JPH04243894A - 新規ｑ−６４０２化合物およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，Ｑ−６４０２化合物お
よび該化合物の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｑ−６４０２化合物は，環状ペプチド構
造を有する新規化合物であって，ホスホリパーゼＡ２（
ＰＬＡ２）阻害作用を有し，抗炎症剤，抗アレルギー剤
等として利用できる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は，天然に
存在する多数の微生物の産生する物質について研究を行
っていたところ，ストレプトミセス属に属する一菌株が
培地中にＱ−６４０２化合物を生産することを見出した
。そして該化合物を単離同定したところ，これらは新規
化合物であって，ホスホリパーゼＡ２の活性を抑制する
作用があるという知見を得て本発明を完成するに至った
。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち，本発明は，次
の平面化学構造式化２で表わされるＱ−６４０２化合物
および該化合物の製造法に関する。

【０００５】

【化２】

【０００６】（式中，Ｒは式−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ
３）２または　　式−（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＨ３）２で
示される基を表わす。）本明細書においては，Ｒが−（
ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ３）２である化合物をＱ−６４０
２−Ａ，また，−（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＨ３）２である
化合物をＱ−６４０２−Ｂと称する。

【０００７】これらの化合物は，不斎炭素原子を有して
おり，異性体が存在する。本発明では，これらの異性体
の分離されたものおよびそれらの混合物をも包含する。

【０００８】Ｑ−６４０２化合物は，ストレプトミセス
属に属するＱ−６４０２化合物生産菌を培養し，培養液
中にＱ−６４０２化合物を生産蓄積させ，培養液から該
化合物を採取することによって製造できる。

【０００９】ストレプトミセス属に属するＱ−６４０２
化合物生産菌としては，たとえば沖縄県鳩間島で採取し
た土壌から分離したストレプトミセス　　エス　　ピー
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｓｐ．）Ｑ−６４０２
　　株（微工研菌寄第１１９３９号）を挙げることがで
きる。 Ｑ−６４０２株の菌学的性質を説明する。

【００１０】（Ｉ）形態本菌株は各種合成及び有機培地
においてよく生育し，生育の色調は紫味灰，またはうす
黄茶を呈す。気菌糸はスターチ・無機塩寒天培地，オー
トミール寒天培地上に良く形成されるが，ペプトン・イ
ースト・鉄寒天培地，栄養寒天培地上にはほとんど作ら
れない。気菌糸の色調はグレイシリーズで，成熟すると
黒っぽい粘液状になり，形状は単純分枝で先端が閉じた
らせん状（クローズドスパイラル）を示す。電子顕微鏡
観察によると，胞子は１０〜５０個程度の連鎖を認め，
胞子の表面はしわ状で，大きさは１．０〜１．３×０．
６〜０．８μｍである。胞子嚢，菌核，輪生糸などの特
殊な器官は観察されない。

【００１１】（２）　　各種寒天培地上の性状各種寒天
培地上の性状は，下表１に示すとおりである。特に記載
しないかぎり，２７℃で２１日間培養し，常法に従って
観察したものである。色調の記載については色の標準（
日本色彩研究所）によった。

【００１２】

【表１】

【００１３】（注）　　Ｇ：　　生育程度　　　　　　
　　　　Ａ；　　気菌糸の着生及びその色相Ｒ：　　裏
面の色相　　　　　　　　Ｓ；　　可溶性色素（３）　
　生理的性質生理的性質を下表２に示す。

【００１４】

【表２】

【００１５】（注）　　生育温度は各温度（５，１０，
１５，２０，２４，２７，３０，３３，３７，４０，４
５，５０℃）で７〜２１日までの観察結果，ミルクに対
する作用は３７℃で３〜２１日までの観察結果，それ以
外は，特に指摘のないかぎり２７℃で２週間後の観察結
果を示す。（４）　　炭素源の資化性（プリドハム・ゴ
ドリーブ寒天培地，２７℃培養）炭素源の資化性を下表
３に示す。

【００１６】

【表３】

【００１７】（５）　　ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）
分析ＬＥＣＨＶＡＬＩＥＲらの方法（ＬＥＣＨＶＡＬＩ
ＥＲ．ＭＰ．ｅｔ　　ａｌ；ｐｐ２７７−２３８　　ｉ
ｎ　　ＤＩＥＴＺ，Ａ　　ｅｔ　　ａｌ　　ｅｄ．，　
　Ａｃ−ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　　Ｔａｘｏｎｏｍｙ，
ＳＩＭ　　Ｓｐｅｃｉａｌ　　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
　　Ｎｏ．６，１９８０）に従い，本菌株の酸加水分解
物の分析を行った結果，ＬＬ−ジアミノピメリン酸及び
グリシンが検出された。

【００１８】以上の性状を要約すると，Ｑ−６４０２株
は，気菌糸が単純分枝で，先端が閉じたらせん状の形態
を示す。色相は生育が紫味灰またはうす黄茶，気菌糸が
明るい灰色〜暗い灰色を呈す。可溶性色素，メラニン様
色素の生成は認められない。電子顕微鏡による観察で，
１０〜５０個の胞子連鎖が観察され，胞子の表面はしわ
状である。また菌体の酸加水分解物の分析よりＬＬ−ジ
アミノピメリン酸とグリシンが検出された。

【００１９】上記諸性質より，本菌株はストレプトミセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株と考え
られる。そこで，とりあえず本菌株をストレプトミセス
　　エス　　ピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｓｐ
．）Ｑ−６４０２株と命名した。本菌株は，工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１９３９号とし
て寄託されている。

【００２０】なお，微生物は人工的に，また自然に変異
を起しやすいが，本発明のストレプトミセス　　エス　
　ピー　　Ｑ−６４０２株は天然から分離された放線菌
のほかにこれを紫外線，Ｘ線，化学薬剤などで人工的に
変異させたもの及びそれらの自然変異株についても，包
含されるものである。

【００２１】Ｑ−６４０２化合物の生産はストレプトミ
セス　　エス　　ピー　　Ｑ−６４０２株を培地に培養
し，培養物より採取することにより行なわれる。培養方
法は一般微生物の培養方法に準じて行なわれるが，通常
は液体培地により深部培養法が有利である。培養に用い
られる培地としては，ストレプトミセス　　エス　　ピ
ー　　Ｑ−６４０２株が利用する栄養源を含有する培地
であればよい。

【００２２】すなわち，合成培地，半合成培地あるいは
天然培地が用いられ，培地の組成は，例えば炭素源とし
てはグルコース，アラビノース，フラクトース，デンプ
ン，植物油等が，窒素源としては肉エキス，ペプトン，
グルテンミール，綿実粕，大豆粉，落花生粉，魚粉，コ
ーンスチーブリカー，乾燥酵母，酵母エキス，硫酸アン
モニウム，硝酸アンモニウム、尿素その他の有機，無機
の窒素源が用いられる。また，金属塩として，Ｎａ，Ｋ
，Ｍｇ，Ｃａ，Ｚｎ，Ｆｅなどの硫酸塩，硝酸塩，塩化
物，炭酸塩，燐酸塩などが必要に応じて添加される。

【００２３】また，必要に応じてメチオニン，システィ
ン，シスチン，チオ硫酸塩，オレイン酸メチル，ラード
油，シリコン油，界面活性剤などの抗生物質生成促進物
質又は消泡剤を添加することもできる。

【００２４】培養条件としては好気的条件下に培養する
のが一般的に有利で，培養温度は約１５〜３７℃の範囲
が望ましく，好ましくは約２５〜２７℃附近で行われる
。培地のｐＨは約５〜１０，好ましくは約６〜８の範囲
に保存すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成
，温度条件に応じて適宜設定される。

【００２５】培養物より目的とするＱ−６４０２化合物
を単離採取するには通常の微生物の培養物より抗生物質
を単離する方法が適用される。目的物は主に培養液中に
含有されるので，遠心分離又は濾過により菌体を除去し
た後，濾過液から有効物質の抽出を行う。すなわち，適
当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差，種々の吸着剤
に対する吸着親和性の差，２種の液相間における分配の
差などを利用する一般の抗生物質の製造に用いられる手
段によって，分離，採取，精製される。これらの方法は
必要に応じて単独に用いられ，あるいは任意の順序に組
合わせ，また反覆し適用できる。

【００２６】

【実施例】以上，本発明の製造法を説明したが，以下に
実施例によりさらに説明する。実施例１グルコース１．
０％，ポテトスターチ２．０％，酵母エキス０．５％，
ポリペプトン０．５％，炭酸カルシウム０．４％を含む
液体培地（ｐＨ７．０）を作成し，これを５００ｍｌ容
の三角フラスコに各１００ｍｌずつ分注し，１２１℃で
２０分間滅菌したものに，ベネット寒天培地上に生育さ
せた菌糸を掻きとって接種して，２８℃で４８時間振と
う培養を行ない，種培養液とする。

【００２７】更に，同培地を２０Ｌ，３０Ｌ容ジャーフ
ァーメンターに作製し，１２１℃で２０分間滅菌したも
のに，種培溶液を２．０％の割合で植菌し，２８℃で４
８時間培養した。次に，ポテトスターチ３．０％，酵母
エキス０．１％，コーンスティプリカー０．１％，魚肉
エキス０．１％，炭酸カルシウム０．１％を含む培地（
ｐＨ７．０）を２００Ｌ，３００Ｌ容のファーメンター
に作製し，１２１℃で２０分間滅菌したものに種培養液
を２．０％の割合で植菌した。これを２８℃で１２０時
間，６０ｒｐｍ，２００Ｌ／ｍｉｎで通気撹拌培養した
。

【００２８】培養液２００Ｌにラジオライト＃６００（
昭和化学工業社製）を加えて撹拌した後，濾過すると濾
液１８０Ｌが得られる。この濾液をｐＨ３．０に調整し
た後，濾液を５等分し各々を４０Ｌ，計２００Ｌの酢酸
エチルにて抽出する。この酢酸エチル層を減圧濃縮する
と，褐色エキス９９ｇが得られる。

【００２９】得られた褐色エキスのうち，９８ｇを１．
５Ｌの酢酸エチルに溶解し，２．５％炭酸水素ナトリウ
ム溶液（ｐＨ９．０）１．５Ｌを加えてよく撹拌する。 水層を分離し，ｐＨを３．０に調整した後再び１．５Ｌ
の酢酸エチルを加えてよく撹拌し，酢酸エチル層を分離
する。この酢酸エチル層を減圧濃縮し褐色エキス２３ｇ
を得た。

【００３０】得られた２３ｇの褐色エキスを，ワコーゲ
ルＣ−２００（和光純薬製）８００ｇをクロロホルム−
メタノール−水（１５：３：０．２５）の混合溶媒にて
充填したカラムに乗せ溶出を行う。この操作を２回繰り
返すことにより，Ｑ−６４０２−Ａ，Ｑ−６４０２−Ｂ
を同時に含んだ画分３．５ｇが得られる。更にこの画分
を３００ｍｌのセファデックスＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ　　製）で充
填したカラムに乗せ，メタノールで溶出させることによ
り，より純度の高い両化合物の混合画分１．９ｇを得る
。

【００３１】この混合画分より高速液体クロマトグラフ
ィーを用いてＱ−６４０２−Ａ，Ｑ−６４０２−Ｂの単
一ピークを分取し，Ｑ−６４０２−Ａとして３２７ｍｇ
，Ｑ−６４０２−Ｂとして１１９ｍｇを得た。高速液体
クロマトグラフィー分取条件カラム；　　Ｉｎｅｒｔｓ
ｉｌ　　ＯＤＳ　　２０ｍｍ×２５０ｍｍ移動相；　　
５０％アセトントリル（１Ｌあたり１ｍｌの１％酢酸添
加）流速；　　　　８．５ｍｌ／ｍｉｎ検出；　　　　
２２０ｎｍ温度；　　　　室温以上の条件において，Ｑ
−６４０２−Ａは約２０．５ｍｉｎ，Ｑ−６４０２−Ｂ
は約２９ｍｉｎで溶出される。

【００３２】以上の様にして得られたＱ−６４０２−Ａ
，Ｑ−６４０２−Ｂの物理学的性状を以下に示す。Ｑ−
６４０２−Ａ化合物；性状　　：　　赤紫色　　固体溶
解性：　　メタノール，エタノール，酢酸エチルに可溶
，水に難溶呈色反応：　　硫酸，ニンヒドリン，塩化第
二鉄に陽性塩基性，中性，酸性の区別：　　酸性

【００
３３】分子式：　　Ｃ５０Ｈ６１Ｎ７Ｏ１２　　質量分
析スペクトル：　　ｍ／ｅ　　９５１　　（Ｍ＋）赤外
線吸収スペクトル：　　図１　　（臭化カリウム錠）紫
外線吸収スペクトル：　　図２　　（メタノール中）核
磁気共鳴スペクトル１Ｈ−ＮＭＲ　　：　　図３　　（
重メタノール中　　５００ＭＨｚ）１３Ｃ−ＮＭＲ　　
：　　図４　　（重メタノール中　　１２５ＭＨｚ）

【００３４】Ｑ−６４０２−Ｂ化合物；性状　　：　　
赤紫色　　固体溶解性：　　メタノール，エタノール，
酢酸エチルに可溶，水に難溶呈色反応：　　硫酸，ニン
ヒドリン，塩化第二鉄に陽性塩基性，中性，酸性の区別
：　　酸性

【００３５】分子式：　　Ｃ５１Ｈ６３Ｎ７
Ｏ１２　　質量分析スペクトル：　　ｍ／ｅ　　９６５
　　（Ｍ＋）赤外線吸収スペクトル：　　図５　　（臭
化カリウム錠）紫外線吸収スぺクトル：　　図６　　（
メタノール中）核磁気共鳴スペクトル１Ｈ−ＮＭＲ　　
：　　図７　　（重メタノール中　　５００ＭＨｚ）１
３Ｃ−ＮＭＲ　　：　　図８　　（重メタノール中　　
１２５ＭＨｚ）

【００３６】

【発明の効果】本発明の新規化合物は，ホスホリパーゼ
Ａ２阻害作用を有し，抗炎症剤として有用である。すな
わち，従来から炎症，アレルギー等に関与する生体内物
質としてはプロスタグランディン，ロイコトリエン等が
知られているが，これらの生体内物質の生成機構は以下
に示す通りである。まず，種々の刺激によってホスホリ
パーゼＡ２が活性化され，この酵素の作用によりアラキ
ドン酸が細胞膜リン脂質から遊離し，このアラキドン酸
を出発物質としてプロスタグランディン，ロイコトリエ
ン等が生体内で合成される。ホスホリパーゼＡ２は，こ
の一連の生体内反応系の律速酵素であると考えられてい
る。

【００３７】一方，抗炎症例として，ステロイド系薬剤
と非ステロイド系薬剤とが知られている。前者は，プロ
スタグランディン，ロイコトリエン両方の生合成経路を
阻害し，抗炎症作用は強いが，しばしば好ましくない副
作用が現れる。また，後者は，抗炎症作用が前者に比べ
て弱い。本発明の化合物は，ホスホリパーゼＡ２の活性
を阻害することによってプロスタグランディン及びロイ
コトリエン両方の生合成を抑えることができ，副作用の
少ない，強い抗炎症剤とすることができる。また抗アレ
ルギー剤をも提供することができる。さらに，ホスホリ
パーゼＡ２が関与しているといわれている虚血性血管障
害，潰瘍，敗血症，膵炎等の治療にも本発明の化合物は
有効であることが期待できる。

【００３８】次に本発明の化合物のホスホリパーゼＡ２
阻害作用について実験例を挙げて説明する。ホスホリパ
ーゼＡ２阻害活性の測定ジャーナル　　オブ　　バイオ
ロジカル　　ケミストリー［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２６１（９），４２３９−４２４６（１９８６）］に
記載の方法に準じ，以下の方法で測定した。１３．５ｍ
Ｍ塩化カルシウムと２７０μｇ／ｍｌの牛血清アルブミ
ンを含む１３５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１
００μｌにウサギ血小板由来ホスホリパーゼＡ２を加え
氷中で３０分間インキュベーションを行う。次に本発明
の化合物１０μｌ，及びトリチウム標識オレイン酸を取
り込ませた大腸菌のオートクレイブ標品２５μｌ（約２
０万ｃｐｍ）を反応液に加え，６℃で１０分間反応させ
る。反応は２規定塩酸５０μｌの添加によって停止させ
る。反応停止後，２０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン５
０μｌを加えて氷中３０分間放置したのち遠心し，遠心
上清のカウントを測定した。

【００３９】なお，ホスホリパーゼＡ２阻害活性の測定
に基質として用いたトリチウム標識オレイン酸を取り込
んだ大腸菌のオートクレイブ標品は以下のようにして調
製した。一夜種培養した大腸菌培養液を１００ｍｌのト
リプトンメディウム（１％バクトトリプトン−０．５％
塩化ナトリウム）に加えて３７℃でＯＤ５５０が０．４
となるまでインキュベーションする。次にＢｒｉｊ３５
（界面活性剤）を１／１００量とトリチウム標識オレイ
ン酸５ｍＣｉを加え，さらに３７℃で５時間インキュベ
ーションを続けた後，１２０℃２０分間オートクレイブ
処理し，一夜４℃に放置する。その後，菌体を０．１％
牛血清アルブミンと１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．
７Ｍトリス塩酸緩衝液でよく洗浄した後，０．２％アジ
化ナトリウムと１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．７Ｍ
トリス塩酸緩衝液に懸濁し，使用時まで４℃で保存する
。この方法で測定した本発明化合物のホスホリパーゼＡ
２阻害活性のＩＣ５０値を表４に示す。

【００４０】マウス耳浮腫の抑制作用の測定雄性ＩＣＲ
マウス（体重３０−３５ｇ）の両耳に供試サンプルを塗
布し，その３０分後に右耳のみに，フォルボール１２−
ミリステイト−１３−アセテイト（ＴＰＡ）１μｇ／ｅ
ａｒを塗布する。４時間後にそれぞれの耳を切り取り，
その重量を測定する。結果を表４に示す。

【００４１】

【表４】

【００４２】この結果，本発明の化合物は，ホスホリパ
ーゼＡ２阻害作用を有し，抗炎症剤等として有用に利用
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　Ｑ−６４０２−Ａ化合物の赤外線吸収スペ
クトル。

【図２】　　Ｑ−６４０２−Ａ化合物の紫外線吸収スペ
クトル。

【図３】　　Ｑ−６４０２−Ａ化合物の１Ｈ−ＮＭＲ。

【図４】　　Ｑ−６４０２−Ａ化合物の１３Ｃ−ＮＭＲ
。

【図５】　　Ｑ−６４０２−Ｂ化合物の赤外線吸収スペ
クトル。

【図６】　　Ｑ−６４０２−Ｂ化合物の紫外線吸収スペ
クトル。

【図７】　　Ｑ−６４０２−Ｂ化合物の１Ｈ−ＮＭＲ。

【図８】　　Ｑ−６４０２−Ｂ化合物の１３Ｃ−ＮＭＲ
。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記の平面化学構造式化１で表わされ
   るＱ−６４０２化合物 【化１】 （式中，Ｒは式−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ３）２または
   式−（ＣＨ２）４ＣＨ（ＣＨ３）２で示される基を表わ
   す。）
2. 【請求項２】ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
   ｃｅｓ）に属するＱ−６４０２化合物生産菌を培養し，
   培養液中にＱ−６４０２化合物を蓄積させ，培養液から
   該化合物を採取することを特徴とするＱ−６４０２化合
   物の製造法。
3. 【請求項３】ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
   ｃｅｓ）に属する菌株が，ストレプトミセス　　エス　
   　ピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｓｐ．）Ｑ−６
   ４０２（微工研菌寄第１１９３９号）である請求項２記
   載のＱ−６４０２化合物の製造法。