KR100271997B1

KR100271997B1 - Fa-70d물질, 이를 생산하기 위한 방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR100271997B1
Application number: KR1019970707478A
Authority: KR
Inventors: 시즈오 기타노; 토루 사사키; 켄이치로 요시다; 토시오 오타니; 레이 위; 윈 우; 노부히코 가쓰누마
Original assignee: 고바야시 유키오; 다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2000-11-15
Also published as: CA2217729C; KR19990007955A; DE69727268T2; EP0822260A1; DE69727268D1; WO1997031122A1; EP0822260B1; US5914348A; ATE258229T1; EP0822260A4; JP3111240B2; CA2217729A1; AU1734097A; AU695190B2

Abstract

다음 화학식 1을 가지는 FA-70D 물질 또는 그 염, 그들의 제조방법, 이 화합물을 유효성분으로 포함하여 구성되는 의약 조성물, 이 화합물을 투여하는 것을 포함하여 구성되는 골다공증 치료 방법, 이 화합물의 의약으로서의 용도 및 FA-70D 물질을 생산할 수 있는 균.

[화학식 1]

이 화합물은 카텝신류 프로테아제에 대한 특이적인 저해활성을 가지고 이 효소가 관여하는 각종 질환, 특히 골다공증의 치료약으로 유용한 것이다.

Description

FA- 70D 물질, 이를 생산하기 위한 방법 및 그 용도

세포내에서 생성되는 효소군으로서 카텝신류 프로테아제(카텝신 B, 카텝신 L. 카텝신 H 등)는 세포내외에서 다양한 생리작용을 담당하고 있다. 예를들면, 세포내에서 단백질 가공, 불필요한 단백질의 분해 및 세포사(apoptosis)에 관여하고, 세포외에서는 골기질 콜라겐의 분해 등의 세포외 기질의 분해와 감염 박테리아의 소화에 관여하고 있다고 생각된다.

특히. 카텝신 L은 매우 강한 콜라겐 분해 활성을 가지는 것으호 알려져 있고, 실험동물에 있어서도 카텝신 L 저해제가 눈에 두드러지게 골 콜라겐의 분해를 억제한다는 것이 밝혀졌다. 카텝신 L을 특이적으로 저해하는 물질은 골다공증 치료약으로서 유망하다고 생각된다(에프이비에스 레터즈(FEBS Letters). 269(1), 189-193, 1990) 또한, 카텝신 1.을 특이적으로 저해하는 물질은 고칼슘혈증치료제로서도 유망하다고 생각된다.

카텝신 B는 염증, 암전이 및 근디스트로피증 등의 병(요)인으로 깊이 관여하고 있다고 일컬어지는 효소이다. 최근에는 전이와 침습과 같은 악성 종양과 카텝신 B 활성사이의 상호관계를 지적하는 보고서(캔서 리서치(Cancer Research), 52, 3610-3614, 1992)들의 수가 증가하고 있다.

카텝신류 프로티아제가 관여하는 질환에 있어서, 이 효소에 대한 특이적인 저해제가 요구되어지고 있지만 아직 만족스러운 물질은 발견되지 않았다. 특히, 골다공증에 있어서 골흡수를 담당하는 카텝신을 특이적으로 억제하는 저해제는 없다.

본 발명은 미생물을 이용해서 카텝신류 효소에 대해서 뛰어난 저해활성을 갖는 물질을 얻는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명은 프로테아제 저해활성을 가지고 의약으로서 유용한 신규의 FA-70D 물질 또는 그 염에 관한 것이다.

제1도는 실시예 1에서 얻은 본 발명에 따른 물질의 적외선 흡수 스펙트럼도.

제2도는 실시예 1에서 얻은 본 발명에 따른 물질의¹H-NMR 스펙트럼도이다.

[실시예]

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 염은, 특별하게 한정되어 있지는 않지만, 제약학적으로 허용되며 염기성 화합물과 반응시킬 수 있는 염기성 염이 바람직하다. 이 염기성 염은 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 알칼리금속의 탄산염, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 등의 알칼리 금속의 탄산수소염, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속의 수산화물, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속의 염, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리토금속의 염, 암모니아염, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 시클로헥실아민, 피페리딘 등의 아민의 염, 및 아르기닌과 리신 등의 염기성 아미노산의 염을 포함한다.

상기 화학식 1의 FA-70D 물질은 광학이 성체를 포함하므로 이성체와 그 혼합물 역시 본 발명의 범위내에 있는 것이다.

상기 화학식 1의 FA-70D 물질 또는 그 염은 무수 상태로 있거나 적당한 비율로 수화한 것일 수 있다. 또한 결정형인 것이거나 분말 또는 무정형의 것일 수도 있다.

FA-70D 물질의 물리화학적성 질은 다음과 같다.

(1) 외관 : 백색 분말

(2) 실험식 : C₃₀H₄₂N₆O₇(M) (고분해능 고속 원자충격 질량 분석계:C₃₀H₄₃N₆O₇(M+H)로서 실험치 599.3181; 계산치 599.3193)

(3) 분자량 : 598.701(고속 원자충격 질량 분석계)

(4) 적외선흡수 스펙트럼 : KBr 정제법.

νmax(cm^-1):3375,2965,2935,1675-1640,1555,1455,1400,1205,1140,840,705,825, 700.(제1도)

(5) 핵 자기 공명 스펙트럼 : 디메틸설폭시드-d₆(DMSO-d₆) 용액 중 30℃에서 측정한 400MHz¹H-NMR 스펙트럼은 제2도에 나타낸다. 화학 쉬프트는 표 1에 나타낸다.

Phe:페닐알라닌

Cit:시트룰린

Val:발린

APP:2-아미노-3-페닐프로판올

(6) 용해도, 메탄올과 디메틸설폭시드에 잘 녹고, 에탄올에 조금 녹는다. 클로로포름, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 및 헥산에는 거의 녹지 않는다.

(7) 정색 반응:

에를리히 반응:양성

사까구찌 반응과 닌히드린 반응:음성

(8) 융점:157-158℃

(9) 비선광도:

(c=3.56mℓ/mℓ, 메탄올)

(10) 고성능 액체 크로마토그래피:하기 조건에 있어서 보지시간(t_R) 5.8분에 피크를 부여 한다.

칼럼:이널트실(Inertsil) ODS-2.5μm

(내경 4.6mm×150mm, 지엘 사이언스)

이동상:아세토니트릴 트리플루오로아세테이트/물

(35:0.05:65, v/v/v)

유속:lmℓ/분

검출:210nm(0.04 a.u.f.s.)

본 발명의 FA-70D 물질은, 본 발명의 물질을 생산할 수 있는 균주(이하 FA-70D 물질 생산균이라 칭함)를 적당한 조건, 전형적으로 다음의 조건하에서 배양함으로써 생산할 수 있다. FA-70D 물질 생산균은 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 균주를 포함한다.

본 발명은, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 균주를 배양하고, 배양물을 회수하는 것에 의해서 얻을 수 있는 상기 FA∼70D 물질과 그 염을 포함한다.

스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 균주의 일예로서는, 스트렙토마이세스 에스피. FA-70주(Streptomyces sp. FA-70 strain)을 예시할 수 있다. 이 균주는, 본 발명자들이 중화인민공화국 하북성 승덕의 토양에서 새롭게 분리한 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주이고, 일본국 이바라켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고에 주소를 둔 통상산업 성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에, 1995년 7월 31일자로 미생물 표시:Strain FA-70 (기탁자가 부여한 식별을 위한 표시로서) 및 수탁 번호FERM BP-5183하에 기탁되어 있다.

FA-70D주에 대해서 인터내쇼날 져널 오브 시스티메틱 박테리오로지(Internationl Journal of Systematic Bacteriology), 16(3), 313-340,1960에 기재 방법에 준해서 검사한 균학적 성질은 다온과 같다.

(a) 형태

인터내쇼날 스트렙토마이세스 프로젝트(Internationl Streptomyces Project. ISP)에 따라서 13일간 27℃에서 배지 No. 4(ISP 4)에서 배양하고, 관찰한 결과를 아래에 나타낸다.

포자 형성균사의 분지법 : 단순 분지

포자형겅의 형태 : 나선상, 포자 형태는 원통상이다.

포자의 수 : 10 내지 50 포자 또는 그 이상

포자의 표면구조 : 평골(smooth)

포자의 크기 : 0.5-0.6×0.8-0.9μm

편모포자의 유무 : 무

포자낭의 유무 : 무

포자병의 착생위치 : 기균사(氣菌絲)

균핵형성성의 유무 : 무

(b) 각종 배지에 있어서 생육상태:

각종 배지에 있어서 생육상태를 표 2에 나타낸다. 분류 색명은 일본색채연구소 감수, 표준색채도표 A. 1981년에 따라 나타내었다. 또한, 더 상세한 색은 콘테이너 코오퍼레이션 오브 아메리카(Container Corporation of America)에 의해 발행된 칼러 하모니 매뉴얼 (The color Hormony Manual, 제4판, 1958년)에 따라 색 코드로 덧붙였다.

c) 생리적 특성

생육 온도범위 :20-37℃에서 양호

젤라틴의 액화(글루코오스 펩톤 젤라틴 배지, 27℃) : 양성

젤라틴의 액화(단순 젤라틴 배지, 20℃) : 음성

밀크의 응고(37℃) : 음성

밀크의 펩톤화(37℃) : 양성

멜라닌 색소의 생성 : 티로신 한천(ISP-7) 및 트립톤 효모추출액 배지(ISP-1)상에서 음성:펩톤 효모 추출 철 한천(ISP-6) 상에서 양성

황화수소의 생성(0.5% 효모추출액을 보충한 펩톤 효모추출액 철 한천(ISP-6)):양성

전분의 가수분해(전분 무기염 한천(ISP-4 )) 양성

질산염의 환원(1%의 질산 칼륨 함유 부용, ISP-8) : 음성

셀룰로오스의 분해 : 음성

(d) 탄소원의 이용 (프리드햄 & 고트리브 한천, ISP-9) :

균주는 D-글루코오스, D-크실로오스, 이노시톨, 용해성 전분, 덱스트린, 글리세를 및 말토스를 이용해서 잘 발육한다. L-아라비노스, 슈크로오스, D-프럭토오스, D- 만니톨 L-람노오스, 라피노스, D-갈락토오스 및 살리신은 이용할 수 없다.

(c) 화학분류

일본방(사)선균학회편(방선균을 분류하기 위한 실험법). 62-70, 1985년에 기재된 방법에 따라, 전균체를 박층 크로마토그라피 법에 의해 산 가수분해하여 분석하였다. 그 결과, LL-형 디아미노피메린산이 검출되었다.

이상의 균학적성질, 특히 기생(基生)균사보다 다수의 포자의 연쇄를 가지는 기(氣)균사를 형성하고, 세포벽의 아미노산의 조성이 LL-디아민피메린산이고, 편모와 포자낭을 형성하지 않는 성질을 기초로 할때, 본 균주는 스트렙토마이세즈속에 속하는 것이 명백하다. 따라서 본 균주를 스트렙토마이세스 에스피 FA-70주(Streptomyces sp. FA-70 strain)로 칭하기로 하였다.

본 발명의 FA-70D 물질은, 예를들어, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하고, FA-70D 물질을 생산할 수 있는 균을 배지에 배양하고, 배양물 중에 이 FA-70D 물질을 생성, 축적하게 하고, 이를 채취하는 것에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 상기 방법은 상기 FA-70주 또는 그 변이주 등의 스트렙토마이세스속에 속하는 각종 FA-70D 물질 생산균을, 적당한 배지에서 배양하고, 뒤이어서 배양물에서 본 발명의 물질을 함유하는 조추출물을 분리하며, 거듭 조추출물로부터 FA-70D 물질을 단리, 정제하는 것에 의해 제조할 수 있다.

상기 균주의 배양은 원칙적으로 일반적인 미생물의 배양에 준하여 행하여지지만, 통상 액체배양에 따른 진탕배양법. 통기성교반배양법 등의 호기적 조건하에서 행하는 것이 바림직하다.

배양에 이용되는 배지로는 FA-70D 물질 생산균을 이용할 수 있는 배양원을 함유하는 배지라면 되고, 각종 합성배지, 천연배지 등 어느 것이든 이용할 수 있다.

배지의 탄소원으로서는 글리코오스, 슈크로오스, 를락토오스, 글리세린, 덱스트린, 전분 당밀, 콘 스팁 리쿼르, 유기산 등을 단독 또는 이종 이상 조합시킨 것이 사용된다. 질소원으로서는 팔마메디아, 펩톤, 육추출물, 효모 추출물, 대두분, 카제인, 아미노산, 요소 등의 유기질소원과 질산 나트륨, 황산 암모늄 등의 무기질소원을 단독 또는 이종이상 조합시킨 것이 사용된다. 또한 배지에는 나트륨 염, 칼륨염, 마그네슘염, 인산염, 그외 중금속염등을 필요에 따라 적당한 양으로 첨가시킨다.

또한, 배양 중 발포가 현저할 때에는, 예를 들어 대두유, 아마인유 등의 식물유와, 옥타디카놀, 테트라디카놀. 헵타디카놀 등의 고급 알콜류, 및 각종 실리콘화합물 등의 소포제를 배지 중에 첨가할 수 있다.

배지의 pH는 중성부근으로 하는 것이 바람직하다. 배양온도는 FA-70D 물질생산균이 양호하게 생육하는 온도, 통상 20-37℃, 바람직하게는 25-30℃부근에서 유지하는 것이 좋다. 배양시간은, 액체진탕배양 및 통기성 교반 배양 어느 경우라도 2-6일간이 바람직하다.

전술한 각종 배양조건은 사용되는 미생물의 종류와 특성, 외부조건 등에 따라 적절하게 변경할 수 있고, 또한 각각에 따라 상기 범위에서 최적의 조건을 선택, 조절 할 수 있다.

배양액에서 FA-70D 물질을 함유하는 조 추출물의 분리는 발효생산물을 채취하는 일반적인 방법에 준해서 행할 수 있는데. 예를 들어 용매추출, 분배 및 흡착크로마토그래피 등의 수단을 단독 또는 이종 이상을 임의의 순서호 조합해서 사용할 수 있다. 보다 자세하게는 상기 배양에 의해 생산되는 FA-70D 물질은 주호 배지속에 존재하기 때문에 통상의 방법에 따라, 먼저 여과, 원심분리 등을 행해서, 균체고형분으로부터 FA-70D 물짙을 함유하는 배양여액을 분리한다. 이 배양여액에 있는 FA-70D 물질을 다이아이온 HP-20수지(미쓰비시카세이(주))에 흡착시키고, 그 후 정제된 물로 수지를 세정한다. 이어서, 메탄올을 이용해서 수지로부터 FA-70D 물질의 용출을 행하고, 뒤이어, 감압하에 용매를 증류하여 FA-70D 물질을 함유하는 조농축액을 얻는다. 이 조농축액에 n-부탄올을 첨가해서 FA-70D물질을 유기용매층에 전용시켜 용매를 감압하에서 제거한다. 잔류물을 에틸아세테이트로 세정하고 뒤이어 용매를 감압하에 증류하여 FA-70D물질을 함유하는 조추출물을 얻는다.

상기 조추출물에서 FA-70D물질을 단리, 정제하기 위해서는 통상 저분자량 펩티드 물질을 단리, 정제하는 수단, 예를 들어 활성탄, 다이아이온 HP-20, 이온계흡착수지 등의 흡착제에 의한 여러 가지 흡착 크로마토그래피 및 ODS-결합형 실리카겔을 이용하는 역상 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 이들 중에, 용출용매로 메탄올과 물의 혼합용매계(pH 2.0)를 이용하는 다이아이온 HP-20 크로마토그래피 및 아세토니트릴과 트리플루오로아세트산의 혼합용매계를 이용하는 역상 크로마토그래피가 특히 바람직하다. 또한, 다시금 정제를 필요로 하는 경우에는, 상기한 크로마토그래피를 반복해서 행하든지 또는 용출용매로서 메탄올을 이용한 세파덱스 LH-20(팔마시아사제)에 의한 겔 여과 크로마토그래피등을 조합해서 행한다. 이 방법에 의하여 고순도 FA-70D 물질을 얻을 수 있다.

정제공정 중에 FA-70D 물질의 확인은, 본 물질에 의해 저해되는 파파인, 카텝신 L의 효소활성을 측정하는 방법 및 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해서 정제된 것을 검출하는 방법을 병용해서 행하는 것이 좋다.

효소활성을 측정하는 구체적인 방법은, 실시예 및 시험예에서 기재한다.

본 발명의 FA-70D 물질 또는 그염은, 카텝신 L 을 저해하기 때문에, 골다공증치료제, 고칼슘혈증 치료제로서의 유효성이 확인되었다.

이상에서와 같이 정제한 FA-70D 물질을 의약조성물로서 사용할 때의 투약형태로서는, 목적에 따라서 각종 투약형태를 넓게 채용할 수 있다. 이 투약형태로서는, 정제, 피복정제, 환제, 산제, 과립제, 조립제, 캅셀제, 액제, 현탁제, 유제 등의 경구제와, 주사제, 좌약, 연고제, 첨부제, 에어졸 등의 비경구제를 예로 들 수 있다. 이 투약형태는 그 분야에서 통상 알려진 실용적인 방법에 따라 제제화시킨다.

정제의 담체는, 예를 들어 락토오스, 슈크로오스, 염화나트륨, 글루코오스, 요소, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정셀루로오스, 규산 등의 부형제, 단일 시럽, 글루코오스액, 전분액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 쉘락, 메틸셀룰로오스, 인산칼륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제, 건조전분, 알긴산나트륨, 한천 분말, 라미나린 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르류, 라우린황산 나트륨, 스테아린산모노글리세리드, 전분, 락토오스 등의 붕괴제, 슈크로오스, 스테아린산, 카카오버터, 수소첨가유 등의 붕괴 억제제, 제4급 암모늄 염기, 라우릴창산나트륨등의 흡수촉진제, 글리세린. 전분 등의 보습제, 전분, 락토오스, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드상 실리카 등의 흡착제, 정제된 활석, 스테아린산염, 붕산 분말, 폴리에틸렌글리콜 등의 윤활제 등을 사용할 수 있다. 게다가 정제는 필요에 따라 통상의 피복막을 입힌 예를 들어 당의정, 젤라틴 피포정, 장용피정, 필름코팅정, 이중정, 다층정등으로 할 수 있다.

환제를 제조하기 위해서는, 담체로서 글루코오스, 락토오스, 전분, 카카오 버터, 경화식물유, 카올린, 활석 등의 다양한 부형제, 아라비아고무 분말, 트래거캔스 고무 분말, 젤라틴 등의 결합제, 라미나린, 한천 등의 붕괴제 등을 사용할 수 있다.

캅셀제는 통상의 방법, 예를들면 본 발명 화합물을 상기에서 예시한 각종 담체와 혼합해서 경화젤라틴캅셀 또는 연질 캅셀 등으로 충전해서 제조한다.

경구용 액체제제를 조제할 경우는 본 발명의 유효 성분에 교정제, 완충제 안정화제 등을 첨가해서 통상의 방법에 따라 내복액제 시럽제, 에릭실제 등을 제조할 수 있다. 이 경우 교정제로서는 슈크로오스, 등피, 구연산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 완충제로서는 구연산나트륨등을, 안정화제로서는 트래거캔스 고무, 아라비아고무, 젤라틴 등을 사용할 수 있다.

주사제로서 제조되는 경우, 액제, 유제 및 현탁제는 살균됨과 동시에 혈액과 등장인 것이 바람직하다. 주사제로서 사용될 희석제로는 예를 들어 물, 에틸알콜, 매크로골, 프로필렌글리콜, 에톡실화 이소스테아릴알콜, 폴리옥실화 이소스테아릴알콜, 폴리옥시에틸렌솔비탄지방산에스테르류 등이다. 또한, 이 경우 등장성 용액을 조제하기에 충분한 양의 염화나트륨, 글루코오스 혹은 글리세린을 의약 조성물증에 함유되게 해도 좋고, 또한, pH 조절제, 완충제, 안정화제, 국소마취제 등의 담체를 첨가하여, 통상의 방법에 따라 정맥내, 근육내 피하, 피내 및 복강내용 주사제를 제조할 수 있다. pH조절제 및 완충제로서는 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산나트륨 등을 사용할 수 있다. 안정화제로서는 피로아황산나트륨, 에틸렌디아민테트라아세트산, 티오글리콜산, 티오락틱산 등을 사용할 수 있다. 국소마취제로서는 염산프로카인 염산리도카인 등을 사용할 수 있다.

좌약을 제조하는 경우에는, 본 발명의 유효성분에 기제, 그 위에 필요에 따라서 계면활성제 등을 첨가한 후, 통상의 방법에 따라 좌약을 제조할 수 있다. 좌약으로서는, 예를들어 매크로골, 라놀린, 카카오버터, 지방산 트리글리세리드, 위텝솔(다이나마이트 노벨사 제품의 상표) 등의 유성기제를 이용할 수 있다.

연고제를 조제하는 경우는, 본 발명 화합물에 통상 사용되는 기제 안정제, 습윤제, 보존제 등의 담체가 필요에 따라 배합되어, 통상의 방법에 따라 혼합, 제제화된다. 기제로서는 유동파라핀, 백색 바세린, 표백한 밀랍, 옥틸도데실알콜, 파라핀 등을 들 수 있다. 보존제로서는 메틸 p-하이드록시벤조에이트, 에틸 7-하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트 등을 들 수 있다.

첨부제는, 통상의 지지체에 상기의 연고, 페이스트, 크림, 젤 등을 통상의 방법에 따라 도포함으로써 제조할 수 있다. 사용되는 지지체로는 면, 스프, 화학섬유로된 직포 또는 부직포와 연질염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리우레탄 등의 필름 또는 발포체 쉬트가 적당하다.

게다가 상기한 각 투약형태에는, 필요에 따라 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제등과 다른 의학적으로 활성인 성분들을 첨가할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물 중에 함유되는 본 발명에 따른 화합물의 양은 특별히 제한되지 않고 광범위하게 선택되지만. 통상 1-70중량 %인 것이 바람직하다.

상기 의약 조성물의 투여 방법은 특별하게 제한되지 않고, 각종 투약형태, 환자의 연령, 성별 그외의 조건 질환의 정도 등에 따라 적절하게 선택된다. 예를 들어 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 파립제 및 캅셀제는 경구투여된다. 주사제는 단독으로 또는 글루코오스, 아미노산 등의 통상의 보액과 혼합해서 정맥내에 투여된다. 다시 필요에 따라서 단독으로 근육내, 피내, 피하 혹은 복강내에 투여된다. 좌약은 렉텀에 투여된다. 연고제는 피부, 구강내점막 등에 도포된다.

상기 각 형태의 투약단위중에 배합되어야 하는 본 발명의 유효성분의 양은 이것을 적용해야 하는 환자의 증상에 따라 또는 투약형태 등에 따라 일정하지는 않다. 그러나, 일반적으로 투약형태단위당 양은, 경구제에서는 약 1-1000mg, 주사제에서는 약 0.1-1000mg, 좌약에서는 0.1-1000mg로 하는 것이 바람직하다.

또, 상기 투약형태를 가지는 약제의 1일 평균 투여량은, 환자의 증상, 체중, 성별, 기타 조건 등에 따라 적절하게 선택된다. 그러나, 통상 성인 1일 평균 약 0.1-1000mg/kg, 바람직하게는 약 1-100mg/kg이고, 이를 1일 1회 또는 2-4회 정도 나누어 투여할 수 있다.

[실시예]

이하 실시예 및 실험예를 들어서 더 구체적으로 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해서 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[본 발명의 FA-70D 물질의 제조]

(a) 배양 공정

글루코오스 0.5%, 가용성 전분 2.4%, 우육추출물 0.3%, 효모 추출물 0.5%, 펩톤 0.5%. 콘 스텝 리쿼트 0.4%, 염화코밭트 0.002%, 탄산칼슘 0.4%로 된 배지(pH 7.2) 100mg를 500mℓ의 삼각 플라스크에 따르고, 멸균 후, 스트렙트마이세스 에스피 FA-70주(수탁번호 FERM BP-5183)를 일백금이량접종하였다. 그런 다음, 27℃에서 3일간 회전 진탕배양하였다(220 rpm, 진폭 7cm).

이어서, 글리세를 2.0%, 덱스트린 2.0%, 효모 추출물 0.3%, 소이톤 1.0%, 황산암모늄 0.2%, 탄산칼슘 0.2%로 된 배지(pH 7.0)을 500mℓ 용량의 삼각 플라스크에 100mℓ씩 나누어 따르고, 멸균(121℃, 15분)후, 상기 종균을 각 플라스크에 2%(v/v)의 비율로 첨가하였다. 접종한 플라스크를 27℃에서 3일간 회전 진탕배양하였다(220rpm, 진폭 7cm).

(b) 분리 공정

상기 공정에서 얻어진 배양액(8.5ℓ, pH 6.1)을 채취하여, 원심분리(3000 rpm, 15분)하고 여과하였다. 그리하여 얻은 배양여액을 1N 수산화나트륨 수용액으로 pH 8.0으로 조절하고, 다이아이온(Diaion) HP-20 (미스비씨카세이(주)) 수지(850mℓ)를 첨가하였다. 1시간 교반후, 여과에 의해 수지를 분리하고, FA-70D 물질을 용리하기 위해 교반하에 1N의 염산으로 pH 7.0으로 조절하면서 수지에 메탄올(4250mℓ)을 처리하였다. 같은 동작을 다시금 2회 반복해서 실시하고, 메탄올 추출물은 1N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.0으로 조절하고, 원심분리하였다. 침전을 제거한 후, 상청액은 감압농축하여 메탄올을 제거한 후, 상청액은 감압농축하여 메탄올을 제거한 FA-70D 물질을 함유하는 수용액을 얻었다. 이 수용액을 1N 수산화나트륨 수용액으로 pH 8.0으로 조절하고, 동량(v/v)의 n-부탄올에서 3회 추출하였다. 이 R 부탄을 추출물은 감압하에 농축하였고 잔여 고형물은 에틸아세테이트(50mℓ)로 3회 세정하고 건조해서 FA-70D 물질을 함유하는 조추출물(7.2g)을 얻었다.

(c) 단리, 정제공정

상기 조추출물(4.2g)을 메탄올(84mℓ)에 용해하고, 원심분리 (3000rpm, 15분)에 의해 메탄올 가용분획과 불용분획으로 나누었다. 불용분칙에 메탄올(33mℓ)을 첨가하고 원심분리에 의해 메탄올 가용분획과 불용분획으로 분리하였다. 메탄올 가용분칙을 합쳐, 물(2213mℓ)을 첨가하였고, 1N 염산으로 pH 3.0으로 조절하였다. 얻어진 침전을 제거하였다. 메탄올 함유 수용액을 IN의 수산화나트륨 수용액으로 pH 7.0으로 조절하였고, CM-세파덱스 칼럼(팔마시아사제, CM-Sephadex C-25, H-형 내경 3.6cm×길이 30cm)에 덧붙였다. FA-70D 물질을 함유하는 비흡착분획을 1N의 수산화나트륨 수용액으로 pH 7.0으로 조절하였고, DEAE-세파덱스 칼럼(팔마시아사제, DEAE Sephadex A-25, OH-형. 내경 3.6×길이 30cm)에 덧붙였다. 칼럼을 물로 씻은 후, 0.1M의 염화나트륨으로 용리하였다. 얻어진 용출분획을 다이아이온 HP-20 수지 칼럼(내경 2cm×길이 l5cm)에 덧붙였다. 칼럼을 물로 씻은 후, 60% 메탄올 수용액(묽은 염산에 의해 pH 2.0으로 조절)으로 용리하였다. 얻어진 용출분획을 감압농축해서 FA-70D 물질을 함유하는 건조분말 (240mg)을 얻었다.

각 단계에서 FA-70D 물질을 함유하는 활성분획의 검출은, 파파인의 저해활성을 측정(바이오케미칼지 (Biochemical Journal), 201, 189-198, 1982)하는 것에 의해 행하였다.

즉, 8mM의 디티오트레이톨과 4mM의 테트라소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트를 함유하는 400mM의 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 0.5mℓ와, 5μM 파파인과 0.1% 브리지 35(폴리옥시에틸렌(23)라우릴 에테르)(와코 쥰야쿠(주)제)를 함유하는 효소액 0.8mℓ, 및 시료를 함유하는 수용액 0.2mℓ를 40℃에서 10분간 프리인큐베이션 하였다. 그 후. 20μM상의 카르보벤즈옥시-L-페닐알라닐-L-아르기닌-4-메틸쿠마릴-7-아미드를 함유하는 0.1% 디메틸설폭시드수용액 0.5mℓ를 첨가하였고, 그 혼합물을 47℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 그후, 100mM의 모노클로로아세트산 나트륨을 함유하는 l00mM의 아세트산나트륨 완충액(pH 4.3) 2.9mℓ를 첨가함으로써 효소 반응을 정지시켜, 여기파장 350nm와 방출파장 458nm에서 형광 강도(F)를 측정하였다. 대조군으로서 시료를 포함하는 수용액 0.2mℓ 대신에 물 0.2mℓ를 첨가하고, 같은 방법으로 458nm에서 형광 강도(F₀)를 측정하였다. 다음 수학식 1에 의해 효소저해활성을 산출하였다.

[수학식 1]

효소저해활성(%)=F/F0*100

얻어진 건조분말을 메탄올에 용해하고, 그 용액을 겔 여과 칼럼(팔마시아사 제품, 세파덱스LH-70. 내경 2cm×길이 127cm)에 덧붙였다. 메탄올에서 용리하였다. 활성분획을 모아 용매를 제거하고, 건조분말(37mg)을 얻었다. 이 건조분말을 메탄올에 용해하고, 이너트실(Inertsil) ODS-2 칼럼(지엘 사이엔스사 제품, 5μm. 내경 10mm×길이 250mm), 이동상으로 아세토니트릴 트리플루오로 아세트산 물(v/v/v, 35:0.05:65)을 이용하여 유속 4.0mℓ/분으로 용리하는 역상 고성능 액체크로마토그래피를 실시하였다. 활성분획을 분취해서 유기용매를 감압증류하였다. 잔여 수용액을 냉동건조해서 백색분말의 FA-70D 물질(11mg)을 얻었다.

얻어진 FA-70D 뭍질의 물리화학적 성질을 이하에 나타낸다.

(1) 외관 : 백색 분말

(2) 실험식 : C₃₀H₄₂N₆O₇(M) (고분해능 고속 원자충격 질량 분석계 : C₃₀H₄₃N₆O₇(M+H)로서 실험치 599.3181; 계산치 599.3193)

(3) 분자량 : 598. 701(고속 원자충격 질량 분석계)

(4) 적외선흡수 스펙트럼 : KBr 정제법,

νmax(cm^-1):3375,2965,2935,1675-1640,1555,1455,1400,1205,1140,840,805,725,700(제1도)

(5) 핵 자기 공명 스펙트럼 : 디메틸설폭시드-d₆(DMSO - d₆) 용액 중 30℃에서 측정한 400Hz¹H-NMR 스펙트럼은 제2도에 나타낸다. 화학 쉬프트는 표 3에 나타낸다.

Phe:페닐알라닌

Cit:시트룰린

Val:발린

APP:2-아미노-3-페닐프로판올

(6) 용해도 : 메탄올과 디메틸설폭시드에 잘 녹고, 에탄올에 조를 녹는다. 클로로포론, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 및 헥산에는 거의 녹지 않는다.

(7) 정색 반응 :

에를리히 반응 : 양성

사까구찌 반응과 닌히드린 반응 : 음성

(8) 융점 : 157-158℃

(9) 비선광도 :

(c=3.56mg/mℓ, 메탄올)

(10) 고성능 액체 크로마토그래피 : 하기 조건에 있어서 보지시간(t_R) 5.8분에 피크를 부여 한다.

칼럼 : 이널트실(Inertsil) ODS-2.5μm

(내경 4.6mm/150mm, 지엘 사이언스)

이동상 : 아세토니트릴/트리플루오로아세테이트/물

(35 : 0.05 : 65, v/v/v)

유속 : 1mℓ/분

검출 : 210nm(0.04 a.u.f.s )

[시험예 1]

FA-70D 물질의 효소저해활성의 측정

카텝신 L 또는 카텝신 B에 대한 저해활성은 A. J. 바레트(Barrett) 등의 방법(바이오케미컬지(Biochemical Journal), 201, 189-198, 1982)에 의하여 측정하였다. 키모트립신 또는 트립신 저해활성의 측정은 츠루 대사전 및 후나스 쇼우헨저 생화학 실험법 단백질 분해 효소 II, 31권, 7-14 항, 1993년에 따랐다.

카텝신 B에 대한 저해활성의 측정방법은 다음과 같다. 8mM 디티오트레이톨 및 4mM의 테트라소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트를 함유하는 400mM의 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 0.5mℓ와, 5μM의 카텝신 B와 0.1% 브리지 35(와코쥰야쿠(주) 제품)를 함유하는 효소액 0.8mℓ, 및 본 발명의 화합물을 함유하는 수용액 0.2mℓ를 40℃에서 10분간 프리인큐베이션 하였다. 그 이후, 20μM의 카르보벤즈옥시-L-페닐알라닐-L-알르기닌-4-메틸쿠마릴-7-아미드를 함유하는 0.1% 디메틸설폭시드 수용액 0.5mℓ를 첨가하고, 그 혼합물을 40℃에서 10분간 인큐베이션 하였다. 100mM의 모노클로로아세트산 나트륨을 함유하는 l00mM의 아세트산나트륨 완충액(pH 4.3) 2.0mℓ를 첨가함으로써 효소반응을 정지시켰다. 여기파장 350nm 및 방출파장 458nm에서 형광 강도(F)를 측정하였다. 대조군으로서, 본 발명의 화합물을 함유하는 수용액 0.2mℓ 대신에 물 0.2mℓ를 첨가하였고, 같은 방법으로 458nm에서 형광 강도(F₀)를 측정하였다. 다음 수학식 1에 의해 효소저해활성을 산출하였다.

[수학식 1]

효소저해활성(%) = F/F0*100

카텝신 L에 대한 저해활성은 다음과 같이 측정하였다. 카텝신 B대신에 카텝신 L을 같은 농도로 사용하고 400mM의 인산나트륨 완충액을 pH 5.5로 조절하는 것을 제외하고는, 카텝신 B에 대한 저해활성측정법을 반복하여 효소저해찰성을 산출하였다.

키모트립신에 대한 저해활성은 다음과 같이 측정하였다. 100mM상의 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 0.1mℓ와, 물 0.15mℓ, 5ng/mℓ의 키모트립신 수용액 0.01mℓ, 및 본 발명의 화합물을 함유하는 수용액 0.04mℓ를 37℃에서 5분간 프리인큐베이션하였다.

그런 다음, 100μM의 숙시닐-L-로이실-L-로이실-L-발릴-L-티로신-4-메틸-쿠마릴-7-아미드를 함유하는 수용액 0.lmℓ를 첨가하였고, 그 혼합물을 37℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 100mM의 모노클로로아세트산 나트륨을 함유하는 100mM의 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.3) 0.5m1을 첨가해서 효소 반응을 정지시키고, 여기 파장 350nm와 방출파장 458nm에서 형광 광도(F)를 측정하였다. 대조군으로서, 본 발명의 화합물을 함유하는 수용액 0.04mℓ 대신에 물 0.4mℓ를 첨가하였고 같은 방법으로 458nm에서 형광 강도(F₀)를 측정하였다. 다음 수학식 1에 따라 효소저해활성을 산출하였다.

[수학식 1]

효소저해활성(%) = F/F0*100

트립신에 대한 저해활성은 다음과 같이 측정하였다. 키모트립신 대신에 트립신을 같은 농도로 사용하고 숙시닐-L-로이실-L-로이실-L-발릴-L-티로신- 7-메틸쿠마릴-7-아미드 대신에 벤조일 -L-로이실-L-리실-알르기닌-7-메틸쿠마릴-7-아미드를 같은 농도로 사용하는 것을 제외하고는, 키모트립신에 대한 저해활성측정법을 반복하였고 상기와 같은 방법으로 효소저해할성을 계산하였다.

그 결과를 표 4에 나타낸다.

험예 1 에서 명백한 것 처럼, 본 발명의 FA-70D물질은 카텝신 B에 비해 카텝신 L 을 보다 강하게 저해하고, 트립신에 비해 키모트립신을 보다 강하게 저해하였다.

상기 배합비율로, 통상의 방법에 따라 캅셀제를 제조하였다.

상기 배합비율로, 통상의 방법에 따라 주사제를 제조하였다.

상기 배합비율로, 통상의 방법에 따라 좌약을 제조하였다.

본 발명의 발명자들은, 천연 토양로부터 많은 미생물을 분리하고, 그것들이 생산하는 대사산물 중에서 카텝신류 프로티아제를 저해하는 물질을 조사하였다. 그 결과 FA-70 주로 표시되는 방(사)선균류에 속하는 균주의 배양물에서 카텝신류 프로티아제 저해활성을 갖는 물질을 발견하고, 그 활성물질의 물리화학적 성상 및 구조를 확정하였다. 본 발명은 이 발견을 기초화하여 완성하였다.

본 발명의 화합물과 구조적으로 유사한 미생물에 의하여 생산되는 화합물로서는, Mer-N5075A(일본특허공개공보 제1994-100588호; 안티바이오틱스지(The Journal of Antibiotics), 46, 1622-1624, 1993)와, α-MAPI 및 β-MAPI(애그리컬처럴 앤드 바이올로지컬 케미스트리(Agricultural and Biological chemistry), 43, 243-250, 1979; 테트라헤드론 레터즈(Tetrahedron Letters), (7), 627-628, 1977), 및 GE20372 Factor A와 B(안티바이오틱스지(The Journal of Antibiotics), 48, 332-334, 1995)가 보고되어 있다. 그러나, 본 발명의 FA-70D 물질은, 펩티드 결합에 의하여 연결된 시트룰린 분자와 구조적으로 일치하는 신규 화합물이다. 본 발명의 화합물은 카텝신 L 저해제 또는 골다공증 치료제 등의 의약으로서 유용한 것이다.

즉, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 FA-70D 물질 또는 그 염에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속에 속하고, 배지에서 상기 FA~70D 물질을 생산할 수 있는 미생물을 배양하여 배양물 중에서 상기 물질을 생성, 축적하게 하고 이를 채취하는 건을 포함하여 구성되는 FA∼70D 물질 또는 그 염의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 FA-70D 물질 또는 그 염을 포함하여 구성되는 의약, 카텝신 L 저해제 또는 골다공증 치료제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 FA-70D 물질 또는 그 염 및 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 유효량의 상기 FA-70D 물질 또는 그 염을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 치료방법에 관한 것이다

또한, 본 발명은 상기 FA-70D 물질 또는 그 염의 의약으로의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 FA-70D 물질을 생성할 수 있는 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 FA-70D 물질은, 카텝신류 프로테아제를 강하게 저해하고, 동효소가 관여하는 각종 질환, 특히 골다공증 치료제로서 유용한 것이다.

Claims

다음 화학식 1로 표현되는 FA-70D 물질 또는 그 염.

[화학식 1]
스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하고, FA-70D 물질을 생산할 수 있는 균주를 배지에 배양하여 배양물 중에 FA-70D 물질을 생성, 축적하게 하고, 상기 배양물로부터 이것을 채취하는 것을 포함하여 구성되는 제 1 항에서 정의한 FA-70D 물질 또는 그 염의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 균주는 스트렙토마이세스 에스피. FA-70(Streptomyces sp. FA-70)주인 것을 특징으로 하는 FA-70D 물질 또는 그 염의 제조방법.
제1항에서 정의한 FA-70D 물질을 생산할 수 있는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 균.
제4항에 있어서, 상기 균이 스트렙토마이세스 에스피. FA-70(Streptomyces sp. FA-70)주인 것을 특징으로 하는 균.