JPH03157372A

JPH03157372A - Ｙｌ―０１８６９ｐ物質及びその製造法

Info

Publication number: JPH03157372A
Application number: JP29466889A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Sato; 勉佐藤; Mitsuji Shibazaki; 充至柴崎; Mikio Morioka; 幹夫森岡; Kenichi Suzuki; 賢一鈴木; Yukihiro Takebayashi; 竹林　幸弘
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-11-13
Filing date: 1989-11-13
Publication date: 1991-07-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、　ＹＬ−０１８６９Ｐ物質及び該物質の製造
法に関する。ＹＬ−０１８６９Ｐ物質は新規化合物であ
り、抗菌作用及びコラゲナーゼ阻害作用を有し、抗菌剤
、抗腫瘍剤等の分野で利用できる。

（発明の解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段）本発明者らは、天然に存在する多数の微生物の産生ずる
物質について研究を行っていたところ、ストレプトミセ
ス属に属する一菌株が培地中にＹＬ−０１８６９Ｐ物質
を生産することを見出した。そして、該物質な単離同定
したところ、これは新規化合物であって、抗菌作用を有
することを見出し本発明を完成するに至った。

即ち９本発明は次の平面構造式（１）　　示されるＹＬ
−０１８６９Ｐ物質及び該物質の製造法に関する。

ＨＩＣＨ。

ＣＨ。

ＹＬ−０１８６９Ｐ物質の理化学的性状を示すと以下の
とおりでちる。

（１）分子式　Ｃ２１Ｈ！８Ｎ４　ｏｓ（２）分子量　
４２６（３）元素分析値（Ｃｔ＋　ＨおＮ４０５・０．３　Ｈ
，Ｏとして）Ｃ（％ｌｌ四　Ｎ（％）　　０（％）理論値　５８．４３　８．８４　１２．４４　２０．２
９実測値　５８．３９　９．０１　１２．９７　１９．
６３（４）融点５１．６°Ｃ〜５３，８℃ （５）紫外線吸収スペクトル（メタノール溶液）第一図（６）赤外゛線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤）第二図（７）　　’Ｈ−核磁気共鳴スベクトル（ジメチルエー
テル−クロロホルム溶液）第三図（３）　　１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（ジメチルエ
ーテル−クロロホルム溶液）第四図（９）　　マススペクトル（Ｆａｂ、　Ｐｏｓ　）（１
０）０υ （ＩｚＵ■ （１４）９（１ｅ αで第五図マススペクトル（ＨＲ−Ｆａｂ、　Ｎｅｇ　）Ｍ−Ｈｍ
／ｚ　４２５．２７４４比旋光度［α］ｏ＝　−２２，８（Ｃ＝１．メタノール）外　　
観淡黄色粉末溶解性メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルムに
可溶。水、ｎ−ヘキサンには不溶塩基性、中性、酸性の
区別弱酸性の挙動を示す。

呈色反応陽性；リンモリブデン酸−硫酸、硫酸、塩化第二鉄。

ニンヒドリン薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４　（
メルク社））Ｒｆ値０．１３（展開溶媒；クロロホルム
：メタノール＝９　：　１　）ｏ、ｉ　ｓ　ｃ展開溶媒
；酢酸エチル：メタノール＝４　：　１　）高速液体ク
ロマトグラフィーカラム；　５ＴＲ−ＯＢＳ　−Ｈ４，６９６Ｘ　１５０
　ｍｍ検出；２１０ｎｍ流　速；０．５ｒｏｔ／分９．８分（展開溶媒；メタノール：０．００５Ｍリン酸
。

緩衝液（ＰＨ３，８５）＝７０　：３０）ＹＬ−０１８
６９Ｐ物質は、ストレプトミセス属に属するＹＬ−０１
８６９Ｐ物質生産菌を培養し、培養液中に。

ＹＬ−０１８６９Ｐ物質を生産蓄積させ、培養液から該
物質を採取することにより製造できる。

ストレプトミセス属に属するＹＬ−０１８６９Ｐ　物質
生産菌としては２本発明者等が沖縄県支那国島の土壌よ
り分離したストレプトミセス　ニス・ビー（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　）　ＹＬ　　０１８６９　Ｐ
株（微工研菌寄第１１．０９１号）を挙げることができ
る。このＹＬ−０１８６９Ｐ株の菌学的性質を説明する
。

形態本菌株は各種合成及び有機培地においてよく生育し、生
育の色調は黄味法、オリーブからにぶ緑を呈す。気菌糸
は、スターチ・無機塩寒天培地、イースト・麦芽寒天培
地及びシュクロース・硝酸塩寒天培地上に良く形成され
るが、その他の培地上にはあまり作られない。気菌糸の
色調はグレイシリーズ、形状は単純分枝でゆるやかに湾
曲し、先端部がかぎ状からコイル状を示す。

電子顕微鏡観察によると、胞子はｌＯ〜５０個程度の連
鎖を認め、胞子表面は平滑で、大きさは１．０〜１．３
　Ｘ　Ｏ，６、〜０．８μｍである。

胞子嚢、菌核２輪生糸などの特殊な器官は観察されない
。

（２）各種寒天培地上の性状各種寒天培地上の性状は、以下に示すとおりである。特
に記載しないかぎり、２７℃で２１日間培養し、常法に
従って観察したものである。

色調の記載については色の標準（日本色彩研究所）によ
った。

（１）（３）生理的性質（注）Ｇ；生育程度Ｒ；裏面の色相Ａ；気菌糸の着生及びその色相Ｓ；可溶性色素（旦生育温度は各温度（５，１０，１５，２０，２４，２７
，３０，３３゜３７、４０．４５．５０℃）で、７〜２
１日までの観察結果。

ミルクに対する作用は３７℃で３〜２１日までの観察結
果、それ以外は、特に指摘のない限り２７℃で２週間後
の観察結果を示す。

（４）炭素源の資化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地、２７℃培養）（田土；生育する　士；生育が疑わしい　−；生育しな
い（５）　ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の分析ＬＥＣ
ＨＶＡＬＩＥＲらの方法（ＬＥＣＨＶＡＬＩＥＲ，ＭＰ
、　ｅｔ　ａｌ　；ＰＰ２７７−２３８　ｉｎ　ＤＩＥ
ＴＺ、　Ａ　ｅｔ　ａｌ　ｅｄ、＋　Ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅＴａｘｏｎｏｍｙ、　ＳＩＭ　５ｐｅｃｉａｌ
　ｐｕｂｌｉｃａｔｔｏｎ　Ｎｏ、　６＋　１９８０　
）に従い２本菌株の酸加水分解の分析を行った結果。

ＬＬ−ジアミノピメリン酸及びグリシンが検出された。

以上の性状を要約すると、　ＹＬ−０１８６９Ｐ株は気
菌糸が単純分枝でゆるやかに湾曲し、先端部がかぎ状か
らコイル状となる。電子顕微鏡下で５０個程度の胞子の
連鎖が観察され、胞子の表面は平滑である。色相は生育
が黄味灰〜オリーブ〜にぶ緑、気菌糸が灰色を呈し、可
溶性色素、メラニン様色素の生成は認められない。また
菌体の酸加水分解物の分析よりＬＬ−ジアミノピメリン
酸とグリシン酸が検出された。

上記諸性質より２本菌株はストレプトミセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅａ　）属に属する菌株と考えられ２本菌
株に類似する既知菌種を、［バーシーズ・マニュアルー
オブ・デタミネティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅ
ｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔａｒｎｉｎａｔ
ｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｔｏｌｏｇｙ　）第８版。

１９７４年」、「インターナショナルφジャーナル・オ
プーシスマティック拳バクテリオロジ−（工ｎｔｅｒ　
−ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第１８巻
、２号、　　６９−１８９頁、４号、　　２７９−３９
２頁（１９６８）。

第１９巻、４号、　３９１−５１２頁（１９６９）、　
第２２巻。

４号、　　２６５−３９４頁（１９７２）　ｊより検索
した。

その結果、気菌糸及び生育の色相、胞子の表面構造、炭
素源の資化性の各性状が本菌株と一致する種は認められ
なかったが９本菌株をストレプトミセス属の新種と判断
する為にはさらに詳細な研究が必要と思われる。そこで
本菌株をとりあえずストレプトミセス　ニス−ビー（５
ｔｒｅ　ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　）ＹＬ−０１８６９
Ｐ株と命名した。本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１１０９１号として寄託されてい
る。

なお、微生物は人工的罠、また自然に変異を起しやすい
が２本発明のスプレブトミセス　ニス・ビーＹＬ−０１
８６９Ｐ株は天然から分離された放線菌のほかにこれを
紫外線、Ｘ線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの
及びそれらの自然変異株についても、包含されるもので
ある。

ＹＬ−０１８６９Ｐ物質の生産はストレプトミセスニス
・ビーＹＬ−０１８６９Ｐ株を培地に培養し、培養物よ
り採取することにより行なわれる。培養方法は一般微生
物の培養方法に準じて行なわれるが。

通常は液体培地により深部培養法が有利である。

培養に用いられる培地としては、ストレプトミセス　ニ
ス・ビーＹＬ−０１８６９Ｐ株が利用する栄養源を含有
する培地であればよい。

すなわち１合成培地、半合成培地あるいは天然培地が用
いられ、培地の組成は１例えば炭素源としてはグルコー
ス、マンノース、イノシトール。

デンプン、植物油等が、窒素源としては肉エキス。

ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉
、魚粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母。

酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿
素その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金
属塩としてＮａ、　Ｋ、　Ｍｇ、　Ｃｎ、　Ｚｎ、　Ｆ
Ｂなどの硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩、燐酸塩など
が必要に応じて添加される。

また、必要に応じてメチオニン、システィン。

シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、
シリコン油、界面活性剤などの抗生物質生成促進物質又
は消泡剤を添加することもできる。

培養条件としては好気的条件下に培養するのが一般的に
有利で、培養温度は約１５〜３７℃の範囲が望ましく、
好ましく約２５〜２７°Ｃ附近で行われる。

培地のｐＨは約５〜１０．好ましくは約６〜８の範囲に
保存すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、
温度条件に応じて適宜設定される。

尚、　ＹＬ−０１８６９Ｐ物質を高濃度に蓄積させる為
には、コーンスターチ、コプラミール、ファーマメデア
、炭酸カルシウムから成る培地により一時種培養を行う
と好結果を与える。

培養物より目的とするＹＬ−０１８６９Ｐ・物質な単離
採取するには通常の微生物の培養物より抗生物質を単離
する方法が適用される。目的物は主に培養液中に含有さ
れるので、遠心分離又はｆ過により菌体を除去した後、
濾過液から有効物質の抽出を行う。すなわち、適当な溶
剤に対する溶解性及び溶解度の差２種々の吸着剤に対す
る吸着親和性の差、２種の液相間における分配の差など
を利用する一般の抗生物質の製造に用いられる手段によ
って９分離、採取、精製される。これらの方法は必要に
応じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合わせ
、また反覆し適用できる。

（発明の効果）ＹＬ−０１８６９Ｐ物質は、各種細菌に対し抗菌作用を
示すとともに、コラゲナーゼ阻害作用をも有しているた
め、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗すューマチ剤、抗炎症剤、骨
粗靭剤、降圧剤等として有用である。

（１）　　抗菌作用各種細菌に対するＹＬ−０１８６９Ｐ物質の最少発育阻
止濃度（ＭＩＣ）を下表に示す。

（２）　　コラゲナーゼ阻害作用Ｍ、　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ　１０　ｆｆ１ｇ　／　ｍｌ
　（流動）（ラフイア）をＬ　ｅｗｉ　ｓラットの尾根
部に０．１　ｍｌ投与し、３〜４週間後のＡｄｊｕｖａ
ｎｔ関節炎発症ラットの膝関節より膝蓋骨を含む骨膜組
織を採取する。これを０．２％ラクトアルブミン−ＭＥ
Ｍ培地で２日間培養する。この培養上清中コラゲナーゼ
に対する阻害活性を水弁らの方法［炎症４（２）。

１２３　（１９８４）参照］に基づき蛍光標識コラーゲ
ンを用いて測定した。

培養上清中コラゲナーゼをトリプシンで活性化し、一方
１次にトリプシンは過剰の大豆トリプシン抑制剤で不活
性化する。次に阻害剤を加えてから基質コラーゲンを加
え３６℃で反応させる。２〜数時間後ＥＤＴＡで反応を
停止し、コラーゲン分解産物のみを７０％エタノールで
抽出する。これを遠心処理し、抽出された分解物の蛍光
強度を５２０ｍｍ（Ｅｍ）／４９５ｍｍ（Ｅｘ）で測定
する。

コラゲナーゼ阻害剤の活性は既知量の酵素を５０％まで
阻害する化合物の量（ＩＣ５０）として表わした。

ＩＣ５００，９μＭ（実施例）以下に、実施例を掲記し本発明を更に詳細に説明する。

実施例１グルコース１．０％、ポテトスターチ２．０％。

ポリペプトン０，５％、酵母エキス０．５％、炭酸カル
シウム０．４％を含む培地Ａ　（ｐＨ７，０）を作製し
、　　５００ｍ１三角フラスコに１００ｍｔずつ分注し
、’１２０℃で２０分間滅菌する。これにベネット寒天
培地上に生育させたエスピーＹＬ−０１８６９Ｐ株の菌
糸をかき取って接種し、２８°Ｃで４８時間振盪培養を
行い種培養を行い種培養液とする。つぎに、コーンスタ
ーチ３％、コプラミール１％、ファーマメデア１．２％
、炭酸カルシウム０．１５％よりなる培地Ｂ　　３５Ｚ
（ｐＨ７，０）を作製し、これを５００　ｍｌ三角フラ
スコ１ｏｏＩＴＩｌずつ分注し、１２０℃で２０分間滅
菌する。これに種培養液を２．０％の割合で植菌し、毎
分２００回転のロータリーシェイカーで２８°Ｃ１４０
時間振盪培養を続けるとバチルス　ズプチルスＡＴＣＣ
６６３３株に対して抗菌活性は最大となる。

培養終了後すべてのフラスコ内容液を合わせて塩酸でｐ
Ｈ４，５に調整した後、ラジオライト＃６００　（昭和
化学工業型）を加えて攪拌の後ろ過すると、ろ液３０１
が得られる。このろ液をダイアイオン５Ｐ９００　（三
菱化成製）３１に吸着させる。５ｔの水で水洗の後、１
２ｔの５０％アセトン水で溶出する。この液を減圧濃縮
し１ｔにする。次にＤＥＡＥセファデックスＡ−２５（
ＣＩ型）ＩＺを通過させる。通過液のｐＨな４に調整し
た後、酢酸エチル２１にて抽出を行う。抽出は２回行う
。硫酸ナトリウムを加えて脱水を行う。この液を減圧濃
縮し、沈澱物は遠心にて除く。乾固物を少量のメタノー
ルに溶解させ、　　ＨＰＬＣにて分取する。カラム：カ
プセルバックＣ１８１！Ｍｌ　ｘ　２５０ｍｍ、検出：
２１０ｎｍ、流速：１０＋ｎｉ：／分、展開溶媒ニア０
％メタノールにて１１分のピークを分取する。この液を
減圧濃縮してメタノールを除いた後、ｐＨを４に調整し
酢酸エチルにて抽出を行う。硫酸ナトリウムを加えて脱
水した後、減圧濃縮するとＹＬ−０１８６９Ｐ物質が２
６８■得られる。

実施例２グルコース１．０％、ポテトスタート２．０％。

ポリペプトン０５％、酵母エキス０．５％、炭酸カルシ
ウム０，４％を含む培地Ａ（ｐＨ７，０）　　を作製し
、　　５ＱＯｍｔ三角フラスコに１００　ｍｌずつ分注
し、１２０℃で２０分間滅菌する。これにベネット寒天
培地上に生育させたエスピーＹＬ−０１８６９Ｐ株の菌
糸をかき取って接種し、２８℃で４８時間振盪培養を行
い種培養液（１）とする。さらに。

培地Ａ４００ｒｎｌを作製し、　　５００ｍ１三角フラ
スコにｆｏＯｍｔずつ分注し、１２０°Ｃで２０分間滅
菌する。これに種培養液（１）を２％接種し、２８°Ｃ
で４８時間振盪培養を行い種培養液（２）とする。

つぎに、消泡剤ＮＫＬ−５４３０（日本油脂）００３％
を加えた培地Ｂ　２０１を作製し、３０を容培養槽中に
いれ、１２０℃で３０分滅菌したものに種培養液（２）
を４００　ｍｌ接種し１通気量２０１／’！、攪拌速度
２００　ｒｐｍで２８℃、４０時間通気攪拌培養を行う
と、バチルス　ズブチルスＡＴＣＣ６６３３株に対して
抗菌活性は最大となる。このようにして得られた培養液
を塩酸でｐＨ４，０に調整した後、ラジオライ）＃６０
０（昭和化学工業型）を加えて攪拌し、ろ過するどろ液
１ｓｔが得られる。このろ液をダイアイオン５Ｐ９００
（三菱化成製）１ｔに吸着させる。２ｔの水で水洗の後
、４ｔの５０％アセトン水で溶出する。この液を減圧濃
縮し１ｔにする。次に。

ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５ＣＣ１型）４００ｍｔ
を通過させる。通過液のｐＨな４に調整した後。

酢酸エチルＩＬにて抽出を行う。抽出は２回行う。硫酸
す）　ＩＪウムを加えて、脱水を行う。

この液を減圧濃縮し、沈澱物は遠心にて除く。

乾固物を少量のメタノールに溶解させ。

ＨＰＬＣにて分取する。カラム：マイクロボンダスフェ
アＣ１８１９０Ｘ１５０ｍｍ、検出：２１０口ｍ、流速
：１２ｍ７７分、展開溶媒：メタノール６２．５ｍｌ、
水３７．５ｒｎｌ、酢酸０．０１ｍ１にて１６分のピー
クを分取する。この液を減圧濃縮してメタノールを除い
た後、酢酸エチルにて抽出を行う。硫酸ナトリウムを加
えて脱水した後、減圧濃縮するとＹＬ−０１８６９Ｐ物
質が７４ｍｇ得られる。

実施例１および２で得られたＹＬ−０１８６９Ｐ物質の
理化学的性状は前記の通りであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＹＬ−０１８６９Ｐ物質の紫外線吸収スペクト
ルを示す。第２図はＹＬ−０１８６９Ｐ物質の赤外線吸収スペクト
ルを示す。第３図はＹＬ−０１８６９Ｐ物質の１Ｈ−核磁気共鳴ス
ペクトルを示す。第４図はＹＬ−０１８６９Ｐ物質の１３Ｃ＝核磁気共鳴
スペクトルを示す。第５図はＹＬ−０１８６９Ｐ物質のＦａｂ−マススペク
トルを示す。第１図００８０６０４０液長（ｎｍｌ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記式で示されるＹＬ−０１８６９Ｐ物質▲数式
、化学式、表等があります▼
（２）ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）に属するＹＬ−０１８６９Ｐ物質生産菌を培養し、培
養液中にＹＬ−０１８６９Ｐ物質を蓄積させ、この培養
液から該化合物を採取することを特徴とする下記式で示
されるＹＬ−０１８６９Ｐ物質の製造法▲数式、化学式
、表等があります▼
（３）ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）に属する菌株がストレプトミセス　エス・ピー（Ｓｔ
ｒ−ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＹＬ−０１８６９Ｐ
株（微工研菌寄第１１０９１号）である請求項（２）記
載のＹＬ−０１８６９Ｐ物質の製造法。