtilis verursacht werden.

Die Struktur des Antibiotikums U43 795, die mit den ermittelten Spektraldaten und analytischen Daten übereinstimmt,

3

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entspricht der vorstehenden Formel I sowie deren ionischen und zwitterionischen Formen.

Das NMR-Spektrum einer gesättigten Lösung von U43 795 in D2O wurde mit Hilfe eines Spektrometers Varian XL-100-15 bestimmt. Das 100-MHz-Spektrum war nicht erster Ordnung und zeigte deutlich die Gegenwart von drei nicht austauschbaren Protonen. Das Methin-Proton am C4 erschien als scheinbares Dublett bei 5,34 S mit einer Linienaufspaltung von 8,2 Hz. Das benachbarte Proton am C-5 erschien als scheinbares Dublett von Dubletten, die bei 5,19 ô zentriert waren, mit Linienaufspaltungen von 3,4 Hz und 8,2 Hz. Das Signal für die Methingruppe der Aminosäure war ein scheinbares Dublett bei 4,43 8 mit einer Linienaufspaltung von 3,4 Hz.

Das IR-Spektrum des partiellen Hydrates von U43 795 in Nujol-Mull wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers nach Perkin-Elmer Nr. 421 bestimmt. Peaks wurden (ausser denen von Nujol) bei 3620,3140,2710,2620,1660,1640 sh, 1610 sh, 1585,1525,1385,1325,1310,1270,1255,1180,1135,1110,1075, 980,915,900,865,805 und 705 cnr1 gefunden (sh = Schulter).

Zirkulärer Dichroismus: Das Antibiotikum U43 795 ergab in Wasser [ Ol?"3" + 60 000 und [ OMT1 - 47 000.

Dünnschichtchromatographie: Die Dünnschichtchromatographie von U43 795 auf einer zuvor mit Silikagel überzogenen Platte (Quanta gram) ergab nach Besprühen der Platte mit einer Ninhydrin-Lösung eine einzige Zone. Durch Entwicklung der Platte mit einem Gemisch aus Tetrahydrofuran, Aceton und Wasser im Verhältnis von 50:30:20 wurde ein Rf-Wert von 0,55 erhalten.

Die chemische Struktur von U43 795 in der kristallinen Form wurde genau durch Röntgenbeugungsanalyse bestimmt. Kristallines U43 795 kann chemisch als aS, 4S, 5R-a-Amino-3-chlor4-hydroxy-2-isoxazolin-5-yl-essigsäure bezeichnet werden. Molekulargewicht: Genaue Röntgenanalyse ergab ein Hydrat von U43 795 mit der Formel CsHrClNzOf H2O oder dem Molekulargewicht von 212,59.

Löslichkeit: U43 795 ist löslich in Wasser und etwas löslich in Methanol. Es ist jedoch fast unlöslich in Äthylacetat, Äther, Benzol und Chloroform.

Wirksamkeit von U43 795 gegen Mikroorganismen: Die folgenden Ergebnisse wurden mit einem üblichen Plattenversuch unter Verwendung von Rundfiltern mit einem Durchmesser von 13 mm und Anwendung einer Konzentration an U43 795 von 3 mgAml erhalten:

Mikroorganismus Hemmzone um ein

13 mm Rundfilter (mm)

Bacillus cereus Spuren

Bacillus subtilis (in synthetischem Agar) 48 Bacillus subtilis (in Nähragar) 0 Lactobacillus casei 0

Sarcina lutea 23 Staphylococcus aureus 0 Mycobacterium avium 0 Escherichia coli (in Nähragar) 0 Escherichia coli (in synthetischem Agar) 0 Salmonella schottmuelleri 0

Salmonella gallinarum 25 verschleiert Proteus vulgaris 0 Klebsiella pneumoniae 0 Saccharomyces pastorianus 0 Pénicillium oxalicum 0

Saccharomyces cerevisiae Spuren

Streptococcus faecalis 38 sehr verschleiert

Pseudomonas fluorescens 0

Glomerella cingulata Spuren

Die Herstellung von U43 795 erfolgt erfindungsgemäss durch Züchten von Streptomyces sviceus, der zu den Actino-myceten gehört. Eine der Eigenschaften dieses Mikroorganismus besteht in der Erzeugung des Antibiotikums AT-125 und 5 des Antibiotikums U43 795.

Eine Subkultur des lebenden Mikroorganismus wurde am 15. Februar 1972 hinterlegt und kann von der ständigen Sammlung der Northern Utilization and Research Division, Agricul-tural Research Services, U.S. Department of Agriculture, Peo-10 ria, Illinois, V.St.A. unter der Hinterlegungsnummer NRRL 5439 erhalten werden.

Die Taxonomie von Streptomyces sviceus wurde bestimmt von Alma Dietz und beschrieben in Band 3 von Antimicrobial Agents and Chemotherapy, März 1973, Seiten 425-431. 1 s Das neue Antibiotikum U43 795 wird bevorzugt hergestellt, indem der erzeugende Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Es versteht sich, dass zur Herstellung begrenzter Mengen auch Oberflächenkulturen und Kolben verwendet 20 werden können. Der Organismus wird z. B. in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein proteinhaltiges Material enthält. Zu den bevorzugten Kohlenstoffquellen gehören Glukose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Mais-25 stärke, Laktose, Dextrin, Melassen und dergleichen. Zu den bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pan-kreatisch verdautes Kasein, Branntweintrester, tierische Pep-30 tonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenstückchen und dergleichen. Vorteilhaft werden Kombinationen dieser Kohlenstoff-und Stickstoffquellen verwendet. Spurenmetalle, wie z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt zu werden, da als 35 Bestandteile des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet werden.

Die Herstellung der genannten Verbindung kann bei jeder Temperatur bewirkt werden, die für ein befriedigendes Wachstum des Mikroorganismus förderlich ist, z. B. bei etwa 18 bis 40 40 °C und vorzugsweise bei etwa 20 bis 32 °C. Gewöhnlich wird eine optimale Herstellung der neuen, antibiotisch aktiven Verbindung in etwa 2 bis 10 Tagen erreicht. Normalerweise bleibt das Medium während der Fermentation schwach sauer (bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,0). Der endgültige pH-Wert hängt 45 teilweise von etwa vorhandenen Puffersubstanzen und teilweise von dem ursprünglichen pH-Wert des Kulturmediums ab, der vorzugsweise vor der Sterilisation auf etwa 7,0 eingestellt wird.

Wenn z. B. das Wachstum in grossen Kesseln und Tanks w durchgeführt wird, wird zur Beimpfung vorzugsweise die vegetative Form und nicht die Sporenform des Mikroorganismus verwendet, um eine deutliche Verzögerung in der Produktion der neuen Verbindung und die damit verbundene unwirksame Anwendung der Vorrichtung zu vermeiden. Daher ist es 55 erwünscht, in einer Nährbrühenkultur durch Beimpfung dieser Brühenkultur mit einem aliquoten Teil einer Boden- oder Schrägkultur ein vegetatives Impfmaterial herzustellen. Wenn auf diese Weise ein junges, wirksames vegetatives Impfmaterial erhalten wurde, wird es aseptisch auf grosse Kessel oder no Tanks übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Impfmaterial hergestellt wird, kann die gleiche oder eine andere Zusammensetzung wie das zur Produktion der neuen Verbindung verwendete Medium haben, vorausgesetzt, dass ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erreicht wird.

65

Das neue, erfindungsgemäss erhaltene Antibiotikum U-43 795 ist eine amphotere Verbindung. Es ist löslich in Wasser und wenig löslich in Methanol.

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Zur Isolierung und Reinigung von U-43 795 können verschiedene Verfahren angewendet werden, z. B. Absorptionsverfahren mit anschliessender Eluierung mit einem geeigneten Lösungsmittel, Säulenchromatographie, Verteilungschromatographie und Kristallisation aus Lösungsmitteln.

In einem bevorzugten Gewinnungsverfahren werden U-43 795 und das gleichzeitig hergestellte AT-125 aus ihrem Kulturmedium durch Filtration durch ein Diatomit mittlerer Porosität, z. B. FW 40 von der Eagle Picher, gewonnen. Andere geeignete Diatomite sind im Handel unter den Handelsbezeichnungen Super Cel (Johns Manville's fine diatomite), Dicalite 4200 (Great Lakes) und Miraflo 40 (Eagle Picher) erhältlich.

Die klare Flüssigkeit wird vorzugsweise durch eine chromatographische Säule geleitet, die mit einem Styrolsulfonsäure-harz oder einem ähnlichen Sulfonsäureharz gefüllt ist. Ein bevorzugtes Sulfonsäureharz ist Dowex 50 in der sauren Form, das vorzugsweise stark vernetzt sein sollte, z. B. Dowex 50x 16. Andere geeignete Harze sind im Handel unter den Handelsbezeichnungen Amberlite IR-120, Nalcite HCR, Chempro C-20, Permutit Q und Zeokarb 225 erhältlich. Nach ausreichendem Waschen der Säule wird das Antibiotikum gewöhnlich mit einer Base eluiert, wobei NH4OH bevorzugt wird. Die aus der vorstehenden chromatographischen Säule erhaltenen antibiotisch wirksamen Eluate können gesammelt und konzentriert werden.

In einem bevorzugten Reinigungsverfahren wird das erhaltene, vorstehend beschriebene wässrige Konzentrat bei einem neutralen pH-Wert (6,2 bis 7,8) durch eine Säule geleitet, die ein schwach basisches Styrol-Polyaminharz oder ähnliches Polyaminharz enthält. Ein bevorzugtes Polyaminharz ist Amberlite IR 45 (OH"). Andere verwendbare Harze sind Amberlite IR 4B, Nalcite WBR, DeAcidite E und Duolite A.2. Die Säule wird insbesondere mit entionisiertem Wasser, 50%igem wässrigen Methylalkohol und 90%igem wässrigen Methylalkohol gewaschen und dann vorzugsweise mit 0,5 n Essigsäure in 90%igem Methylalkohol eluiert. Die wirksamen Eluatfraktionen werden gewöhnlich gesammelt und anschliessend vorzugsweise unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wird. Methylalkohol kann durch Wasser ersetzt werden.

Der vorstehend erhaltene Rückstand, der sowohl U-43 795 als auch AT-125 enthält, wird vorzugsweise anschliessend einer chromatographischen Trennung unter Verwendung von Silika-gel 60 (Nummer 7734 von E. Merck Darmstadt) und einem Gemisch aus Methyläthylketon, Aceton und Wasser im Verhältnis von 65:20:15 als Lösungsmittelsystem unterworfen. Dieses Verfahren ergibt relativ reine Präparate von U-43 795 und AT-125.

Der Titer für AT-125 in der Flüssigkeit kann während der verschiedenen Stufen der Gewinnungsverfahren mit Hilfe eines Plattenversuchs unter Verwendung von Bacillus subtilis überwacht werden, wobei Bacillus subtilis in einem synthetischen Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet wird:

NaMo04-2H20

C0CI2

Q1SO4

MnSC>4

CaCh

FeCl2.4H20 ZnCh*

200 p.g/ml 100 ng/ml 100 (ig/ml 2 mg/ml 25 mg/ml 5 mg/ml 5 mg/ml

25

30

Na2HP04-7H20

KH2PO4

(NH4)2S04

MgSCU

Glucose

Bacto Agar*

destilliertes Wasser

Metallionen-Vorratslösung*

1.7 g

2,0 g 1,0 g 0,1 g 2,0 g 15,0 g 11 1 ml

*Bacto Agar von der Difco Laboratories, Detroit, Michigan

**Metallionen-Vorratslösung der folgenden Zusammensetzung:

*ZnCh muss unter Verwendung von einem Tropfen 0,1 n HCl pro 10 ml Wasser getrennt gelöst werden. Die Vorratslösung wird gewöhnlich erhitzt, um alle Verbindungen in Lösung zu bringen, anschliessend 24 Stunden lang stehengelassen und steril filtriert.

Dieses Medium wird in der Regel mit einer Sporensuspension von B. subtilis (l,5x 10' Zellen/ml) in einem Verhältnis von 0,5 ml pro Liter beimpft. Die Flüssigkeitsproben werden z. B. auf Filtrierpapiere mit einem Durchmesser von 12,5 mm aufgebracht (0,08 ml pro Rundfilter), das Versuchssystem wird über Nacht bei 37 °C inkubiert und die Hemmzonen werden gemessen. Die Potenz der Probe wird im allgemeinen mit Hilfe der üblichen Standardkurve auf den Durchmesser der Hemmzone bezogen.

Dieses Medium kann nach dem Besäen mit B. subtilis auch zur Feststellung von Antibiotikum AT-125 verwendet werden. Das Antibiotikum U43 795 kann durch Bioautographie in verhältnismässig reinen Proben, d. h. Proben, die frei von Antibiotikum AT-125 sind, festgestellt werden. Bei diesem Verfahren können Papierdiagramme mit der oberen Phase eines Lösungsmittelgemisches von 1-Butanol, Methanol, Benzol und Wasser im Verhältnis 2:1:1:1 entwickelt werden. Nach der Entwicklung werden die Blätter gewöhnlich getrocknet, und die Papierdiagramme können dann auf transparente Papierdiagramm-Einsätze gelegt werden, die das besäte Medium enthalten, und nach etwa 20 Minuten entnommen. Die Einsätze werden wie vorstehend beschrieben, vorzugsweise über Nacht, inkubiert, und die Hemmzonen werden beobachtet.

Da das Antibiotikum U43 795 eine amphotere Verbindung ist, kann es Salze mit Säuren, Alkalimetallen, Ammoniak, Erdal-kajimetallen, Magnesium, Aluminium und Aminen bilden. Metallsalze können hergestellt werden, indem man das Antibiotikum U43 795 in Wasser löst und die Lösung mit einer verdünnten Metallbase versetzt, bis der pH-Wert der Lösung mehr als 7 beträgt. Zu den Metallsalzen von U43 795 gehören bevorzugt die Natrium-, Kalium- und Kalziumsalze. Auch die Salze mit organischen Basen, wie primären, sekundären und tertiären Mono-, Di- und Polyaminen, können unter Anwendung bekannter Methoden gebildet werden. Weiterhin können auch Ammoniumsalze nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Andere Salze mit therapeutisch wirksamen Basen können erhalten werden, die den Salzen eine zusätzliche therapeutische Wirkung verleihen. Derartige Basen sind z. B. die Purinba-sen, wie z. B. Theophyllin, Theobromin, Caffein oder Derivate solcher Purinbasen, Antihistaminbasen, die in der Lage sind, Salze mit schwachen Säuren zu bilden; Pyridinverbindungen, wie z. B. Nicotinsäureamid, Isonicotinsäurehydrazid und dergleichen; Phenylalkylamine, wie z. B. Adrenalin, Ephedrin und dergleichen; Cholin und andere Basen.

Säureanlagerungssalze können durch Neutralisation von U43 795 mit der geeigneten Säure auf einen pH-Wert unterhalb etwa 7,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 2 bis 6, hergestellt werden. Geeignete Säuren für diesen Zweck sind z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfaminsäure, Bromwasserstoffsäure und dergleichen. Die Salze von U43 795 mit Säuren und Basen können für die gleichen biologischen Zwecke wie die Stammverbindung verwendet werden.

Das Antibiotikum U43 795 ist wirksam gegenüber Bacillus subtilis und kann bei der Lagerung von Erdölprodukten zur Bekämpfung dieses Mikroorganismus verwendet werden, der

5

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für die Lagerung von Erdölprodukten einen bekannten Schlamm- und Korrosionsbildner darstellt. Weiterhin kann das Antibiotikum U43 795 aufgrund seiner Wirksamkeit gegenüber Bacillus subtilis verwendet werden, um den Geruch von Fisch oder Fischkörben, der durch diesen Organismus verursacht wird, zu verhindern oder soweit wie möglich zu vermindern. U43 795 kann weiterhin verwendet werden, um Laboratoriumstische und -einrichtungen in einem bakteriologischen Laboratorium, die mit Bacillus subtilis und/oder Sarcina lutea verunreinigt sind, zu reinigen. i

Ferner ist U43 795 wirksam gegenüber Mäuseleukämie LI 210 in Laboratoriumsmäusen und kann daher zur Behandlung dieser Mäuse verwendet werden.

Es besteht die Möglichkeit, das erfindungsgemäss erhaltene Antibiotikum der Formel I in Bis-acylderivate der folgenden i Formel c!

Formel co2h

(ii)

h

-n-r!

ist. Diese Verbindungen der Formel III und IV kann man erhalten, indem man das Bis-acylat der Formel II in ein Säurechlorid umwandelt und dann mit einem Alkohol der Formel R'OH oder einem Amin der Formel NH2R' umsetzt.

Die Bis-acylate können nach üblichen Veresterungsverfahren, wie sie z. B. von Smuszkovicz in J. Org. Chem., Band 29 (1964), S. 843, beschrieben sind, in die entsprechenden verester-ten Bis-acylderivate umgewandelt werden. Die vorstehenden Reaktionsfolgen werden wie folgt erläutert:

«Bis-acyl»-derivate

Cl

.oh nh-a

C0H

(I)

worin A den Acylrest einer Carbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einer durch Halogenatome, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Thiocyano- oder niedere Alkoxygruppen sub- 30 stituierten Carbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder den Rest -SO2R, worin R = CH3 oder ist,

bedeutet, überzuführen.

Aus den genannten Bis-acylderivate der Formel II können Verbindungen der Formeln

(iii)

h-n-a

Übliche Acylierungsbedingungen mit einem entsprechenden Säurehalogenid oder -anhydrid oder einem Sulfonylhalogenid

Cl da

K

0-

co2h

(ii)

nh-a

A = Acylrest einer Carbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffato-men oder einer durch Halogenatome, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Thiocyano- oder niedere Alkoxygruppen substituierten Carbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder der Rest -SO2R, worin R = CH3 oder sowie

(ivi

Umwandlung in Säurechlorid mit anschliessender Umsetzung mit geeigneten Alkoholen oder Aminen = übliche Veresterungsbedingungen

1

hergestellt werden, worin A die weiter oben angegebene Bedeutung hat, B die Gruppe -O-R' ist, worin R' einen Alkyl-rest mit 1 -20 Kohlenstoffatomen bedeutet, und B' ein Rest der

(II bzw. III)

h-n-a

A wie vorstehend H, B" = -H-N-R' oder = -O-R', worin R' eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen

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6

Weiterhin kann das Antibiotikum U43 795 nach üblichen Verfahren [vgl. R.A. Boissonnas, Advances in Organic Chem, Bd. 3 (1963), S. 159] in Aminoacyl-Stickstoff-Derivate umgewandelt werden, indem man zuerst den Aminostickstoff mit einer geeigneten Schutzgruppe, z. B. Carbobenzyloxy (Cbz>chlorid oder Carboäthoxyphthalimid umsetzt, oder indem man selektive Acylierungsbedingungen mit Acylanhydriden anwendet. Die erhaltene Verbindung kann anschliessend unter Anwendung üblicher Veresterungsverfahren verestert werden, worauf die Schutzgruppe für den Aminostickstoff durch Hydrolyse entfernt wird. Die vorstehende Reaktionsfolge kann wie folgt erläutert werden:

«Monoacyl»-Stickstoffderivate selektive Acylierungsbedingungen mit Acylanhydriden = wäss-rige Base

I

Carbobenzyloxychlorid oder Carboäthoxyphthalimid oder oder Acylrest einer Carbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoff ato-men oder einer durch Halogenatome, Nitro-, Hydroxy-, Amino-,Cyano-, Thiocyano- und niedere Alkoxygruppen substituierten Carbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen.

übliche Veresterungsverfahren (+ Amidbildung)

übliche

Cl

Entfernung von Cbz- '

oder PhthaL-imido- ^-0

Schutzgruppeni •

C-B

v>

B" = -H-N-R' oder = -OR', D wie vorstehend, worin R' =

eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Weiterhin kann das Antibiotikum U43 795 in Monoacyl- 4; Sauerstoff-Derivate umgewandelt werden, indem man zuerst den Aminostickstoff wie vorstehend erläutert schützt und dann die Schutzgruppe wie ebenfalls vorstehend erläutert unter üblichen Acylierungsbedingungen acyliert. Die Schutzgruppe an der Aminogruppe kann dann entfernt werden, oder das geschützte Acylat kann unter Anwendung üblicher Veresterungsbedingungen wie vorstehend erläutert verestert werden, wobei das veresterte Aminoacyl-Sauerstoff-Derivat erhalten wird. Die vorstehende Reaktionsfolge kann wie folgt erläutert werden:

«Monoacyl»-Sauerstoff-Derivate

COpH

Cbz- oder Phthalimido-Derivate oder andere, leicht entfernbare Schutzgruppe am Stickstoff

übliche Acylierungsbedingungen

7

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Cl

7

,C02H übliche Entfernung. der Schut2T-gruppe am Aminostickstoff

+NH;

übliche Veresterungsverfahren (+ Amidbildung)

1

.0A

II übliche C-B Entfernung der Schutz-gr.uppe- am ^ 0

Aminostickstoff

Die Acyl- und Estergruppen sind die gleichen, wie sie vorstehend für die Bis-acylderivate von U43 795 angegeben wurden. 30

Die vorstehenden Derivate von U43 795 können für die gleichen Zwecke angewendet werden, wie sie bereits vorstehend für U43 795 aufgeführt wurden.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung. Alle Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht und alle Anteile von 35 Lösungsmittelgemischen beziehen sich auf das Volumen, wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel

A. Fermentation •»«

Eine Vorratsbodenprobe von Streptomyces sviceus, NRRL 5439, wurde zum Beimpfen von 500 ml Erlenmeyer-Impfkolben verwendet, die jeweils 100 ml eines sterilen Mediums enthielten, das aus den folgenden Bestandteilen bestand:

45

Dextrose 25 g/1

Pharmamedia* 25 g/1

Leitungswasser auf 11

*Produkt der Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas.

Der pH-Wert des Mediums betrug vor der Sterilisation 7,2. Das Impfmaterial wurde 2 Tage bei 28 °C auf einer mit 250 UpM laufenden umlaufenden Schüttelmaschine nach Gump gezüchtet. Das auf diese Weise hergestellte Impfmaterial 55 wurde zum Impfen von 500 ml Erlenmeyer-Fermentationskolben verwendet, die jeweils 100 ml eines sterilen Fermentationsmediums enthielten, das aus den folgenden Bestandteilen bestand:

60

NH4C1 5 g/1

Cerelose 2 g/1

Maisstärke 10 g/1

gewaschene Hefe 2,5 g/1

Sojabohnenmehl, fettextrahiert, fein gemahlen (KaySoy) 20 g/1

Schmalzöl 1 ml

Leitungswasser auf 11

Der pH-Wert der Vorsterilisation wurde mit 4 n NaOH auf 7,2 eingestellt. Die Fermentationskolben wurden in einer Menge von 5 ml Impfmaterial pro 100 ml Fermentationsmedium beimpft. Die Fermentationskolben wurden 2 bis 3 Tage bei einer Temperatur von 32 °C auf einer mit 250 UpM laufenden umlaufenden Schüttelmaschine nach Gump gezüchtet.

B. Gewinnung

Die gesamte Flüssigkeit (2501) aus einer vorstehend beschriebenen Fermentation von AT-125 und U43 795 wurde durch ein Diatomit mittlerer Porosität filtriert. Die erhaltene klare Flüssigkeit wurde bei einem pH-Wert von 7 bis 8 in einer chromatographischen Säule durch 251 frisch regeneriertes Dowex 50x16 (H+) geleitet. Die Säule wurde mit 501 entionisiertem Wasser gewaschen und anschliessend mit 1201 1 n NH4OH eluiert, wobei 61 Fraktionen gesammelt wurden. Die wirksamsten Fraktionen (Hemmzonen > 50 mm) wurden bestimmt, indem man darin eingetauchte und an der Luft getrocknete Filtrierpapiere auf einen Einsatz von Bacillus subtilis (gezüchtet in dem vorstehend beschriebenen synthetischen Medium) aufbrachte. Die wirksamen Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert, um überschüssiges NH4OH zu entfernen.

C. Reinigung

(1) Säulenchromatographie mit einem schwachbasischen Polyaminharz vom Typ Styrol-Polyamin.

Das wie vorstehend beschrieben hergestellte, wirksame wässrige konzentrierte Dowex-50-Eluat wurde bei einem pH-Wert von 7 bis 7,5 durch eine Säule geleitet, die 41 Amberlite IR 45 (OH-) enthielt. Die Säule wurde mit 81 entionisiertem Wasser, 4150%igem wässrigen Methylalkohol und 8190%igem wässrigen Methylalkohol gewaschen und anschliessend mit 0,5 n Essigsäure in 90%igem Methylalkohol eluiert, wobei 21 Fraktionen gesammelt wurden. Die wirksamsten Fraktionen (bestimmt durch den Versuch mit Bacillus subtilis) wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.

(2) Silikagel-Chromatographie

Das folgende Verfahren wurde unter Verwendung von Sili-

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8

kagel 60 (Nr. 7734 von E. Merck Darmstadt) mit den vorstehend erhaltenen Rückständen der IR 45 (OH")-Säule durchgeführt. Wirksame Fraktionen (mit einem Gehalt von 6,55 g, 934 BU/mg oder 5,84% AT-125) aus der vorstehend beschriebenen Säule IR 45 wurden zur Trockene eingedampft, und die Essig- 5 säure wurde mit Wasser ausgetrieben. Der erhaltene Rückstand wurde in 328 ml Wasser suspendiert und auf 33 g Silikagel eingedampft Der Kolben wurde mit 5 g frischem Silikagel gespült Das homogene Pulver wurde über einer Säule mit Silikagel chromatographiert, wobei das Silikagel durch Auf-io schlämmen von 600 g Silikagel in einem Gemisch aus Methyl-äthylketon, Aceton und Wasser im Verhältnis 65:20:15 hergestellt worden war. Die Säule wurde mit 7200 ml dieses Lösungsmittelgemisches eluiert, wobei zuerst 1200 ml gesammelt (Nr. 0) und dann 500 ml Fraktionen (Nr. 1 bis 12) aufgefangen wur-is den. Die Ergebnisse waren die folgenden:

Nr. BSS-Zone2 5 ATüpfel auf DC3

(1-10)1

Silikagelplatte Ninhydrin-Bestimmung

0

1

0

keine Zone

2

23H

keine Zone

3

29

stark

U43 795

4

30

stark

U43 795

5

57

mässig

U43 795+ AT-125

6

70

mässig

AT-125

7

70

mässig/schwach

AT-125

8

60

schwach

AT-125

9

55

schwach

10

47

schwach

11

32

schwach

12

0

'1 bis 10 Verdünnungen der Fraktionen wurden getüpfelt

2BSS-Zone ist die Hemmzone (in mm) in einem vorstehend beschriebenen Plattenversuch mit B. subtilis.

'Dünnschichtchromatographie mit einem Gemisch aus Methyläthylketon, Aceton und Wasser im Verhältnis 65 :20:15 auf einer Silikagelplatte. Ninhydrin-Bestimmung.

Die Fraktionen 3 und 4 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck bei 40 °C eingedampft; der Rückstand wurde mit Methylalkohol zerrieben, wobei 1,37 g praktisch reines U-43 795 erhalten wurden. Umkristallisation aus wässrigem Methylalkohol ergab das analytisch reine U43 795 in Form seines kristallinen Hydrates. Das Hydratwasser konnte durch Trocknen entfernt werden.

In ähnlicher Weise ergab die Kristallisation der Fraktionen 6 bis 8 0,37 g praktisch reines AT-125, das nach Umkristallisation aus wässrigem Methylalkohol analytisch reines AT-125 ergab.

Die Salze vom U43 795-Hydrat Hessen sich wie vorstehend für das nichthydratisierte U43 795 beschrieben herstellen. Das U43 795-Hydrat und seine Salze können für die gleichen Zwecke wie vorstehend für das nichthydratisierte U43 795 angegeben verwendet werden.

Unter einer Bioeinheit der Wirksamkeit (BU) wird die Menge an Antibiotikum verstanden, die erforderlich ist, um aus einem mit 0,08 ml der Antibiotikum-Lösung behandeltem Filtrierpapier von 1,27 cm Durchmesser eine Hemmzone von 20 mm zu erhalten. Der Plattenversuch entspricht der vorstehenden Beschreibung.

G

Claims

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2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums U-43 795 der Formel

C-OH

» e

5CH—ÇH-C0

I 2

0 ®NH3

(I)

sowie seiner Säure, dessen Hydrat bzw. der entsprechenden Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man Strep- '5 tomyces sviceus in einem wässrigen Nährmedium züchtet und anschliessend das gebildete Antibiotikum der Formel I als solches oder in Form seines Hydrates isoliert und gegebenenfalls das erhaltene Antibiotikum als solches bzw. das Hydrat bei einem pH-Wert von weniger als 7 durch Umsetzung mit einer 20 Säure in das entsprechende Säureadditionssalz überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man das erhaltene Antibiotikum isoliert, indem man a) die Fermentationsflüssigkeit filtriert,

b) die filtrierte Flüssigkeit an einem Ionentauscher-Harz 25 absorbiert,

c) das Ionentauscher-Harz eluiert,

d) die Eluate chromatographischen Verfahren mit schwach basischen Styrol-Polyaminharzen unterwirft und die gegen Bacillus subtilis aktiven Fraktionen isoliert, 30

e) diese Fraktionen einer Silicagel-Chromatographie unterwirft, und f) das relativ reine Produkt dadurch von den Nebenprodukten abtrennt.
3. Verfahren zur Herstellung von Metallsalzen, Aminsalzen 35 und Ammoniumsalzen des neuen Antibiotikums U-43 795 bzw. dessen Hydrates der Formel

CO,

dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum bzw. ein Hydrat davon nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 herstellt und dieses anschliessend bei einem pH-Wert von 7-8 mit einer entsprechenden Base umsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum bzw. dessen Hydrat mit therapeutisch wirksamen Basen umgesetzt wird.

C-OH

c*

5CH—CH—C02

(I)

sowie sein Hydrat bzw. Säureadditionssalze werden erfin-dungsgemäss hergestellt, indem man Streptomyces sviceus in einem wässrigen Nährmedium züchtet und anschliessend das gebildete Antibiotikum der Formel I als solches oder in Form seines Hydrates isoliert und gegebenenfalls das erhaltene Antibiotikum als solches bzw. das Hydrat bei einem pH-Wert von weniger als 7 durch Umsetzung mit einer Säure in das entsprechende Säureadditionssalz überführt.

Die Metallsalze, Aminsalze und Ammoniumsalze des Antibiotikums U43 795 bzw. dem Hydrat davon werden erfindungs-gemäss erhalten, indem man zuerst, wie weiter oben beschrieben, das neue Antibiotikum der Formel I bzw. dessen Hydrat herstellt und anschliessend bei einem pH-Wert von 7-8 mit einer entsprechenden Base umsetzt.

Das neue Antibiotikum ist eine amphotere Verbindung, die je nach dem pH-Wert der Umgebung in unterschiedlichen Ionenformen auftreten kann. Bei niedrigem pH-Wert z. B. existiert U-43 795 in Form der Säureanlagerungssalze, bei hohem pH-Wert in Form eines Zwitterions und bei noch höherem pH-Wert in Form eines Metallsalzes.

Das Antibiotikum U-43 795 hemmt das Wachstum von grampositiven Bakterien, z. B. Bacillus subtilis und Sarcina lutea. Es ist auch wirksam gegenüber Salmonella gallinarum und Bacillus cereus.

Das erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum U43 795 ist ein amphoteres Antibiotikum, das gleichzeitig mit dem Antibiotikum AT-125 durch Züchten einer AT-125 produzierenden Actinomycete, nämlich Streptomyces sviceus, in einem wässrigen Nährmedium hergestellt wird.

Das Antibiotikum AT-125 (U-42126), das gleichzeitig neben dem genannten Antibiotikum U43 795 durch Züchten von Streptomyces sviceus in einem wässrigen Nährmedium hergestellt wird, hat die Strukturformel:

Cl

V

CH;

a

5 tH—CH-

■C0;

0-

+NH.

(I)

45