DE2849696A1

DE2849696A1 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p-3

Info

Publication number: DE2849696A1
Application number: DE19782849696
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Asai; Kazunori Hatano; Eiji Higashide
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-11-18
Filing date: 1978-11-16
Publication date: 1979-05-23
Also published as: IT1206651B; PL211028A1; IT7829922A0; ES475178A1; DK514378A; PL122463B1; GB2011385A; CH640270A5; JPS6016236B2; SU1036251A3; US4228239A; FR2409307A1; NL7811325A; DK144657C; DK144657B; GB2011385B; HU179600B; JPS5473194A; FR2409307B1

Description

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums OI5003 P-3

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums OI5OO3 P-3 .in industriell vorteilhafter Weise.

Das Antibiotikum 0^15003 P-3, nachstehend kurz als "P-3" bezeichnet, ist eine neue Verbindung, welche durch Züchtung eines Mikroorganismu.s der Gattung Nocardia, welcher aus natürlichen Quellen isoliert wird, erhalten "wird.

Die erfindungsgemäss verwendbaren'Mikroorganismen erzeugen beim Züchten unter Anwendung üblicher Kulturmedien im allgemeinen gleichzeitig mehrere Komponenten des Antibiotikums C-15003. Zur Trennung einer jeden Komponente aus der Kulturbrühe bedarf man ausserordentlich komplizierter Verfahren, wodurch sich in unvermeidlicher Weise eine niedrige Ausbeute an gewünschter Komponente ergibt.

Zur Behebung dieses Nachteils wurde nach einem Verfahren für die Gewinnung von P-3 ausgiebig geforscht, wobei nun festgestellt wurde, dass P-3 in einem beachtenswert hohen Ausmass, bezogen auf den Gesamtgehalt an Antibiotikum C-15OQ3 dann erhalten werden kann, wenn das Kulturmedium eine spezifische Zusammensetzung aufweist.

Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-3 wobei dieses Verfahren darin besteht> dass man einen

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zur Gattung Nocardia gehörenden und das Antibiotikum C-15003 P-3 (nachstehend hin und wieder als "Antibiotikum C-15003 P-3 erzeugender Stamm" bezeichnet) zu erzeugen vermögender Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet ₃ welches Valin oder Isobuttersäure oder Derivate oder Salze davon enthält, um auf diese Weise in der Kulturbrühe insbesondere Antibiotikum C-15003 P-3 zu erzeugen, worauf man das so erhaltene Antibiotikum C-15003 P-3 gewinnt.

In der vorliegenden Beschreibung bedeuten die Ausdrücke "Antibiotikum C-15003" oder "C-15003^II im allgemeinen die vier Verbindungen der folgenden Formel I als eine Gruppe oder eine Mischung von zwei oder drei der besagten Verbindungen oder irgendeine der besagten Verbindungen.

worin R die Reste -COf

-CO-

-CO-CH , -CO-CH₂-CH₂-CH₃ oder ^CH

CH,

bedeutet.

Unter Bezugnahme auf die obige allgemeine Formel I wird jene Verbindung, in welcher das Symbol R den Rest -CO-CH₂-CH-. darstellt, in der vorliegenden Beschreibung als "Antibiotikum C-15003 P-2" oder kurz als "P-2" bezeichnet, während die Verbindung, in welcher R den Rest

CH₃

darstellt, nachstehend als "Antibiotikum C-15QO3 F-3" oder

wird
kurz "P-3" bezeichnet/. Die Verbindung, in welcher R den Rest -CO-CH₂-CH₂-CH₃ bedeutet, wird hier als "Antibiotikum C-15003 P-3'" oder kurz als "p-3·" bezeichnet. ' Schliesslich wird die Verbindung, in welcher R den Rest

bedeutet, in der vorliegenden Beschreibung als ^i:Antibiotikum C-15003 P-¹I" oder kurz als "P-V bezeichnet.

Als Beispiel des das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes eines Mikroorganismus kann man einen Actinomycetenstamm Nr. C-15003, nachstehend hin und wieder auch "Stamm Nr. C-15003" genannt, bezeichnen, welcher aus dem Eoden oder anderen Proben bei der Sichtung von ein Antibiotikum erzeugenden Mikroorganismen isoliert worden ist.

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Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirljng & Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology Ij), 313-3^0 (I966)] vorgeschlagen wurde, erforscht. Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28 ⁰C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium, Manche der Hyphen haben einer. Durchmesser von 0,8 bis 1,2 μτα und können sich in gewissen Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen I4edien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50-200 χ 200 - 1000 /im) ,· auf welchen weiteres Luftmycel wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, dass nur in wenigen Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen,

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während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale (0,8-1,2\jinF χ ^,8-6,8 jim) und ellipsoidale (0,8-1,2 ^m χ 1,0-2,0 pm) Körper, welche Arthrosporen ähneln, enthielten»

Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergäbe^ dass diese Körper glatte Oberflächen haben»

2) Zellenzusammensetzung

Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP No. 1-Medium während 66 bis 90 Stunden bei 28 ⁰G unter Schütteln gesuchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach der Methode von B* Becker et al» [Applied Microbiology 12, 421 (196¹OI und der Methode nach M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71» 93*1 (1968)} wurden die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag.in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose deuteten.

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3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigte ein verhältnismäßig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blass-· gelb und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben bis gelblichlchfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftrakel war pulvrig und zeigte "im, allgemeinen ein massiges Wachstum bei weisser bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomischen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.

Tabelle I ' .

Züchtungseigenschaften des Stammes Ho^ C-15003

auf taxonomischen Medien
(A) Saccharosenitrat-Agar:

Wachstum (G): massig , leuchtendmelonengelb (3 ia)

bis bernsteinlohfarben (3 lc) _t Bildung - von coremiaähnlichen Gebilden •Luftmycel (AM): spärlich^ weiss Lösliches Pigment (SP): keines oder blass gelblich-:

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lohfarben

(B) Glycerinnitrat-Agar:

ν.

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von

coremiaähnlichen Gebilden AM: massig, v/eiss SP: kein

(C) Glucose-Asparagin-Agar:

G : massig, hellringelblumenfarbig (3 pa) bis leuchtendgelb (2 pa) AM: spärlich, weiss·

-Ji

SP: leuchtendgelb (2 pa)· ■ ·

(D) Glycerin-Asparagin-Agar: .

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von

coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss SP: kein

(E) Stärkeagar:

G :: massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellweizenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen ' • Körpern

AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein

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(P) Nähragar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) · bis khakigelb

(2 ga)^, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss

SP: kein
(G) CaIciummaleat-Agar:

G" : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellweizenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca) .SP: kein ι

(H) Hefeextrakt-Kalzextrakt-Agar:

G : massig, bernsteinfarbig (3 Ic) bis leuchtend gelb (3 la) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca) SP; kein

(I) Hafermshl-Agar: . :

G' : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) ' bis khakigelb

(2 ga) _f Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss bis hellgelb SP: kein·
(J) Pepton~Hefeextrakt~P:isen-Agar: ·

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G ϊ massig, khakigelb (2 ga)

AM: kein · · '

' SP: khakigelb (2 ga)* · ' (K) Tyrosin-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis bellmelonengelb (3 ea) _y Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca) SP: kanielfarben (3 ie)

-" Farbcode nach "Color Harmony Manual", k. Auflage (Container Corporation of America, 1958)

4) Physiologische Eigenschaften · ·

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich für das Wachstum lag bei 12 bis 3& ⁰C · Der Temperaturbereich, in viele hem ein gutes .Wachstum des Lu ft my eel auf Agar (ISP No. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35 ⁰C.

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ORIGINAL INSPECTED

Tabelle II '

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15OO3

waren die folgenden:

Temperaturbereich für das Wachstum: 12 bis 38 *C

Temperaturbereich für das Wachstum des Luft-

mycels: 20 bis 35 ⁰C

Verflüssigung von Gelatine; Hydrolyse von Stärke: ^: Reduktion von Nitraten: Peptonisierung von Milch: ■ Coagulierung von Milch; "-·

Zersetzung von Casein: Herstellung von Melanoid-Pigmenten:

Zersetzung von Tyrosin:^ Zersetzung von Xanthin: Zersetzung von Hypoxanthin: Toleranz in bezug auf Lysozym: Toleranz in bezug auf Natriumchlorid: positiv positiv positiv positiv negativ

positiv negativ (Pepton-

Hefeextrakt-Eisen-Agar),

positiv (Tyrosin-Agar) positiv negativ negativ positiv 2 % .

5) Verwendung ,von verschiedenen Kohlenstoffquellen

909621/0603 OFHÖiNÄl INSPECTED

Die Verwendung von verschiedenen' Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology 56, 107 (IW)] beschr-ieben ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1 % Hefeextrakt untersucht. Dabei liessen sich
die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen V/erte
eruieren.

Tabelle III
Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm N0.C-I5OO3

Kohlenstoffquelle	Wachstum	Kohlenstoffquellen Wachstum
D-Xylose	+ -H-*	Raffinose + +
L-Arabinose • *	+ +	Melibiose ' . +. +
D-Glucose	++ ++	i-Inositol - -
D-Galactose	+ +	D-Sorbitol - -
D-Fructose	+.++ -t+	D-Manna toi ++ -J-+
L-Rhamnose	+ +	Glycerin - +
D-Mannose	-fc-fc* +.+	lösliche Stärke + +
Saccharose	++ ++	Blindversuch - -
Lactose	- ^ -	-
Maltose	+ +'
Trehalose	+ +rt

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■' Grundmedium bei Zusatz von 0,1 JS Hefeextrakt

Anmerkung: -fc-fc-fc; üppiges Wachstum ' ·

■fc-b; gutes Wachstum

•fc: V/achstum -

+ ; schlechtes V/achstum

-j kein Wachstum

6) Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden nach der vielter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen Methode jener von J. Harmur et al. [Journal of Molecular Biology, 3, 2O8, 1961] hergestellt .· Der G-CCGuanin-Cytosin)-« Gehalt des DNA betrug ungefähr 71 MoI-Ji.

Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.

Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes" Bd.. 2 [The Williams and Wilkins Co., I96I] ; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative.Bac-^ teriology, 8. Ausgabe, 197*1"; und anderen Literaturstellen verglichen.

Es wurde angenommen, dass dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber un~ -

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ter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, Vielehe die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu schliessen, dass dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen darstellt.

- Der besagte Stamm No. C-15OO3 ist beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (PERM)" unter der Nummer PERM -P 3992, beim "Institute for Fermentation, Osaka, (IPO)" unter der Nummer IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection (ATCC), 'Maryland, U.S.A." unter der Mummer ATCC-31281 registriert worden.

Ein Mikroorganismus der Gattung Nocardia kann, wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder künstlich. So sollten beispielsweise die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem Licht usw., durch Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind, ) sowie die Mutanten, die sich spontan aus dem Stamm ableiten, im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten Art betrachtet werden. Irgendwelche die Antibiotika C"15O03 P-2, P-3, P-3^f und/oder- P-* zu bilden " '

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und Mutanten lassen sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwenden. So liefert beispielsweise der Stamm No» C-I5OO3 durch verschiedene mutegene Behandlungen Mutanten, welche sozusagen keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien, v/elche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben- oder orangerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weissen Luftmycelien oder im wesentlichen ohne Luftmycelien.

Das im Sinne der vorliegenden Erfindung als Zusatzsubstanz. verwendete Valin und/oder Isobuttersäure kann in Form eines Derivates Verwendung finden. Beispiele von Derivaten sind Alkylester mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, z.B. die Methylester oder Aethylester der soeben genannten Verbindung gen, Amide, wie z.B. das Amid, Alkylamide mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, wie z.B. N-Methylamid oder N-Aethylamid der genannten Verbindungen, deren Ketosäuren, z,B> die ce-Ketoisovaleriansäure, oder Salze der oben erwähnten Verbindungen, wie z.B, die Chlorhydrate, die Natriumsalze, die Kaliumsalze oder Calciumsalze . Valin kann in der D-Form, L^Form oder DL-Form verwendet werden. Man kann auch Mischungen von Valin, Isobuttersäure und/oder deren Derivate verwenden.

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Bei der Durchführung des Verfahrens werden die vorgenannten Substanzen im allgemeinen in Mengen von ungefähr 0,01 bis 1,0 % (Gew./Vol.) und vorzugsweise von ungefähr 0,1 bis 0,5 % (Gew./Vol.) dem Me-.dium in einem beliebigen Zeitpunkte der Züchtung von Nocardia sp.Nr. C-15003 hinzugegeben. Die Zugabe erfolgt vorzugsweise im Anfangsstadium der Züchtung.

Das Medium, welches für die Züchtung eines derartigen ein Antibiotikum C-15003 P~3 erzeugenden Stammes verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, dass es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält', Vorzugsweise wird man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden.

Das Medium kann die erfindungsgemäss verwendete Zusatzsubstanz, ferner Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen, welche durch den das Antibiotikum No. C-15003 P-3 erzeugenden Stamm assimiliert und verdaut werden können,_ anorganische Stoffe, Spurennährmittel usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann

) man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette und OeIe, z.B. Sojabohienöl , Specköl, Hühneröl usw., und dergl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleisch-

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extrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Baumwollsamenmehl, Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z,B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, und Nitratsalze, z.B. Natriumnitrat oder Kaliumnitrat, und dergl, genannt. Das Medium kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze usw., Eisen-, Mangan-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze usw., Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. enthalten. Ferner kann das Medium zusätzlich Vitamine, z.B. die Vitamine B,, Bp, Nicotinsäure, B,₂j ^c> E etc., Nucleinsäuren, z.B. Purin, Pyrimidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine Mineralsäure und/oder ein Alkalimetall oder Ammoniak sowie die entsprechenden Basen als den pH-Wert einstellende Mittel verwenden. Gele, Fette, oberflächenaktive Mittel und schaumverhindernde Mittel können gleichfalls zugesetzt werden.

Die Züchtung kann untei* beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen. Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen, Die Züchtungsbedingungen hängen selbstverständlich vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züch-

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tungsmethode und anderen Paktoren ab. Normalerweise er^ folgt sie bei 20 bis 35 ⁰C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr 5,5 bis 8,5. Vorzugsweise wird man als Züeh-■ tungstemperatur eine solche von 23 bis 30- ⁰C bei einem anfänglichen pH*-Wert von 6,5 bis 7,5 anwenden. Auch die Züchtungsdauer schwankt je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Züchtung so lange fortsetzt, bis die Produktivität von P-3 einen Maximalwert erreicht hat. Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob- submersen Kulturen in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr 48 bis 240 Stunden,

Nachstehend findet sich ein konkretes Beispiel für die Herstellung von P-3 .

Der Stamm Nr. C-15003 wurde in einem Kulturmedium I, welches sich aus 3 % löslicher Stärke, 0,2 % Ammoniumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat, 1,09 % Kaliumdihy- " drogenphosphat, 2,09 % Dikaliumhydrogenphoephat^ 0,001 % Ferrosülfat und der Zusatzsubstanz zusammensetzte, oder in einem Kulturmedium II, welches sich aus 5 % Dextrin, 3 % Maisquellflüssigkeit, 0,1 % Pepton, 0,5 % Calciumcarbonat und der Zusatzsubstanz zusammensetzte, inokuliert und väh*· rend l44 Stunden in einem rotierenden Schuttelbehälter (200 Umdrehungen pro Minute) oder einer Fermentiervorrich-

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tung bei 28 ⁰C gezüchtet.

Die Tabellen IV und V zeigen die Resultate bei Verwendung des Mediums I bzw. II,

Die Gesamtproduktivität an O15003 wurde mit Talaromyces avellaneus IFO 7721 als Testorganismus mittels der Papierscheibenmethode getestet. Das Testmedium bestand aus 3,5 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 % Kaliumdihydrogenphosphat, 5 g Hefeextrakt (Difco, USA), IO g Glucose, 15 g Agar und 1000 ml destilliertem Wasser (pH 7,0),

Die Bestimmung von in der Kulturbrühe angereichertem P-2, P-3 und P-4 erfolgte in folgender Weise:

Die Kulturbrühe wurde mit dem gleichen Volumen Aethylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde eingeengt und getrocknet. Das getrocknete Material wurde dermassen in Aethylacetat gelöst-, dass man 1/100 Volumen der Ausgangsbrühe erhielt. Die Produkte wurden durch Dünnschichtchromatographie mittels Kieselgel (Kieselgelplatten' 6OP₂J-N, Merck, BRD) mit Hilfe von mit Wasser gesättigtem Aethylacetat entwickelt. Die Menge an Antibiotikum und das Verhältnis der Komponenten wurden mit einem Shimazu TLC-ScannerModel CS-910 mit 2 Messwellenlängen (Shimazu, Ltd._s Japan) auf der Basis der integrierten Dichten jedes einzelnen Fleckens auf dem Chromatogramm. bei 25^;-l nm bestimmt. Das Verhältnis der Komponenten wurde in Qe\i,^%₃ bezogen auf sämtliche Produkte, nämlich P-2, P-3 und P-²I _y wiedergegeben.

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Wie sich aus den Tabellen IV und V ergibt, erzeugte der Stamm Nr. C-15003 das Antibiotikum P-3 in einem Verhältnis von 90$ oder mehr, bezogen auf die Gesamtmenge, sofern man die erfindungsgemäss anvisierten Zusatzstoffe verwendete, wogegen die Vierte bei 65 % oder weniger in Abwesenheit solcher Zusatzstoffe lagen. Daraus ergibt sich, dass die Gewinnung von P-3 aus der Kulturbrühe im ersteren Falle wirksamer ist als im letzteren Falle.

Tabelle IV

Zusatz substanz	zugesetzte Menge (%)	Dauer der Zugabe (Std.)*	Verhältnis der Komponenten (Gew.-ji)	P-3	P-4	Totale Produk tivität (jxg/xal)
keine	-	-	P-2	65	.25	10
L-VaIin	0,1·	0	10	95	H	16
L-Valin	0_;3	0	1	97.	2	26
L-VaIin .	0,1	72	1	• 95	3	10
D-Valin	0,1	0	2	95	3	16
Natrium- isobu- tyrat	0,01	0	2	91	8	8
1

Die mit der Zahl 0 angegebene Dauer der Zugabe bedeutet, dass die Zusatzsubsta'nz im Medium zusammen mit den übrigen Bestandteilen zugegeben wurde.

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Tabelle V

Zusatz substanz	zugesetzte Menge {%)	Dauer der Zugabe Cstd.)	Verhältnis der Komponenten (Gew.-50	P-3	P-1	Totale Produk tivität (^g/ml)
keine	-		P-2-	60	25	18
L-VaIin	0,1 :	0	15	90	5	15
L-VaIin	o,3	0	5	9^	3	15
L^VaIin	0,5	0		96	2	13
L-VaIin	0,3	48	2	94	3	13,5
Natrium- isobuty- rat	0,3	0	3	92	3	11
5

■% Die mit der Zahl 0 angegebene Dauer der Zugabe hat die gleiche Bedeutung wie bei der Tabelle IV.

Da P-3, welches in dieser Weise in der Fermentierbrühe erzeugt worden ist, eine lipophile, neutrale Substanz darstellt, lässt sie sich leicht aus der Kulturbrühe nach an sich für die Gewinnung solcher Metabolite bekannten Trennungs- und Reinigungsmethoden gewinnen. P-3 liess sich leicht aus dem Züchtungsfiltrat in mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie z.B." Fettsäureestern, wie Aethylacetat oder Amylacetat, Alkoholen, wie Butanol, halogenieren Kohlenv/asser stoff en, wie z.B. Chloroform, und Ketonen, wie z.B. Mechylisobutylketon, extrahieren. Die Extrahierung von P-3 aus dem Filtrat erfolgte bei einem möglichst neutralen pH-Wert und vorzugsweise mittels Aethylacetat bei einem pH-Wert von 7. Der Extrakt wurde mit V/asser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf wurde ein nichtpolares Lösungsmittel, z.B. Petroläther oder Hexan, dem Konzentrat hinzugegeben und das rohe, die Wirksubstanz enthaltende Produkt als Niederschlag gewonnen. Das rohe Produkt wurde hierauf

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nötigenfalls einer üblichen Reinigungsmethode unterzogen. Als routinemässige Reinigungsmethode kann man die Adsorptionschromatographie nennen. Zu diesem Zwecke kann man übliche' Adsorptionsmittel, wie z,B, Kieselgel, aktives Alüminiumoxyd, ein makroporöses, nicht ionogenes Adsorptionshars usw., verwenden, Das im Rohprodukt enthaltende P-3 liess sich z.B. durch Kieselgelchromatographie mit beispielsweise einer Mischung von Petroläther und Hexan entwickeln und durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, ■ wie z.B.. Aethylacetat, Aceton, Aethanol oder Methanol, oder einem halogenierten Kohlemvasserstoff, wie z.B. Dichlormethan oder Chloroform, welches ein polares Lösungsmittel, wie z.B. einen Alkohol, wie Methanol oder Aethanol, ein Keton, wie z.B. Aceton oder Methylethylketon, oder dergl. enthielt, eluieren. Auf diese Weise liess ι sich P-3 eluieren, abtrennen und gewinnen.

Verwendete man für die Reinigung von P-3 ein makroporöses Ädsorptionsharz, so wurde die Eluierung von P-3 aus der Säule mit einer Mischung von Wasser und einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester durchgeführt. Als niederer Alkohol kommt beispielsweise Methanol_a Aethanol, Propanol oder Butanol usw. und als niederes Keton beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon usw., in Frage. Der Ester kann beispielsweise Aethylacetat, Butylacetat usw. sein. Gemäas einem besonderen Verfahren wurde das rohe Produkt in einer 60 #-igen Methanol-Wasser-Misohung gelöst und in einer Säule von Diaion HP-ΙΟ (Mitsubishi' Chemical Industries Ltd,, Japan) adsorbiert. Die Säule wurde mit einer 70 £~igen Methanol-Wasser-Mischung gewaschen und das P-3 mit einer 90 #-igem Methanol-Wasser-Mischung eluiert.

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^ 2k ~

Beim oben beschriebenen Verfahren wurden die P-3 enthaltenden Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das getrocknete Produkt wurde dann mit 5 bis 8 Volumina Aethylacetat versetzt und das Gemisch -stehengelassen, wobei sich Kristalle vom P-3 ausschieden.

Beim er.findungsgemässen Verfahren erreichte man ein Produktionsverhältnis von P-3 in den C-15003 Produkten von 90 % ' oder mehr,, wobei man P-3 leicht aus der Kulturbrühe gewinnen konnte. Daher ist das erfindungsgemässe Verfahren für die industrielle Herstellung von P-3 besonders interessant»

Die physikochemischen Eigenschaften des nach Beispiel 4 erhaltenen P-3 rinden sieh in der Tabelle VI.

Tabelle VI

Antibiotikum C-15003 P-3

K_?0_o = 635,169

Schmelzpunkt (⁰C)	190 - 192°
Spezifische Drehung v«>_D	; -1-6° + io° (c=0,375 CHCl₅)
Elementaranalyse Gef,-{%)	C = 60,06 H - 7,04 N = ,33. Cl 5,37

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Tabelle VI Fortsetzung

Elementaranalyse Ber, (JS)	C = 60,51 H= 6,82 N = 4,41 Cl = 5,58
Ultraviolett- absorptionsspektren nm Cf)* (in Methanol)	233(30250) 240(sh 28450) 252(27640) 280(5750) 288(5700)
Infrarotabsorptions- spektren (cm"¹) KBr	1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385. 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, IO38
magnetische Kern resonanz spektren (ppm) 100 MHz in CDCl₃	1,27 (d) (3H) l,28(d) (3H)
Massenspektren (m/e)	573, 485, 470, 450
Löslichkeit	unlöslich in Petroläthei·, Hexan und V/asser, spär lich löslich in Benzol und Aether, löslich in Chloroform, Aethylacetat, Aceton, Aethanol, Metha nol, Pyridin, Tetrahydro furan und Dimethylsulf- oxyd
Parbreakt ionen	Dragendorff; positiv Beilstein; positiy

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Es darf angenommen werden, dass die Verbindungen P-3, P-3¹ und P*-H neue Verbindungen darstellen, dass aber P*-2 die gleiche Verbindung wie Maytansinolpropionat ist, welches sich in "Kupchan et al's report" [The Journal of American Chemical Society 3]_, 529²J (1975)] findet. Dies geht aus der Elementaranalyse, aus der spezifischen Drehung, aus der Ultraviolettstrahlenabsorption, der Infrarot Strahlenabsorption j dem I'Iassenspektrum usw. hervor.

Die biologische Wirkung von P-3 ist die folgende:

A) Antimikrobielle Wirksamkeit :

Mit Trypticase-Soja-Agar (BBL) als Versuchsmedium wurden die Hemmkonzentrationen gegenüber den weiter unten erwähnten Mikroorganismen mit Hilfe der Papierschei- ' benmethode festgestellt. Die Filterpapierscheiben (Toyo Seisakusho, dünne Qualität, mit einem Durchmesser von 8 mm) wurden jeweils mit 0,02 ml einer 300 ug/ml Lösung von P-3 imprägniert, worauf man diese Scheiben auf Agar-Platten anordnete, Vielehe mit den weiter unten genannten Mikroorganismen beimpft waren. P-3 hatte-keine Wirkung in bezug auf die folgenden Bakterien, nämlich Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens und Mycobacterium avium.

Andererseits wurde mit Agar-Platten, welche aus 3,5 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g Monokaliumdihydrogenphosphat, 5 g Hefeextrakt (Difco), 10 g Glucose, 15 g Agar und 1.000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 bestanden, die Wachstumsverhinderung gegenüber

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Talaromyees avellaneus getestet. Bei diesem Testversuch lagen die minimalen Hemmkonzentrationen bei 3 pg/ml für P-3 . Ferner wurde Tetrahymena pyriformis W auf einem Testmedium, bestehend aus 20 g Proteose-Pepton -(Difeo), Ig Hefeextrakt ι 2 g Glucose, 1,000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7.0 bei 2% ⁰C während Hk bis 48 Stunden gezüchtet und hierauf die Hemmwirkung auf das Wachstum von P>3 in bezug auf Protozoen durch die Serienverdünnungsmethode bestimmt. Die Wachstumsinhibitlon trat bei I_-UgZmI für C-15003 P-3 ein.

P-3 zeigte Wirkungen gegenüber den folgenden Mikroorganismen :

Fusieladium levieri, Helminthosporium sigmoidium var.. irreguläre, Pjrpicularia oryzae, Cochlioborus miyabeanus, Sclerotinia screrotiorum, Pellicularia sasakii, Trichophyton rubrum,. Rhodotorula rubra und Cryptococcus neoformans.

-B-) Cytostatische Wirkung :

Die therapeutische Wirkungen von F-3 nach einer 9-tägigen, intraperitonealen Dosierung- in bezug auf P 388-Leukämie bei Mäusen (1 χ IS Zellen/Tiere)_ wurden bestimmt. p-3 wies bezüglich des lebensverlängernden Verlaufes eine.cytostatische Wirkung auf, welche, verglichen mit einer Dosismenge von Q,OO(S25 mg/kg/ Tag, einem Wert von 168 % entsprach.

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C) Toxizität ; -

Bei einem akuten Toxizitätstest mit Mäusen als Testtiere, denen man intraperitoneal p-3 injizierte, ergab sich mit diesem Antibiotikum ein LD -Wert von mehr als 0,313 mg/kg.

. Wie bereits erwähnt, zeichnet sich P-3 durch eine starke Hemmwirkung gegenüber Fungi und Protozoen aus und ist daher als fungizides Mittel oder als Antiprotozoenmitt.el sehr wertvoll. Da darüberhinaup P-3 bei mit Tumoren befallenen Säugetieren, z.B. Mäusen, eine lebensverlängernde Wirkung ausübt, darf man auch annehmen, dass diese Verbindung als

• -

Cytostatikum wertvoll sein wird.

. " P-3 kann als fungizides Mittel und als Antiprotozoenmittel mit Vorteil auch im Zusammenhang mit der bakteriellen Oekologie im Boden, in Belebtschlämmen, in der tierischen Körperflüssigkeit oder dergl. verwendet werden. Wünscht man daher wertvolle Bakterien aus einer Bodenprobe zu isolieren oder will man die Wirkungen von Bakterien unabhängig von jenen von Pilzen und Protozoen bei der Bearbeitung und Analyse von Belebtschlämmen, wie sie bei der Behandlung von Abwässern Verwendung finden, einschätzen, so kann man das naue Antibiotikum dazu einsetzen, um ein selektives Wachsen der bak-

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teriellen Flora zu fördern, ohne ein gleichzeitiges Wachsen dter Pilze und Protozoen zu begünstigen. Gemäss einem besonderen Beispiel kann man eine Probe einem flüssigen oder fes.ten Medium und überdios 0,1 ml einer 10 bis 100 ^ig/ml-Lös.ung von P-3 in einer 1 #~igen wässrigen Methanol-' lösung pro ml des Mediums zusetzen, worauf man eine Inkubation einleitet.

P-3 kann auch alb antimikrobielles Mittel für die Behandlung von durch die oben erwähnten Mikroorganismen verursachten Pflanzenkrankheiten eingesetzt werden. Gemäss . einer typischen Anwendung wird P-3 in Form einer 1 #-igen ir.ethanolischen wässrigen Lösung, Vielehe 0,5 ^g/ml bis 5 ^ug/ml cos Antibiotikums enthält, verwendet. So kann man P-3 beispielsweise zum Bekämpfen von Mehltau, der durch Kelmintho-Gporium verursachten Blattfleckenkrankheit und des Blattecheidenbrandes von Reispflanzen verwenden.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils Gew,-Teile, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "%" bezieht sich auf "Gew./VoI", sofern nichts anderes ausgesagt wird.

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Beispiel 1

JJO VoI,'•Teile eines Impf kulturmedxums mit einem •pH-Wert von 7,0, welches 1,0 % Glucose, 2,0 % Bacto-Trypton und 1,2 % Bacto-Hefeextrakt enthielt, wurde in einen Erlenmeyerkolben mit 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen gegossen.

Nach dem Sterilisieren wurde das Medium mit Nocardia sp. No. C-15003 (IFO 13726; ATCC 31281: FERM-P xNo. 3992) geimpft. Das geimpfte Material wurde dann bei 200 Umdrehungen pro Minute in einem rotierenden Schüttelbeeher inkubiert, wobei man die Impfkultur erhielt.

Die in der Kultur vorhandenen Zellen wurden dreimal mit sterilisiertem, destilliertem Wasser gewaschen und die gewaschenen Zellen hierauf erneut in der ursprünglichen Brühe von sterilisiertem, destilliertem Wasser angeschlämmt. 1 Vol.-Teil des so erhaltenen Materials wurde

in 'SO Vol.-Teilen eines als Hauptbestandteil dienenden Kulturmediums, welches aus 3 % lösliche Stärke, 0,2 % Ammoniumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat, 1,09 % Kaliumdihydrogenphosphat, 2,09 % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,001 % Ferrosulfat und 0,3 % L-Valin bestand, inokuliert und diese Hauptkultur bei 28 ⁰C während 8 Tagen in einem rotierenden Schüttelbehälter, welcher mit 200 Umdrehungen pro Minute drehte, behandelt,

Die Gesamtproduktion an C-15OO3 betrug "16 und das Verhältnis von P-3, bezogen auf das gesamte Material, lag bei 95 Gew,-%.

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p.

Beispiel 2"

500 VoI,-Teile der geraäss Beispiel 1 erhaltenen Impfkultur wurden in einem Sakaguchikolben mit einem Passungsvermögen von 2.000 Vol.-Teilen inokuliert und während 48 Stunden bei 28 ⁰C in einer sich hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung (110 Hübe/Minute) gezüchtet, um zu einem Inokulum zu gelangen. Das Inokulum wurde dann zu 100 χ 10 Vol.-Teilen eines Medium hinzugegeben, welches aus 2,0 % Glucose, 3,0 % lösliche Stärke, 1,0 Ji Maisquellflüssigkeit, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,5 % Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 0,3 % Natriumchloridind 0,5 % Calciumearbonat (Gew./Vol.) bestand_; be^a'ndelt, wobei das ganze Materia] sich in einem rostfreien Stahlfermentierbehälter n:
Teilen befand.

tierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 χ 10 VoL-

Die Züchtung erfolgte während 48 Stunden bei

28 ⁰C bei einer Belüftung von loo χ 1o³ Vol-Teilen/Minute und durcl Rühren bei 2CO Umdrehungen pro Minute. Die Kulturbrühe (10 χ 10 Vol.-Teile) wurde in einen röstfreien Stahlfermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 χ 10 Vol.-Teilen eingebracht, welcher IOC- χ 10 Vol.-Teile eines Fermentierungsmediums enthielt, Jas aus 5 %' Dextrin, 3 % Maisquellflüssigkeit, 0,1 % Pepton, o,3 % L-VaIin und 0,5 % Calciumcarbonat (Gew,/Vol.) bestand, wobei der pH-Wert bei 7,0 lag. Die Züchtung erfolgte während 4 Tagen bei 28 ⁰C und einer Belüftung von 100 χ 10³ Vol.-Teilen/ Minute bei Rühren mit 150 Umdrehungen pro Minute.

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Die Gesamtproduktion an C-15003 betrug 12 Das P-3 in C^-15003 wurde in einer Gewichtsmenge von ungefähr 98 % erhalten,

Beispiel 3

Zu 95 x 10 Vol.-Teilen der Kulturbrühe, wie sie gemäss Beispiel 2 erhalten worden war, wurden 50 χ 10 Vol.-Teile Aceton hinzugegeben. Das Gemisch wurde während 30 Minuten gerührt. Das so erhaltene Gemisch wurde mit 2 χ 10^ VbI,-Teilen Hyflo Super-Cel (Johnes and Manville Products, Ltd.) versetzt und das Gemisch gründlich gerührt. Das Gemisch wurde unter Druck durch einen Filter filtriert, wobei man 135 x 10* Vol.--Teile eines FiI-trats erhielt, Dieses Filtrat wux-de mit 50 χ 10⁵ Vol.-Teilen Wasser und 90 χ 10 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch gerührt und zweimal extrahiert. Die erhaltenen Aethylacetatschichten wurden vereinigt und zweimal mit jeweils 80 χ 10"⁵ Vol.-Teilen Wasser gewaschen. Dann wurde die so erhaltene Aethylacetatschicht mit 1 χ 10^ Vol.-Teilen wasserfreiem Natriumsulfat versetzt, getrocknet und auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der gebildete Niederschlag durch Filtrieren gewonnen. Auf diese V/eise erhielt man 35 Teile des rohen Produktes,

Das so erhaltene rohe Produkt wurde mit 50 VoI.-Teilen Aethylacetat versetzt und das· Gemisch gerührt. Die unlöslichen Bestandteile wurden dann durch Filtrieren entfernt und das Filtrat mit 10 Teilen Kieselgel (Merck, BRD, 0,05 bis 0,2 mm) versetzt. Nach dem Rüh-

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ren des Gemisches wurde das Aethylacetat durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde oben einer Kieselgelsäule (500 Vol.-Teile) zugegeben. Die Antibiotika wurden stufenweise mit 500 Vol.-Teilen n-Hexan, 500 VoI.-Teilen einer Mischung von η-Hexan und Aethylacetat im Mischungsverhältnis von 3:1, 2.000 Vol.-Teilen einer Mischung von η-Hexan und Aethylacetat im Mischungsverhältnis von 1:1 und 2.000 VoI,-Teilen mit Wasser gesättigtem Aethylacetat eluiert. Das Eluac wurde jeweils ir Fraktionen von 50 Vol.-Teilen gesammelt.

Ein Anteil von 1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann mit U₃I Vol.-Teil Aethylacetat versetzt, wobei man zu einem Gemisch gelangte. Dieses Gemisch wurde bei 2,5 cm von der Bodenkante einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, BRD₃ 60 F₂₅J₁, 0,25 mm, 20 χ 20) aufgetragen und bei einer Laufstrecke von ungefähr 17 cm mit mit VJasser gesättigtem Aethylacetat entwickelt. Nach der Entwicklung wurde der Nachweis mit ultraviolettem Licht (2.537 S) vorgenommen. Die aktiven Fraktionen von Rf O₃ H2 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf ungefähr 2 Vol.-Teile eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann mit 20 Vol.-Teilen Petroläthpr versetzt, wobei man 9,1 Teile rohe Kristalle erhielt, Diese rohen Kristalle wurden in 20 Vol.-Teilen warmem Aethylacetat gelöst, Nach dem Kühlen gewann man 0,85 Teile P-3 in Form von Kristallen, die in reinem Zustand in einer Menge von 97 Gew.-% erhalten wurden. Der Schmelzpunkt der Kristalle lag bei I89 bis I90 ⁰C.

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Beispiel 4

In 400 VoI,-Teilen 50 %-igem Methanol wurden 20 Teile des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Produktes gelöst. Dann wurde eine Säule (2,5 cm Durchmesser) mit 1.000 Vol.-Teilen Diaion HP-IO (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan) beschickt und mit 3.000 Vol.-Teilen 50 £-igem methanolischem V/asser behandelt. Die nach den obigen Angaben erhaltene Probenlösung wurde dann durch die Säule hindurchgeleitet und mit 1.000 Vol.-Teilen 60 #-igem Methanol gewaschen und durch kontinuierliches Hinunterfliessenlassen unter Verwendung von 7.500 VoI.-Teilen 60 £-igem Methanol in V/asser und 7.500 Vol.-Teilen 95 #-igem Methanol in Wasser eluiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 75 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion nach den Angaben von Beispiel 3 der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterworfen.

Die aktiven Fraktionen Nr. Vl 5 bis 153 wurden gesammelt und eingeengt. Das Konzentrat wurde dann mit 500 Vol.-Teilen V/asser und 1.000 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt.

Das so erhaltene Gemisch wurde in einem Scheidetrichter geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt. Mach zweimaligem Waschen mit jeweils 300 Vol.-Teilen Wasser wurde die Aethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehengelassen.

Die auf diese Weise erhaltenen Kristalle von P-3

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wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet (0,880 Teile'P-3). Die auf diese Weise erhaltenen reinen P-3-Kristalle betrugen 95 Gew.-% und wiesen einen Schmelzpunkt von 188 bis 190 ⁰C auf.

Beispiel 5

Anstelle von L-Valin, wie dies in Beispiel 1 der Fall war, wurde der Methylester von Valin, der N-Kethylester von Valin, Valin-hydrochlorid, die oc-Ketoisovaleriansäure_? der Methylester der Isobuttersäure., der N-Methylcster der Isobuttersäure oder ein Gemisch von Valin und Iscbuttersäure verwendet. Auf diese Weise gelangte man zu ähnlichen Resultaten, d.h. man erhielt das gewünschte P-3 in ähnlichen Ausbeuten.

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Claims

Verfahren sur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-3 Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-3 durch Züchtung eines zur Gattung Nocardia gehörenden, das Antibiotikum C-1-5003 P-3 zu erzeugen vermögenden Mikroorganismus in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen und verdaubare Stickstoffquellen enthaltenden Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Kulturmedium Valin, Isobuttersäure und/oder mindestens ein Derivat davon als Zusatzsubstanzen'hinzugibt.

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ORIGINAL IMSPECTED

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass als Mikroorganismus Nocardia sp.No.
C-15003 (ATCC-31281; IFO 13726; FERM-P No. 3992) verwendet wird.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Zusatzsubstanz Valin und/oder ^Iso' Buttersäure verwendet,

!Als neue Verbindung das Antibiotikum

C-15003 P-3.

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