NL8004303A - Monacoline k verbindingen. - Google Patents

Description

** *

803271/vdV

Korte aanduiding: Monacoline K-verbindingen.

5 De uitvinding heeft betrekking op zouten en esters van het vrije zuur van Monacoline K-lacton, alsmede op de werkwijze voor hun bereiding en op fran gebruik als anti-hypercholestere*mische middelen.

De Britse octrooiaanvrage 80057^8 beschrijft de verbinding Monacoline-K en zijn bereiding door micro-organismen van het geslacht 10 Monascus, in het bijzonder de Monascus rub^er-stam in 1005 (FERM 4822).

In de onderhavige aanvrage wordt de waardevolle en onverwachte werking van de Monacoline K-verbinding als anti-hypercholesteremiemiddel beschreven.

In de Britse octrooiaanvrage 8007240 wordt de bereiding beschreven van Monacoline K door kweken van een variëteit van andere 15 micro-organismen van het geslacht Monascus. Men heeft nu gevonden dat de zouten en esters van het vrije zuur, waarvan Monacoline K het lacton is, een vergelijkbare of sterkere, gelijksoortige anti-hypercholesteremische werking bezitten als Monacoline K. Deze verbindingen zullen hierna aangeduid worden als Monacoline K-zouten of -esters, waarbij het vanzelf spreekt 20 dat hiermee de zouten en esters van het zuur bedoeld worden, waarvan Monacoline K de lacton is.

De Monacoline K-zouten en -esters volgens de onderhavige uitvinding bezitten de formule 1 van het formuleblad, waarin S een al niet gesubstitueerde alkylgroep of een metaalatoom en n het omgekeerde van 25 de waardigheid van de door R weergegeven groep of atoom voorstelt.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een werkwijze voor de bereiding van Monacoline K-zouten en -esters door omzetting van Monacoline K of een reactief derivaat daarvan in een zout of ester.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze 30 voor de bereiding van de zouten van Monacoline K door kweken van een micro-organisme van het geslacht Monascus dat een Monacoline K-zout levert en afscheiden van het Monacoline K-zout uit het kweekmedium.

De Monacoline-K-zouten volgens de onderhavige uitvinding zijn metaalzouten en bij voorkeur: alkalimetaalzouten, zoals natrium-, 35 kaliurazouten, aardalkalimetaalzouten, zoals calcium- of magnesiumzouten; zouten van metalen uit groep lila van het Periodiek Systeem der Elementen, zoals het aluminiumzout, of zouten van de overgangsmetalen uit de groepen Ib, Ilb, en VIII van het Periodiek Systeem der Elementen, zoals ijzer-, nikkel-, kobalt-, koper- en zinkzouten. Van deze metaalzouten wordt de 40 voorkeur gegeven aan alkalimetaalzouten, aardalkalimetaalzouten en het -2- aluminiumzout, in het bijzonder natrium-, kalium- en aluminiumzouten·

Men kan de Monacoline K-zouten gemakkelijk door aanzuren in Monacoline K of het basiszuur van Monacoline K omzetten· Het verkregen Monacoline K of zuur worden in aanwezigheid van een alkali, 5 bijvoorbeeld alkalimetaalhydroxyde of -carbonaat, in het zout omgezet·

Deze omzetting kan kwantitatief en herhaalde malen worden uitgevoerd· Men heeft vastgesteld dat de omzetting van Monacoline K of het zuur in het metaalzout in sterke mate van de pH van het medium afhankelijk is· De kritische pH-waarde bedraagt ongeveer 5* Als metaal-10 ionen aanwezig zijn bezit Monacoline K bij een pH boven 5 steeds de vorm van een zout· Als daarentegen de pH beneden 5 ligt verkrijgt men Monacoline K zelf, of het basiszuur waarvan Monacoline K is afgeleid of een mengsel van deze twee in verschillende verhoudingen.

De Monacoline K-esters volgens de uitvinding bezitten 15 de formule 1 van het formuleblad, waarin R een al dan niet gesubstitueerde alkylgroep voorstelt. Als R een aiet-gesubstitueerde alkylgroep voorstelt bezit deze groep een rechte of vertakte keten met bij voorkeur 1-8 kool-stofatomen. Voorbeelden van dergelijke door R voorgestelde alkylgroepen zijn de methyl-, ethyl-, propyl-, isopropyl-, butyl- en hexylgroepen.

20 Als R een gesubstitueerde alkylgroep voorstelt kan de substituent zoals bekend uit een groot aantal groepen en atomen gekozen worden, onder andere arylgroepen, acylgroepen (in het bijzonder arylcarbo nylgroepen), alkoxygroepen, halogeenatomen, en hydroxylgroepen. Substitu-enten waaraan in het bijzonder de voorkeur wordt gegeven zijn de aryl-25 groepen en arylcarbonylgroepen, dat wil zeggen dat R een aralkylgroep of een arylcarbonylalkylgroep voorstelt·

Als R een aralkylgroep voorstelt geeft men de voorkeur aan een al dan niet gesubstitueerde benzylgroep· Gesubstitueerde benzyl-groepen bezitten bij voorkeur een of meer substituenten bestaande uit een 30 alkylgroep, alkoxygroep of halogeenatoom. Voorbeelden van dergelijke ben-zylgroepen zijn benzyl, 2-methylbenzyl, 3-methylbenzyl, Jf-methylbenzyl, 2- ethylbenzyl, 3-ethylbenzyl,- 2-methoxy benzyl, 3-methoxybenzyl, ^-methoxy-benzyl, 2-ethoxybenzyl, 3-ethoxybenzyl, V-ethoxybenzyl, 2-chloorbenzyl, 3- chloorbenzyl, ^-chloorbenzyl, 2-broombenzyl, 3-broombenzyl of ^-broom-35 benzyl·/ 4-ethylbenzylgroepen.

Als R een arylcarbonylalkylgroep voorstelt is dit bij voorkeur een al dan niet gesubstitueerde fenacylgroep. De gesubstitueerde fenacylgroepen bevatten bij voorkeur één of meer substituenten bestaande uit een alkylgroep, alkoxygroep of halogeenatoom· Voorbeelden van derge- 8004303 * Λ -3- lijke fenacylgroepen zijn fenacyl, 2-methylfenacyl, 3-fflethylfenacyl, b-methylfenacyl, 2-ethylfenacyl, 3-ethylfenacyl, b-ethylfenacyl, 2-methoxy-fenacyl, 3-methoxyfenacyl, 4-methoxyfenacyl, 2-ethoxyfenacyl, 3-ethoxy-fenacyl, ^-ethoxyfenacyl, 2-chloorfenacyl, 3-chloorfenacyl, ^-chloorfena-5 cyl, 2-broomfenacyl, 3-broomfenacyl of 4-broomfenacyl.

Van de esters gaat de voorkeur uit naar methyl-, ethyl-butyl- en benzylesters.

Men kan de Monacoline K-zouten en -esters volgens de uitvinding gemakkelijk bereiden door omzetten in een zout of veresteren 10 van Monacoline K zelf of van een reactief Monacoline K-derivaat. Voorbeelden van geschikte reaktieve derivaten zijn het basiszuur waarvan Monacoline K is geleid en voor de bereiding van esters: Monacoline K-zouten (bijvoorbeeld de bovengenoemde groepen van zouten, in het bijzonder de ‘ natrium-, kalium-, calcium-, magnesium-, aluminium-, ijzer-, zink-, koper-15 of kobaltzouten).

Men kan de Monacoline K-zouten bereiden door rechtstreekse reaktie van Monacoline K of het basiszuur met een oxyde, hydroxyde, carbonaat of bicarbonaat, bij voorkeur het hydroxyde of carbonaat van het gekozen metaal. Hierbij moet ervoor worden gezorgd dat de reaktie bij een 20 pH boven 5» en bij voorkeur boven 7 wordt uitgevoerd om Monacoline K of het zuur volledig in het gewenste zout om te kunnen zetten. Het bij deze reaktie gebruikte Monacoline K wordt bij voorkeur bereid zoals beschreven in de hierboven genooemde octrooiaanvrage(n) door kweken van een schimmel van het geslacht Monascus en isoleren van Monacoline K uit het kweekmedium.

25 Men kan Monacoline K uit het kweekmedium isoleren en vóór omzetting in het zout zuiveren, waarbij men bij voorkeur het zout tijdens het isoleren en zuiveren van Monacoline K in het kweekmedium vormt, zodat Monacoline K in de vorm van het gewenste metaalzout geïsoleerd wordt. Onafhankelijk van de toegepaste methode kan het metaalzout volgens een bekende werkwijze 30 uit het reaktiemedium of het kweekmedium geïsoleerd worden met inbegrip' van de hierna beschreven werkwijzen die op de isolatie van Monacoline K-metaalzouten uit de kweek van de Monacoline K-zout leverende schimmels betrekking hebben.

Men kan de Monacoline K-esters bereiden door rechtstreek-33 se verestering van Monacoline K of van de reactieve derivaten daarvan, door reaktie van een alcohol met de formule ROH (of een reaktief derivaat daarvan), waarin R een al dan niet gesubstitueerde alkylgroep voorstelt, met Monacoline K of het basiszuur, bij voorkeur in aanwezigheid van een dehydraterend middel, bijvoorbeeld een zuurhalogenide, zoals acetylchloride.

ft η n i 3 o 3 -4-

Men kan Monacoline K-esters ook bereiden door reaktie van een Honacoline K-zout met een halogenide met formule EX (waarin E een al of niet gesubstitueerde alkylgroep en X een halogeenatoom, bij voorkeur een joodatoom voorstelt).

5 Men kan Monacoline K ook rechtstreeks bereiden door kweken van een Monacoline K-zout leverend micro-organisme van het geslacht Monascus. Micro-organismen die volgens de onderhavige werkwijze gebruikt kunnen worden zijn: Monascus anka SANK 10171 (IFO 6540), Monascus nurpurous SANK 10271 (IFO 4513); Monascus ruber SANK 10671 (Ferm 4958)? Monascus 10 vitreus SANK 10960 (NIHS 609, e-609; Ferm 4960); Monascus paxii SANK 11172 (IFO 8201); Monascus ruber SANK 11272 (ΠΡΟ 9203); Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959); Monascus ruber SANK 15177 (Ferm 4956); Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832.70); Monascus ruber SANK 17*175 (CBS 503.70); Monascus ruber SANK 17275 (ATCC 18199); en Monascus ruber SANK 18174 (Ferm 4957).

15 Deze micro-organismen zijn allen uit erkende collecties verkrijgbaar en zijn met de volgende codes aangegeven.

IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan.

Ferm = Fermentation Eesearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Inter-20 national Trade and Industry, Japan; NIHS = National Institute of Hygenic Sciences, Japan; CBS = Centraal Bureau voor Schimmelculturen, Nederland; ATCC = American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A.

De stammen van het geslacht Monascus waaraan volgens de 25 werkwijze der uitvinding ter bereiding van Monacoline K-zouten de voorkeur wordt gegeven zijn Monascus ruber SANK 10671, Monascus ruber SANK 11272, Monascus ruber SANK 13778, Monascus ruber SANK 15177 en Monascus ruber SANK 18174, Monascus ruber SANK 10671, Monascus ruber SANK 13778, Monascus ruber SANK 15177 en Monascus ruber SANK 18174, en zijn alien door Aanvraag-30 ster onlangs uit de bodem geïsoleerde schimmels met de volgende microbiologische eigenschappen:

Monascus ruber SANK 15177 (Ferm 4956)

Dit geslacht is geïsoleerd uit de bodem in Tukimino, :: Yamato-City, Kanagawa-prefectuur, Japan en op 27 april 1979 onder No. 4956 35 bij het eerdergenoemde Fermentation Research Institute gedeponeerd.

Het geslacht groeit bij 25°G goed op een aardappel-glucose-agar-medium en levert een oplosbaar gekleurd materiaal met in het medium een geel-bruine tot rood-bruine kleur en vormt cleistothecen op de basale hyphenlaag.

8004303 t ·* -5-

Op havermeel-agar-agar-medium ontstaat een lichtbruin gekleurd materiaal en treedt een goede groei op. De vorming van sferische cleistothecen met een diameter van 30-60 micron op korte stengels is goed.

De stengels zijn vrijwel kleurloos en vertakt met afmetingen van 25-60 x 5 3,5-5,0 micron. De asci verdwijnen en zijn dus moeilijk waar te nemen. De ascosporen zijn kleurloos en ellipsoidevorming en bezitten afmetingen van **,5-6,5 x **,0-5,0 micron met een glad oppervlak. De conidien zijn aan hun basis met elkaar verbonden en bezitten afmetingen van 7,0-10,0 x 6,0-10,0 micron. Hun weefsels zijn gescheurd.

10 Hoewel de stam bij 37°C groeit wordt de beste groei tussen 23°C 'en 30°C waargenomen.

Monascus ruber SANK 10671 (Ferm **958) ·

Deze stam is geïsoleerd uit de bodem in Shinagawa-ku,

Tokio, Japan en op 27 april 1979 onder no. **958 bij het eerdergenoemde 15 Fermentation Research Institute gedeponeerd.

De groei op aardappel-glucose-agar-agar- en havermeel-agar-agar-medium komt overeen met die van de stam SANK 15177, behalve dat de gevormde oplosbare kleurstof donkerrood is. De diameter van de cleistothecen bedraagt 30-80 micron en de afmetingen van de stengels zijn 30-70 20 x 3,0-5,0 micron. Asci werden niet waargenomen. De ascosporen zijn kleurloos en ellipsvormig met afmetingen van **,5-6,5 x **,0-5,0 micron. De conidien zijn kleurloos en pyrivormig of eivormig met afmetingen van 6,0-10,0 x 6,0-8,5 micron.

Monascus ruber SANK 13778 (FERM **959).

25 Deze stam is geisoleerd uit de bodem in Inawashiro-cho,

Nagata, Yama-gun, Fukushima-prefectuur, Japan en op 27 april 1979 onder No. **959 bij het eerdergenoemde Fermentation Research Institute gedeponeerd.

De groei op aardappel-glucose-agar-agar- en havermeel-agar-agar-medium komt overeen met die van de stam SANK 15177, behalve dat 30 het gevormde oplosbare gekleurde materiaal licht roodbruin tot roodbruin is. De cleistothecen bezitten een diameter van 35-75 micron en de stengels afmetingen van 30-70 x 3,5-5,0 micron. Asci worden niet waargenomen. De ascosporen zijn kleurloos en ellipsvormig met afmetingen van **,5-6,0 x **,0-5,0 micron en een glad oppervlak. De afmetingen van de conidien be-35 dragen 7,0-10,0 x 6,0-10,0 micron.

Monascus ruber SANK 1817** (FERM **957).

Deze stam is geisoleerd uit de bodem in Shakotan-cho, Shakotan-gun, Shiribeshi Shicho, Kokkaido-prefectuur, Japan en op 27 april 1979 onder No. **957 bij het eerdergenoemde Fermentation Research Institute snru3 03 -6- gedeponeerd.

De groei op aardappel-glueose-agar-agar- en havermeel-agar-agarmedium koot overeen met die van de stam SANK 15177» behalve dat het gevormde gekleurde materiaal lichtrose is· De cleistothecen bezitten 5 een diameter van 20-70 micron en de afmetingen van de stengels bedragen 20-60 x 5,0-5,0 micron. Asci werden niet waargenomen. De ascosporen zijn kleurloos en ellipsvormig en bezitten afmetingen van 5»0-7»0 x 4,0-5,5 micron en een glad oppervlak. De conidien zijn aan hun basis onderling verbonden en kleurloos en de meeste van hen zijn pyrivormig en bezitten 10 afmetingen van 6,0-9,5 x 6,0-10,0 micron.

Op basis van bovengenoemde eigenschappen werden deze micro-organismen geïdentificeerd als behorende tot de stam Monascus ruber van Tieghem.

De microbiologische eigenschappen van Monascus ruber 15 zijn vermeld in de onderstaaande literatuur: Takada, Transactions of the Micrological Society of Japan, j?, 125-1350 (19&9) (material for the Fungus Flora of Japan (7) en van Tieghem, Bull, Soc. Botan, France, 31, 227 (188½). De ascosporenvorming van de stam is gerapporteerd door Cole et al in de Canadian Journal of Botany, 46, 987 (1968), "Conidium ontogeny in 20 hyphomycetes. The imperfect state of Monascus ruber and its meristem arthro6poΓes,,.

Behalve de bovengenoemde schimmelstammen kan men volgens de werkwijze der uitvinding ook de schimmels van het geslacht Monascus, de variëteiten en mutaties inbegrepen, die in staat zijn Monacoline K-25 zouten te leveren, gebruiken.

Monacoline K kan door kweken van het gekozen micro-orga-nisme in een kweekmedium onder aerobe omstandigheden en onder toepassing van de methoden die algemeen voor het kweken van schimmels en andere micro-organismen bekend zijn, worden verkregen. Men kan bijvoorbeeld de gekozen 30 Monascus-stam eerst op een geschikt medium kweken, de gevormde micro-organismen verzamelen en op een ander medium enten en kweken onder vorming van het gewenste Monacoline K-zout. Men kan voor de vermenigvuldiging van het micro-organsime en voor de vorming van Monacoline K-zout hetzelfde medium of andere media gebruiken.

33 Voor het kweken van schimmels kan elk bekend kweekmedium, dat de nodige bekende voedingsbestanddelen, in het bijzonder een assimileerbare koolstof-stikstofbron bevat, worden gebruikt. Voorbeelden van geschikte assimileerbare koolstofbronnen zijn, glucose, maltose, dextrine, zetmeel, lactose, sucrose en glycerine, waarbij aan glucose, glycerine en 8004303 + * zetmeel de / voorkeur wordt gegeven. Voorbeelden van geschikte assimileerbare stikstof-bronnen zijn pepton, vleesextract, gist, gistextract, sojabonenmeel, aard-notenmeel, mais-weekvloeistof, rijstzeoelen en anorganische stikstofbronnen, waarbij in het bijzonder aan pepton de voorkeur wordt gegeven, Bij de 5 bereiding van Monacoline K-zout kan zonodig een anorganisch zout en/of metaalzout aan het kweekmedium worden toegevoegd· Voorts kan, indien nodig ook een gering? hoeveelheid van een zwaar metaal worden toegevoegd. Bij de bereiding van Monacoline K-zouten door fermentatie met een schimmel van het geslacht Monascus is het van belang dat in het kweekmedium of binnen-10 in de schimmel metaalionen aanwezig zijn die overeenkomen met de metaal-zouten die men wenst te bereiden.

In het bijzonder verdient het de voorkeur de micro-orga-nismen eerst op een aardappel-dextrose-agarmedium (bijvoorbeeld een pro-dukt van Difco Company) te kweken en daarna op een ander kweekmedium te 15 enten en te kweken onder vorming van het gewenste Monacoline K-zout.

Het micro-organisme wordt bij voorkeur gekweekt onder aerobe omstandigheden onder toepassing van bekende kweekmethoden, bijvoorbeeld een vaste kweek, een schudkweek of kweken onder beluchting en roeren.

Het micro-organisme groeit bij sterk uiteenlopende températren, dat wil 20 zeggen tussen 7°C en 35°C, waarbij in het bijzonder bij de vorming van

O

Monacoline K of een Monacoline K-zout, een kweektempeatuur van 20 C tot 30°C de voorkeur verdient.

Tijdens het kweken van het micro-organisme kan de vorming van Monacoline K nagegaan worden door monsters van het kweekmedium 23 te nemen en de fysiologische werkzaamheid van Monacoline K-zout in het kweekmedium volgens de hierna beschreven proeven te bepalen. Het kweken kan dan voortgezet worden tot een aanzienlijke opeenhoping van Monacoline K-zout in het kweekmedium is bereikt, waarna het Monacoline K-zout geïsoleerd en uit de kweekvloeistof gewonnen kan worden en de weefsels van de 30 micro-organismen met behulp van elke geschikte combinatie van isolatie-methoden, rekening houdend met de fysische en chemische eigenschappen. Bijvoorbeeld kunnen één of meer van de volgende isolatiemethoden toegepast worden, extractie van de vloeistof uit het kweekmedium met een hydrofiel oplosmiddel (bijvoorbeeld diethylether, ethylacetaat of chloroform); 35 extractie van het organisme met een hydrofiel, oplosmiddel (zoals aceton of een alcohol); concentratie, bijvoorbeeldίΑόστ verdampen van het gehele of een deel van het oplosmiddel onder verminderde druk; oplossen in een meer polair oplosmiddel (bijvoorbeeld aceton of een alcohol); verwijdering van verontreinigingen met een minder polair oplosmiddel (zoals petroleum-onn Π Π7 -8- ether of hexaan); gel-filtratie door een kolom met een materiaal zoals Sephadex (in de handel verkrijgbaar produkt van Pharmacia, Co·, Ltd· U.S.A.); absorptiechromatografie met aktieve kool of silicagel; snelle vloeistof-chromatografie, omzetting in Monacoline K zelf of het basis'zuur; direkte 5 zuivering in de vorm van het metaalzout; en andere soorgelijke methoden·

Door toepassing van een geschikte combinatie van deze methoden kan het gewenste Monacoline K-zout als een zuivere stof uit het kweekmedium geïsoleerd worden·

Zoals in de genoemde octrooiaanvragen beschreven, kan 10 Monacoline K zelf ook met behulp van de bovenbeschrevm micro-organismen en methoden bereid worden.

De fysiologische werkzaamheid van Monacoline K-zouten en esters kan onder toepassing van de volgende proeven die ook in gewijzigde vorm kunnen worden toegepast, kwantitatief onderzocht en bepaald 15 worden om de bereiding van Monacoline K-zouten volgens de fermentatie-werkwijze der onderhavige uitvinding doorlopend te kunnen controleren· 1« Remming van cholesterolbiosynthese.

Zoals Monacoline K zelf, remmen Monacoline K-zouten en -esters in het bijzonder de werking van 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-20 reductase, dat het snelheidsbepalende enzym bij de biosynthese van cholesterol is. In Tabel A zijn de concentraties (in n©/nl) van de verbindingen volgens de uitvinding aangegeven die de werking van 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl(HMG)-CoA-reductase met 50$ afremmen (zoals bepaald volgens de methode beschreven in Analytical Biochemistry, 31» 3^3 (1969)) en de 25 concentraties in ng/ml van de verbinding volgens de uitvinding die de cholesterolbiosynthese met 50$ afremt (zoals gemeten volgens de methode beschreven in Journal of Biological Chemistry, 2*t7. ^91½ (1972))· Ook de overeenkomtige resultaten van de bekende verbindingen ML-236B (een verbinding die een soortgelijke werking bezit en die door kweken van micro-30 organismen van het geslacht Penicillium bereid worden, beschreven in het Britse octrooischrift 1.^53*^25) zijn aangegeven· Verder zijn aangegeven de concentratie van Monacoline K zelf die de cholesterolbiosynthese met 50$ remt* Het blijkt nu dat wanneer de concentratie van ML-236B, nodig om de cholesterolbiosynthese met 50$ te remmen, 10,0 ng/ml bedraagt, de 35 overeenkomstige concentratie van Monacoline K-esters 1 ng/ml bedraagt (dat wil zeggen ongeveer 10 x beter),, terwijl de overeenkomstige con- .centratie van het natriumzout van Monacoline K ongeveer 0,14 ng/ml bedraagt(d.w.z.ongeveer 70 x beter). De werking van de zouten en esters van Monacoline K kunnen worden vergeleken met of zijn beter/" „ dan die van Monacoline K zelf. _ _ Λ _ F' 800 43 03 V t -9- _TABEL A_

Concentratie (ng/ml) voor de afremming met HMG-CoA-reductase cholesterolbiosynthese 5 methylester 70,0 1,2 ethylester 12,0 1,3 butylester 15,0 2,0 benzylester 11,0 1,1 natriumzout 2,0 0,14 10 calciumzout 12,0 1,8

Monacoline K - 2,0 ML - 236b 10,0 10,0 15 2. Verlaging van het cholesterolgehalte in bloed en lever bi.i ratten.

De bij de proef gebruikte dieren waren ratten van de stam Wistar Imamichi met een lichaamsgewicht van ongeveer 300 g. De proeven werden uitgevoerd met groepen van elk 5 ratten. Elk dier werd intraveneus met kQQ mg/kg Triton WR-1339 (een handelsprodukt, waarvan 20 bekend is dat het het cholesterolgehalte in het bloed verhoogt) ingespoten, terwijl gelijktijdig oraal een van de verbindingen in Tabel B met de in de tabel aangegeven hoeveelheden werd toegediend. 20 Uren na orale toediening werden de ratten gedood door aderlating, het bloed en de levers verzameld en de cholesterolgehalten met behulp van de gebruikelijke 25 middelen bepaald. De resultaten zijn in Tabel B samengevat waarin de verlaging van het cholesterolgehalte in het bloed en in de lever vergeleken wordt mé die van een blanco groep ratten die alleen Triton WR-1339 hadden ontvangen.

Ter vergelijking, worden de overeenkomstige resultaten 30 van Monacoline K zelf en van ML-236B gegeven, waarbij deze verbindingen echter in aanzienlijk grotere hoeveelheden dan die van de verbinding volgens de uitvinding worden toegediend om een vergelijkbare verlaging van het cholesterolgehalte te verkrijgen.

35 8004303 -10- _TABEL B________

Verlaging cholesterolgehalte in % Verbinding Dosis mgAg bloed lever methylester 5 23,8 18,½ 5 ethylester 5 23,3 18,0 butylester 5 19,5 15*7 benzylester 5 18,5 natriumzout 2 27,5 18,9 calciumzout 5 21,½ 17»1 10-—-

Monacoline K 10 22,½ 16,½ ML-236B to 2^6 20,9

De verlaging van het cholesterolgehalte in bloed of 1_(c - B) 15 lever volgt uit de formule —£·· g — x 100 , waarin A het gehalte in de groep aangeeft die alleen met Triton WB-1339 is behandeld; B het gehalte in de onbehandelde blancogroep en C het gehalte in de proefgroep.

3. Acute giftigheid.

De onderzochte verbindingen waren de methyl-, ethyl-, 20 butyl- en benzylesters en de natrium- en calciumzouten van Monacoline K* Men heeft gevonden dat de 5C$’s lethale dosis (LD^q) van deze verbindingen tenminste 2000 mg/kg bij orale toediening en tenminste 500 mg/kg bij intraperitoneale toediening bedroeg. De giftigheid van de verbindingen is dus zeer laag.

25 Uit deze resultaten volgt dat de verbindingen volgens de uitvinding de biosynthese van de cholesterol remmen, daardoor het cholesteolgehalte in bloed verlagen en dus waardevolle geneesmiddelen zijn bij de behandeling van hyperlipemie en arteriosclerosis.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen oraal of 30 parenteraal worden toegediend in de vorm van capsules, tabletten, injek-tiepreparaten of elk andere bekende vorm, hoewel gewoonlijk de voorkeur wordt gegeven aan orale toediening. De dosis varieert afhankelijk van de leeftijd, het lichaamsgewicht van de patient en de ernst van de toestand, maar in het algemeen bedraagt de dagelijkse hoeveelheid voor vol-35 wassenen bij voorkeur 0,1-100 mg, meer in het bijzonder 1-10 mg voor

Monacoline K-zouten en 0,5-100 mg, bij voorkeur 0,5-10 mg voor Monacoline K-esters.

De bereiding van de verbindingen volgens de uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht· 800 4303 ψ \ -11-

VOORBEELD I

Natrimnzout van Monacoliae K.

Men brengt 300 1 van een kweekmedium ret een pH vóór sterilisatie van 5,5, dat 5$ gew/vol. glucose, 0,5# gew/vol. maiskweek-5 vloeistof, 2# gew/vol. pepton (merk Kyokuto, produkt van Kyokuto Seiyaku KK, Japan) en 0,5# gew/vol. ammoniumchloride bevat, in een fermentatie-tank van 600 liter en ent met het organisme Monascus ruber SANK 1817^ (Ferm ^957)· Men kweekt het organisme 116 uren bij 26°C met een beluch-tingssnelheid van 300 liter/min. en een roersnelheid van 190 omw./min.

10 Hierna wordt de pH van het cultuurmedium dat het organisme bevat door toevoeging van 6N zoutzuur op 3Λ ingesteld, waarna het medium met 800 liter methanol wordt geëxtraheerd.

Men voegt 6 kg Hyflo Super Cel toe, waarna men het ex-trakt met een filterpers filtreert waardoor men 1100 liter methanolextrakt 15 verkrijgt. Men wast dit extrakt met 200 liter van een verzadigde oplossing van natriumchloride in water en vervolgens met 180 liter ethylcyclo-hexaan. De verkregen oplossing wordt met 600 liter ethyleendichloride geëxtraheerd en aan het ethyleendichloride-extrakt 50 g trifluorazijnzuur toegevoegd, waarna men 30 minuten bij 80°C laat reageren. Het reaktie-20 mengsel wordt nu achtereenvolgens met 200 1 van een 2#’s gew./vol. oplossing van natriumbicarbonaat in water en met 200 liter van een 10#'s gew./vol. oplossing van natriumchloride in water gewassen. Daarna concentreert men het mengsel door indampen onder verminderde druk en verkrijgt 135 g van een olieachtige stof.

25 Men lost de olieachtige stof op in **00 ml methanol en onderwerpt 20 ml van de verkregen methanoloplossing (die 6,8 g olie bevat) aan preparatieve snelle vloeistofchromatografie in een Waters Co. Ltd.

System 500» uitgerust met een Prepac C^g kolom (omgekeerde fasekolom). Als ontwikkelaar gebruikt men een mengsel van methanol en water in de volume-30 verhouding 85 : 15· Men ontwikkelt bij een stroomsnelheid van 200 ml/min.

(ontwikkeltijd ongeveer 10 minuten), en leest een differentiaalrefrakto-meter af die verbonden is met het lichaam, waarbij men de fraktie die de hoogste piek op de differentiaalrefraktometer aangeeft afscheidt. Na herhaling van deze behandeling verzamelt men de verkregen frakties met de 35 hoogste pieken en concentreert onder vorming van 10,2 g van een olieachtige stof. Men lost de olieachtige stof op in 30 ml methanol en onderwerpt 6 ml van de methanoloplossing (die ongeveer 2 g olie bevat) opnieuw aan dezelfde preparatieve snelle vloeistofchromatografie, waarbij men met een mengsel van methanol en water met een volumeverhouding van 80 : 20 en een flOIU 3 03 -12- stroomsnelheid van 200 ml/min. ontwikkelt· Se fraktie met de hoogste piek wordt afgescheiden. Se bewerking wordt herhaald en de frakties met de hoogste pieken verzameld en geconcentreerd. Men behandelt het residu met methanol en water waardoor men 1170 mg ruwe kristallen verkrijgt, die men 5 enige malen uit ethanol herkristalliseert onder vorming van 864 mg kridallen.

Aan deze kristallen voegt men 19,4 ml van een 0,1N oplossing van natriumhydroxyde in water toe en roert het mengsel 3 uren bij 50-60°C. Men filtreert de onoplosbare bestanddelen af en droogt het 10 filtraat uit bevroren toestand waardoor men 900 mg natriumzout van Monacoline K verkrijgt met de volgende eigenschappen: 1. Kleur en vorm: wit poeder 2. Elementair analyse:

Berekend : C, 64,84%, H, 8,38%, Na, 5,1?% 15 Gevonden : C, 64,78%, H, 8,53%, Na, 5,21% 3. Molecuulgewicht: 444 (massaspectrometrie (F.B.Mass.)) 4. Molecuulformule: C^H^OgNa 5. Ultravioletabsorptiespectrum: zie Fig. 1 van de tekening, \max : 20 232 nm (log , = 4,30) 239 um (log ï = 4,36) 248 nm (log = 4,19) 6. Infraroodabsorptiespectrum (KBr korrel):

Zie Fig. 2 van de tekening; 25 7. Kernmagnetisch resonantiespectrum (BgO):

Zie Fig. 3 van de tekening; 8. Snelle vloeistofchromatografie:

Tijdsduur: 8,8 minuten

Kolom, Microbondapac C18; 30 60%'s vol/vol waterige methanol + 0,1%'s PIC-A (van de firma Waters Co. Ltd.); Stroomsnelheid 1,5 ml/min.

Zie Fig. 4 van de tekening 9. Oplosbaarheid:

Oplosbaar in water, onoplosbaar in organische oplos-35 middelen; 10. Soortelijke rotatie: M d5 = +266° (c = °i33, water).

VOOBBEELB II

Natriumzout van Monacoline K.

800 4 3 03 * « -13-

Men brengt 300 liter van een kweekmedium met een pH 7,k vóór sterilisatie, dat 1,5$ gew/vol. oplosbaar zetmeel, 1,5$ gew/vol glycerol, 2$ gew/vol· vismeel en 0,2$ gew/vol· calciumcarbonaat bevat, in een fermentatietank van 600 1 en ent met het organisme Monascus ruber 5 SANK 17075 (CBS 832.70). Men kweekt het organisme 120 uren bij 2ó°C met een beluchtingssnelheid van 300 1/min. en een roersnelheid van 190 omw/ min. Vervolgens filtreert men de kweekvloeistof in een filterpers, waarbij men 35 hg (nat gewicht) van het organisme verkrijgt.

Hieraan voegt men 100 liter water toe en brengt onder 10 roeren de pH van het mengsel met natriumhydroxyde op 12. Men laat het mengsel 1 uur bij kamertempeatuur staan en voegt vervolgens 2 kg Hyflo Super Cel aan het mengsel toe dat men in een filterpers filtreert. Men brengt de pH van het filtraat door toevoegen van zoutzuur op 10 en absorbeert het verkregen mengsel in een kolom die 5 liter HP-20 hars bevat dat 15 gewassen is met 15 liter water en 15 liter van een 10$*s vol/vol oplossing van methanol en water. De kolom wordt vervolgens met 9C$'s vol/vol water-methanol geelueerd en het eluaat tot een volume van ongeveer 10 liter geconcentreerd, waarna men de pH door toevoegen van zoutzuur op 2 brengt en het mengsel met ethylacetaat extraheert. Men wast het extrakt met een ver-20 zadigde oplossing van natriumchloride in water, droogt boven watervrij natriumsulfaat en concentreert vervolgens door indampen tot droog onder vorming van 50 g van een olieachtige substantie die Monacoline K-zuur bevat. Aan de olieachtige stof voegt men methanol tot een totaal volume van 100 ml toe. Van de verkregen oplossing wordt 20 ml aan preparatieve snelle 25 vloeistofchromatografie onderworpen met behulp van een omgekeerde fase-kolom (zoals beschreven in Voorbeeld I) en met 2C$ vol/vol oplossing van methanol in water (die 2% azijnzuur bevat) bij een stroomsnelheid van 200 ml/min. geelueerd. De fraktie die op de differentiaalrefraktometer de hoogste piek toont wordt afgescheiden (7-10 minuten). De resterende 80 30 ml van de methanoloplossing behandelt men op dezelfde wijze. De verkregen frakties met de hoogste pieken worden verzameld, geconcentreerd en met ethylacetaat geëxtraheerd. Het extrakt wordt na toevoeging van heptaan tot droog ingedampt onder vorming van 1,2 g van een olieachtige stof.

Men lost het olieachtige produkt op in 20 mlnethanol, 35 onderwerpt aan snelle vloeistofchromatografie zoals hierboven beschreven en verkrijgt 150 ml Monacoline K-zuur. Hieraan voegt men 2 mlnethanol toe en 100 ml water toe en stelt de pH van de verkregen oplossing met 1N natriumhydroxyde in op 8 en verkrijgt een heldere waterige oplossing. Deze oplossing leidt men door een kolom die 10 ml HP-20 hars bevat, wast de 8004303 -14- kolom met 100 ml water en elueert met 80$ vol/vol methanol in water. Hen droogt het eluaat uit bevroren toestand en verkrijgt 130 mg natriumzout van Monacoline K in de vorm van een wit poeder. De eigenschappen van het produkt zijn gelijk aan die van het produkt van Voorbeeld I.

5 VOORBEELD III

Calciumzout van Monacoline K.

Men herhaalt de kweek, extraktie, concentratie, prepara-tieve snelle vloeistofchromatografie en herkristalliseert uit ethanol zoals beschreven in Voorbeeld I. Men lost 500 mg van de verkregen kristallen 10 op in 50 ml methyleenchloride en filtreert de verkregen oplossing door een milliporienfilter. Aan het filtraat voegt men 20 ml toe van een verzadigde oplossing van calciumhydroxyde in water en roert het mengsel krachtig bij kamertemperatuur. Zodra de pH van de oplossing 'beneden 8 daalt voegt men opnieuw 10 ml van een verzadigde oplossing van calciumhydroxyde in water 15 toe en roert verder. AI3 de pH niet meer daalt (na toevoegen van in totaal 50 ml van de oplossing van calciumhydroxyde in water) voegt men gedestilleerd water toe en brengt de gehele oplossing in een scheitrechter. Men verzamelt de organische fase en destilleert het oplosmiddel af. Men behandelt het residu met heptaan en verkrijgt als men het mengsel ultrasoon 20 behandelt een poeder. Men filtreert het poeder en droogt waardoor men 450 mg van het calciumzout van Monacoline K in de vorm van een wit poeder verkrijgt.

Dit calciumzout bezat de volgende eigenschappen.

1. Molecuulgewicht : 882 (massaspectrometrie)· 25 2. Molecuulformule: (C^H^Og^.Ca 3. Smeltpunt : 155-165°C (onder ontleding) 4. Soortelijke rotatie: ^ = +209° (c = 1,48, chloroform).

5. Infraroodabsorptiespectrum (KBr): 30 Zie Fig. 5 van de tekening.

6. Kernmagnetisch resonantiespectrum (CD^OD):

Zie Fig. 6 van de tekening.

VOORBEELD IV

Methylester van Monacoline K.

35 Men herhaalt de kweek, extraktie, concentratie, prepara tieve snelle vloeistofchromatografie en herkristallisatie uit ethanol zoals beschreven in Voorbeeld I, waarbij men 864 mg Monacoline K verkrijgt. Men lost 200 mg Monacoline K op in 20 ml methanol (die tevoren met mole-cuulzeef 3A gedehydrateerd is). Na toevoegen van enkele druppels acetyl- 8004303 -15- chloride roert men de oplossing 3 uren bij kamertemperatuur. Men destilleert het oplosmiddel af en extraheert het residu met 50 ml ethylacetaat. Men wast het extrakt eerst met een 2#'s gew/vol. oplossing van natriumbicarbonaat in water en daarna met een verzadigde oplossing van natrium-5 chloride in water, waarna men boven watervrij natriumsulfaat droogt en het oplosmiddel afdestilleert· Het residu wordt in een kolom geadsorbeerd, die 10 g met benzeen behandeld silicagel (Wakogel C-100) bevat. Men verzamelt de frakties die met een mengsel van ethylacetaat en benzeen in de volumeverhouding 6 : 9** geelueerd zijn en destilleert het oplosmiddel af 10 onder vorming van 65 mg methylester van Monacoline K in de vorm van een kleurloze olie.

Dit produkt bezit de volgende eigenschappen: 1. Molecuulgewicht : **36,6 (massaspectrometrie); 2. Molecuulformule: C^H^Og; 15 3. Soortelijke rotatie: H,25 = +208° (c = 1,05 methanol).

**. Infraroodabsorptiespectrum:

Zie Fig. 7 van de tekening; 5. Kernmagnetisch resonantiespectrum: 20 Zie Fig. 8 van de tekening.

VOORBEELD V

Methylester van Monacoline K.

Men bereidt het natriumzout van Monacoline K zoals beschreven in Voorbeeld II, Vervolgens lost men 100 mg van het natriumzout 25 op in 2 ml dimethylsulfoxyde en voegt 50 jH methyljodide aan de oplossing toe. Men kookt de oplossing onder roeren 5 uren bij **0-50°C in een reak-tor voorzien van een terugvloeikoeler. Men verdunt het reaktiemengsel met 5 ml water en extraheert met 10 ml methyleenchloride. Men destilleert het oplosmiddel van het extrakt af en adsorbeert het residu in een kolom die 30 10 g tevoren met benzeen behandeld silicagel (Wakogel C-100) bevat. Men verzamelt de met een mengsel van ethylacetaat en benzeen in de volumeverhouding k : 96 geelueerde frakties en destilleert het oplosmiddel af waardoor men 35 mg van het methylester van Monacoline K in de vorm van een olie verkrijgt,

35 VOORBEELD VI

Ethylester van Monacoline K.

Men lost 100 mg Monacoline K (bereiding zoals beschreven in Voorbeeld I) op in 15 ml ethanol die van tevoren met Molecuulzeef 3A gedehydrateerd is, waarna men enkele druppels acetylchloride aan de op- 800 43 03 -16- lossing toevoegt. Men roert het mengsel 3 uren bij kamertemperatuur, destilleert het oplosmiddel af en extraheert het residu met 50 ml ethylace-taat. Men wast het extrakt achtereenvolgens met een 2#'s gew/vol. oplossing van natriumbicarbonaat in water en een verzadigde oplossing van 5 natriumchloride in water waarna men boven watervrij natriumsulfaat droogt. Na afdestilleren van het oplosmiddel, adsorbeert men het residu in een kolom die 10 g tevoren met benzeen behandeld silicagel (Wakogel C-100) bevat. De frakties die met een mengsel van ethylacetaat en benzeen in de volumeverhouding 6 : 94 elueren verzamelt men en destilleert het oplos-<I0 middel af onder vorming van 30 mg ethylester van Monacoline K in de vorm van een kleurloze olie.

De eigenschappen van deze verbinding zijn als volgt: 1. Molecuulgewicht : 450,6 (massaspectrometrie).

2. Molecuulformule : 3. Infraroodabsorptiespectrum (CHCl^):

Zie Fig. 9 van de tekening.

4. Kernmagnetisch resonantiespectrum (CDCl^):

Zie Fig. 10 van de tekening.

VOORBEELD VII

20 Butylester van Monacoline K.

Men lost 200 mg Monacoline K (bereid zoals beschreven in Voorbeeld I) op in 20 ml butanol dat tevoren met een molecuulzeef 3A gedehydrateerd is. Na toevoegen van enkele druppels acetylchloride aan de oplossing roert men het mengsel 2 uren bij kamertemperatuur. Men destil-25 leert het oplosmiddel af en extraheert het residu met 50 ml ethylacetaat. Men wast het extrakt achtereenvolgens met 2# gew/vol. natriumbicarbonaat in water en een verzadigde oplossing van natriumchloride in water. Men droogt de oplossing boven watervrij natriumsulfaat en destilleert het oplosmiddel af. Men adsorbeert het residu in een kolom die 10 g tevoren met 50 benzeen behandeld silicagel (Wakogel C-100) bevat. Men verzamelt de frak-tie die met een mengsel van ethylacetaat en benzeen in de volumeverhouding 4 : 96 elueert en destilleert het oplosmiddel af waardoor men 80 mg butylester van Monacoline K in de vorm van een kleurloze olie verkrijgt.

De verbinding bezit de volgende eigenschappen: 35 1. Molecuulgewicht : 478,7 (massaspectrometrie).

2. Molecuulformule: ^28^46^6 3. Infraroodabsorptiespectrum (CHCl^):

Zie Fig. 11 van de tekening.

4. Kernmagnetisch resonantiespectrum (CDCl^): 8004303 -17-

Zie Fig. 12 van de tekening.

VOORBEELD VIII

Benzylester van Monacoline K.

Men lost 200 mg Monacoline K (bereid zoals beschreven 5 in Voorbeeld I) op in 20 ml benzylalcohol dat tevoren met molecuulzeef 3A gedehydrateerd is. Na toevoegen van enkele druppels acetylchloride aan de oplossing roert men het verkregen mengsel 3 uren bij kamertemperatuur. Men destilleert het oplosmiddel af en extraheert het residu met 50 ml ethylacetaat. Men wast het extrakt achtereenvolgens met een 2$’s gew/vol. 10 oplossing van natriumbicarbonaat in water en een verzadigde oplossing van natriumchloride in water. Men droogt de oplossing boven watervrij natriumsulfaat en destilleert het oplosmiddel af. Het residu wordt in een kolom, die 10 g vooraf met benzeen behandeld silicagel (Wakogel G-100) bevat, geadsorbeerd. De frakties die met een mengsel van ethylacetaat en 15 benzeen in een volumeverhouding k : 96 elueren worden verzameld en het oplosmiddel gedestilleerd waardoor men 70 mg benzylester van Monacoline K in de vorm van kleurloze olie verkrijgt.

De verbinding bezit de volgende eigenschappen: 1. Molecuulgewicht : 512,6 (massaspectrometrie).

20 2. Molecuulformule : W

3. Infraroodabsorptiespectrum (CHCl^):

Zie Fig. 13 van de tekening.

Kernmagnetisch resonantiespectrum (CDCl^):

Zie Fig. 14 van de tekening.

25 8004303

Claims (16)

1. Verbindingen met anti-hypercholesteretnische werking met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R een metaalatoom of een 5 al dan niet gesubstitueerde alkylgroep en n het omgekeerde van de waardigheid van de door R voorgestelde atoom of groep voorstelt·

2. Monacoline K-zouten volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat R een metaalatoom voorstelt·

3. Zouten volgens conclusie 2, met het kenmerk, 10 dat het metaalatoom natrium, kalium, calcium, magnesium, aluminium, ijzer, zink, koper, nikkel of kobalt is· k. Zouten volgens conclusie 3, me t het kenmerk, dat het metaal natrium, calcium of aluminium is·

5. Monacoline K-esters volgens conclusie 1, m e t het 15 kenmerk, dat R een al dan niet gesubstitueerde alkylgroep en n het getal 1 voorstelt·

6. Esters volgens conclusie 5i m et het kenmerk, dat R een alkylgroep, een aralkylgroep of een acylalkylgroep voorstelt.

7. Esters volgens conclusie 6, met het kenmerk, 20 dat R een alkylgroep, een aralkylgroep of een arylcarbonylalkylgroep voorstelt.

8· Esters volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat R een alkylgroep, een al dan niet gesubstitueerde benzylgroep of een al dan niet gesubstitueerde fenacylgroep voorstelt· 25 9· Esters volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat R een .alkylgroep, een benzylgroep of een benzylgroep met 1 of meer alkyl-, alkoxy- of halogeensubstituenten, een fenacylgroep of een fenacylgroep met één of meer alkyl-, alkoxy- of halogeensubstituenten voorstelt· 10· Esters volgens conclusie 5» met het kenmerk, 30 dat R een methyl-, ethyl-, butyl- of benzylgroep voorstelt·

11· Werkwijze voor de bereiding van Monacoline K-zouten en -esters, met het kenmerk, dat men Monacoline K of een reak-tief derivaat daarvan in een zout of ester omzet·

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het ken- 35 merk, dat het reaktieve derivaat het basiezuur van Monacoline K of een Monacoline K-zout is·

13· Werkwijze volgens conclusie 11, met het ken merk, dat men de Monacoline K-esters bereidt door reaktie van een halogenide met formule RX (waarin R een al danniet gesub-stitueerde alkyl- 8004303 -19- groep en X een halogeenatoom voorstelt) met een Monacoline K-zout.

14. Werkwijze volgens conclusie 11, m e t het kenmerk, dat men de Monacoline K-esters bereidt door reaktie van een alcohol met formule EOH (waarin E een al dan niet gesubstitueerde alkylgroep 5 voorstelt) met Monacoline K of het basiszuur daarvan, in aanwezigheid van een dehydrateermiddel.

15. Werkwijze voor de bereiding van Monacoline K-zouten, met het kenmerk, dat men een Monacoline K-zout vormend micro-organisme van het geslacht Monascus in een geschikt kweekmedium kweekt en 10 het Monacoline K-zout van het kweekmedium scheidt·

16. Werkwijze volgens conclusie 15» met het kenmerk, dat het genoemde micro-organisme van het geslacht Monascus: Monascus anka SANK 10171 (IFO 65^0); Monascus nurourous SANK 10271 (IFO 4513); Monascus ruber SANK 1067I (Ferm 4958); Monascus vitreus SANK 10960 15 (NIHS 609, e-609; Ferm 4960); Monascus paxii SANK 11172 (IFO 8201); Monascus ruber SANK 11272 (IFO 9203); Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959); Monascus ruber SANK 15177 (Ferm 4956); Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832.70); Monascus ruber SANK 17175 (CBS 503*70); Monascus ruber SANK 17275 (AiPCC 18199) ? of Monascus ruber SANK 18174 (Ferm 4957) is.

17. Werkwijze volgens conclusie 15, met het ken merk, dat het genoemde micro-organisme: Monascus ruber SANK 10671 (Ferm 4958); Monascus ruber SANK 11272 (IFO 9203); Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959); Monascus ruber SANK 15177 (Ferm 4956); Monascus ruber SANK 1817^ (Ferm 4957) is. 25 18· Werkwijze volgens conclusie 15, m e t het ken merk, dat het metaal: natrium, kalium, calcium, magnesium, aluminium, ijzer, zink, koper, nikkel of kobalt is.

19. Werkwijze volgens conclusie 18,met het ken merk, dat het metaal natrium, calcium of aluminium is.

20. Werkwijze voor de bereiding van een geneesmiddel, met het kenmerk, dat men een verbinding met formule 1, waarin de substituenten de voornoemde betekenis bezitten in een voor geneeskundige toediening geschikte vorm brengt. 800 4 3 03 35