JP2786219B2 - Ｙ―０９１９４ｌ―ｂ物質および該物質の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，医薬として有用な化合物であるＹ−09194L
−Ｂ物質および発酵法による該物質の製造法に関する。

（発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段） 本発明のＹ−09194L−Ｂ物質は，つぎの化学構造式並
びに理化学的性状によって特定される化合物である。

化学構造式 理化学的性状： （１）元素分析値（C₂₄H₃₄N₄O₅・2HCl・3.8H₂Oとして） C H N Cl 計算値（％） 48.05 7.33 9.34 11.82 実測値（％） 48.01 6.87 9.40 11.43 （２）融点 明確な融点は示さず,190℃付近から徐々に褐変する。

（３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中） 第１図 （４）赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠） 第２図 （５）¹H−核磁気共鳴スペクトル（メタノール中） 第３図 （６）¹³C−核磁気共鳴スペクトル（メタノール中） 第４図 （７）質量分析（FAB−MS） 第５図 （８）HR−FAB MS Ｍ＋H m/z 459.26711 C₂₄H₃₅N₄O₅ （９）比旋光度 ［α］Ｄ＝−62（Ｃ＝1,メタノール） （10）外観 淡黄色粉末 （11）溶解性 水，メタノール，エタノールに可溶。

アセトン，酢酸エチル，クロロホルム,n−ヘキサンに
は不溶。

（12）塩基性，中性，酸性の区別 塩基性の挙動を示す。

（13）呈色反応 陽性：ユニバーサル，硫酸、ニンヒドリン （14）薄色クロマトグラフィー シリカゲル60F254（メルク社） Rf＝0.29（クロロホルム：メタノール：アンモニア水
＝15:15:0.1） Rf＝０（ｎ−プロパノール：水＝4:1） （15）高速液体クロマトグラフィー（HPLC） 保持時間 6.1分 カラム YMC−ODS 4.6φ×250mm 検出 210nm 流速 1ml/分 展開溶媒 0.1M硫酸ナトリウム 100ml 酢酸 0.05ml １−ペンタンスルホン酸ナトリウム 0.02g アセトニトリル 3.1ml （発明の効果） Ｙ−09194L−Ｂ物質は，各種細菌に対して抗菌作用を
示すと共に，各種腫瘍細胞に対し，細胞障害作用を有し
ている。

（１）抗菌作用 Ｙ−09194L−Ｂ物質の抗菌活性を次表に示す。

（２）腫瘍細胞を用いる試験管内細胞障害作用試験方
法： １×10⁵cells/mlに調整したL1210^※，P388^※※の各細
胞液1mlに，生理食塩水で溶解した各濃度のＹ−09194L
−Ｂ化合物４μｌを加え,37℃炭酸ガス培養器中で３日
間培養した後，トリパンブルー染色法により生残細胞を
計数した。細胞障害活性は，薬剤無添加の細胞数を対照
として各濃度での細胞増殖抑制率を算出し，グラフ上に
プロットして求めた。

使用したmedium: ※RPMI−1640＋10％新生子牛血清 ※※RPMI−1640＋５％牛胎児血清 ＋５μM2−ヒドロキシエチル ジスフィド （３）P388を用いた動物での抗腫瘍活性試験方法： P388腫瘍細胞５×10⁵セルをBDF1/SLC5週令オスマウス
に腹腔内接種し，接種翌日よりＹ−09194L−Ｂを腹腔内
投与で７日間連投した。効果は対照群の中間生存日数に
対する,Y−09194L−Ｂ投与群の中間生存日数の比より延
命率を算出して求めた。

（製造法） つぎに，本発明物質の製造法について説明する。

Ｙ−09194L−Ｂ物質は，ノカルジオプシス属に属する
この物質の生産菌を培養し，培養液中にＹ−09194L−Ｂ
物質を蓄積させ，ついで培養液からこの物質を採取する
ことによって製造することができる。本発明で使用する
ノカルジオプシス属に属する微生物の一例としては，小
笠原諸島，父島で採取した土壌から分離されたノカルジ
オプシス エスピー（Nocardiopsis sp.）Ｙ−09194L
（微工研菌寄第10461号）を挙げることができる。以下,
Y−09194L株の菌学的性質を説明する。

1.形態 各種有機及び無機培地で基生菌糸は良く発達し，菌糸
の幅はほぼ0.4μｍであり，そのいずれの培地において
も，気菌糸を良く着生する。気菌糸は，長い直線状また
は曲線状で，単純分岐し，培養早期にジグザグな形状が
観察される。成熟した気菌糸は分断するとともに,20個
以上の長い胞子連鎖を形成する。電子顕微鏡による観察
では，胞子の形状は円筒形，大きさは0.8〜1.2μｍ×0.
4〜0.5μｍで，その表面は平滑である。胞子のう，菌
核，菌束糸等の特殊な器官は観察されない。

2.各種寒天培地上の性状 各種寒天培地上の性状は，以下に示すとおりである。
特に記載しないかぎり,28℃で21日間培養し，常法に従
って観察したものである。色調の記載については色の標
準（日本色彩研究所）によった。

5.菌体成分の化学分析 LECHVALIERらの方法（LECHVALIER,MP.et al;PP277−2
38 IN DIETZ,A et al ed.,Actinomycete Taxonomy,SIM
Special publication No.6,1980）に従い本菌株酸加水
分解の分析を行った結果,meso−ジアミノピメリン酸が
検出された。また，細胞壁成分としてmeso−ジアミノピ
メリン酸，ガラクトース，ラムノース，グルコースが検
出された（細胞壁タイプIII−Ｃ）。主たるメナキノン
は,MK9（H4）であった。

上記諸性状を要約すると,Y−09194L株は気菌糸上に長
い胞子の連鎖を作り，培養の初期に気菌糸がジグザグな
形状を呈し，後期になると基生菌糸に断裂が生じる。細
胞壁タイプはIII−Ｃで，主メナキノンはMK−９（4H）
である。

以上の性質を有する菌種を各種の文献等により検索す
ると，本菌株はノカルジオプシス（Nocardiopsis）に属
する一菌株であること認められる。そこで本菌株をノカ
ルジオプシス エスピー（Nocardiopsis sp.）Ｙ−0919
4Lと命名した。

本菌株は，工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第10461号として寄託されている。なお，微生物は
人工的に，また自然に変異を起しやすいが，本発明のノ
カルジオプシス エスピーＹ−09194L株には天然から分
離された放線菌のほかにこれを紫外線,X線，化学薬剤な
どで人工的に変異させたもの及びそれらの自然変異株
も，包含されるものである。

Ｙ−09194L−Ｂ物質の生産はノカルジオプシス エス
ピーＹ−09194L株を培地に培養し，培養物より採取する
ことにより行なわれる。培養方法は一般微生物の培養方
法に準じて行なわれるが，通常は液体培地により深部培
養法が有利である。培養に用いられる培地としては，ノ
カルジオプシス エスピーＹ−09194L株が利用する栄養
源を含有する培地であればよい。

すなわち，合成培地，半合成培地あるいは天然培地が
用いられ，培地の組成は例えば炭素源としてはグルコー
ス，アラビノース，フラクトース，デンプン，植物油等
が，窒素源としては肉エキス，ペプトン，グルテンミー
ル，綿実粕，大豆粉，落花生粉，魚粉，コーンスチーブ
リカー，乾燥酵母，酵母エキス，硫酸アンモニウム，硝
酸アンモニウム，尿素その他の有機，無機の窒素源が用
いられる。また，金属塩としてNa,K,Mg,Ca,Zn,Feなどの
硫酸塩，硝酸塩，塩化物，炭酸塩，燐酸塩などが必要に
応じて添加される。

また，必要に応じてメチオニン，システイン，シスチ
ン，チオ硫酸塩，オレイン酸メチル、ラード油，シリコ
ン油，界面活性剤などの抗生物質生成促進物質又は消泡
剤を添加することもできる。

培養条件としては好気的条件下に培養するのが一般的
に有利で，培養温度は約25〜37℃の範囲が望ましく，好
ましく約30℃附近で行なわれる。培地のpHは約５−10,
好ましくは約６〜８の範囲に保存すると好結果が得られ
る。培養期間は培地の組成，温度条件に応じて適宜設定
される。

培養物より目的とするＹ−09194L−Ｂ物質を単離採取
するには通常の微生物の培養物より抗生物質を単離する
方法が適用される。目的物は主に培養液中に含有される
ので，遠心分離又は過により菌体を除去した後，過
液から有効物質の抽出を行なう。すなわち，適当な溶剤
に対する溶解性及び溶解度の差，溶液からの析出性及び
析出速度の差，種々の吸着剤に対する吸着親和性の差,2
種の液相間における分配の差などを利用する一般の抗生
物質の製造に用いられる手段によって、分離，採取，精
製される。これらの方法は必要に応じて単独に用いら
れ，あるいは任意の順序に組合せ，また反覆し適用でき
る。

（実施例） 以上，本発明の製造法を説明したが，以下に実施例に
よりさらに説明する。

実施例1. グルコース0.5％，白色デキストリン2.0％，ポリペプ
トン0.5％，酵母エキス0.5％，ブレインハートインフュ
ージョン0.52％，コーンスチープリカー0.5％，肉エキ
ス0.3％，炭酸カルシウム0.2％，を含む培地Ａ（PH8.
0）を作成し，これを500ml三角フラスコに60mlずつ分注
し120℃で20分間滅菌したものに，ベネット寒天培地上
に生育させたノカルジオプシス エスピーＹ−09194L株
の菌糸をかき取って接種し,27℃で48時間振盪培養を行
ない種培養液とする。つぎに培地A3Lを作製し，これを5
00ml三角フラスコに60mlずつ分注し,120℃で20分間滅菌
したものに種培養液を3.0％の割合で植菌した。27℃で4
8時間振盪培養を行ない種培養液（２）とする。本培養
はフルクトース1.0％，エスサンミート0.5％，ラブレム
コパウダー0.2％を加えた培地B25L（pH7.0）を作製し，
これを500ml三角フラスコ60mlずつ分注し120℃で20分間
滅菌したものに種培養液（２）を3.0％の割合で植菌し
毎分200回転のロータリーシェイカーで27℃,3日間振盪
培養を続けるとバチルス ズブチルスATCC6633株に対し
て抗菌活性は最大となる。培養終了後すべてのフラスコ
内容液を合わせて塩酸でpH2.5に調整した後，ラジオラ
イト＃600（昭和化学工業製）を加えて攪拌の後過す
ると，液23Lが得られる。この液に水酸化ナトリウ
ムを加えてpH6.5に調整した後,CMセファデックスＡ−25
（Na型）に吸着させる。2Lの水で水洗の後,3Lの５％食
塩水で溶出する。次に300mlのダイアイオンHP−20（三
菱化製）に吸着させ700mlの水で水洗した後,40％メタノ
ールで溶出する。この液を減圧濃縮しメタノールをとば
した後，ダウエックス１（C1型）を通過させる。さらに
CMセファデックスＡ−25（Na型）に吸着させ,0−５％食
塩水の濃度勾配による溶出を行なう。バチルス スブチ
リスATCC6633株に対して活性を示す区分を集め，ダイア
イオンCHP−20（三菱化成製）に吸着させる。０−40％
メタノールの濃度勾配による溶出を行なう。バチルス
スブチリスATCC6633株に対して活性を示す区分を集め，
減圧濃縮する。この液をHPLCにて分取する。カラム:YMC
−ODS20φ×250mm,検出210mm,流速11ml/分、展開溶媒;
0.1M硫酸ナトリウム100ml,酢酸0.05ml,1−ペンタンスル
ホン酸ナトリウム0.02g,アセトニトリル3.1mlにて運転
し９分のピークを分取する。この液を減圧濃縮した後凍
結乾燥する。得られた粉末をメタノールにて抽出する。
メタノール液を減圧乾固した後、水を加えて水溶液とす
る。これをダウエックス１（C1型）に通し塩酸塩とす
る。減圧濃縮した後凍結乾燥すると,Y−09194L−Ｂ物質
の塩酸塩が90mg得られる。

実施例2. グルコース0.5％，白色デキストリン2.0％，ポリペプ
トン0.5％，酵母エキス0.5％，ブレインハートインフュ
ージョン0.52％，コーンスチープリカー0.5％，肉エキ
ス0.3％，炭酸カルシウム0.2％を含む培地Ａ（PH8.0）
を作製し，これを500ml三角フラスコに60mlずつ分注し1
20℃で20分間滅菌したものに，ベネット寒天培地上に生
育させたノカルジオプシス エスピーＹ−09194L株の菌
糸をかき取って接種し,27℃で48時間振盪培養を行ない
種培養液とする。つぎに培養地A31を作製し，これを500
ml三角フラスコに60mlずつ分注し,120℃で20分間滅菌し
たものに種培養液を3.0％の割合で植菌した。27℃で48
時間振盪培養を行ない種培養液（２）とする。つぎに消
泡剤NKL−5430（日本油脂）0.03％を加えた培地A20Lを
作製し,30L容培養槽中に入れ120℃で30分滅菌したもの
に種培養液（２）を600ml接種し，通気量30L/分，攪拌
速度200rpmで27℃,3日間通気攪拌培養を行ない種培養液
（３）とする。本培養は種培養（３）6.6Lを予め120℃,
30分間滅菌した300L培養槽中の，フルクトース2.0％，
エスサンミート1.0％，ラブレムコパウダー0.2％，消泡
剤NKL−5430（日本油脂）0.03％を含む生産培地220L（p
H7.0）に接種し，通気量150L/分，回転数70rpmで３日間
培養すると，バチル ズブチルス ATCC6633株に対して
抗菌活性は最大となる。このようにして得られた培養液
を塩酸でpH2.5に調整した後，ラジオライト＃600（昭和
化学工業製）を加えて攪拌の後過すると，液220Lが
得られる。この液に水酸化ナトリウムを加えてpH6.5
に調整した後,CMセファデックスＡ−25（Na型）5Lに吸
着させる。10Lの水で水洗の後,15Lの５％食塩水で溶出
する。次に2LのダイアイオンHP−20（三菱化成製）に吸
着させ、4Lの水で水洗した後,40％メタノールで溶出す
る。この液を減圧濃縮しメタノールをとばした後，ダウ
エックス１（C1型）3Lを通過させる。さらにCMセファデ
ックスＡ−25（Na型）900mlに吸着させ,0−５％食塩水
の濃度勾配による溶出を行なう。HPLCにてＹ−09194L−
Ｂ物質を検出し，その区分を集める（カラム:YMC−ODS
4.6φ×250mm,検出210nm,流速11ml/分、展開溶媒;0.1M
硫酸ナトリウム100ml,酢酸0.05ml,1−ペンタンスルホン
酸ナトリウム0.02g,アセトニトリル3.1ml,保持時間6.1
分）。これらの区分をダイアイオンCHP−20（三菱化成
製）に吸着させる。０−20％メタノールの濃度勾配によ
る溶出を行なう。HPLCにてＹ−09194L−Ｂ物質を検出
し，その区分を集める。減圧濃縮しメタノールをとばし
た後，ダウエックス１（C1型）に通し，塩酸塩とする。
減圧濃縮後，凍結乾燥を行なうとＹ−09194L−Ｂ物質の
塩酸塩が3g得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は,Y−09194L−Ｂ物質の紫外部吸収スペクトルを
示す。 第２図は,Y−09194L−Ｂ物質の赤外部吸収スペクトルを
示す。 第３図は,Y−09194L−Ｂ物質の¹H−核磁気共鳴スペクト
ルを示す。 第４図は,Y−09194L−Ｂ物質の¹³C−核磁気共鳴スペク
トルを示す。 第５図は,Y−19194L−Ｂ物質の質量分析スペクトルを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:01） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 C12N 1/20 C07D 498/22 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記平面化学構造式で表わされるＹ−0919
   4L−Ｂ物質又はその酸付加塩。
2. 【請求項２】ノカルジオプシス属に属する請求項１記載
   のＹ−09194L−Ｂ物質を生産する能力を有する菌を培養
   し、培養液中にＹ−09194L−Ｂ物質を蓄積させ、ついで
   培養液からこの物質を採取することを特徴とするＹ−09
   194L−Ｂ物質の製造法。
3. 【請求項３】ノカルジオプシス属に属する菌株が、ノカ
   ルジオプシス エスピー Ｙ−09194L（微工研菌寄第10
   461号）である請求項２記載の製造法。