CH647749A5

CH647749A5 - Salze und ester von monacolin-k, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische praeparate.

Info

Publication number: CH647749A5
Application number: CH5736/80A
Authority: CH
Inventors: Yoshio Tsujita; Masao Kuroda; Kazuhiko Tanzawa; Seigo Iwado; Kiyoshi Hamano; Akira Terahara; Sadao Sato
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1979-07-27
Filing date: 1980-07-25
Publication date: 1985-02-15
Also published as: NL8004303A; AT375334B; FI71300C; ATA392380A; PL225901A1; DE3028284A1; IT8068211A0; FI71300B; FR2462417B1; ES8105781A1; DD153827A5; NZ194445A; ES493726A0; DE3028284C2; FI802357A; AU6083980A; GB2055100A; NO156210C; SE8005386L; DK322380A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Salze und Ester der dem Lacton Monacolin-K entsprechenden freien Säure, auf Verfahren zu deren Herstellung und auf deren Verwendung in antihypercholesterämischen Mitteln.

In der deutschen Patentanmeldung P 3 006 216 wird das Monacolin-K und dessen Herstellung mittels Mikroorganismen der Gattung Monascus, insbesondere Monascus ruber Stamm 1005 (FERM 4822), offenbart. In jener Patentschrift wird die wertvolle und unerwartete Wirkung von Monacolin-K als antihypercholesterämisches Mittel beschrieben. Später wurde in der deutschen Patentanmeldung P 3 006 215 die Herstellung von Monacolin durch Züchtung einer Varietät anderer Mikroorganismen der Gattung Monascus beschrieben. Es wurde nun gefunden, dass die Salze und Ester der freien Säure, von der Monacolin-K das Lacton ist, eine antihypercholesterämische Wirkung gleicher Art wie Mona2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

colin-K besitzen, wobei diese Wirkung vergleichbar oder sogar besser ist. Der Einfachheit halber werden diese Verbindungen nachstehend als Salze und Ester von Monacolin-K bezeichnet. Diese Bezeichnung bezieht sich auf die Salze und Ester der Säure, von welcher Monacolin-K das Lacton ist.

Die Salze und Ester der vorliegenden Erfindung entsprechen der folgenden Formel:

HO

COOtR), OH n worin R einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest oder ein Metallatom und n den reziproken Wert der Valenz des durch R wiedergegebenen Restes oder Atoms bedeuten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf je ein Verfahren für die Herstellung der oben definierten Salze und Ester von Monacolin-K durch Salzbildung oder Veresterung von Monacolin-K oder eines reaktionsfähigen Derivates davon.

Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Salzen von Monacolin-K durch Züchtung eines ein Monacolin-K-salz erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Monascus und durch Isolieren des Monacolin-K-salzes aus dem Züchtungsmedium.

Die erfindungsgemässen Monacolin-K-salze sind Metallsalze und vorzugsweise Alkalimetallsalze, wie z.B. Natriumoder Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie z.B. die Calcium- oder Magnesiumsalze, Salze der Metalle aus der Gruppe lila des Periodensystems der Elemente, wie z. B. die Aluminiumsalze von Übergangsmetallen aus den Gruppen Ib, IIb und VIII des Periodensystems der Elemente, z. B. die Eisen-, Nickel-, Kobalt-, Kupfer- und Zinksalze. Unter diesen Metallsalzen werden die Alkalimetallsalze, die Erdalkalimetallsalze und das Aluminiumsalz bevorzugt und unter diesen wird man den Natrium-, Calcium- und Aluminiumsalzen den Vorrang geben.

Die Monacolin-K-salze lassen sich ohne weiteres in Monacolin-K oder durch Ansäuern in die entsprechende Säure von Monacolin-K überführen. Das so erhaltene Monacolin-K bzw. die so erhaltene Säure lässt sich in Gegenwart eines Alkalis, z. B. eines Alkalimetallhydroxyds oder -carbonats, in ein entsprechendes Salz überführen. Dieser Austausch lässt sich quantitativ und wiederholt durchführen. Es wurde festgestellt, dass die Überführung von Monacolin-K oder der entsprechenden Säure in ein Metallsalz weitgehend vom pH-Wert des die Verbindungen enthaltenden Mediums abhängt. Der kritische pH-Wert liegt bei ungefähr 5,0. Sofern Metallionen zugänglich sind, fällt das Monacolin-K stets in Form eines Salzes an, wenn der pH-Wert über 5,0 ansteigt. In jenen Fällen, in denen der pH-Wert niedriger als 5,0 ist, wird Monacolin-K als solches, als entsprechende Säure von Monacolin-K oder als Mischung dieser beiden Verbindungen in verschiedenen Mengenverhältnissen vorhanden sein.

Die erfindungsgemässen Monacolin-K-ester sind jene Verbindungen der obigen allgemeinen Formel, in welchen R

647 749

einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest bedeutet. Sofern R einen unsubstituierten Alkylrest darstellt, kann es sich um einen geradkettigen oder verzweigten Rest mit vorzugsweise bis zu 8 Kohlenstoffatomen handeln. Beispiele solcher Alkylgruppen R sind die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl- und Hexylgruppen.

Sofern R eine substituierte Alkylgruppe darstellt, kann der Substituent, wie dies für diese Art von Verbindungen bestens bekannt ist, aus den verschiedensten Gruppen ausgewählt sein, einschliesslich der Arylgruppen, Acylgruppen, insbesondere der Arylcarbonylgruppen, Alkoxygruppen, Halogenatome und Hydroxygruppen. Besonders bevorzugte Substituenten sind Arylgruppen und Arylcarbonylgruppen, d.h. solche, bei denen der Rest R eine Aralkylgruppe oder eine Arylcarbonylalkylgruppe bedeutet.

Sofern R eine Aralkylgruppe bedeutet, wird sie vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte Benzylgruppe sein. Substituierte Benzylgruppen besitzen vorzugsweise eine oder mehrere Alkylgruppen, Alkoxygruppen und/oder Halogenatome. Beispiele solcher Benzylgruppen sind die Ben-zyl-, 2-Methylbenzyl-, 3-Methylbenzyl-, 4-Methylbenzyl-, 2-Äthylbenzyl-, 3-Äthylbenzyl-, 4-Äthylbenzyl-, 2-Meth-oxybenzyl-, 3-Methoxybenzyl-, 4-Methoxybenzyl-, 2-Äthoxybenzyl-, 3-Äthoxybenzyl-, 4-Äthoxybenzyl-, 2-Chlor-benzyl-, 3-Chlorbenzyl-, 4-Chlorbenzyl-, 2-Brombenzyl-, 3-Brombenzyl- oder 4-Brombenzylgruppen.

In jenen Fällen, in denen R eine Arylcarbonylalkylgruppe bedeutet, handelt es sich vorzugsweise um eine substituierte oder unsubstituierte Phenacylgruppe. Substituierte Phenacylgruppen besitzen vorzugsweise mindestens einen Alkylrest, Alkoxyrest und/oder mindestens ein Halogenatom. Beispiele solcher Phenacylgruppen sind die Phenacyl-, 2-Methylphenacyl-, 3-Methylphenacyl-,__4-Methylphenacyl-, 2-Äthylphenacyl-, 3-Äthylphenacyl-, 4-Äthylphenacyl-, 2-Methoxyphenacyl-, 3-Methoxyphenacyl-, 4-Methoxyphen-acyl-, 2-Äthoxyphenacyl-, 3-Äthoxyphenacyl-, 4-Äthoxy-phenacyl-, 2-Chlorphenacyl-, 3-Chlorphenacyl-, 4-Chlor-phenacyl-, 2-Bromphenacyl-, 3-Bromphenacyl- oder 4-Bromphenacylgruppen.

Die bevorzugten Ester sind die Methyl-, Äthyl-, Butyl-und Benzylester.

Die erfindungsgemässen Monacolin-K-salze und -ester lassen sich leicht durch der Bedeutung von R entsprechende Behandlung von Monacolin-K als solches oder eines reaktionsfähigen Derivates von Monacolin-K in das gewünschte Salz überführen oder verestern. Beispiele geeigneter reaktionsfähiger Derivate sind die dem Monacolin-K entsprechende Säure und im Falle der Herstellung von Estern auch die Monacolin-K-salze, z.B. Salze der oben erwähnten Art, insbesondere die Natrium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, Eisen-, Zink-, Kupfer-, Nickel- und Kobaltsalze.

Monacolin-K-salze können durch blosse Umsetzung von Monacolin-K oder der ihm zugrundeliegenden Säure mit einem Oxyd, Hydroxyd, Carbonat oder Bicarbonat, vorzugsweise mit einem Hydroxyd oder Carbonat, des in Frage stehenden Metalles erhalten werden. Dabei ist Sorge zu tragen, dass die Umsetzung bei einem pH-Wert von mehr als 5,0 und vorzugsweise von mehr als 7,0 durchgeführt wird, um eine vollständige Überführung von Monacolin-K bzw. der Säure in das gewünschte Salz zu bewirken.

Das bei dieser Umsetzung verwendete Monacolin-K erhält man vorzugsweise nach den Angaben, wie sie in den vorgenannten Patentschriften geoffenbart sind, indem man einen Fungus der Gattung Monascus züchtet und aus dem Kulturmedium Monacolin-K isoliert. Das Monacolin-K kann aus dem Züchtungsmedium isoliert und vor der Salzbildung gereinigt werden. Vorzugsweise erfolgt die Salzbil3

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 749

4

dung aber gleichzeitig mit dem Isolieren und Reinigen des Monacolin-K, wodurch man das Monacolin-K in Form des gewünschten Metallsalzes isolieren kann. Ungeachtet der angewandten Methoden kann man das Metallsalz aus dem Reaktionsmedium oder aus dem Kulturmedium nach an sich bekannten Methoden isolieren, wobei dies auch nach den nachstehend für die Isolierung von Monacolin-K-metallsal-zen aus Kulturen von Monacolin-K-salzen erzeugenden Fungi beschriebenen Methoden geschehen kann.

Die Monacolin-K-ester können durch blosses Verestern von Monacolin-K oder eines reaktionsfähigen Derivates davon erhalten werden. Die Umsetzung kann durch Umsetzung eines Alkohols der Formel ROH oder eines reaktionsfähigen Derivates davon, worin R einen substituierten oder unsubstituierten Alkylrest darstellt, mit Monacolin-K oder der ihm zugrunde liegenden Säure, vorzugsweise in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, z. B. einem Säurehalo-genid, wie z.B. Acetylchlorid, erfolgen. Andererseits kann man die Monacolin-K-ester auch durch Umsetzung eines Monacolin-K-salzes mit einem Halogenid der Formel RX, worin R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe und X ein Halogenatom, vorzugsweise das Jodatom, bedeuten, erhalten.

Man kann auch Monacolin-K-salze direkt durch Züchtung eines ein Monacolin-K-salz erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Monascus erhalten. Geeignete Mikroorganismen, welche man für das vorliegende Verfahren verwenden kann, umfassen Monascus anka SANK 10171, welcher unter der IFO Nr. 6540 bei der Culture Collection of the Institute for Fermentation, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532 (Japan) hinterlegt wurde, Monascus purpureus SANK 10271, welcher unter der IFO Nr. 4513 bei der Culture Collection of the Institute for Fermentation, Osaka (Japan) hinterlegt wurde, Monascus ruber SANK 10671, hinterlegt am 27. April 1979 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chôme Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305 (Japan) unter der Nr. FERM 4958, Monascus vi-treus SANK 10960, hinterlegt am 27. April 1979 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ibaraki-ken (Japan) unter NIHS 609, e-609; Nr. FERM 4960, Monascus paxii SANK 11172, welcher unter der IFO Nr. 8201 bei der Culture Collection of the Institute for Fermentation, Osaka (Japan), hinterlegt wurde, Monascus ruber SANK 11272 (IFO 9203), Monascus ruber SANK 13778, hinterlegt am 27. April 1979 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ibaraki-ken (Japan) unter der Nr. FERM 4959, Monascus ruber SANK 15177, hinterlegt am 27. April 1979 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and technology, Ibaraki-ken (Japan) unter der Nr. FERM 4956, Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832.70), Monascus ruber SANK 17175 (CBS 503.70), Monascus ruber SANK 17275 (ATCC 18199) oder Monascus ruber SANK 18174, hinterlegt am 27. April 1979 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ibaraki-ken (Japan) unter der Nr. FERM 4957. Alle diese Mikroorganismen sind aus bekannten, anerkannten Kultursammelstellen zugänglich, wobei die Kurzbezeichnungen folgendes bedeuten:

NIHS = National Institute of Hygenic Sciences, Japan; CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Ooster-

straat 1, 3740 AG Baarn, Niederlande;

ATCC= American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA.

Bevorzugte, beim vorliegenden Verfahren verwendbare Stämme der Gattung Monascus, welche Monacolin-K-salze zu liefern vermögen, sind Monascus ruber SANK 10671, Monascus ruber 11272, Monascus ruber SANK 13778, Monascus ruber SANK 15177 und Monascus ruber SANK 18174. Monascus ruber SANK 10671, Monascus ruber SANK 13778, Monascus ruber SANK 15177 und Monascus ruber SANK 18174 sind allesamt kürzlich aus Bodenproben isolierte Fungi, deren mikrobiologische Eigenschaften die folgenden sind:

Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956)

Dieser Stamm wurde aus dem Boden bei Tukimino, Ya-mato-city, Kanagawa-prefecture, Japan, gewonnen und am 27. April 1979 unter der Nr. 4956 beim Fermentation Research Institute hinterlegt.

Bei einer Temperatur von 25 °C wächst der Stamm gut auf einem Kartoffel-Glucose-Agarmedium und erzeugt ein lösliches, dem Medium farbgebendes Material von gelblichbrauner bis rötlichbrauner Farbe. Er bildet auf der Grundschicht von Hyphen beliebige geschlossene Fruchtkörper.

Auf einem Weizenmehl-Agarmedium erzeugt dieser Stamm ein blassbraun gefärbtes Material bei gutem Wachstum. Die Bildung von geschlossenen Fruchtkörpern ist gut und die geschlossenen Fruchtkörper sind sphärisch bei einem Durchmesser von 30 bis 60 (im. Diese bilden sich auf kurzen Stielen. Diese Stiele sind nahezu farblos und verzweigt und besitzen eine Grösse von 25-60 x 3,5-5,0 (im. Die Aski sind zart bzw. durchsichtig und lassen sich daher schwer beobachten. Die Askosporen sind farblos und ellip-soid und besitzen Ausmasse von 4,5-6,5 x 4,0-5,0 um. Deren Oberflächen sind glatt. Die Konidien sind basipetal verbunden und besitzen Dimensionen von 7,0-10,0 x 6,0-10,0 (im. Ihre Gewebe sind zerrissen.

Dieser Stamm wächst bei Temperaturen bis zu 37 °C, wobei man allerdings das beste Wachstum bei Temperaturen im Bereiche von 23 bis 30 °C feststellt.

Monascus ruber SANK 10671 (FERM 4958)

Dieser Stamm wurde aus dem Boden bei Shinagawa-ku, Tokyo, Japan, isoliert und am 27. April 1979 beim Fermentation Research Institute unter der Zugänglichkeits-Nr. 4958 eingetragen.

Das Wachstum auf Kartoffel-Glucose-Agarmedium und Weizenmehl-Agarmedium ähnelt jenem des Stammes SANK 15177, mit dem Unterschied jedoch, dass das gebildete, lösliche, färbende Material dunkelrot ist. Der Durchmesser der geschlossenen Fruchtkörper liegt bei 30-80 um und die Durchmesser der Stiele bei 30-70 x 3,0-5,0 um. Aski werden nicht beobachtet. Die Askosporen sind farblos und ellip-soid bei Dimensionen von 4,5-6,5 x 4,0-5,0 [im. Die Konidien sind farblos und birnenförmig oder eiförmig mit Dimensionen von 6,0-10,0 x 6,0-8,5 |xm.

Monascus ruber SANK 13778 (FERM 4959)

Dieser Stamm wurde aus dem Boden bei Inawashirocho, Nagata, Yama-gun, Fukushima-Prefecture, Japan, isoliert und am 27. April 1979 unter der Zugänglichkeits-Nr. 4959 beim Fermentation Research Institute hinterlegt.

Das Wachstum auf Kartoffel-Glucose-Agarmedium und Weizenmehl-Agarmedium ist ähnlich dem Stamm SANK 15177, mit dem Unterschied jedoch, dass das erhaltene, lösliche, färbende Material eine blassrötlichbraune bis rötlichbraune Farbe aufweist. Die geschlossenen Fruchtkörper, auch Kleistotheka genannt, besitzen Durchmesser von 35 bis 75 (im, und die Stiele solche von 30-70 x 3,5-5,0 [im. Aski werden keine beobachtet. Die Askosporen sind farblos und ellipsoid und besitzen Dimensionen von 4,5-6,0 x 4,0-5,0 (im. Deren Oberflächen sind glatt. Die Dimensionen der Konidien liegen bei 7,0-10,0 x 6,0-10,0 (im.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

647 749

Monascus ruber SANK 18174 (FERM 4957)

Dieser Stamm wurde aus dem Boden bei Shakotancho, Shakotan-gun, Shiribeshi Shicho, Kokkaido-Prefecture, Japan, isoliert und am 27. April 1979 beim Fermentation Research Institute unter der Zugänglichkeits-Nr. 4957 hinterlegt.

Das Wachstum auf Kartoffel-Glucose-Agarmedium und Weizenmehl-Agarmedium ist ähnlich jenen des Stammes SANK 15177 mit dem Unterschied indessen, dass das erzeugte, färbende Material blassrosafarben ist. Die geschlossenen Fruchtkörper besitzen einen Durchmesser von 20 bis 70 um und die Durchmesser der Stiele Dimensionen von 20-60 x 3,0-5,0 (im. Aski werden keine beobachtet. Die Askosporen sind farblos und ellipsoid und deren Ausmasse liegen bei 5,0-7,0 x 4,0-5,5 |xm. Deren Oberflächen sind glatt. Die Konidien sind basipetal miteinander verbunden und farblos, wobei die meisten birnenförmig sind und Dimensionen von 6,0-9,5 x 6,0-10,0 (im aufweisen.

Aufgrund der Beobachtungen der oben erwähnten Eigenschaften wurden alle diese Mikroorganismen als Stämme von Monascus ruber van Tieghem identifiziert.

Die mikrobiologischen Eigenschaften von Monascus ruber sind in den folgenden Literaturstellen geoffenbart: Takada, Transactions of the Micological Society of Japan, 9, 125-130 (1969) [Materials for the Fungus Flora of Japan (7)] and van Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, 31,227 (1884). Die Askosporenerzeugung der Stämme wurde durch Cole et al. in the Canadian Journal of Botany, 46,987 (1968), «Co-nidium ontogeny in hyphomycetes. The imperfect state of Monascus ruber and its meristem arthrospores», geoffenbart.

Ausser den vorgenannten Pilzstämmen kann man beliebige Pilze der Gattung Monascus, einschliesslich der Varietäten und Mutanten, welche zur Erzeugung von Monacolin-K-salzen fähig sind, beim vorliegenden Verfahren verwenden.

Monacolin-K-salze lassen sich durch Züchtung des ausgewählten Mikroorganismus in einer Kulturbrühe unter aeroben Bedingungen unter Anwendung der gleichen Arbeitsweisen, wie dies für die Züchtung von Fungi und anderen Mikroorganismen aus dem Stande der Technik bestens bekannt ist, herstellen. So kann man beispielsweise den gewünschten Stamm von Monascus zuerst auf einem geeigneten Medium züchten und hierauf die erzeugten Mikroorganismen sammeln und in einem anderen Kulturmedium impfen und darin züchten, um auf diese Weise das gewünschte Monacolin-K-salz zu erhalten. Das für die Vermehrung des Mikroorganismus verwendete Kulturmedium und das für die Erzeugung von Monacolin-K-salzen verwendete Züchtungsmedium können die gleichen oder verschiedene Medien sein.

Beliebige, für die Züchtung von Fungi bekannte Kulturmedien lassen sich verwenden vorausgesetzt, dass sie, wie dies ebenfalls bestens bekannt ist, die erforderlichen Nährmaterialien, insbesondere eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, enthalten. Beispiele geeigneter assimilierbarer Kohlenstoffquellen sind Glucose, Maltose, Dextrin, Stärke, Lactose, Saccharose und Glycerin. Für die Erzeugung von Monacolin-K-salzen wird man von den soeben genannten Kohlenstoffquellen insbesondere der Glucose und dem Glycerin den Vorzug geben. Beispiele geeigneter assimilierbarer Stickstoffquellen sind Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Maisquellflüssigkeit, Kleie sowie anorganische Stickstoffquellen. Als Stickstoffquellen wird man vorzugsweise Pepton verwenden. Bei der Herstellung von Monacolin-K-salzen kann man dem Kulturmedium nötigenfalls ein anorganisches Salz und/oder ein Metallsalz zugeben. Ferner kann man nötigenfalls eine kleine Menge eines Schwermetalles hinzugeben.

Bei der Herstellung von Monacolin-K-salzen durch Fer- , mentieren mit einem Fungus der Gattung Monascus ist es wichtig, dass im Kulturmedium oder innerhalb des Körpers des Fungus Metallionen vorhanden sind, welche dem Metallsalz entsprechen, das man zu erzeugen wünscht.

Vorzugsweise wird man den Mikroorganismus zuerst in einem Kartoffel-Dextrose-Agarmedium, z.B. einem Produkt der Firma Difco Company, vorzüchten und hierauf in einem anderen Kulturmedium impfen und darin züchten, bis das gewünschte Monacolin-K-salz erhalten worden ist.

Der Mikroorganismus wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen unter Anwendung von Züchtungsmethoden bekannter Art, beispielsweise mit einer festen Kultur, einer Schüttelkultur oder einer unter Belüftung und unter Schütteln gehaltenen Kultur, gezüchtet. Der Mikroorganismus wächst innerhalb eines breiten Temperaturbereiches von beispielsweise 7 bis 35 °C. Für die Herstellung von Monacolin-K oder einem Monacolin-K-salz liegt aber die bevorzugte Züchtungstemperatur im Bereiche von 20 bis 30 °C.

Während der Züchtung des Mikroorganismus kann das Ausmass der Erzeugung eines Monacolin-K-salzes durch Entnahme von Proben aus dem Kulturmedium und durch Messen der physiologischen Aktivität des im Kulturmedium vorhandenen Monacolin-K-salzes mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Teste festgehalten werden. Die Züchtung kann hierauf so lang weiter geführt werden, bis eine wesentliche Anreicherung von Monacolin-K-salz im Kulturmedium stattgefunden hat. In diesem Zeitpunkt kann man das Monacolin-K-salz durch beliebige Kombination von Isolationsmethoden, die je nach den physikalischen und chemischen Eigenschaften ausgewählt werden, aus dem Kulturmedium und den Geweben des Mikroorganismus gewinnen. So kann man sich einer oder mehrerer der nachfolgenden Isoliertechniken bedienen, nämlich der Extraktion der Flüssigkeit aus der Kulturbrühe mit einem hydrophilen Lösungsmittel, z. B. Diäthyläther, Äthylacetat oder Chloroform, Extraktion des Organismus mit einem hydrophylen Lösungsmittel, wie z.B. Aceton oder einem Alkohol, Konzentration, z. B. Verdampfen mindestens eines Teiles des Lösungsmittels unter vermindertem Druck, Auflösen in einem polareren Lösungsmittel, wie z. B. Aceton oder einem Alkohol, Entfernung der Verunreinigungen mit Hilfe eines weniger polaren Lösungsmittels, wie z.B. Petroläther oder Hexan, Gelfiltrie-rung durch eine Säule, welche mit einem Material, wie z. B. Sephadex (Warenzeichen eines bei der Firma Pharmacia Co., Ltd., USA, erhältlichen Materials) beschickt ist, ab-sorptive Chromatographie mit Aktivkohle oder Kieselgel, raschen Flüssigchromatographie, Überführung in das Monacolin-K oder die ihr zugrundeliegende Säure, direkten Reinigung in Form eines Metallsalzes und anderer ähnlicher Methoden. Durch Anwendung einer geeigneten Kombination dieser Arbeitsmethoden kann man die gewünschten Monacolin-K-salze als reine Substanzen aus der Kulturbrühe gewinnen.

Wie in den oben erwähnten Schweiz. Patentschriften beschrieben worden ist, lässt sich Monacolin-K als solches unter Verwendung der oben beschriebenen Mikroorganismen und oben erwähnten Arbeitsweisen herstellen.

Die physiologische Wirkung der Monacolin-K-salze und -ester kann nach den folgenden Testen quantitativ bestimmt werden. Diese Teste lassen sich auch modifizieren. Auf diese Weise kann man die Herstellung von Monacolin-K-salzen im Verlaufe des erfindungsgemässen Fermentierungsprozes-ses ermitteln.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 749

1. Hemmung der Cholesterinbiosynthese Ähnlich dem Monacolin-K hemmen die Monacolin-K-salze und -ester die Aktivität der 3-Hydroxy-3-methylglut-aryl-CoA-Reduktase, welche das ablaufbestimmende Enzym in der Biosynthese von Cholesterin darstellt, in spezifischer Weise. Die folgende Tabelle 1 zeigt die Konzentration (in ng/ml) der erfindungsgemässen Verbindungen, welche die Aktivität der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-(HMG)-CoA-Reduktase um 50% herabsetzt [gemessen nach der in Analy-tical Biochemistry, 31, 383 (1969) beschriebenen Methode], und die Konzentrationen (in ng/ml) der erfindungsgemässen Verbindungen, welche die Cholesterinbiosynthese um 50% hemmt [gemessen nach der im Journal of Biological Chemi-stry, 247,4914 (1972) beschriebenen Methode]. Es finden sich darin auch die entsprechenden Resultate für die bekannte Verbindung ML-236B, welche bekanntlich eine ähnliche Aktivitätsart aufweist und durch Züchten von Mikroorganismen der Gattung Pénicillium gemäss Angaben der britischen Patentschrift Nr. 1 453 425 erhalten wird. Ferner findet sich in der Tabelle auch die Konzentration von Monaco-lin-K als solches, welche die Cholesterinbiosynthese um 50% hemmt. Daraus ergibt sich, dass die Konzentration von ML-236B, welche erforderlich ist zum Hemmen der Cholesterinbiosynthese um 50%, bei 10,0 ng/ml liegt, während die entsprechende Konzentration der Monacolin-K-ester in einem Bereiche von 1 ng/ml (d.h. ungefähr lOmal besser) und die entsprechende Konzentration beim Natriumsalz von Monacolin-K bei ungefähr 0,14 ng/ml, d.h. ungefähr 70mal besser, liegt. Die Aktivitäten der Salze und Ester von Monacolin-K sind mit jenen von Monacolin-K selbst vergleichbar oder besser.

Tabelle 1

Verbindung zur 50%igen Hemmung erforderliche

Konzentration (ng/ml) HMG-CoA-Reduk- Cholesterin-

tase biosynthese

Methylester 70,0 1,2

Äthylester 12,0 1,3

Butylester 15,0 2,0

Benzylester 11,0 1,1

Natriumsalz 2,0 0,14

Calciumsalz 12,0 1,8

Monacolin-K - 2,0

ML-236B 10,0 10,0

2. Reduktion im Blutcholesterinspiegel

Die bei diesem Test verwendeten Tiere waren Ratten vom Wistar Imamichi-Stamm mit jeweils einem Körpergewicht von ungefähr 300 g. Die Teste wurden jeweils an Gruppen von fünf Tieren durchgeführt. Jedem Tier wurden intravenös 400 mg/kg Triton WR-1339 (Warenzeichen für ein zur Steigerung des Blutcholesterinspiegels bekannten Material) injiziert, wobei man gleichzeitig eine in der folgenden Tabelle 2 aufgezählten Verbindungen in der ebenfalls in der Tabelle erwähnten Menge oral vèrabreichte. 20 Stunden nach oraler Verabreichung wurden die Ratten durch Ausblutenlassen getötet und das Blut und die Leber eines jeden Tieres wurden gesammelt und deren Cholesteringehalt in bekannter Weise bestimmt. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 2, aus welcher die Reduktion des Blutcho-lesteringehalts und Lebercholesteringehalts verglichen mit einer Kontrollgruppe von Ratten, denen nur Triton WR-1339 verabreicht worden war, hervorgeht.

Zu Vergleichszwecken finden sich auch die Resultate mit Monacolin-K als solches und mit ML-236B, wobei diese

Verbindungen in wesentlich grösseren Mengen als die erfindungsgemässen Verbindungen verabreicht wurden, um eine vergleichbare Cholesteringehaltreduktion zu bewirken.

5

Tabelle 2

Verbindung

Dosis

Reduktion des

Cholesterin

mg/kg gehalts (%)

10

im Blut in der Leber

Methylester

5

23,8

18,4

Äthylester

5

23,3

18,0

Butylester

5

19,5

15,7

15 Benzylester

5

24,4

18,5

Natriumsalz

2

27,5

18,9

Calciumsalz

5

21,4

17,1

Monacolin-K

10

22,4

16,7

ML-236B

40

24,6

20,9

20

Die Reduktion des Blut- bzw. Lebercholesterinspiegels ergibt sich durch die Formel:

!=(C=B) x 100 A—B

worin A = Gehalt in der nur mit Triton WR-1339 behandelten Gruppe,

30 B = Gehalt der unbehandelten Kontrollgruppe und

C = Gehalt bei der Testgruppe bedeuten.

3. Akute Toxizität Als Testverbindungen wurden die Methyl-, Äthyl-, Bu-35 tyl- und Benzylester und die Natrium- und Calciumsalze von Monacolin-K verwendet. Dabei wurde gefunden, dass die 50%ige lethale Dosis (LDS0) bei jeder dieser Verbindungen bei oraler Verabreichung mindestens 2000 mg/kg und bei interperitonealer Verabreichung bei mindestens 500 mg/kg lag. 40 Die erfindungsgemässen Verbindungen besitzen daher eine äusserst niedrige Toxizität.

Diese Resultate veranschaulichen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen die Biosynthese von Cholesterin hemmen und demzufolge den Cholesterinspiegel im Blut senken. 45 Es handelt sich daher um wertvolle Arzneimittel für die Behandlung von Hyperlipämie und Arteriosklerose.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können oral oder parenteral in Form von Kapseln, Tabletten, injizierbaren Präparaten oder in einer beliebigen anderen Formulierungsso form verabreicht werden. Normalerweise werden sie oral verabreicht. Die Dosierung schwankt je nach dem Alter und dem Körpergewicht des Patienten und je nach dem Grad der Erkrankung. Im allgemeinen liegen die täglichen Dosierungsmengen bei Erwachsenen bei 0,1 bis 100 mg und vor-55 zugsweise bei 0,1 bis 10 mg für Monacolin-K-salze und bei 0,5 bis 100 mg und vorzugsweise 0,5 bis 10 mg im Falle von M onacolin-K-estern.

Die Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

60

Beispiel 1 Natriumsalz von Monacolin-K 300 Liter eines Kulturmediums, dessen pH-Wert vor der Sterilisierung 5,5 betrug und welches 5%ige (Gew./Vol.) 65 Glukoselösung, 0,5%ige (Gew./Vol.) Maisquellflüssigkeit, 2%ige (Gew./Vol.) Peptonlösung (Kyokutoprodukt) der Fa. Kyokuto Seiyaku KK, Japan) und 0,5%ige (Gew./Vol.) Ammoniumchloridlösung enthielt, wurden in einen 600 Liter

7

647 749

fassenden Fermentierbehälter eingetragen und mit dem Mikroorganismus Monascus ruber SANK 18174 (Ferm. 4957) geimpft. Die Züchtung des Organismus erfolgte bei 26 °C während 116 Stunden unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 300 Liter pro Minute und unter Rühren mit 190 Umdrehungen pro Minute. Nach Ablauf dieser Zeitdauer wurde der pH-Wert der den Organismus enthaltenden Kulturbrühe durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf 3,4 eingestellt und die Brühe hierauf mit 800 Liter Methanol extrahiert.

6 kg Hyflo Super Cel werden dann hinzugegeben und der Extrakt unter Verwendung einer Filterpresse filtriert, wobei man 1100 Liter des methanolischen Extraktes erhielt. Dieser Extrakt wurde mit 200 Liter einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung und hierauf mit 180 Liter Äthylcyclohe-xan gewaschen. Dann wurde die so erhaltene Lösung mit 600 Liter Äthylendichlorid extrahiert. Dieser Äthylendichlo-ridextrakt wurde anschliessend mit 50 g Trifluoressigsäure versetzt und die Umsetzung während 30 Minuten durch Erwärmen auf 80 "C durchgeführt. Dann wurde das Reaktionsgemisch nacheinander mit 200 Liter einer 2%igen (Gew./Vol.) wässrigen Natriumbicarbonatlösung und mit 200 Liter einer 10%igen (Gew./Vol.) wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Das so erhaltene Gemisch wurde dann durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 135 g einer öligen Substanz erhielt.

Diese ölige Substanz wurde in 400 ml Methanol gelöst. Dann wurden 20 ml der so erhaltenen methanolischen Lösung, welche 6,8 g des Öls enthielt, der präparativen Flüssigchromatographie unter Verwendung eines Waters Co. Limited Systems 500, ausgerüstet mit einer Prepac C18-Säule (umgekehrte Phasensäule) unterworfen. Als Laufmittel wurde eine Mischung von 85 Vol.-Teilen Methanol und 15 Vol.-Teilen Wasser verwendet. Die Entwicklung erfolgte mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 200 ml/Minute (Entwicklungsdauer ca. 10 Minuten), unter Zuhilfenahme eines Differentialrefraktometers, welcher mit der Chromatographievorrichtung verbunden war. Die den Hauptpeak am Differentialrefraktometer zeigende Fraktion wurde abgetrennt. Dieser Vorgang wurde wiederholt und die anfallenden Hauptpeak-fraktionen wurden gesammelt und eingeengt, wobei man zu 10,2 g einer öligen Substanz gelangte. Diese ölige Substanz wurde in 30 ml Methanol gelöst und 6 ml dieser methanolischen Lösung, welche ungefähr 2 g des Öls enthielt, wurden erneut der gleichen raschen Flüssigchromatographie unterworfen und mit einer Mischung von 80 Vol.-Teilen Methanol und 20 Vol.-Teilen Wasser bei einer Fliessgeschwindigkeit von 200 ml/Minute entwickelt. Die den Hauptpeak aufweisende Fraktion wurde abgetrennt. Dieser Vorgang wurde wiederholt und die Hauptpeakfraktionen wurden gesammelt und eingeengt. Der Rückstand wurde mit wässrigem Methanol behandelt, wobei man 1170 mg rohe Kristalle erhielt, die man mehrere Male aus Äthanol umkristallisierte. Auf diese Weise erhielt man 864 mg Kristalle.

Diese Kristalle wurden anschliessend mit 19,4 ml einer wässrigen O,ln-Natriumhydroxydlösung versetzt und das Gemisch während 3 Stunden bei 50 bis 60 °C gerührt. Die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert, worauf man das Filtrat lyophilisierte. Auf diese Weise erhielt man 900 mg des Natriumsalzes von Monacolin-K, welches die folgenden Eigenschaften aufwies:

1. Farbe und Form: weisses Pulver

2. Elementaranalyse:

Ber.: C = 64,84%; H = 8,38%; Na = 5,17% Gef.: C = 64,78%; H = 8,55%; Na = 5,21%

3. Molekulargewicht: 444 [durch Massenspektrometrie ermittelt (F.D. Mass.)]

4. Molekularformel: C24H37OeNa

5. Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung, >„max:

232 nm (log e = 4,30);

239 nm (log e = 4,36);

248 nm (log e = 4,19).

6. Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Kügelchen): gemäss Fig. 2 der beiliegenden Zeichnung.

7. Magnetisches Kernresonanzspektrum (D20): gemäss Fig. 3 der beiliegenden Zeichnung.

8. Rasche Flüssigchromatographie:

Dauer 8,5 Minuten;

Microbondapac C18-Säule unter Verwendung einer 60 vol.-%igen wässrigen Lösung von Methanol plus 0,1 % PIC-A (ein Produkt der Firma Waters Co. Limited); Fliessgeschwindigkeit 1,5 ml/Minute gemäss Fig. 4 der beiliegenden Zeichnung.

9. Löslichkeit: In Wasser löslich und in organischen Lösungsmitteln unlöslich;

10. Spezifische Drehung:

[a]D25 = +266rj (c = 0,33, Wasser).

Beispiel 2 Natriumsalz von Monacolin-K

300 Liter eines vor der Sterilisierung einen pH-Wert von 7,4 aufweisenden Kulturmediums, welches eine l,5%ige (Gew./Vol.) lösliche Stärkelösung, l,5%ige (Gew./Vol.) Gly-cerinlösung, 2,0%ige (Gew./Vol.) Fischmehllösung und 0,2%ige (Gew./Vol.) Calciumcarbonatlösung enthielt, wurden in einem 600 Liter fassenden Fermentierbehälter eingetragen und mit dem Mikroorganismus Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832.70) geimpft. Die Züchtung des Organismus erfolgte während 120 Stunden bei 26 °C bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 300 Liter pro Minute und unter Rühren mit 190 Umdrehungen pro Minute. Die Kulturbrühe wurde hierauf unter Verwendung einer Filterpresse filtriert, wobei man 35 kg (Gewicht in feuchtem Zustande) des Organismus erhielt.

Diese Masse wurde dann mit 100 Liter Wasser versetzt und der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe einer Natriumhydroxydlösung unter Rühren auf 12 eingestellt. Hierauf wurde das Gemisch während 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen gelassen, worauf man dem Gemisch 2 kg Hyflo Super Cel hinzugab. Dann wurde das Ganze unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Der pH-Wert des Filtrâtes wurde durch Zugabe von Salzsäure auf 10 eingestellt und das entstandene Gemisch hierauf in einer 5 Liter HP-20 Harz enthaltenden Säule adsorbiert und mit jeweils 15 Liter Wasser und einer 10 vol.-%igen wässrigen Methanollösung gewaschen. Hierauf wurde die Säule mit 90 vol.-%igem wässrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde auf ein Volumen von ungefähr 10 Liter eingeengt und hierauf dessen pH-Wert durch Zugabe von Salzsäure auf 2 eingestellt. Das so entstandene Gemisch wurde dann mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und hierauf durch Eindampfen zur Trockne eingeengt, wobei man 50 g einer öligen Substanz, welche Monacolin-K-säure enthielt, erhielt. Diese ölige Substanz wurde dann mit genügend Methanol versetzt, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erreichen. 20 ml der so erhaltenen Lösung wurden der präparativen raschen Flüssigchromatographie unter Verwendung einer umgekehrten Phasensäule (gemäss Angaben in Beispiel 1) unterworfen und mit einer 20 vol.-%igen wässrigen Methanollösung, welche 2% Essigsäure enthielt, bei einer Fliessgeschwindigkeit von 200 ml/Minute eluiert. Die den Hauptpeak auf einem Differentialrefraktometer zeigende Fraktion wurde abgetrennt (7 bis 10 Minu5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 749

8

ten). Die verbleibenden 80 ml der methanolischen Lösung wurden hierauf in der gleichen Weise behandelt. Die anfallenden Hauptpeakfraktionen wurden gesammelt, eingeengt und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde nach der Zugabe von Heptan zur Trockne eingeengt, wobei man 1,2 g einer öligen Substanz erhielt.

Diese ölige Substanz wurde in 20 ml Methanol gelöst und diese Lösung hierauf nach den obigen Angaben der raschen Flüssigchromatographie unterworfen, wobei man 150 mg Monacolin-K-säure erhielt. Dieses Material wurde dann mit 2 ml Methanol und 100 ml Wasser versetzt und die entstandene Lösung durch Zugabe einer wässrigen ln-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, wobei man eine klare, wässrige Lösung erhielt. Diese Lösung wurde über eine Säule, welche 10 ml HP-20 Harz enthielt, geführt und die Säule hierauf mit 100 ml Wasser gewaschen und mit einer 80 vol.-%igen wässrigen Methanollösung eluiert. Das Eluat wurde lyophilisiert, wobei man 130 mg des Natriumsalzes von Monacolin-K in Form eines weissen Pulvers erhielt. Die Eigenschaften des so erhaltenen Produktes waren die gleichen wie jene gemäss Beispiel 1.

Beispiel 3 Calciumsalz von Monacolin-K

Die Züchtung, die Extraktion, die Konzentration, die rasche präparative Flüssigchromatographie und das Umkristallisieren aus Äthanol, wie dies in Beispiel 1 beschrieben worden ist, wurden wiederholt. 500 mg der so erhaltenen Kristalle wurden hierauf in 50 ml Methylenchlorid gelöst und die entstandene Lösung durch einen Milliporenfilter filtriert. Dann wurden dem Filtrat 20 ml einer wässrigen Cal-ciumhydroxydlösung hinzugegeben und das Gemisch hieraufkräftig bei Zimmertemperatur gerührt. Sobald der pH-Wert der Lösung auf einen Wert von weniger als 8 gesunken war, wurden weitere 10 ml Portionen einer gesättigten wässrigen Calciumhydroxydlösung hinzugegeben und das ganze Material ständig gerührt. Sobald der pH-Wert nicht mehr abnahm, d. h. nachdem insgesamt 50 ml der wässrigen Calciumhydroxydlösung hinzugegeben worden war, wurde mit destilliertem Wasser versetzt und die gesamte Lösung in einen Trenntrichter eingebracht. Die organische Phase wurde gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde hierauf mit Heptan aufgearbeitet und durch anschliessende Behandlung des Gemisches mit Ultraschallwellen ein Pulver erhalten. Das so erhaltene Pulver wurde filtriert und getrocknet, wobei man 450 mg des Calciumsalzes von Monacolin-K in Form eines weissen Pulvers erhielt.

Dieses Calciumsalz besass die folgenden Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: 882 (mittels Massenspektrometrie gemessen)

2. Molekularformel: (C24H3706)2-Ca

3. Schmelzpunkt: 155 bis 165 °C (unter Zers.)

4. Spezifische Drehung: [a]D25 = +209° (c = 1,48, Chloroform)

5. Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäss Fig. 5 der beiliegenden Zeichnung

6. Magnetisches Kernresonanzspektrum (CD3OD): gemäss Fig. 6 der beiliegenden Zeichnung.

Beispiel 4 Methylester von Monacolin-K

Die Züchtung, Extraktion, Konzentration, präparative Flüssigchromatographie und Umkristallisierung aus Äthanol erfolgten gemäss Angaben in Beispiel 1. Auf diese Weise erhielt man 864 mg Monacolin-K. 200 mg dieses Monaco-lins-K wurden in 20 ml Methanol gelöst, welches zuvor mit einem Molekularsieb 3A dehydratisiert worden war. Nach der Zugabe von einigen Tropfen Acetylchlorid wurde die

Lösung während 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde nacheinander mit einer 2%igen (Gew./Vol.) wässrigen Na-5 triumbicarbonatlösung und einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Hierauf wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde auf einer Säule, welche 10 g zuvor mit Benzol behandeltes Kieselgel (Wako-lo gel C-100) enthielt, adsorbiert. Die mit einer Mischung von 6 Vol.-Teilen Äthylacetat und 94 Vol.-Teilen Benzol eluierten Fraktionen wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Auf diese Weise erhielt man 65 mg des Methylesters von Monacolin-K in Form eines farblosen Öls.

i5 Dieses Produkt besass die folgenden Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: 436,6 (durch Massenspektrometrie ermittelt);

2. Molekularformel: C25H40O6;

3. Spezifische Drehung: [a]D25 = +208° (c = 1,05, Me-20 thanol)

4. Infrarotabsorptionsspektrum: gemäss Fig. 7 der beiliegenden Zeichnung;

5. Magnetisches Kernresonanzspektrum: gemäss Fig. 8 der beiliegenden Zeichnung.

25

Beispiel 5 Methylester von Monacolin-K

Das Natriumsalz von Monacolin-K wurde gemäss den in Beispiel 2 gemachten Angaben hergestellt. 100 mg dieses Na-30 triumsalzes wurden hierauf in 2 ml Dimethylsulfoxyd gelöst und anschliessend die Lösung mit 50 p.1 Methyljodid versetzt. Dann wurde diese Lösung unter Rückfluss und unter Rühren während 5 Stunden bei 40 bis 50 °C in einem mit einem Rückflusskondenser versehenen Reaktor erhitzt. An-35 schliessend wurde das Reaktionsgemisch mit 5 ml Wasser verdünnt und hierauf mit 10 ml Methylenchlorid extrahiert. Das Lösungsmittel wurde aus dem Extrakt abdestilliert und der Rückstand in einer Säule, die 10 g zuvor mit Benzol behandeltes Kieselgel (Wakogel C-100) enthielt, adsorbiert. 40 Die mit einer Mischung von 4 Vol.-Teilen Äthylacetat und 96 Vol.-Teilen Benzol eluierten Fraktionen wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert, wobei man 35 mg des gewünschten Methylesters von Monacolin-K in Form eines Ols erhielt.

45

Beispiel 6 Äthylester von Monacolin-K

100 mg des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Monacolin-K wurden in 15 ml Äthanol, welches zuvor mittels eines Moleso kularsiebes 3A dehydratisiert worden war, gelöst und diese Lösung dann mit einigen Tropfen Acetylchlorid versetzt. Darauf wurde das Gemisch während 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, worauf man das Lösungsmittel abdestillierte und den Rückstand mit 50 ml Äthylacetat extrahierte, ss Der Extrakt wurde nacheinander mit einer 2%igen (Gew./ Vol.) wässrigen Natriumbicarbonatlösung und einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels wurde der Rückstand über 60 einer Säule, welche 10 g zuvor mit Benzol behandeltes Kieselgel (Wakogel C-100) enthielt, adsorbiert. Die mit einer Mischung von 6 Vol.-Teilen Äthylacetat und 94 Vol.-Teilen Benzol eluierten Fraktionen wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Auf diese Weise erhielt man 30 mg 65 des Äthylesters von Monacolin-K in Form eines farblosen Öls.

Die Eigenschaften dieser Verbindung waren die folgenden:

1. Molekulargewicht: 450,6 (durch Massenspektrometrie ermittelt);

2. Molekularformel: C26H4206;

3. Infrarotabsorptionsspektrum (CHC13): gemäss Fig. 9 der beiliegenden Zeichnung

4. Magnetisches Kernresonanzspektrum (CDC13): gemäss Fig. 10 der beiliegenden Zeichnung.

Beispiel 7 Butylester von Monacolin-K

200 mg Monacolin-K, wie es gemäss Beispiel 1 erhalten worden war, wurden in 20 ml Butanol, welches zuvor mit einem Molekularsieb 3A dehydratisiert worden war, gelöst. Nach der Zugabe von einigen Tropfen Acetylchlorid zu der so erhaltenen Lösung wurde das Gemisch während 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde nacheinander mit einer 2%igen (Gew./Vol.) wässrigen Natriumbicarbonatlösung und einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Dann wurde das Lösungsmittel über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in einer 10 g zuvor mit Benzol behandeltem Kieselgel (Wakogel C-100) enthaltenden Säule adsorbiert. Die mit einer Mischung von 4 Vol.-Teilen Äthylacetat und 96 Vol.-Teilen Benzol eluierten Fraktionen wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Auf diese Weise erhielt man 80 mg des Butylesters von Monacolin-K in Form eines farblosen Öls.

Diese Verbindung besass die folgenden Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: 478,7 (durch Massenspektrometrie erfasst);

2. Molekularformel: C28H4606;

3. Infrarotabsorptionsspektrum (CHC13): gemäss Fig. 11 der beiliegenden Zeichnung;

9 647 749

4. Magnetisches Kernresonanzspektrum (CDC13): gemäss Fig. 12 der beiliegenden Zeichnung.

s Beispiel 8

Benzylester von Monacolin-K

200 mg Monacolin-K, wie es gemäss Beispiel 1 erhalten worden war, wurden in 20 ml Benzylalkohol, welcher zuvor mittels eines Molekularsiebs 3A dehydratisiert worden war, io gelöst. Nach der Zugabe von einigen Tropfen Acetylchlorid zu der so erhaltenen Lösung wurde das Gemisch während 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit 50 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde nacheinander mit i5 einer 2%igen (Gew./Vol.) wässrigen Natriumbicarbonatlösung und einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wurde anschliessend über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in einer Säule, welche 10 g 20 zuvor mit Benzol behandeltes Kieselgel (Wakogel C-100) enthielt, adsorbiert. Die mit einer Mischung von Äthylacetat und Benzol in einem Volumenmischverhältnis von 4: 96 eluierten Fraktionen wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Auf diese Weise erhielt man 70 mg des 25 Benzylesters von Monacolin-K in Form eines farblosen Öls.

Diese Verbindung besass die folgenden Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: 512,6 (durch Massenspektrometrie ermittelt);

30 2. Molekularformel: C31H4406;

3. Infrarotabsorptionsspektrum (CHC13): gemäss Fig. 13 der beiliegenden Zeichnung;

4. Magnetisches Kernresonanzspektrum (CDC13): gemäss Fig. 14 der beiliegenden Zeichnung.

45

50

55

60

s

4 Blatt Zeichnungen

Claims

647749

PATENTANSPRÜCHE 1. Antihypercholesterämisch wirkende Salze und Ester der allgemeinen Formel:

COO(R), OH n worin R ein Metallatom oder eine substituierte oder unsub-stituierte Alkylgruppe und n der reziproke Wert der Wertigkeit des durch R wiedergegebenen Atoms bzw. der durch R wiedergegebenen Gruppe bedeuten.
2. Salze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R ein Metallatom darstellt.
3. Salze nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Metallatom Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Aluminium, Eisen, Zink, Kupfer, Nickel oder Kobalt ist.
4. Salze nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Metall Natrium, Calcium oder Aluminium ist.
5. Monacolin-K-ester nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe und n die Zahl 1 bedeuten.
6. Ester nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine Acylalkyl-gruppe bedeutet.
7. Ester nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine Arylcar-bonylalkylgruppe bedeutet.
8. Ester nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Benzylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Phenacylgruppe bedeutet.
9. Ester nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Alkylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Benzylgruppe mit einem oder mehreren Alkyl-, Alkoxy- oder Halogensub-stituenten, eine Phenacylgruppe oder eine Phenacylgruppe mit einem oder mehreren Alkyl-, Alkoxy- oder Halogensub-stituenten bedeutet.
10. Ester nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Methyl-, Äthyl-, Butyl- oder Benzylgruppe ist.
11. Verfahren zur Herstellung der Salze der im Anspruch 1 wiedergegebenen Formel, dadurch gekennzeichnet, dass man Monacolin-K oder ein reaktionsfähiges Derivat desselben entsprechend der Bedeutung von R in ein Salz überführt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als reaktionsfähiges Derivat die entsprechende Monacolin-K-säure verwendet.
13. Verfahren zur Herstellung der Ester der im Anspruch 1 wiedergegebenen Formel, dadurch gekennzeichnet, dass man Monacolin-K oder ein reaktionsfähiges Derivat desselben entsprechend der Bedeutung von R verestert.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als reaktionsfähiges Derivat die entsprechende

Monacolin-K-säure oder ein Salz von Monacolin-K verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Halogenid der Formel RX, worin R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe und X ein Halogenatom bedeuten, mit einem Salz von Monacolin-K umsetzt.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Alkohol der Formel ROH, worin R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe bedeutet, mit Monacolin-K oder der entsprechenden Säure in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels umsetzt.
17. Verfahren zur Herstellung der Salze der im Anspruch 1 wiedergegebenen Formel, dadurch gekennzeichnet, dass man einen ein Salz von Monacolin-K erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Monascus in einem Kulturmedium züchtet und aus dem Kulturmedium das Salz von Monacolin-K isoliert.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen solchen der Gattung Monascus einsetzt, nämlich Monascus anka SANK 101711 (IFO 6540); Monascus purpurous SANK 10271 (IFO 4513); Monascus ruber SANK 10671 (Ferm 4958); Monascus vitreus SANK 10960 (NIHS 609, e-609; Ferm 4960); Monascus paxii SANK 11172 (IFO 8201); Monascus ruber SANK 11272 (IFO 9203); Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959); Monascus ruber SANK 15177 (Ferm 4956); Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832.70); Monascus ruber SANK 17175 (CBS 503.70); Monascus ruber SANK 17275 (ATCC 18199) oder Monascus ruber SANK 18174 (Ferm 4957).
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Monascus ruber SANK 10671 (Ferm 4958); Monascus ruber SANK 11272 (IFO 9203); Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959); Monascus ruber SANK 15177 (Ferm 4956); oder Monascus ruber SANK 18174 (Ferm 4957) ist.
20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Aluminium, Eisen, Zink, Kupfer, Nickel oder Kobalt ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall Natrium, Calcium oder Aluminium ist.
22. Pharmazeutische Präparate, welche als Wirkstoff ein Salz oder einen Ester der im Anspruch 1 wiedergegebenen Formel enthalten.