JPH02218684A - Ｙ―０９１９４ｌ―ｂ物質および該物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、医薬として有用な化合物であるＹ−０９１９
４Ｌ−Ｂ物質および発酵法忙よる該物質の製造法に関す
る。

（発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段） 本発明のＹ　−０９１９４Ｌ−Ｂ物質は、っぎの化学構
造式並びに理化学的性状によって特定される化合物であ
る。

化学構造式 理化学的性状： （１）元素分析値（ＣｕＨｓ＊Ｎ４０ｓ・２ＨＣ１・３
．８　Ｈ，Ｏとして）ＣＨＮ　　　Ｃ１ 計算値（％）　４８．０５　７．３３　９．３４　１１
．８２実測値（％’）　４８．０１　６．８７　９．４
０　１１．４３（２）融点 明確な融点は示さず、１９０℃付近から徐々に褐変する
・ （３）紫外部吸収スペクトル（メタノール中）第１図 （４）　　光外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠）第
２図 ＜５）　　’Ｈ−核磁気共鳴スベクトル（メタノール中
）第３図 （６）　　”Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（メタノール中
）第４図 （力　質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ） 第５図 （８）　　ＨＲ−ＦＡＢ　ＭＳ Ｍ＋Ｈｍ／ｚ　４５９．２６７１１　ＣｕＨｓｓＮｉＯ
ｓ（９）比旋光度 ［αコＤ＝−６２　（Ｃ＝１．メタノール）（１Ｇ外観 淡黄色粉末 ａυ　溶解性 水、メタノール、エタノールに可溶。

アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、　　ｎ　−ヘキ
サンには不溶。

＠　塩基性、中性、酸性の区別 塩基性の挙動を示す。

αＪ　呈色反応 陽性：ユニバーサル、　硫酸、ニンヒドリンａ４　　薄
色クロマトグラフィー シリカゲル６０Ｆ２５４　（メルク社）α勺 Ｒｆ＝０．２９（クロロホルム：メタノール：アンモニ
ア水＝１５：１５：０．１） Ｒｆ＝Ｏ（ｎ−プロパツール：水＝４：１）高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間　６．１分 カラムＭＭＣ−ＯＤ８４．６＄Ｘ２５０ｍｍ検　　出　
　　　２１０ｎｍ 流　速　　１ｍ１１分 展開溶媒　０．１Ｍ硫酸ナトリウム　　１００ｍ７酢　
　酸　　　　　　　　　　０．０５　ｒｎｌｌ−ペンタ
ンスルホン酸 ナトリウム　０．０２ｇ （発明の効果） Ｙ−０９１９４Ｌ−Ｂ物質は、各種細菌に対して抗菌作
用を示すと共に、・各種腫瘍細胞に対し。

細胞障害作用を有している。

（１）抗菌作用 Ｙ−０９１９４Ｌ　−Ｂ物質の抗菌活性を数表に示す。

表１　（抗菌活性：ＭＩＣμｇＡｌ） アセトニトリル　　　３．１ｍｌ （２）　　腫瘍細胞を用いる試験管内細胞障害作用試験
方法： Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＬ　１２
１０”、　Ｐ　３８８”の各細胞液１　ｒｎｌに、生理
食塩水で溶解した各濃度のＹ−０９１９４Ｌ　−Ｂ化合
物４μｔを加え。

３７℃炭酸ガス培養器中で３日間培養した後。

トリバンブルー染色法により生残細胞を計数した。細胞
障害活性は、薬剤無添加の細胞数を対照として各濃度で
の細胞増殖抑制率を算出し、グラフ上にプロットして求
めた。

使用したｍｅｄｉｕｍ　： 豪　ＲＰＭＩ−１６４０＋　１０％新生子牛血清賎ＲＰ
ＭＩ　−１６４０＋　５％牛脂児血清＋５μＭ２−ヒド
ロキシエチル　ジスルフィド結果： ＋３）　　Ｐ２Ｓ５を用いた動物での抗種瘍活性試験方
法： Ｐ３８８腫瘍細胞５Ｘ１０’−！＝ルなりＤＦ’ｌ／５
ＬＣ５週令オスマウスに腹腔内接種し、接種翌日よりＹ
　−０９１９４Ｌ　−Ｂを腹腔内投与で７日間連設した
。効果は対照群の中間生存日数に対する。　Ｙ　−０９
１９４Ｌ−Ｂ投与群の中間生存日数の比より延命率を算
出して求めた。

結果： （製造法） つぎに２本発明物質の琴造法について説明する。

Ｙ　−０９１９４Ｌ−Ｐ物質は、ノカルジオプシス属に
属するこの物質の生産菌を培養し、培養液中にＹ　−０
９１９４Ｌ−Ｂ物質を蓄積させ、ついで培養液からこの
物質を採取することによって製造することができる。本
発明で使用するノカルジオプシス属に属する微生物の一
例としては、小笠原諸島、父島で採取した土壌から分離
されたノカルジオプシス　エスピー　（Ｎｏｃａｒｄｉ
ｏｐｓｌｓ　ｓｐ、　）Ｙ　−０９１９４Ｌ　（微工研
菌寄第１０４６１号）を挙げることができる。以下、　
Ｙ−０９１９４Ｌ株の菌学的性質を説明する。

１、形態 各種有機及び無機培地で基土菌糸は良く発達し、菌糸の
幅はほぼ０．４μｍであり、そのいずれの培地において
も、気菌糸を良く着生する。気菌糸は、長い直線状また
は曲線状で。

単純分岐し、培養早期にジグザグな形状が観察される。

成熟した気菌糸は分断するとともに、２０個以上の長い
胞子連鎖を形成する。

電子顕微鏡による観察では、胞子の形状は円筒形、大き
さは０．８〜１．２　Ａｍ　Ｘ　０．４〜０．５　ｐｍ
で。

その表面は平滑である。胞子の５．菌核、苗束糸等の特
殊な器官は観察されない。

２、各種寒天培地上の性状 各種寒天培地上の性状は、以下に示すとおりである。特
忙記載しないかぎり、２８℃で２１日間培養し、常法に
従って観察したものである。色調の記載については色の
標準（日本色彩研究所）によった。

３　生理的性質 ４）硝酸還元作用 ５）スターチの加水分解作用 陽性 陽性 （注）Ｇ；生育程度 Ｒ；裏面の色相 Ａ；気菌糸の着生及びその色相 Ｓ；可溶性色素 （注）生育温度は各温度（５，１０，１５，２０，２５
，２８，３０，３３゜３７、４０．４５．５０　℃）で
、７−２１日までの観察結果。

ミルクに対する作用は３７℃で３−２１日までの観察結
果、それ以外は、特に指摘のないかぎり２８℃で２週間
後の観察結果を示す。

４、炭素源の資化性（プリトノ・ム・ゴドリーブ寒Ｌ−
７ラビノース　　　＋　　　フンノース　　　　　　＋
Ｄ−キシｐ−ス　　　　＋　　　メリビオース　　　　
　＋Ｄ−グルコース　　　　＋　　　ラクトース　　　
　　　＋Ｄ−７ラクトース　　　＋　　　Ｄ−ガラクト
ース　　　＋シュクロース　　　　＋　　　マルトース
　　　　　＋イノシトール　　　　＋　　　サリシン　
　　　　　＋−ラムノース　　　　　　＋　　　トレハ
ｐ−ス　　　　　＋ラフイノース　　　　＋−グリセリ
ン　　　　　十〇−マンニトール　　　＋−デキストリ
ン　　　　　＋スターチ　　　　　　　＋　　　キサン
千ン５、菌体成分の化学分析 ＬＥＣＨＶＡＬＩＥＲらの方法（ＬＥＣＨＶＡＬＩＥＲ
，ＭＰ。

ｅｔ　ａｌ　；　ＰＰ２７７−２３８　ｉｎ　ＤｒＥＴ
Ｚ、　Ａ　ｅｔ　ａｌ　ｅｄ、、　Ａｃｔ−ｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ、　Ｓ　ＩＭ　５ｐｅｃｉ
ａｌ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　６゜１９８０
）に従い本菌株酸加水分解の分析を行った結果、　　ｍ
ｅｓｏ−ジアミノピメリン酸が検出された。

また、細胞壁成分としてＩｎ６ｇｏ−ジアミノピメリン
酸、ガラクトース、ラムノース、グルコースが検出され
た（細胞壁タイプＩＩＩ−Ｃ）。主たるメナキノンは、
　　ＭＫ９　（Ｈ４）であった。

上記諸性状を要約すると、Ｙ−０９１９４Ｌ株は気菌糸
上に長い胞子の連鎖を作り、培養の初期に気菌糸がジグ
ザグな形状を呈し、後期になると基土菌糸に断裂が生じ
る。細胞壁タイプはＩＩＩ−Ｃで、主メナキノンはＭＫ
−９（４Ｈ）である。

以上の性質を有する菌種を各種の文献等により検索する
と２本菌株はノカルジオプシス（Ｎｏ−ｃａｒｄｉｏｐ
ｓｉｓ　）に属する一菌株であること認められる。そこ
で本菌株をノカルジオプシス　エスピー（Ｎｏｅａｒｄ
ｉｏｐｓｉａ　ｓｐ、　）　Ｙ　−０９１９４Ｌと命名
した。

本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄１０４６１号として寄託されている。

なお、微生物は人工的に、また自然に変異を起しやすい
が１本発明のノカルジオプシス　エスピ−Ｙ−０９１９
４Ｌ株には天然から分離された放線菌のほかにこれを紫
外線、Ｘ線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及
びそれらの自然変異株も、包含されるものである。

Ｙ−０９１９４Ｌ−Ｒ物質の生産はノカルジオプシス　
エスピーＹ−０９１９４Ｌ株を培地に培養し、培養物よ
り採取することにより行なわれる。培養方法は一般微生
物の培養方法に準じて行なわれるが１通常は液体培地に
より深部培養法が有利である。培養に用いられる培地と
しては、ノカルジオプシス　エスピーＹ−０９１９４Ｌ
株が利用する栄養源を含有する培地であればよい。

すなわち９合成培地、半合成培地あるいは天然培地が用
いられ、培地の組成は例えば炭素源としてはグルコース
、アラビノース、フラクトース、デンプン、植物油等が
、窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール
、綿実粕。

大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチープリカー　乾燥
酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム。

硝酸アンモニウム、尿素その他の有機、無機の窒素源が
用いられる。また、金属塩としてＮａ。

Ｋ、　Ｍｇ、　Ｃａ、　Ｚｎ、　Ｆｅなどの硫酸塩、硝
酸塩、塩化物、炭酸塩、燐酸塩などが必要に応じて添加
される。

また、必要に応じてメチオニン、システィン。

シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、
シリコン油、界面活性剤などの抗生物質生成促進物質又
は消泡剤を添加することもできる。

培養条件としては好気的条件下に培養するのが一般的に
有利で、培養温度は約２５〜３７℃の範囲が望ましく、
好ましく約３０℃附近で行なわれる。培地のｐＨは約５
−１０．好ましくは約６〜８の範囲に保存すると好結果
が得られる。

培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定され
る。

培養物より目的とするＹ　−０９１９４Ｌ−Ｂ物質を単
離採取するには通常の微生物の培養物より抗生物質を単
離する方法が適用される。目的物は主に培養液中に含有
されるので、遠心分離又は濾過により菌体を除去した後
、濾過液から有効物質の抽出を行なう。すなわち、適当
な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差、溶液からの析出
性及び析出速度の差２種々の吸着剤に対する吸着親和性
の差、２欅の液相間における分配の差などを利用する一
般の抗生物質の製造に用いられる手段によって１分離、
採取、精製される。これらの方法は必要に応じて単独に
用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、また反覆し適
用できる。

（実施例） 以上２本発明の詳細な説明したが、以下に実施例により
さらに説明する。

実施例　１゜ グルコース０．５％、白色デギストリン２．０％、ポリ
ヘフトン０．５％、酵母エキス０．５％、プレインハー
トインクニージョン０．５２％、コーンスチープリヵー
０．５％、肉ｘ、＊、；＜ｏ、３％、炭酸カルシウム０
．２％、を含む培地Ａ（ＰＨ８，０）を作成シ、コれを
５００ｍ４三角フラスコに６０ｍ＃ずつ分注し１２０’
Ｃ，で２ｏ分間滅菌したものに、ベネット寒天培地上に
生育させたノカルジオプシス　エスピーＹ−０９１９４
Ｌ株の菌糸をかき取って接種し、２７℃で４８時間振盪
培養を行ない種培養液とする。つぎに培地Ａ３Ｌを作製
し。

これを５００ｍ７三角フラスコに６０ｍｔずつ分注し。

１２０℃で２０分間滅菌したものに種培養液を３．０％
の割合で植菌した。２７℃で４８時間振盪培養を行ない
種培養液（２）とする。本培養はフルクトース１．０％
、ニスサンミート０．５％、ラプレムコパウター０．２
％を加えた培地Ｂ　２５Ｌ　（ｐＨ７，０）を作製し、
これを５００ｍ１三角フラスコ６０ｍｔずつ分注し１２
０℃で２０分間滅菌したものに種培養液（２）を３．０
％の割合で植菌し毎分２００回転のロータリーシェイカ
ーで２７℃、３日間振盪培養を続けるとバチルス　ズプ
チルスＡＴＣＣ６６３３株に対して抗菌活性は最大とな
る。培養終了後すべてのフラスコ内容液を合わせて塩酸
でｐＨ２，５に調整した後、ラジオライト＃６００（昭
和化学工業製）を加えて攪拌の後濾過すると、Ｐ液２３
Ｌが得られる。この炉液に水酸化ナトリウムを加えてｐ
Ｈ６，５に調整した後、　　０ＭセファデックスＡ２５
（Ｎａ型）に吸着させる。２Ｌの水で水洗の後、３Ｌの
５％食塩水で溶出する。次に３００ｍ１のダイアイオン
ＨＰ−２０（三菱化製）に吸着させ７００ｍ１の水で水
沫した後、４０％メタノールで溶出する。この液を減圧
濃縮しメタノールをとばした後、ダウエックス１　（Ｃ
Ｉ型）を通過させる。さらにＣＭセファデックスＡ２５
（Ｎａ型）に吸着させ、０−５％食塩水の濃度勾配によ
る溶出を行なう。

バチルス　ズブチリスＡＴＣＣ６６３３株に対して活性
を示す区分を集め、ダイアイオンＣＨＰ−２０（三菱化
成製）に吸着させる。０−４０％メタノールの濃度勾配
による溶出を行なう。バチル　スプチリスＡＴＣＣ６６
３３株に対して活性を示す区分を集め、減圧濃縮する。

この液をＨＰＬＣにて分取する。カラム：　ＹＭＣ−Ｏ
ＤＳ　２０＄　Ｘ２５０ｍｍ、検出２１Ｑｒｒｕｎ、流
速１１ｍｔ／分、展開溶媒；　０．ＩＭ硫酸ナトリウム
１００ｍ１゜酢酸０．０５ｍ１．１−ペンタンスルホン
酸ナトリウム０．０２ｇ、アセトニトリル３．１　ｍＺ
にて運転し９分のピークを分取する。この液を減圧濃縮
した後凍結乾燥する。得られた粉末をメタノールにて抽
出する。メタノール液を減圧乾固した後、水を加えて水
溶液とする。これをダウエックス１．（ＣＩ型）に通し
塩酸塩とする。減圧濃縮した後凍結乾燥すると。

Ｙ−０９１９４Ｌ−Ｂ物質の塩酸塩が９０■得られる。

実施例　２゜ グルコース０．５％、白色デキストリン２．０％、ポリ
ペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、ブレインノ１
−トインフェージ甘ン０．５２％、コーンスチープリカ
ー０．５％、肉エキス０．３％、炭酸カルシウム０．２
％を含む培地ＡＣＰＨ８，０）を作製し、これを５００
ｍ１三角フラスコに６０ｍｔずつ分注し１２０℃で２０
分間滅菌したものに、ベネット寒天培地上に生育させた
ノカルジオプシス　エスピーＹ−０９１９４Ｌ株の菌糸
をかき取って接種し、２７℃で４８時間振盪培養を行な
い種培養液とする。つぎに培養地Ａ３１を作製し。

これを５００ｍ１三角フラスコに６０ｍｔずつ分注し。

１２０℃で２０分間滅菌したものに種培養液を３．０％
の割合で植菌した。２７℃で４８時間振盪培養を行ない
種培養液（２）とする。つぎに消泡剤ＮＫ・Ｌ−５４３
０（日本油脂）０．０３％を加えた培地Ａ２０Ｌを作製
し。

３０Ｌ容培養槽中に入れ１２０℃で３０分滅菌したもの
に種培養液（２）を６００ｍ１接種し２通気量３０Ｌ／
分。

攪拌速度２００　ｒｐｍで２７℃、３日間通気攪拌培養
を行ない種培養液（３）とする。本培養は種培養（３）
６゜６Ｌを予め１２０°Ｃ１３０分間滅菌した３００Ｌ
培養槽中の。

フルクトース２．０％、ニスサンミート１，０％、ラブ
レムコバウダー０，２％、消泡剤ＮＫＬ−５４３０（日
本油脂）０．０３％を含む生産培地２２０Ｌ（ｐＨ７，
０）Ｋ接種し。

通気量１５０Ｌ／分２回転数７　Ｏｒｐｍで３日間培養
すると、バチル　ズプチルス　ＡＴＣＣ６６３３株に対
して抗菌活性は最大となる。このようにして得られた培
養液を塩酸でｐＨ２，５に調整した後、ラジオライ）　
ｌ＃　６００　（昭和化学工業製）を加えて攪拌の後濾
過すると、Ｐ液２２ＯＬが得られる。この炉液に水酸化
ナトリウムを加えてｐＨ６，５に調整した後。

ＣＭセファデックスＡ−２５（Ｎａ型）５Ｌに吸着させ
る。ＩＯＬの水で水洗の後、１５Ｌの５％食塩水で溶出
する。次に２ＬのダイアイオンＨＰ−２０（三菱化成製
）に吸着させ、４Ｌの水で水洗した後、４０％メタノー
ルで溶出する。この液を減圧濃縮しメタノールをとばし
た後、ダウエックスｌ　（Ｃ’ｌ型）３Ｌを通過させる
。さらにＣＭセファデックスＡ−２５（Ｎａ型）９００
ｍｌに吸着させ、０−５％食塩水の濃度勾配による溶出
を行なう。ＨＰＬＣにてＹ−０９１９４Ｌ−Ｂ物質を検
出し、その区分を集める（カラＡ　：　ＹＭＣ−ＯＤＳ
　４．５５１　Ｘ　２５０ｍｍ、検出２１０ｎｍ。

流速１１ｍ１／分、展開溶媒；Ｏ，ｉＭ硫酸す）　ＩＪ
ウム１００ｍｔ、酢酸０．０５ｍ１．　１−ペンタンス
ルホン酸ナトリウム０．０２　ｇ　、　　ア・セトニト
リル３．１　ｍｌ、保持時間６．１分）。これらの区分
をダイアイオンＣＨＰ−２０（三菱化成製）に吸着させ
る。０−２０％メタノールの濃度勾配による溶出を行な
う。ＨＰＬＣにてＹ−（１１９４Ｌ−Ｂ物質を検出し、
その区分を集める。

減圧濃縮しメタノールをとばした後、ダウエックス１（
Ｃ１型）に通し、塩酸塩とする。減圧濃縮後。

凍結乾燥を行なうとＹ　−０９１９４Ｌ−Ｂ物質の塩酸
塩が３ｇ得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、　Ｙ−０９１９４Ｌ−Ｂ物質の紫外部吸収ス
ペクトルを示す。 第２図は、　　Ｙ−０９１９４Ｌ−Ｂ物質の赤外部吸収
スペクトルを示す。 第３図は、　Ｙ−０９１９４Ｌ−Ｂ物質の１Ｈ−核磁気
共鳴スペクトルを示す。 第４図は、　Ｙ−０９１９４Ｌ−Ｂ物質の１３Ｃ−核磁
気共鳴スペクトルを示す。 第５図は、　ｙ−１９１９４Ｌ−Ｂ物質の質量分析スペ
クトルを示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記平面化学構造式で表わされるＹ−０９１９４
   Ｌ−Ｂ物質又はその酸付加塩 ▲数式、化学式、表等があります▼
2. （２）ノカルジオプシス属に属するＹ−０９１９４Ｌ−
   Ｂ物質生産菌を培養し、培養液中にＹ−０９１９４Ｌ−
   Ｂ物質を蓄積させ、ついで培養液からこの物質を採取す
   ることを特徴とする下記平面化学構造式で表わされるＹ
   −０９１９４Ｌ−Ｂ物質の製造法 ▲数式、化学式、表等があります▼
3. （３）ノカルジオプシス属に属する菌株が、ノカルジオ
   プシスエスピーＹ−０９１９４Ｌ（微工研菌寄第１０４
   ６１号）である請求項（２）記載の製造法