JP3448334B2 - 新規生理活性物質ピペラスタチンａおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素阻害活性を有する
新規な生理活性物質ピペラスタチンＡ（Piperastatin
A）およびその製造法に関する。本発明のピペラスタチ
ンＡは医薬、動物薬、試薬等の分野への応用が期待され
る。

【０００２】

【従来の技術】セリンカルボキシペプチダーゼは、活性
中心にセリン残基が存在するカルボキシペプチダーゼで
ある。セリンカルボキシペプチダーゼとしては、カルボ
キシペプチダーゼＹおよび血小板デアミダーゼなどが知
られている。

【０００３】血小板デアミダーゼはサブスタンスＰをは
じめとするタキキニンやブラジキニンなどのペプチドを
分解する〔The Journal of Biological Chemistry 、26
5 巻、11265 〜11272 頁、1990年〕。血小板デアミダー
ゼによって分解されるサブスタンスＰは血栓溶解活性化
作用を有することが報告されている〔Experimentia、49
巻、242 〜244 頁、1993年〕。したがってセリンカルボ
キシペプチダーゼ阻害剤は、抗血栓剤としての応用、な
らびにこれらの生理活性ペプチドの活性調節剤への応用
が期待される。

【０００４】ラット尿中には、ブラジキニンを分解する
カルボキシペプチダーゼＹ様酵素が存在し、当酵素は尿
中のブラジキニンを分解することで高血圧症の発症に関
与していることが報告されている〔European Journal o
f Pharmacology、232 巻、181 〜190 頁、1993年〕。し
たがってセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は尿中の
ブラジキニンの生理作用を増強し、抗高血圧剤および利
尿剤などへの応用が期待される。

【０００５】セリンカルボキシペプチダーゼ阻害物質と
しては、ジイソプロピルフルオロリン酸〔蛋白質核酸酵
素、28巻、1421〜1431頁、1983年〕、キモスタチン〔Th
eJournal of Biological Chemistry 、265 巻、11265
〜11272 頁、1990年〕およびポストスタチン〔European
Journal of Pharmacology、232 巻、181 〜190 頁、19
93年〕などが報告されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ジイソプロピルフルオ
ロリン酸、キモスタチンおよびポストスタチンなどは、
セリンカルボキシペプチダーゼに対する酵素阻害活性の
特異性が低い。したがってセリンカルボキシペプチダー
ゼに対する特異性の高い酵素阻害剤が望まれている。本
発明の目的は、そのような特異性の高いセリンカルボキ
シペプチダーゼ阻害活性を有する新規な生理活性物質、
その製造法およびその用途を提供することにある。

【０００７】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上述の
要望にこたえるべく酵素阻害活性を有する物質の探索を
続けていたところ、ストレプトミセス属に属する１菌株
の培養物中にセリンカルボキシペプチダーゼ酵素阻害活
性を有する物質が生産されていることを見出し、有効物
質を単離することに成功した。そして、この物質の化学
構造を決定して新規な物質であることを認め、ピペラス
タチンＡと命名した。これらの知見に基づいて、本発明
を完成させた。本発明によると、新規な酵素阻害物質ピ
ペラスタチンＡならびにその製造法が提供された。

【０００８】すなわち、第１の本発明は、下記の式
〔Ｉ〕： で表わされるピペラスタチンＡおよびその製薬学的に許
容し得る塩を提供するものである。

【０００９】ピペラスタチンＡは水に難溶性の酸性物質
である。ピペラスタチンＡはその製薬学的に許容し得る
塩の形態に常法で転化できる。このような塩としては、
たとえばナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカ
リ金属およびカルシウムなどのアルカリ土類金属などと
の塩があげられる。

【００１０】ピペラスタチンＡの物理化学的性状は下記
の通りである。 （１）色および形状：無色針状結晶 （２）融点：225 〜228 ℃ （３）分子式：Ｃ₃₈Ｈ₆₇Ｎ₉ Ｏ₁₀ （４）マススペクトル：FAB-MS（pos.）m/z 810 （M+H)
⁺ （５）比旋光度：［α］_D -38.6 °（27.5℃、c 0.35、
メタノール） （６）紫外部吸収スペクトル（メタノール）：末端吸収 （７）赤外部吸収スペクトル：図１に示す （８） ¹H-NMR スペクトル：図２に示す （９）¹³C-NMR スペクトル：図３に示す （10）溶解性：メタノール、エタノール、プロパノール
に可溶で、水に難溶である （11）薄層クロマトグラフにおけるRf値：0.64 シリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社製、Art. 571
5)を用い、展開溶媒としてブタノール−メタノール−水
（４：１：２）を使用した。

【００１１】ピペラスタチンＡの酵素阻害活性は下記の
方法で測定できる。

【００１２】（ａ）本発明のピペラスタチンＡ（Pipera
statin A）のカルボキシペプチダーゼＹに対する酵素阻
害活性の評価は、カルボキシペプチダーゼＡ〔Journal
ofAntibiotics 、37巻、682 〜684 頁、1984年〕の酵素
阻害活性の測定法の変法で行った。すなわち、10mMのヒ
プリル-L- フェニルアラニン（ペプチド研究所製）0.01
ml、50mMのナトリウムリン酸緩衝液(pH6.5) 0.05ml、検
体としてピペラスタチンＡを含む水溶液0.034ml を加え
た混合液に、カルボキシペプチダーゼＹ（オリエンタル
酵母工業社製）0.05mg/ml と牛アルブミン１mg/ml を含
む水溶液を0.006ml 加えて、37℃、45分間反応させた。
1N苛性ソーダの0.006ml を加えて反応を停止し、10分後
に0.36M ナトリウムリン酸緩衝液（pH7.2)の0.05mlを加
え、次いで２％塩化シアヌルのメチルセロソルブ溶液0.
15mlを加えて発色させ、室温に10分放置後405nm におけ
る吸光度（ａ）を測定した。同時に、検体を省略して同
様に反応させ、反応液を同様に後処理した後に、同様に
測定した時の吸光度（ｂ）を測定した。なお、この時そ
れぞれに対する盲検の吸光度（ａ′）、（ｂ′）を測定
し、阻害率（％）を計算式〔１−（ａ−ａ′）／（ｂ−
ｂ′）〕×100 により計算した。50％阻害率を示す検体
の濃度をIC₅₀の値とした。

【００１３】この定量法でピペラスタチンＡは、0.055
μg/mlの濃度でカルボキシペプチダーゼＹを50％阻害し
た。

【００１４】（ｂ）ラット尿管尿におけるブラジキニン
の分解に対する本発明のピペラスタチンＡの阻害活性の
評価は、European Journal of Pharmacology、232 巻、
181〜190 頁（1993年）に記載の方法の改良法で行っ
た。12〜14週齢の雄のSDラットの尿管から採取した尿管
尿0.01mlに、検体としてのピペラスタチンＡと１μmol
／mlのブラジキニン（ペプチド研究所製）を含む0.85％
の塩化ナトリウム水溶液0.03mlとを加え、37℃で45分間
反応させた後、0.1 ％のトリフルオロ酢酸と10％のアセ
トニトリルを含む水溶液0.5ml を加え反応を止めた。反
応液をポアーサイズ0.45μm のメンブレン（日本ミリポ
ア社製）に通したあと、そのうち0.1ml を高速液体クロ
マトグラフィーに供しブラジキニンの分解を測定した。

【００１５】すなわち1.5ml/min の流速でＡ液（0.1 ％
のトリフルオロ酢酸を含む10％のアセトニトリル水溶
液）を用いて平衡化したShodex RS pack DS-613 カラム
（昭和電工社製）に前記の反応液を吸着させ、さらに３
分間Ａ液でカラムを洗浄したのち、Ａ液からＢ液(0.1％
のトリフルオロ酢酸、40％のアセトニトリル水溶液）へ
の25分間の直線濃度勾配条件で溶出した。さらにＢ液か
らＣ液(0.1％のトリフルオロ酢酸、70％のアセトニトリ
ル水溶液）への５分間の直線濃度勾配で溶出し、溶出液
の210nm における吸光度を測定した。

【００１６】反応液中のブラジキニンとＣ末端のアルギ
ニン残基を切断されたdes-Arg9- ブラジキニンの濃度
は、クロマトグラフィーの吸収ピークの面積を測定し、
基準物質（ともにペプチド研究所製）を用いた外部標準
法によって定量できる。

【００１７】上記の試験法（ｂ）に従って、ラットの尿
管尿に上記の通りブラジキニンを含む水溶液を加え、37
℃，45分間培養して反応させ、その後に上記の通りトリ
フルオロ酢酸とアセトニトリルを含む水溶液の添加によ
り反応を停止させて得られた反応液を上記の条件の高速
液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し、上記の如く溶
出して溶出液の210nm における吸光度を測定した。この
場合に測定された吸光度の変化と滞留時間（分）との関
係を表わす曲線図を添付図面の図４ａに示す。この場
合、ブラジキニンは当初濃度0.75μmol/mlで存在した
が、37℃，45分間の反応で分解されて0.27μmol/mlの濃
度に減少したことが測定した吸光度曲線から認められ
た。また、ブラジキニンの分解により0.18μmol/mlの濃
度のdes-Arg9-ブラジキニンが生成したことが認められ
た。

【００１８】他方、ラットの尿管尿に上記の通りのブラ
ジキニンを含む水溶液を加えると共にピペラスタチンＡ
を50μg/mlの濃度で添加して上記の条件で培養して反応
させ、その後に同様に反応停止させて得られた反応液を
上記の条件でHPLCにかけ溶出し且つ溶出液の210nm にお
ける吸光度を測定した。この後者の場合に測定された吸
光度の変化と滞留時間（分）との関係を表わす曲線図を
添付図面の図４ｂに示す。

【００１９】後者の場合に測定された吸光度曲線から
は、des-Arg9- ブラジキニンの生成は0.02μmol/ml以下
に阻害され、ブラジキニンの残存量は0.67μmol/mlとな
り、ブラジキニンの分解が抑制されたことが認められ
た。

【００２０】さらに第２の本発明の要旨は、ストレプト
ミセス属に属する前記の式〔Ｉ〕で表わされるピペラス
タチンＡの生産菌を培養し、その培養物からピペラスタ
チンＡを採取することを特徴とするピペラスタチンＡの
製造法にある。

【００２１】本発明の方法に使用されるピペラスタチン
Ａの生産菌の一例としては、本発明者らにより分離され
た放線菌であるストレプトミセス属MJ908-WF13がある。

【００２２】MJ908-WF13株の菌学的性状は下記の通りで
ある。

【００２３】１．形 態 MJ908-WF13株は、分枝した基生菌糸よりらせん状の気菌
糸を伸長する。輪生枝及び胞子のうは認められない。成
熟した胞子鎖には50個以上の円筒形の胞子の連鎖を認
め、胞子の大きさは約0.5 〜0.9 ×0.7 〜1.0 ミクロン
であった。なお、胞子の表面は平滑である。

【００２４】２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（Container Corporation ofAmerica
のcolor harmony manual）を用いた。

【００２５】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27
℃培養） 無色の発育上に、うすピンク［5gc, Peach Tan〜4ec, B
isque]の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認め
られない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃培養） うす黄［1ca, Cream］の発育上に、うすピンク［5ca, P
ale Peach 〜4gc,Nude Tan］の気菌糸をうっすらと着生
し、溶解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地
５、27℃培養） うす黄［3ca, Pearl Pink]の発育上に、うすピンク［5g
c, Peach Tan］〜うす赤茶［5ie, Copper Tan]の気菌糸
を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びる。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ISP-培地４、27℃培
養） うす黄［3ca, Pearl Pink]の発育上に、うすピンク［5g
c, Peach Tan〜4ec,Bisque］の気菌糸を着生し、溶解性
色素は茶色味を帯びる。

【００２６】（５）チロシン寒天培地（ISP-培地７、27
℃培養） うす茶［3 lg, Lt Brown〜3ig, Beige Brown］の発育上
に、うすピンク［5ec,Dusty Peach 〜5gc, Peach Tan］
の気菌糸を着生する。溶解性色素は暗い茶を呈する。 （６）栄養寒天培地（27℃培養） 明るい黄味だいだい［2gc, Bamboo 〜3gc, Lt Tan]の発
育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は
認められない。 （７）イースト・麦芽寒天培地（ISP-培地２、27℃培
養） うす黄茶［2ic, Honey Gold]の発育上に、うすピンク
［5ec, Dusty Peach］〜ピンク灰［5ge, Rosewood]の気
菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。 （８）オートミール寒天培地（ISP-培地３、27℃培養） うす黄茶［2ic, Honey Gold ］の発育上に、うすピンク
［5ec, Dusty Peach〜5gc, Peach Tan］の気菌糸を着生
し、溶解性色素は茶色味を帯びる。 （９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培養） うす黄［3ca, Pearl Pink]の発育上に、白の気菌糸をう
っすらと着生し、溶解性色素は認められない。

【００２７】（10）スターチ寒天培地（27℃培養） 無色の発育上に、うすピンク［5gc, Peach Tan〜4ec, B
isque]の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認め
られない。 （11）リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養） 無色〜うす黄の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生
し、溶解性色素は認められない。 （12）セルロース（ろ紙片添加合成液、27℃培養） 53日間の培養では生育しなかった。 （13）ゼラチンの穿刺培養 15％単純ゼラチン培地（20℃培養）では、うす黄〜黄茶
の発育上に、うすピンクの気菌糸を着生し、溶解性色素
は茶色味を帯びる。グルコース・ペプトン・ゼラチン培
地（24℃培養）の場合、無色〜うす黄の発育上に、うす
ピンクの気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色を呈する。 （14）脱脂牛乳（37℃培養） 発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認めら
れない。

【００２８】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン 1.0％、イ
ースト・エキス 0.2％、ひも寒天3.0 ％、pH7.0)を用
い、10℃、20℃、24℃、27℃、30℃、37℃、50℃の各温
度で試験した結果、50℃を除き、そのいずれの温度でも
生育する。生育至適温度は27℃〜30℃付近と思われる。 （２）ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン培地、20℃培
養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、24℃培養） 単純ゼラチン培地においては49日間の培養で液化が認め
られなかった。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地に
おいては培養後16日目頃より液化が認められ、３週間を
経過しても完了しなかった。その作用は弱い方である。 （３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培
地、ISP-培地４及びスターチ寒天培地、いずれも27℃培
養） いずれの培地においても培養後３日目頃より水解性が認
められ、その作用は強い方法である。

【００２９】（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂
牛乳、37℃培養） ２回試験を行い、１回目は培養後18日目頃より凝固状を
呈し、２〜３日で完了後、ペプトン化が始まった。更に
ペプトン化は３週間の培養で完了せず、その作用は中等
度〜弱い方である。２回目は培養後16日目頃より凝固な
しにペプトン化が始まり、培養３週間で完了した。その
作用は中等度である。 （５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ISP-培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培
地、ISP-培地６；チロシン寒天培地、ISP-培地７；いず
れも27℃培養） いずれの培地においても陽性である。

【００３０】（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴト
リーブ寒天培地、ISP-培地９、27℃培養） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースを
利用して発育し、ラクトース、Ｄ−フラクトース、シュ
クロース、イノシトール、ラフィノース及びＤ−マンニ
トールは利用しない。ラムノースはおそらく利用しな
い。 （７）硝酸塩の還元反応（0.1 ％硝酸カリウム含有ペプ
トン水、ISP-培地８、27℃培養）陽性である。 （８）セルロースの分解（ろ紙片添加合成液、27℃培
養） 53日間の観察で分解は認められない。

【００３１】以上の性状を要約すると、MJ908-WF13株
は、その形態上、基生菌糸よりらせん状の気菌糸を伸長
し、輪生枝及び胞子のうは認められない。成熟した胞子
鎖には50個以上の円筒形の胞子を連鎖し、その表面は平
滑である。種々の培地で、発育はうす黄〜うす黄茶、気
菌糸はうすピンク〜ピンク灰を呈し、溶解性色素は茶色
味を帯びる。生育至適温度は27〜30℃付近である。メラ
ニン様色素の生成は陽性、蛋白分解力は中等度〜弱い
方、スターチの水解性は強い方である。なお、細胞壁に
含まれる２、６−ジアミノピメリン酸は、LL- 型であっ
た。

【００３２】これらの性状より、MJ908-WF13株は、スト
レプトミセス（Streptomyces）属に属すると考えられ
る。本物質と類似の構造のデプシドマイシン(depsidomy
cin,文献、The Journal of Antibiotics、43巻、1195
頁、1990年）の生産菌でストレプトミセス・ラベンドフ
ォリエ（Streptomyces lavendofoliae ；文献１、Inte
rnational Journal of Systematic Bacteriology,18
巻,333頁, 1968年；文献２，International Journal of
Systematic Bacteriology, 30巻,390頁, 1980年；文献
３，Berqey's Manual of Systematic Bacteriology, ４
巻, 2490項, 1989年）と同定されたMI951-62F2株が近縁
の種としてあげられた。

【００３３】そこで当研究所保存のMI951-62F2株、スト
レプトミセス・ラベンドフォリエISP5217T株およびMJ90
8-WF13株とを実地に比較検討した。その成績の大要を次
表にする。

【００３４】

【表１】

【００３５】表１から明らかなように、MJ908-WF13株と
ストレプトミセス・ラベンドフォリエISP5217T株とは、
硝酸塩の還元反応及びイノシトールの利用性を除き、よ
く一致した性状を示した。また、本菌株とストレプトミ
セス・ラベンドフォリエ MI951-62F2株とは、ゼラチン
の液化を除き、いずれの性状においてもよく一致してい
た。しかし、前回のMI951-62F2株の同定試験の際にはグ
ルコース・ペプトン・ゼラチン培地においてゼラチンの
液化が弱いことが認められた。これらのことから、MJ90
8-WF13株はストレプトミセス・ラベンドフォリエ IMC
S-0784（MI951-62F2）に最も近縁であると考えられる。
そこで、MJ908-WF13株をストレプトミセス・ラベンドフ
ォリエ（Streptomyces lavendofoliae ）MJ908-WF13と
同定した。

【００３６】なお、MJ908-WF13株をつくば市所在の工業
技術院 生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成５
年11月１日、FERM P-13940として受託された。

【００３７】MJ908-WF13株は、他の放線菌に見られるよ
うにその性状が変化し易い。例えば、MJ908-WF13株の、
またはこの株に由来する突然変異株（自然発生または誘
発性）、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、
ピペラスタチンＡを生産する菌は全て本発明に使用でき
る。

【００３８】ピペラスタチンＡ生産菌の培養について以
下に説明する。

【００３９】本発明の方法では、前記の生産菌を通常の
微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。
炭素源としては、グルコース、シュクロース、水飴、デ
キストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等
を使用しうる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦、
小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エ
キス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、尿素等を使用しうる。その他必要に応じ、
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コ
バルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成
することができる無機塩類を添加することは有効であ
る。また、菌の発育を助け、ピペラスタチンＡの生産を
促進するような有機および無機物を適当に添加すること
ができる。

【００４０】ピペラスタチンＡ生産菌の培養法として
は、好気的条件での培養法、特に深部培養法が最も適し
ている。培養に適当な温度は15〜37℃であるが、多くの
場合26〜30℃付近で培養する。ピペラスタチンＡの生産
は培地や培養条件により異なるが、振盪培養、タンク培
養のいずれにおいても通常１〜10日間でその蓄積が最高
に達する。培養中のピペラスタチンＡの蓄積量が最高に
なった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精
製する。

【００４１】ピペラスタチンＡの採取と精製は次のよう
に行われる。すなわち、本発明によって得られるピペラ
スタチンＡの培養物からの採取に当たっては、その性状
を利用した通常の分離手段、例えば、溶剤抽出法、イオ
ン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル
ろ過法、透析法、沈澱法等を単独でまたは適宜組み合わ
せて抽出精製することができる。例えば、ピペラスタチ
ンＡは、培養菌体中からはメタノール等の有機溶剤で抽
出される。また、培養液中に蓄積されたピペラスタチン
Ａは、クロマトグラフ用活性炭（和光純薬工業株式会社
製）などの吸着剤に吸着させ、有機溶剤と水の混合液で
溶出される。たとえば、70％プロパノールなどでピペラ
スタチンＡは溶出される。ピペラスタチンＡを更に精製
するには、シリカゲル（ワコーゲル C-300、和光純薬工
業社製等）あるいはYMC-GEL ODS-A60-200/60（株式会社
山村化学研究所製）等を用いるクロマトグラフィーまた
は向流分配法などを行うとよい。

【００４２】以上のような方法により、あるいはこれら
を適宜組み合わせることにより、高純度のピペラスタチ
ンＡが得られる。

【００４３】ピペラスタチンＡの急性毒性を評価するた
めに、ピペラスタチンＡをマウスに腹腔内投与して２週
間観察した結果、100mg/kgの投与でも毒性を示さなかっ
た。

【００４４】第１の本発明によるピペラスタチンＡまた
はその塩は、その酵素阻害活性を有することからセリン
カルボキシペプチダーゼ阻害剤として利用できる。

【００４５】従って、第３の本発明によると、ピペラス
タチンＡまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分
として含有するセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤が
提供される。

【００４６】更に、ピペラスタチンＡはセリンカルボキ
シペプチダーゼに対して高い特異性で酵素阻害活性を有
することに由り抗高血圧剤または利尿剤として利用でき
る。

【００４７】それ故、第４の本発明によると、ピペラス
タチンＡまたはその製薬学的に許容できる塩を有効成分
として含有する抗高血圧剤が提供される。

【００４８】また、第５の本発明によると、ピペラスタ
チンＡまたはその製薬学的に許容できる塩を有効成分と
して含有する利尿剤が提供される。

【００４９】第１の本発明によるピペラスタチンＡまた
はその塩は、抗高血圧剤またはその他の医薬として使用
する場合、製薬学的に許容できる通常の固体または液体
状の担体と混和することにより医薬組成物として製剤で
きる。

【００５０】従って、本発明の抗高血圧剤と利尿剤は、
ピペラスタチンＡまたはそれの製薬学的に許容される塩
を有効成分として含有し且つこれと混和された製薬学的
に許容できる固体または液体状の担体を含有する医薬組
成物の形であることができる。

【００５１】本発明によるピペラスタチンＡまたはその
塩は、医薬として用いる場合は、一般に経口的にまたは
非経口的に投与できる。

【００５２】ピペラスタチンＡはマウスに腹腔内投与し
た場合に100mg/kg以上のLD₅₀値を示し、毒性が低い。

【００５３】ピペラスタチンＡまたはその製薬学的に許
容できる塩は、賦形剤あるいは担体と混合して注射剤、
経口剤または坐剤などの製剤の形で投与される。賦形剤
および担体としては製薬学上許容されるものが選ばれ、
その種類および組成は投与経路や投与方法によって決ま
る。例えば、液状担体として水、アルコールもしくは大
豆油、ゴマ油、ミネラル油などの動植物油、または合成
油などが用いられる。固体担体としてマルトース、シュ
クロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類、ヒドロ
キシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、シク
ロデキストリンなどの多糖類、ステアリン酸マグネシウ
ムなどの有機酸塩などが使用される。

【００５４】注射剤として製剤する場合には、液状担体
は一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシ
トール、マンニトールなどの糖類溶液、エチレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、などのグリコール類で
あることができる。また、イノシトール、マンニトー
ル、グルコース、マンノース、マルトース、シュクロー
スなどの糖類、フェニルアラニンなどのアミノ酸類など
の賦形剤と共に凍結乾燥製剤とし、それを投与時に注射
用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖
液、電解質溶液、アミノ酸などの静脈投与用液体に溶解
して使用できる。

【００５５】製剤された組成物中におけるピペラスタチ
ンＡの含量は製剤型により種々異なるが、通常は0.1 〜
100 重量％、好ましくは１〜90重量％である。例えば注
射液の場合には、通常、0.1 〜５重量％の含量でピペラ
スタチンＡを含むようにすることがよい。経口投与の場
合には、前記固体担体もしくは液状担体と共に錠剤、カ
プセル剤、粉剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シ
ロップ剤などの形態で用いられる。カプセル、錠剤、顆
粒、粉剤の場合、一般にピペラスタチンＡの含量は３〜
100 重量％、好ましくは５〜90重量％であり、残部は担
体である。

【００５６】本発明によるピペラスタチンＡまたはその
塩の投与量は、患者の年令、体重、症状、治療目的など
により決定される。しかし、その投与量は動物試験の結
果など種々の状況を勘案して総投与量が一定量を越えな
い範囲で、連続的または間けつ的に投与できる。一定の
条件下における投与の適量と投与回数は、専門医の決定
による。

【００５７】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、ピペラスタ
チンＡの性状が本発明によって明らかにされたので、そ
れらの性状にもとずきピペラスタチンＡの製造法を種々
考案することができる。従って本発明は実施例に限定さ
れるものではなく、実施例の修飾手段は勿論、本発明に
よって明らかにされたピペラスタチンＡの性状にもとず
いて公知の手段を施してピペラスタチンＡを生産、濃
縮、抽出、精製する方法をすべて包括する。

【００５８】実施例１ 種培地として、グルコース 2.0％、グリセリン 2.0％、
ファーマメディア 1.0％、トーストソーヤ 1.2％、塩化
ナトリウム 0.5％、炭酸カルシウム 0.32 ％、塩化マン
ガン４水和物 0.005％の組成からなる培地を用いた。な
お、殺菌前のpHは7.4 に調整した。

【００５９】前記の種培地（110ml)を分注した500ml 容
三角フラスコを120 ℃で20分間殺菌し、これにストレプ
トミセス属MJ908-WF13株（FERM P-13940）の斜面寒天培
養の１白金耳を接種し、毎分180 回転の回転式振盪器を
用いて26℃で48時間振盪培養して種培養とした。次いで
前記の培地（110ml)を分注した500ml 容三角フラスコを
120 ℃で20分間殺菌し、これに種培養2ml を接種し、30
℃で７日間振盪培養した。培養終了後、濾過助剤として
珪藻土を加えて濾過し、培養濾液を得た。

【００６０】上記のようにして得られた培養濾液10L を
クロマトグラフ用活性炭（和光純薬工業株式会社製）1L
のカラムに吸着させ、2Lの精製水で洗浄したのち4Lの70
％プロパノール水で溶離し、活性画分を含む溶離液を減
圧濃縮して褐色の粗物質23.4ｇを得た。

【００６１】この粗物質を精製水に溶解したのち、250m
l のYMC-GEL ODS-A60-200/60（株式会社山村化学研究所
製）に吸着させ、4Lの0 〜100 ％メタノール水の濃度勾
配法によって溶離し、活性画分を含む溶離液を凍結乾燥
し活性粗粉末414mg を得た。

【００６２】この粉末をL. L. N.モデルNMF(三鬼エンジ
ニアリング社製）による遠心液液分配クロマトグラフを
用いて精製に供した。すなわちクロロホルム−メタノー
ル−水（５：６：４）の溶媒系の上層を固定相液とし下
層を移動相液として20℃、遠心部の回転数を毎分700 回
転、移動相液の流速を毎分10mlの条件で展開し、移動相
液を500ml 送液したのち、固定相液を逆方向に送液して
固定相中の移動度の低いものから順に溶離した。得られ
た活性画分のうち不純物の混在する画分を、前記の条件
の遠心液液分配クロマトグラフを用いて精製に供した。
この操作を繰り返し最終的に３度の遠心液液分配クロマ
トグラフを行い、不純物の混在しない画分を分離した。
これを凍結乾燥して30mgのピペラスタチンＡの白色粉末
を得た。

【００６３】さらにこの粉末をメタノールと精製水中で
結晶化させることによりピペラスタチンＡの無色針状結
晶17mg（融点225 〜228 ℃）を単離した。

【００６４】上記の培養工程中のピペラスタチンＡの追
跡は、カルボキシペプチダーゼＹに対する酵素阻害活性
で、また精製工程中での追跡は、酵素阻害活性に加えて
展開溶媒としてブタノール−メタノール−水（４：１：
２）あるいはクロロホルム−メタノール−水（65：25：
２）によるシリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社
製、Art. 5715)を用いて行った。

【００６５】

【発明の効果】本発明のピペラスタチンＡ物質は、セリ
ンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有しており、新し
い薬理作用を有する薬剤としての有用性が期待される。
また、尿中におけるブラジキニンの分解を抑制すること
から利尿剤あるいは抗高血圧剤などとしての有用性が期
待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ピペラスタチンＡの臭化カリウム錠内での赤外
線吸収スペクトルである。

【図２】ピペラスタチンＡの重メタノール溶液中での 4
00 MHz ¹H-NMR スペクトルである。

【図３】ピペラスタチンＡの重メタノール溶液中での10
0 MHz ¹³C-NMR スペクトルである。

【図４】（ａ）尿管尿にブラジキニンを添加して一定時
間で反応させた後に反応を停止させて得られた反応液中
のブラジキニンの残存量と生成したdes-Arg9- ブラジギ
ニンの量とを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定
した場合における溶出液の吸光度(210nmでの）の変化と
滞留時間（分）との関係を示す曲線図である。 （ｂ）尿管尿にブラジキニンとピペラスタチンＡ（50μ
g/ml）とを添加して反応させた後に反応を停止させて得
られた反応液中のブラジキニンの残存量と生成したdes-
Arg9- ブラジキニンの量を同様にHPLCで測定した場合に
おける溶出液の吸光度（210nm での）の変化と滞留時間
（分）との関係を示す曲線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｒ 1:465 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 高橋 良和 東京都多摩市桜ケ丘３丁目２番地の３ (72)発明者 村上 省一 神奈川県川崎市川崎区日進町23番地８ メイカハイム川崎705号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 7/06 A61K 38/55 C12N 9/99 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の式〔Ｉ〕： で表わされる生理活性物質ピペラスタチンＡまたはその
   製薬学的に許容し得る塩。
2. 【請求項２】 ストレプトミセス(Streptomyces)属に属
   して上記の式〔Ｉ〕で表わされるピペラスタチンＡを生
   産する菌を培養し、その培養物からピペラスタチンＡを
   採取することを特徴とする生理活性物質ピペラスタチン
   Ａの製造法。
3. 【請求項３】 ピペラスタチンＡあるいはその製薬学的
   に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴と
   するセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤。
4. 【請求項４】 ピペラスタチンＡあるいはその製薬学的
   に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴と
   する抗高血圧剤。
5. 【請求項５】 ピペラスタチンＡあるいはその製薬学的
   に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴と
   する利尿剤。