JPH07291924A - 新規生理活性物質ピロスタチンおよびその製造方法 - Google Patents
新規生理活性物質ピロスタチンおよびその製造方法Info
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- JPH07291924A JPH07291924A JP9234094A JP9234094A JPH07291924A JP H07291924 A JPH07291924 A JP H07291924A JP 9234094 A JP9234094 A JP 9234094A JP 9234094 A JP9234094 A JP 9234094A JP H07291924 A JPH07291924 A JP H07291924A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 式（Ｉ）
【化１】
（式中ＲはＯＨ又はＨを示す。）で表される化合物であ
ることを特徴とする生理活性物質ピロスタチンＡ（Ｒ＝
ＯＨ）およびＢ（Ｒ＝Ｈ）又はその薬理学的に許容し得
る塩を提供する。 【効果】 ピロスタチンＡ及びＢはＮ−アセチルグルコ
サミニダーゼを強く阻害した。
ることを特徴とする生理活性物質ピロスタチンＡ（Ｒ＝
ＯＨ）およびＢ（Ｒ＝Ｈ）又はその薬理学的に許容し得
る塩を提供する。 【効果】 ピロスタチンＡ及びＢはＮ−アセチルグルコ
サミニダーゼを強く阻害した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＮ−アセチルグルコサミ
ニダーゼ阻害作用を有する新規な生理活性物質ピロスタ
チン（Ｐｙｒｏｓｔａｔｉｎ）、その製造法およびその
用途ならびにストレプトマイセス属の新規放線菌に関す
る。
ニダーゼ阻害作用を有する新規な生理活性物質ピロスタ
チン（Ｐｙｒｏｓｔａｔｉｎ）、その製造法およびその
用途ならびにストレプトマイセス属の新規放線菌に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞表面に存在する糖蛋白や糖脂
質の糖鎖が、細胞間の認識や情報伝達および細胞の分化
に、重要な役割を果たしていることが明らかにされてき
た。すなわち、これらの糖鎖は、細胞の相互認識、増
殖、分化、癌化、癌転移、免疫機能、神経突起増強、受
精、ウイルス感染などの生体機能の発現、増強に密接に
係わっていることが明らかになってきた〔細胞工学、第
５巻、７月号、５６４〜６６９頁（１９８６年）〕。一
方、糖加水分解酵素や糖転移酵素は、動物細胞、微生
物、ウイルスなどに幅広く分布し、生合成や分解を通し
て、これら糖鎖が係わる多種多様な作用を支配している
と考えられている。このことは、これら酵素の阻害剤
が、上記生体機能の解明に役立つばかりでなく、これら
酵素の異常によって引き起こされる糖蛋白質や糖脂質の
糖鎖の無秩序に起因する疾病に対して治療剤となる可能
性を示唆している。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
は、細胞表面に存在する糖蛋白や糖脂質の糖鎖からＮ−
アセチルグルコサミンを遊離させるエキソ型加水分解酵
素である。尿中でのＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活
性の上昇は、腎臓の尿細管障害を示している〔Journal
of Pathology、第１１８巻、１７１〜１８２頁（１９７
６）〕。また血清中でのＮ−アセチルグルコサミニダー
ゼ活性の上昇が、糖尿病〔Biochemical Medicine、２７
巻、２１４〜２２５頁（１９８２）〕、白血病〔Leukem
ia Research 、第７巻、６１１〜６１９頁（１９８
３）〕、癌〔Cancer、第５８巻、１４８４〜１４８７頁
（１９８６）〕において認められている。
質の糖鎖が、細胞間の認識や情報伝達および細胞の分化
に、重要な役割を果たしていることが明らかにされてき
た。すなわち、これらの糖鎖は、細胞の相互認識、増
殖、分化、癌化、癌転移、免疫機能、神経突起増強、受
精、ウイルス感染などの生体機能の発現、増強に密接に
係わっていることが明らかになってきた〔細胞工学、第
５巻、７月号、５６４〜６６９頁（１９８６年）〕。一
方、糖加水分解酵素や糖転移酵素は、動物細胞、微生
物、ウイルスなどに幅広く分布し、生合成や分解を通し
て、これら糖鎖が係わる多種多様な作用を支配している
と考えられている。このことは、これら酵素の阻害剤
が、上記生体機能の解明に役立つばかりでなく、これら
酵素の異常によって引き起こされる糖蛋白質や糖脂質の
糖鎖の無秩序に起因する疾病に対して治療剤となる可能
性を示唆している。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
は、細胞表面に存在する糖蛋白や糖脂質の糖鎖からＮ−
アセチルグルコサミンを遊離させるエキソ型加水分解酵
素である。尿中でのＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活
性の上昇は、腎臓の尿細管障害を示している〔Journal
of Pathology、第１１８巻、１７１〜１８２頁（１９７
６）〕。また血清中でのＮ−アセチルグルコサミニダー
ゼ活性の上昇が、糖尿病〔Biochemical Medicine、２７
巻、２１４〜２２５頁（１９８２）〕、白血病〔Leukem
ia Research 、第７巻、６１１〜６１９頁（１９８
３）〕、癌〔Cancer、第５８巻、１４８４〜１４８７頁
（１９８６）〕において認められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、腎臓の尿細
管障害、糖尿病、白血病、癌等の疾病に関与する酵素で
あるＮ−アセチルグルコサミニダーゼの阻害物質として
有用な新規生理活性物質を提供することを目的とする。
管障害、糖尿病、白血病、癌等の疾病に関与する酵素で
あるＮ−アセチルグルコサミニダーゼの阻害物質として
有用な新規生理活性物質を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規な生
理活性物質ピロスタチンの生産菌である新規なストレプ
トマイセス属の放線菌を見い出し、この知見に基づいて
本発明をなすに至った。本発明の第１の発明は新規生理
活性物質ピロスタチンに関する発明であって、下記式
（Ｉ）：
理活性物質ピロスタチンの生産菌である新規なストレプ
トマイセス属の放線菌を見い出し、この知見に基づいて
本発明をなすに至った。本発明の第１の発明は新規生理
活性物質ピロスタチンに関する発明であって、下記式
（Ｉ）：
【化２】 （式中ＲはＯＨ又はＨを示す。）で表される生理活性物
質ピロスタチン又はその薬学的に許容し得る塩を提供す
るものである。
質ピロスタチン又はその薬学的に許容し得る塩を提供す
るものである。
【０００５】本明細書において、式（Ｉ）で表される化
合物は、Ｒが表す置換基の種類に対応してピロスタチン
Ａ（Ｒ＝ＯＨの化合物）及びピロスタチンＢ（Ｒ＝Ｈの
化合物）と命名される。ピロスタチンＡは下記式で表さ
れる。
合物は、Ｒが表す置換基の種類に対応してピロスタチン
Ａ（Ｒ＝ＯＨの化合物）及びピロスタチンＢ（Ｒ＝Ｈの
化合物）と命名される。ピロスタチンＡは下記式で表さ
れる。
【化３】 ピロスタチンＡの理化学的性質は下記の通りである。ピロスタチンＡの理化学的性状 （１） 色及び形状：白色粉末 （２） 分子式：Ｃ6 Ｈ10Ｎ2 Ｏ3 （３） 分子量：１５８ ＦＡＢ−ＭＳ(Positive) m/
z １５９ (M+H)+ （４） 融点：９２〜９４℃ （５） 比旋光度： [α] D 29 ＋１２５．４°（Ｃ
０．５、水） （６） 紫外線吸収スペクトル：２５μg/ml水溶液中で
２００〜４００nm間に特徴的な吸収を示さない。 （７） 赤外線吸収スペクトル：添付図面の図１に示
す。 （８） 水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図２
に示す。 （９） 炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３
に示す。 （１０）溶解性：水、ジメチルスルホキシド、メタノー
ルに可溶であり、クロロホルムに不溶である。 （１１）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０．３５ シリカゲル（メルク社製 Art.５７１５）薄層を用い、
展開溶媒としてブタノール−酢酸−水（２：１：１）を
用いた。
z １５９ (M+H)+ （４） 融点：９２〜９４℃ （５） 比旋光度： [α] D 29 ＋１２５．４°（Ｃ
０．５、水） （６） 紫外線吸収スペクトル：２５μg/ml水溶液中で
２００〜４００nm間に特徴的な吸収を示さない。 （７） 赤外線吸収スペクトル：添付図面の図１に示
す。 （８） 水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図２
に示す。 （９） 炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３
に示す。 （１０）溶解性：水、ジメチルスルホキシド、メタノー
ルに可溶であり、クロロホルムに不溶である。 （１１）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０．３５ シリカゲル（メルク社製 Art.５７１５）薄層を用い、
展開溶媒としてブタノール−酢酸−水（２：１：１）を
用いた。
【０００６】ピロスタチンＢは下記式で表される。
【化４】 ピロスタチンＢの理化学的性質は下記の通りである。ピロスタチンＢの理化学的性状 （１） 色及び形状：白色粉末 （２） 分子式：Ｃ6 Ｈ10Ｎ2 Ｏ2 （３） 分子量：１４２ ＦＡＢ−ＭＳ(Positive) m/
z １４３ (M+H)+ （４） 融点：９３〜９５℃ （５） 比旋光度： [α] D 30 ＋９８．４°（Ｃ
０．５、水） （６） 紫外線吸収スペクトル：２５μg/ml水溶液中で
２０５nmに吸収極大（ε：５３３１）を示す。 （７） 赤外線吸収スペクトル：添付図面の図４に示
す。 （８） 水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図５
に示す。 （９） 炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図６
に示す。 （９） 溶解性：水、ジメチルスルホキシド、メタノー
ルに可溶であり、クロロホルムに不溶である。 （１１）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０．３５ シリカゲル（メルク社製 Art.５７１５）薄層を用い、
展開溶媒としてブタノール−酢酸−水（２：１：１）を
用いた。
z １４３ (M+H)+ （４） 融点：９３〜９５℃ （５） 比旋光度： [α] D 30 ＋９８．４°（Ｃ
０．５、水） （６） 紫外線吸収スペクトル：２５μg/ml水溶液中で
２０５nmに吸収極大（ε：５３３１）を示す。 （７） 赤外線吸収スペクトル：添付図面の図４に示
す。 （８） 水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図５
に示す。 （９） 炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図６
に示す。 （９） 溶解性：水、ジメチルスルホキシド、メタノー
ルに可溶であり、クロロホルムに不溶である。 （１１）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０．３５ シリカゲル（メルク社製 Art.５７１５）薄層を用い、
展開溶媒としてブタノール−酢酸−水（２：１：１）を
用いた。
【０００７】ピロスタチンＡおよびＢはその薬学的に許
容し得る塩の形態にあってもよく、このような塩として
は、例えばナトリウム、カリウム、リチウムなどのアル
カリ金属および塩酸や硫酸などとの塩が挙げられる。
容し得る塩の形態にあってもよく、このような塩として
は、例えばナトリウム、カリウム、リチウムなどのアル
カリ金属および塩酸や硫酸などとの塩が挙げられる。
【０００８】本発明の第２の発明は、上記新規生理活性
物質ピロスタチンの製造法に関する発明であって、スト
レプトマイセス属に属するピロスタチン生産菌を栄養培
地中で培養し、その培養物から上記式（Ｉ）で表される
生理活性物質ピロスタチンを分離採取することからなっ
ている。
物質ピロスタチンの製造法に関する発明であって、スト
レプトマイセス属に属するピロスタチン生産菌を栄養培
地中で培養し、その培養物から上記式（Ｉ）で表される
生理活性物質ピロスタチンを分離採取することからなっ
ている。
【０００９】本発明の方法で用いるピロスタチン生産菌
は、１９９０年６月１３日岩手県大槌湾の水深１０５ｍ
から採集した海底堆積物より分離された新規な放線菌で
あって、菌株番号ＳＡ−３５０１を付されている。
は、１９９０年６月１３日岩手県大槌湾の水深１０５ｍ
から採集した海底堆積物より分離された新規な放線菌で
あって、菌株番号ＳＡ−３５０１を付されている。
【００１０】次に、本菌株ＳＡ−３５０１の菌学的性質
について記載する。
について記載する。
【００１１】本発明の方法で用いうるＳＡ−３５０１株
は菌糸幅が１ミクロン内外の放線菌であり、光学顕微鏡
下では本菌株の気菌糸上の胞子鎖はらせん状である。電
子顕微鏡下では桿状の胞子が観察され、その胞子表面は
平滑である。細胞壁の構成成分としては、Ｌ，Ｌ−ジア
ミノピメリン酸が検出され、電子顕微鏡でも、胞子嚢や
その他の特徴的な構造は認められない。以上の性状よ
り、本菌株はストレプトマイセス属の放線菌と考えられ
る。
は菌糸幅が１ミクロン内外の放線菌であり、光学顕微鏡
下では本菌株の気菌糸上の胞子鎖はらせん状である。電
子顕微鏡下では桿状の胞子が観察され、その胞子表面は
平滑である。細胞壁の構成成分としては、Ｌ，Ｌ−ジア
ミノピメリン酸が検出され、電子顕微鏡でも、胞子嚢や
その他の特徴的な構造は認められない。以上の性状よ
り、本菌株はストレプトマイセス属の放線菌と考えられ
る。
【００１２】本菌株の培養性状、生理学的性状ならびに
糖の資化性能の有無を以下の表１、表２、表３に示す。
なお、各種の糖の資化性能の有無は基礎培地としてデン
プンを除いたスターチ・無機塩培地を用い、それぞれの
糖１％を基礎培地に加えて判定した。
糖の資化性能の有無を以下の表１、表２、表３に示す。
なお、各種の糖の資化性能の有無は基礎培地としてデン
プンを除いたスターチ・無機塩培地を用い、それぞれの
糖１％を基礎培地に加えて判定した。
【００１３】なお、各種培地における色の記載について
はコンテイナー・コーポレーション・オブ・アメリカの
カラー・ハーモニー・マニアルを用いた。全ての性状試
験は２７℃において３週間培養後判定した。
はコンテイナー・コーポレーション・オブ・アメリカの
カラー・ハーモニー・マニアルを用いた。全ての性状試
験は２７℃において３週間培養後判定した。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【００１６】
【表３】
【００１７】上記の性状は本ＳＡ−３５０１株がストレ
プトマイセス属に属する放線菌であることを示す。
プトマイセス属に属する放線菌であることを示す。
【００１８】したがって、本発明の方法で用いうるピロ
スタチン生産菌は、本ＳＡ−３５０１株ならびに本菌株
と同等または類縁であって、ピロスタチン生産能を有す
るストレプトマイセス属の放線菌のすべてを包含する。
スタチン生産菌は、本ＳＡ−３５０１株ならびに本菌株
と同等または類縁であって、ピロスタチン生産能を有す
るストレプトマイセス属の放線菌のすべてを包含する。
【００１９】なお、前記のＳＡ−３５０１株は、工業技
術院生命工学技術研究所に寄託申請され、平成６年２月
２４日、受託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８２）として
受託された。
術院生命工学技術研究所に寄託申請され、平成６年２月
２４日、受託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８２）として
受託された。
【００２０】ＳＡ−３５０１株は他の放線菌と同様に、
その性状が変化しやすい。たとえば、ＳＡ−３５０１株
に由来する（自然発生または誘発性の）突然変異株、形
質融合体または遺伝子組み換え体であっても、ピロスタ
チンの生産能を有するストレプトマイセス属の菌はすべ
て本発明の製造方法に使用することができる。
その性状が変化しやすい。たとえば、ＳＡ−３５０１株
に由来する（自然発生または誘発性の）突然変異株、形
質融合体または遺伝子組み換え体であっても、ピロスタ
チンの生産能を有するストレプトマイセス属の菌はすべ
て本発明の製造方法に使用することができる。
【００２１】本発明の製造方法では、前記の菌を、通常
の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養す
る。炭素源としては、グルコース、水飴、デキストリ
ン、シュクロース、でんぷん、糖蜜、動・植物油等を使
用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦
胚芽、コーンスティープ・リカー、綿実かす、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソ
ーダ、尿素等を利用できる。その他、必要に応じ、ナト
リウム、コバルト、塩素、硫酸、燐酸、及びその他のイ
オンを生成することのできる無機塩類を添加することは
有効である。また、菌の生育を助け、生理活性物質ピロ
スタチンの生産を促進するような有機及び無機物を適当
に添加することができる。
の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養す
る。炭素源としては、グルコース、水飴、デキストリ
ン、シュクロース、でんぷん、糖蜜、動・植物油等を使
用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦
胚芽、コーンスティープ・リカー、綿実かす、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソ
ーダ、尿素等を利用できる。その他、必要に応じ、ナト
リウム、コバルト、塩素、硫酸、燐酸、及びその他のイ
オンを生成することのできる無機塩類を添加することは
有効である。また、菌の生育を助け、生理活性物質ピロ
スタチンの生産を促進するような有機及び無機物を適当
に添加することができる。
【００２２】培養法としては、好気的条件での培養法、
特に深部培養法が適している。培養に適当な温度は１５
〜３７℃であるが、多くの場合、２６〜３０℃付近で培
養する。生理活性物質ピロスタチンの生産は培地や培養
条件により異なるが、振盪培養、タンク培養とも通常１
〜１０日の間でその蓄積が最高に達する。
特に深部培養法が適している。培養に適当な温度は１５
〜３７℃であるが、多くの場合、２６〜３０℃付近で培
養する。生理活性物質ピロスタチンの生産は培地や培養
条件により異なるが、振盪培養、タンク培養とも通常１
〜１０日の間でその蓄積が最高に達する。
【００２３】培養物中の生理活性物質ピロスタチンの蓄
積量が最高になった時に、培養を停止し、培養液から目
的物質を単離精製するのが好ましい。ピロスタチンの培
養液からの採取にあたっては、その性状を利用した通常
の分離手段を適宜組み合わせて抽出して精製することが
できる。たとえば、培養液を濾過したのち、培養濾液よ
り、ダウエックス５０Ｗ（Ｈ+ 型）等のイオン交換樹脂
に吸着し、抽出することができる。
積量が最高になった時に、培養を停止し、培養液から目
的物質を単離精製するのが好ましい。ピロスタチンの培
養液からの採取にあたっては、その性状を利用した通常
の分離手段を適宜組み合わせて抽出して精製することが
できる。たとえば、培養液を濾過したのち、培養濾液よ
り、ダウエックス５０Ｗ（Ｈ+ 型）等のイオン交換樹脂
に吸着し、抽出することができる。
【００２４】上述の方法に加え、水溶性物質の採取に用
いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、
あるいは繰り返すことによってピロスタチンを純粋に単
離することができる。
いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、
あるいは繰り返すことによってピロスタチンを純粋に単
離することができる。
【００２５】ピロスタチンの薬学的に許容し得る塩は、
公知の方法によって製造することができ、例えば水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムおよび塩
酸、硫酸などを含む溶液でピロスタチンを処理すること
によって得ることができる。
公知の方法によって製造することができ、例えば水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムおよび塩
酸、硫酸などを含む溶液でピロスタチンを処理すること
によって得ることができる。
【００２６】本発明の第３の発明は、ピロスタチンまた
はその薬学的に許容し得る塩及び医薬用添加剤とからな
るＮ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害剤である。医薬
用添加剤は特に制限はなく、一般的に使用されるものが
使用できる。
はその薬学的に許容し得る塩及び医薬用添加剤とからな
るＮ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害剤である。医薬
用添加剤は特に制限はなく、一般的に使用されるものが
使用できる。
【００２７】上記阻害剤組成物中の有効成分（ピロスタ
チンＡ又はＢ）の割合はその剤形などにより異なるので
一概にはいえないが、０．０５〜９９％程度まで広範囲
に使用することができ、通常注射剤では０．１〜５０％
程度であり、それ以外の製剤では１％〜６０％程度であ
る。残部は医薬用添加剤である。
チンＡ又はＢ）の割合はその剤形などにより異なるので
一概にはいえないが、０．０５〜９９％程度まで広範囲
に使用することができ、通常注射剤では０．１〜５０％
程度であり、それ以外の製剤では１％〜６０％程度であ
る。残部は医薬用添加剤である。
【００２８】ピロスタチンＡ又はＢは以下の試験例に示
すように糖鎖を切断する酵素であるＮ−アセチルグルコ
サミニダーゼを強く阻害するが、毒性を示さない。した
がって、ピロスタチンＡ又はＢはＮ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ阻害剤として極めて有用である。
すように糖鎖を切断する酵素であるＮ−アセチルグルコ
サミニダーゼを強く阻害するが、毒性を示さない。した
がって、ピロスタチンＡ又はＢはＮ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ阻害剤として極めて有用である。
【００２９】ピロスタチンＡ又はＢを、通常、人を含む
温血動物に経口投与あるいは静脈、皮内、筋肉内投与な
どの非経口投与でその有効量を投与することにより生体
中のＮ−アセチルグルコサミニダーゼを阻害することが
できる。投与量は投与する対象、投与ルートなどによっ
て変動するが通常、０．０５〜１５０mg/Kg/日、好まし
くは０．５〜１００mg/Kg/日、より好ましくは１〜５０
mg/Kg/日である。
温血動物に経口投与あるいは静脈、皮内、筋肉内投与な
どの非経口投与でその有効量を投与することにより生体
中のＮ−アセチルグルコサミニダーゼを阻害することが
できる。投与量は投与する対象、投与ルートなどによっ
て変動するが通常、０．０５〜１５０mg/Kg/日、好まし
くは０．５〜１００mg/Kg/日、より好ましくは１〜５０
mg/Kg/日である。
【００３０】投与する際の製剤としては慣用的に用いら
れている剤形が挙げられる。経口投与の場合には、医薬
用添加剤例えばデンプンなどの通常の賦形剤などととも
に成型された錠剤、顆粒剤、カプセル剤などが用いられ
る。非経口投与の場合には医薬用添加剤例えば生理食塩
水、溶解剤などを用いて製剤化された通常の注射剤など
が用いられる。
れている剤形が挙げられる。経口投与の場合には、医薬
用添加剤例えばデンプンなどの通常の賦形剤などととも
に成型された錠剤、顆粒剤、カプセル剤などが用いられ
る。非経口投与の場合には医薬用添加剤例えば生理食塩
水、溶解剤などを用いて製剤化された通常の注射剤など
が用いられる。
【００３１】
【発明の効果】以上に詳細に説明したように、本発明で
は新規な生理活性物質ピロスタチンＡ及びＢが提供さ
れ、これらの化合物はＮ−アセチルグルコサミニダーゼ
を強く阻害する。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミ
ニダーゼ阻害剤として極めて有用である。
は新規な生理活性物質ピロスタチンＡ及びＢが提供さ
れ、これらの化合物はＮ−アセチルグルコサミニダーゼ
を強く阻害する。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミ
ニダーゼ阻害剤として極めて有用である。
【００３２】
【実施例】次に実施例によって本発明のピロスタチンＡ
及びＢの製造例及び製剤例を示す。実施例１ 種培地として、可溶性デンプン２．０％、グルコース
１．０％、酵母エキス（ディフコ社製）０．５％、トリ
プチケース（ＢＢＬ社製）０．５％、炭酸カルシウム
０．２％および１／４強度の人工海水（ジャマリン社
製）から成る培地を用いた。なお、滅菌前の培地はpH
７．２に調整して使用した。
及びＢの製造例及び製剤例を示す。実施例１ 種培地として、可溶性デンプン２．０％、グルコース
１．０％、酵母エキス（ディフコ社製）０．５％、トリ
プチケース（ＢＢＬ社製）０．５％、炭酸カルシウム
０．２％および１／４強度の人工海水（ジャマリン社
製）から成る培地を用いた。なお、滅菌前の培地はpH
７．２に調整して使用した。
【００３３】５００ml容三角フラスコに１１０mlを分注
した前記種培地を１２０℃で２０分間滅菌し、これにス
トレプトマイセス・エスピー・ＳＡ−３５０１株（ＦＥ
ＲＭＰ−１４１８２）の斜面培養の１〜２白金耳を接種
し、２７℃、１８０回転／分の回転式振盪機にて２日間
培養し種培養とした。ついで、生産培地として種培地と
同様の培地を５００ml容三角フラスコに１１０mlずつ分
注し、１２０℃で２０分間滅菌し、前記種培養液２mlず
つを移植し、２７℃で４日間振盪培養した。培養終了
後、培養液１５リットルを濾過し培養濾液と菌体に分別
した。
した前記種培地を１２０℃で２０分間滅菌し、これにス
トレプトマイセス・エスピー・ＳＡ−３５０１株（ＦＥ
ＲＭＰ−１４１８２）の斜面培養の１〜２白金耳を接種
し、２７℃、１８０回転／分の回転式振盪機にて２日間
培養し種培養とした。ついで、生産培地として種培地と
同様の培地を５００ml容三角フラスコに１１０mlずつ分
注し、１２０℃で２０分間滅菌し、前記種培養液２mlず
つを移植し、２７℃で４日間振盪培養した。培養終了
後、培養液１５リットルを濾過し培養濾液と菌体に分別
した。
【００３４】培養濾液１４リットルを６Ｎ塩酸を用いて
pH７．０に調整したのち、クロマトグラフ用活性炭素
（和光純薬工業社製）９００mlのカラム（７×２３cm）
にかけ、不純物を除去した。活性炭素の通過液をダウエ
ックス５０Ｗ（Ｈ+ 型）１．７リットルのカラム（７．
５×４０cm）にかけ、４．５リットルの水で洗浄後、
２．８％アンモニア水４．５リットルで有効成分を溶出
し、阻害活性を示す画分を濃縮乾固して褐色の粗物質
８．０ｇを得た。
pH７．０に調整したのち、クロマトグラフ用活性炭素
（和光純薬工業社製）９００mlのカラム（７×２３cm）
にかけ、不純物を除去した。活性炭素の通過液をダウエ
ックス５０Ｗ（Ｈ+ 型）１．７リットルのカラム（７．
５×４０cm）にかけ、４．５リットルの水で洗浄後、
２．８％アンモニア水４．５リットルで有効成分を溶出
し、阻害活性を示す画分を濃縮乾固して褐色の粗物質
８．０ｇを得た。
【００３５】この粗物質を８０mlの水に溶解し、ダウエ
ックス１（酢酸型）５００mlのカラム（４×４８cm）に
かけ、水１リットルで有効成分を溶出し、阻害活性を示
す画分を濃縮乾固して褐色の粗物質４．９ｇを得た。次
いで、この粗物質を１０mlの水に溶解し、アビセル（フ
ナコシ薬品社製）１０ｇを加えて減圧下に濃縮乾固し
た。これを酢酸ブチル：ブタノール：酢酸：水（１：
４：１：１）で懸濁後、あらかじめ同混合溶媒で充填し
たシリカゲル６０（メルク社製）５５０mlのカラム（４
×５２cm）にかけ、同混合溶媒で洗浄した。続いて、有
効成分をブタノール：酢酸：水（４：１：１）で溶出
し、阻害活性を示す画分を濃縮乾固して淡い褐色の粗物
質１．４ｇを得た。
ックス１（酢酸型）５００mlのカラム（４×４８cm）に
かけ、水１リットルで有効成分を溶出し、阻害活性を示
す画分を濃縮乾固して褐色の粗物質４．９ｇを得た。次
いで、この粗物質を１０mlの水に溶解し、アビセル（フ
ナコシ薬品社製）１０ｇを加えて減圧下に濃縮乾固し
た。これを酢酸ブチル：ブタノール：酢酸：水（１：
４：１：１）で懸濁後、あらかじめ同混合溶媒で充填し
たシリカゲル６０（メルク社製）５５０mlのカラム（４
×５２cm）にかけ、同混合溶媒で洗浄した。続いて、有
効成分をブタノール：酢酸：水（４：１：１）で溶出
し、阻害活性を示す画分を濃縮乾固して淡い褐色の粗物
質１．４ｇを得た。
【００３６】この粗物質を少量の水に溶解し、セファデ
ックスＧ−１０（ファルマシア社製）１．８リットルの
カラム（４．５×１２５cm）にかけ、水で展開し、阻害
活性を示す画分を濃縮乾固して淡い褐色の粗物質１．２
ｇを得た。次に、この粗物質を１０回に分けて、あらか
じめ水で平衡化した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）用カラム（資生堂社製、カプセルパックＣ18、２
×２５cm、流速８ml／min ）へ通し、水で溶出し、阻害
活性を示す２つの画分をそれぞれ濃縮乾固することによ
り、純粋なピロスタチンＡの白色粉末を６１７．１mg、
また純粋なピロスタチンＢの白色粉末を２９５．９mg得
た。
ックスＧ−１０（ファルマシア社製）１．８リットルの
カラム（４．５×１２５cm）にかけ、水で展開し、阻害
活性を示す画分を濃縮乾固して淡い褐色の粗物質１．２
ｇを得た。次に、この粗物質を１０回に分けて、あらか
じめ水で平衡化した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）用カラム（資生堂社製、カプセルパックＣ18、２
×２５cm、流速８ml／min ）へ通し、水で溶出し、阻害
活性を示す２つの画分をそれぞれ濃縮乾固することによ
り、純粋なピロスタチンＡの白色粉末を６１７．１mg、
また純粋なピロスタチンＢの白色粉末を２９５．９mg得
た。
【００３７】純粋なピロスタチンＡおよびＢを用いて、
赤外線吸収スペクトル、水素核核磁気共鳴スペクトルお
よび炭素核核磁気共鳴スペクトルを測定した。これらの
スペクトルは図１、図２、図３、図４、図５および図６
に示した通りである。ピロスタチンＡおよびＢの培養工
程ならびに精製工程中での追跡は、Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼ阻害活性の測定に基づいて行った。その方
法は、後述する試験例で示すＮ−アセチルグルコサミニ
ダーゼ阻害活性の測定法と同様の方法を用いた。
赤外線吸収スペクトル、水素核核磁気共鳴スペクトルお
よび炭素核核磁気共鳴スペクトルを測定した。これらの
スペクトルは図１、図２、図３、図４、図５および図６
に示した通りである。ピロスタチンＡおよびＢの培養工
程ならびに精製工程中での追跡は、Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼ阻害活性の測定に基づいて行った。その方
法は、後述する試験例で示すＮ−アセチルグルコサミニ
ダーゼ阻害活性の測定法と同様の方法を用いた。
【００３８】実施例２ ピロスタチン３０重量部、結晶乳糖１２０部、結晶セル
ロース１４７部及びステアリン酸マグネシウム３部をＶ
型混合機で打錠し、１錠３００mgの錠剤を得た。
ロース１４７部及びステアリン酸マグネシウム３部をＶ
型混合機で打錠し、１錠３００mgの錠剤を得た。
【００３９】試験例 以下に、ピロスタチンＡおよびＢがＮ−アセチルグルコ
サミニダーゼ阻害活性を有し、且つ毒性を示さないこと
を試験例により示す。
サミニダーゼ阻害活性を有し、且つ毒性を示さないこと
を試験例により示す。
【００４０】試験例１ ピロスタチンＡおよびＢのＮ−アセチルグルコサミニダ
ーゼ阻害活性 Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害活性は、Methods
in Enzymology 、第２８巻、７７２頁（１９７２）に記
載の方法の改良法で行った。即ち、緩衝液として、０．
１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）１００μl
、基質として２０mMp −ニトロフェニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド３０μl 、検体あるいは水
を含む溶液６０μl を加えた混合液に、ブタ腎臓からMe
thods in Enzymology 、第２８巻、７７２頁（１９７
２）に記載の方法に従い精製し、０．１Ｍクエン酸ナト
リウム緩衝液（pH４．５）で４００倍に希釈したＮ−ア
セチルグルコサミニダーゼ溶液を１０μl 加え、３７
℃、３０分間反応させた。
ーゼ阻害活性 Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害活性は、Methods
in Enzymology 、第２８巻、７７２頁（１９７２）に記
載の方法の改良法で行った。即ち、緩衝液として、０．
１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）１００μl
、基質として２０mMp −ニトロフェニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド３０μl 、検体あるいは水
を含む溶液６０μl を加えた混合液に、ブタ腎臓からMe
thods in Enzymology 、第２８巻、７７２頁（１９７
２）に記載の方法に従い精製し、０．１Ｍクエン酸ナト
リウム緩衝液（pH４．５）で４００倍に希釈したＮ−ア
セチルグルコサミニダーゼ溶液を１０μl 加え、３７
℃、３０分間反応させた。
【００４１】反応終了後、ただちに分光光度計により４
０５nmにおける吸光度（ａ）を測定した。同時に検体を
含まない対照の吸光度（ｂ）を測定し、それぞれに対す
る反応をしない盲検の吸光度（ａ’）および（ｂ’）を
測定した。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害率は
〔１−（ａ−ａ’）／（ｂ−ｂ’）〕×１００により計
算した。５０％阻害率を示す検体の濃度をＩＣ50の値と
した。この定量法で純粋なピロスタチンＡおよびＢは、
おのおの０．４５μg/ml、０．８２μg/mlの濃度でＮ−
アセチルグルコサミニダーゼを５０％阻害した。
０５nmにおける吸光度（ａ）を測定した。同時に検体を
含まない対照の吸光度（ｂ）を測定し、それぞれに対す
る反応をしない盲検の吸光度（ａ’）および（ｂ’）を
測定した。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害率は
〔１−（ａ−ａ’）／（ｂ−ｂ’）〕×１００により計
算した。５０％阻害率を示す検体の濃度をＩＣ50の値と
した。この定量法で純粋なピロスタチンＡおよびＢは、
おのおの０．４５μg/ml、０．８２μg/mlの濃度でＮ−
アセチルグルコサミニダーゼを５０％阻害した。
【００４２】試験例２ ピロスタチンＡおよびＢの毒性 ピロスタチンＡおよびＢを、それぞれ、マウスに静脈内
投与してその毒性を調べたところ、それぞれの１００mg
／kg投与でも毒性を示さなかった。
投与してその毒性を調べたところ、それぞれの１００mg
／kg投与でも毒性を示さなかった。
【図１】ピロスタチンＡの臭化カリウム錠内での赤外線
吸収スペクトルを示す。
吸収スペクトルを示す。
【図２】ピロスタチンＡの重水中で測定した５００ＭHz
水素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
水素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
【図３】ピロスタチンＡの重水中で測定した１２５ＭHz
炭素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
炭素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
【図４】ピロスタチンＢの臭化カリウム錠内での赤外線
吸収スペクトルを示す。
吸収スペクトルを示す。
【図５】ピロスタチンＢの重水中で測定した５００ＭHz
水素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
水素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
【図６】ピロスタチンＢの重水中で測定した１２５ＭHz
炭素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
炭素核核磁気共鳴スペクトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 村岡 靖彦 東京都板橋区高島平３−11−２−1107 (72)発明者 今田 千秋 埼玉県浦和市文蔵３−32−15−304 (72)発明者 青山 貴之 東京都北区志茂３−17−２−302
Claims (4)
- 【請求項１】 下記式（Ｉ） 【化１】 （式中ＲはＯＨ又はＨを示す。）で表される生理活性物
質ピロスタチン又はその薬理学的に許容し得る塩。 - 【請求項２】 ストレプトマイセス属に属するピロスタ
チン生産菌を栄養培地中で培養し、その培養物からピロ
スタチンを採取することを特徴とする請求項１記載のピ
ロスタチンの製造方法。 - 【請求項３】 請求項１記載のピロスタチン又はその薬
学的に許容し得る塩および医薬用添加剤とからなるＮ−
アセチルグルコサミニダーゼ阻害剤。 - 【請求項４】 請求項１記載のピロスタチンを生産する
ストレプトマイセスｓｐ．ＦＥＲＭ Ｐ−１４１８２。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9234094A JPH07291924A (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 新規生理活性物質ピロスタチンおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9234094A JPH07291924A (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 新規生理活性物質ピロスタチンおよびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07291924A true JPH07291924A (ja) | 1995-11-07 |
Family
ID=14051672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9234094A Pending JPH07291924A (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 新規生理活性物質ピロスタチンおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07291924A (ja) |
-
1994
- 1994-04-28 JP JP9234094A patent/JPH07291924A/ja active Pending
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