KR0122427B1 - 아미노펩티데이스 m 저해물질, 그의 제조방법 및 그를 생성하는 미생물 - Google Patents

아미노펩티데이스 m 저해물질, 그의 제조방법 및 그를 생성하는 미생물

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Abstract

본 발명은 아미노펩티데이스 M 저해물질, 그를 생성하는 미생물 및 상기 물질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 강한 아미노펩티데이스 M 저해활성 및 면역증강활성을 나타내는 신규한 물질인 발리스타틴을 미생물 스트렙토마이세스 속 20209 균주(KCTC 0103BP)를 배양하여 그 배양액으로부터 분리 정제할 수 있다.

Description

아미노펩티데이스 M 저해물질, 그의 제조방법 및 그를 생성하는 미생물
제1도는 본 발명의 아미노펩티데이스 M 저해물질인 발리스타틴의 메탄올중에서의 자외선 및 가시광선의 흡광도를 도시한 것이고,
제2도는 발리스타틴(브롬화칼슘내)의 적외선 흡수 스펙트럼을 도시한 것이며,
제3도는 발리스타틴의 중메탄올 내에서 측정한 수소핵자기공명 스펙트럼(300MHz)이고,
제4도는 발리스타틴의 6N 염산가수분해물(B)과 3-아미노-2-하이드록시-페닐부타노산(A), 표준아미노산(C)의 아미노산 분석 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 아미노펩티데이스 M 저해작용 및 여러 면역증강작용을 나타내는 신규의 아미노펩티데이스 M 저해물질, 그를 생성하는 미생물 및 상기 물질의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 신규한 아미노펩티데이스 M 저해물질인 발리스타틴(valistatin)의 미생물에 의한 제조방법에 관한 것이다.
미생물이 생산하는 생리활성물질중에서 지금까지 액티노닌(actinonin)[The Journal of Antibiotics, 38, 1629-1630(1985)], 프로베스틴(probstion)[The Journal of Antibiotics, 43, 143-148(1990)], 류히스틴(leuhistin)[The Journal of Antibiotics, 44, 573-578(1991)] 등이 아미노펩티데이스 M을 저해하는 활성과 면역증강작용을 나타내는 것으로 보고되어 있다.
또한, 우메자와(Umezawa) 등이 아미노펩티데이스 B 저해물질인 베스타틴(bestatin)을 미생물 대사산물로부터 발견하여 이 물질이 면역증강 활성과 무통각활성을 갖는다는 사실을 발견[The Journal of Antibiotics, 29, 97-102(1976)]한 이래로, 신규의 아미노펩티데이스 B 저해물질의 개발에 관한 보고는 베스타틴 외에 아르파메닌 A와 B(ar phamenine A B)[The Journal of Antibiotics, 36, 1572-1575(1983))], 및 5종류의 OF4949 [The Journal of Antibiotics, 39 : 1674-1684(1986)]. [The Journal of Antibiotics, 40, 519-525(1987)] 등이 보고되어 있으며 이들 물질도 면역증강 활성이 있는 것으로 나타나 있다.
아미노펩티데이스 M은 펩타이드의 N-말단 아미노산을 잘라주는 효소로 생체내에서 무통각 효과를 나타내는 엔케팔린(enkephatlin)을 분해하여 불활성화[Biochemistry, 24, 2179-2185(1984)]할 뿐만 아니라 최근 암세포의 전이과정에서 암세포 침윤(invasion)에 관여한다고 보고[Proceedings of the National Academy of Sciences of The United of America, 87, 8296-8300(1990)]되어 있어, 신규한 구조를 갖는 아미노펩티데이스 M에 대한 저해물질의 개발은 비마약성 진통제, 암전이 억제제, 및 면역증강제의 개발에 있어 필수불가결한 요건이다.
따라서, 본 발명자들은 아미노펩티데이스 M에 대한 저해작용을 나타내는 신규한 물질을 찾기 위해 연구를 거듭한 결과 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 균주의 배양액 중에 아미노펩티데이스 M을 강하게 저해하는 물질이 존재함을 발견하였다.
이 유효물질을 배양액으로부터 단리 정제하게 신규로 밝혀진 물질을 발리스타틴(Valistatin)으로 명명 하였다. 상기 아미노펩티데이스 M 저해활성을 갖는 신규한 물질인 발리스타틴의 이화학적 특성 및 이물질의 생산균주의 특성을 조사하여 이를 바탕으로 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 강한 아미노펩티데이스 M 저해활성 및 면역 증강 활성을 갖는 아미노펩티데이스 M 저해물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 아미노펩티데이스 M 저해물질을 생성하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 분리, 정제함을 특징으로 하는 아미노펩티데이스 M 저해물질의 제조방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 미생물을 사용하여 신규한 아미노펩티데이스 M 저해물질인 발리스타틴 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 하기 구조식을 갖는 신규한 아미노펩티데이스 M 저해물질인 발리스타틴이 제공된다 :
본 발명의 신규한 아미노펩티데이스 M 저해물질인 발리스타틴 화합물의 이화학적 특성은 다음과 같다 :
(1) 색 및 형성 : 백색 분말
(2) 분자식 : C20H31N3O4
(3) 분자량 : 394 SI-MS m/z
(4) 자외선흡수 스펙트럼 : 제1도에 도시함.
(5) 적외선흡수 스펙트럼 : 제2도에 도시함.
(6) 수소핵자기공명 스펙트럼 : 제3도에 도시함.
(7) 아미노산 분석 : 제4도에 도시함.
(8) 정색반응 : 실리카겔 박층상에서 닌하이드린 시약에 양성반응.
(9) 용해성 : 물, 에탄올, 디메틸설폭사이드에 용해되고 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 헥산에 불용임.
(10) 박층 크로마토그래피의 Rf치 : 실리카(머크사제 실리카겔 Art. 5715, 전개용매 n-부탄올-아세트산-물(4 : 1 : 1)), Rf : 0.76.
본 발명에 의해, 신규한 아미노펩티데이스 M 저해물질을 생산하는 신규한 미생물이 제공된다.
또한, 본 발명에 따라서, 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물을 배양하고 그 배양액으로부터 발리스타틴을 분리, 정제함을 특징으로 하는 아미노펩티데이스 M 저해물질 발리스타틴의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 방법에 사용되는 균주는 토양에서 새로이 분리된 스트렙토마이세스 속 20209 균주이다. 20209 균주의 균학적 성상은 다음과 같다.
1. 형태
20209 균주는 현미경 하에서 가지난 기저균사에서 나선상의 기균사를 형성한다. 성숙한 포자사슬은 20내지 30개의 포자가 연결되어 있으며 포자의 크기는 0.7-0.8×1.0-0.1μm 정도이고 포자의 표면은 매끄러운 형이었다.
2. 각종 배지에서의 생육상태
(1) 트립톤 효모엑기스 한천배지(ISP 배지 1, 28℃ 배양)
불량한 발육을 나타내고 기균사의 색깔은 옅은 녹황색이였으며 용해성 색소는 형성하지 않는다.
(2) 효모엑기스-맥아엑기스 한천배지(ISP 배지 2, 28℃ 배양)
황갈색의 생육에 짙은 회갈색의 기균사를 형성하며 용해성 색소는 형성하지 않는다.
(3) 오트밀 한천배지(ISP 배지 3, 28℃ 배양)
옅은 주황색의 생육에 짙은 회갈색의 기균사를 형성하며 용해성 색소는 생성하지 않는다.
(4) 전분 무기염 한천배지(ISP 배지 4, 28℃ 배양)
황갈색의 생육에 짙은 회갈색의 기균사를 형성하며 용해성 색소는 생성하지 않는다.
(5) 글리세롤 아스파라긴 한천배지(ISP 배지 5, 28℃ 배양)
황갈색의 생육에 회갈색의 기균사를 형성하며 용해성 색소는 형성하지 않는다.
(6) 타이로신 한천배지(ISP 배지 7, 28℃ 배양)
황갈색의 생육에 회갈색의 기균사를 형성하며 용해성 색소는 형성하지 않는다.
3. 생리적 성질
(1) 생육온도 범위
벤넷배지(Bennett, 글리코스 1.0%, 펩톤 0.2%, 쇠고기 추출물 0.1%, 효모 엑기스 0.1%)를 사용하여 10℃, 20℃, 24℃, 27℃, 30℃, 37℃, 45℃의 각 온도에서 시험결과, 45℃와 10℃를 제외한 모든 온도에서 생육하였지만 최적 생육온도는 24℃ 내지 30℃ 범위인 것으로 생각된다.
(2) 젤라틴의 액화 : 양성
(3) 가용성 전분의 액화 : 양성
(4) 탈지 우유의 펩톤화 : 양성
(5) 멜라닌형의 색소형성 : 펩톤-효모엑기스-철-한천배지(ISP 배지 6)에서나 타이로신 한천배지(ISP 배지 7)에서 모두 갈색색소를 형성하지 않았다.
(6) 탄소원 이용성 : D-글루코스, D-프럭토스, D-갈락토스, L-아라비노스, D-만노스, D-키실로스, D-라피노스, 키실리톨, 만니톨, 셀로바이오스, 말토스, 멜리바이오스, 슈크로스를 이용하여 생육하였다.
(7) 질산염의 환원반응 : 음성
(8) 황화수소의 생성 : 음성
이상의 특성을 요약하면 20209 균주는 스트렙토마이세스 속에 속하고, 세포벽에 함유된 2,6-디아미노피멜린산은 L, L형이다. 또한, 포자낭은 보이지 않고 기균사는 나선형이다. 포자의 표면은 매끄럽고 각종 배지에서 황갈색의 생육을 나타내며 짙은 회갈색의 기균사를 형성하고 용해성 색소는 형성하지 않으며 멜라닌형의 색소생성은 음성이고 단백질 및 전분 분해력이 강한 편이였다.
상기 언급한 특성들을 근거로 하여 20209 균주와 유사한 기존의 균종을 [Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol.4]에서 조사하였다. 하기 표 1에서 나타냈듯이 본 발명에 사용한 20209 균주는 스트렙토마이세스 라이디커스(Streptomyces lydicus)와 유사한 성상을 나타내었다.
본 발명의 20209 균주가 스트렙토마이세스 라이디커스와 상이한 점은 이노시톨 및 D-멜리지토스의 이용성에서 다르므로 20209 균주를 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속(sp.) 20209로 동정하였다. 20209 균주를 한국과학기술연구원 유전공학연구소 유전자 은행에 1994년 3월 10일 기탁번호 KCTC 0103BP로 기탁하였다. 20209 균주는 다른 방선균의 경우에서와 같이 그 성상이 변하기 쉬우므로 20209 균주 또는 이 균주의 돌연변이주(자연발생 또는 유발성 둘다 포함), 형질융합체 또는 유전자 조환체라도 발리스타틴의 생산능력이 있는 스트렙토마이세스 속의 균을 사용하는 방법은 모두 본 발명의 방법에 포함되는 것으로 간주한다.
본 발명에 따른 아미노펩티데이스 M 저해물질의 제조방법은 다음과 같다 :
전술한 발리스타틴 및 데스-에이에스피 4-아마스타틴 생산균을 통상의 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로서 탄소원은 글루코스, 물엿, 덱스트린, 슈크로스, 전분, 당밀, 동·식물유 등을 사용한다. 또한 질소원으로서는 대부분, 탈지 땅콩분, 어분, 육추출물, 펩톤, 효모추출물 등을 이용한다. 경우에 따라서, 나트륨, 마그네슘 염소, 인산, 황산 및 기타 이온을 생성할 수 있는 무기염류를 첨가할 수도 있다.
배양법으로서는 호기적 조건에서의 배양법, 특히 액침 배양법이 적당하다. 배양에 적당한 온도는 15 내지 37℃이지만, 대부분의 경우 약 26 내지 30℃ 범위의 온도에서 배양한다.
아미노펩티데이스 M 저해물질 발리스타틴의 생산은 배지나 배양 조건에 따라 다르지만 진탕배양, 탱크배양으로 통상 2 내지 7일 사이에 축적량이 최고에 도달한다. 배양물 중의 아미노펩티데이스 M 저해물질 발리스타틴의 축적량이 최고에 도달하였을 때 배양을 중단하고 배양물로부터 목적물질을 단리 정제한다.
본 발명의 발리스타틴을 배양액으로부터 분리 수득하기 위해, 상기 물질들의 성상을 이용한 통상의 분리수단을 적절히 조합하여 추출, 정제하였다. 즉, 배양여액을 흡착수지 암버라이트(Amberite) XAD-4(시그마제)의 칼럼에 통과시켜 물로 세척하고 메탄올 등의 유기용매로 탈착시킨다. 탈착액에서 유기 용매를 제거한 후 pH 2에서 부탄올과 같은 수-비혼화성 유기 용매를 사용하여 유효성분을 추출한다. 추출액을 감압하에서 농축건조시켜 조 분말을 얻을 수 있다.
그런 다음, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 적절히 조합, 반복하여 발리스타틴을 단리한다.
발리스타틴의 항 아미노펩티데이스 M 활성은 다음과 같이 측정한다. 먼저 배양액 또는 물에 용해시킨 검체 20㎕을 96 웰 마이크로플레이트에 넣고 L-류신-p-니트로아닐라이드 저장액(12.5mg/디메틸설폭사이드 1㎖) 100㎕을 0.1M 트리스염산 완충용액(pH 7.0) 10㎖로 사용직전에 희석하여 희석된 용액 160㎕을 넣은 후 아미노펩티데이스 M 용액(1mU) 20㎕을 첨가하여 마이크로플레이트리더(바이오라드사제)에서 405nm로 흡광도를 측정한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 후 다시 405nm에서 흡광도를 측정한다.
아미노펩티데이스 M 저해율(%)은 본 발명의 저해물질을 첨가한 용액의 반응전 흡광도(A) 및 반응 후 흡광도(B), 저해제를 넣지 않은 대조용의 반응전 흡광도(C) 및 반응 후 흡광도(D)로부터 [(D-C)-(B-A)/(D-C)]×100의 식으로 계산하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 이로 제한하려는 것이 아님을 주지해야 한다.
[실시예1]
아미노펩티데이스 M 저해물질 생산균주의 배양
본 발명에 사용된 미생물의 종배지 및 생산배지로서 가용성 전분 3%, 대두박 2.5%, 효모추출물 0.5%, 인산수소이칼륨 0.05%, 탄산칼슘 0.1% 및 제올라이트 0.3%를 함유하는 배지를 사용하였다.
살균전의 pH는 모두 6.8로 조정하여 사용하였다. 상기 종배지를 500㎖의 삼각 플라스크에 100㎖씩 분주하여 120℃에서 20분간 살균하여 여기에 스트렙토마이세스 속 20209 균주의 사면배양물 1 내지 2백금이를 접종한 후 28℃에서 30분간 살균한 3ℓ의 생산배지를 함유한 5ℓ 자(jar) 발효조에 상기 종배양액 100㎖을 접종하여 28℃에서 72시간 동안 통기(3ℓ/분)하에서 교반(180rpm) 배양하였다. 배양 종료 후 여과 보조제로서 규조토를 가하여 여과하여 균체를 함유한 고형물 및 배양액을 얻었다.
[실시예2]
아미노펩티데이스 M 저해물질의 분리 및 정제
실시예1에서 얻은 배양액을 흡착수지 암버라이트 XAD-4에 가하여 물로 세정하고 60% 메탄올로 탈착시켰다. 활성분획을 함유하는 탈착액을 감압농축하여 부피를 500㎖로 하고 염산을 사용하여 pH 3.0으로 저 조정한 후 동량의 부탄올로 3내지 4회 반복 추출하고 부탄올층을 재농축한 후 소량의 부틸 아세테이트-부탄올-아세트산-물(3 : 4 : 1 : 1)의 용매에 용해시켜 동일 용매로 충진된 실리카 칼럼에 통과시켰다. 통과된 활성분획만을 감압농축하고 소량의 물에 용해시킨 다음 물로 평형화한 도웩스(Dowerx)-50 칼럼에 흡착시킨 후 0 내지 0.5N 암모니아 선형구배를 행하여 용출시켰다. 재농축된 활성분획을 디이에이이-세파덱스(DEAE-sephadex) A-25(파마시아사제) 칼럼에서 물로 용출시켜 통과된 활성분획을 50% 메탄올 용매 조건으로 엠씨아이(MCI, 미쓰비씨사제) 겔 칼럼 크로마토그래피를 행하였다.
얻어진 활성분획을 100% 메탄올로 충진된 세파덱스 LH-20 칼럼에 동일 용매로 용출시켜 겔 여과를 행한 후 재농축된 활성물질을 로바(Lobar, 머크사제) RP-18 컬럼에서 50% 메탄올로 용출시켜 감압농축한 다음 얻어진 미황색 분말을 최종적으로 역상 실리카겔상에서 고속액체 크로마토그래피(칼럼; 페노메넥스(Phenomenex) 5C18, 크기; 250×10mm, 유속; 2.0㎖/분, 용매; 35% 메탄올)를 행하여 체류시간 31분 대에서 발리스타틴을 분리하였다.

Claims (4)

  1. 하기 구조식을 갖는 발리스타틴 또는 그의 염 :
  2. 제1항의 발리스타틴을 생성하는 스트렙토마이세스 속 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 20209 균주(기탁번호 KCTC 0103BP).
  4. 제2항 또는 제3항의 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 분리, 정제함을 특징으로 하는, 제1항의 발리스타틴의 제조방법.
KR1019940012837A 1994-06-08 1994-06-08 아미노펩티데이스 m 저해물질, 그의 제조방법 및 그를 생성하는 미생물 KR0122427B1 (ko)

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