KR0155403B1 - 신규한 생리 활성 물질 엠알-387 에이, 엠알-387 비 및 그의 제조방법 - Google Patents

신규한 생리 활성 물질 엠알-387 에이, 엠알-387 비 및 그의 제조방법

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Abstract

본 발명은 아미노펩티다제 M 저해작용 및 면역 증강 작용을 나타내는 신규한 아미노펩티다제 M 저해물질 MR-38A, MR-387B 및 이들의 염과 이들의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규한 생리 활성 물질 엠알-387 에미(MR-387A).엠알-387 비(MR-387B) 및 그의 제조방법
제1도는 브롬화 칼륨(KBr)정내에서 MR-387A의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
제2도는 MR-387A의 중수(D2O)용액에서 300MHz 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
제3도는 브롬화 칼륨(KBr)정내에서 MR-387B의 적외선 흡수스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
제4도는 MR-387B의 중수(D2O)용액에서 300MHz 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
제5도는 MR-387A와 MR-387B를 6N 염산 용액으로 48시간 가수분해한 후 아미노산 자동 분석기를 이용하여 분자내 아미노산 조성을 분석한 결과이다.
제6도는 여러 아미노펩티다제 M 저해물질과 MR-387A와 MR-387B의 아미노펩티다제 M에 대한 저해활성을 비교한 것이다.
본 발명은 아미노펩티다제 M 저해 작용 및 면역증강 작용을 나타내는 신규한 물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 아미노펩티다제 M 저해 작용 및 면역증강 작용을 나타내는, 프로베스틴(Probestin)의 2번 아미노산인 로이신이 발린으로 치환되고, 하이드록시프롤린을 C-말단에 갖는 펩티드성 물질(구조식은 하기 기재한 바와 같으며, 이하 본 발명에서는 MR-387A로 명명함)과 프로베스틴의 2번 아미노산인 로이신이 발린으로 치환되었고, 프롤린을 C-말단에 갖는 펩티드성 물질(구조식은 하기 기재한 바와 같으며, 이하 본 발명에서는 MR-387B로 명명함) 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
미생물이 생산하는 생리활성 물질중에서 지금까지 액티노닌(Actinonin)[The Journal of Antibiotics, 38, 1629-1630, (1980)]과 프로베스틴(Probestin)[The Journal of Antibiotics, 43, 143-148(1990)]이 아미노펩티다제 M을 저해하는 활성과 면역증강 작용을 나타내는 것으로 보고되어있다. 그러나, 이러한 아미노펩티다제 M 저해물질은 아미노펩티다제 M 저해활성면에서 만족스럽지 못하다. 이러한 의미에서 상기 아미노펩티다제 M 저해물질과 다른 구조의 저해물질의 개발이 신규의 면역 증강제 개발에 필수적이다.
이에, 본 발명자들은 기존의 아미노펩티다제 M 저해물질의 문제점을 인식하고 이를 해결하고자 아미노펩티다제 M 에 대한 강한 저해활성을 보이는 물질을 탐색한 결과, 스트렙토미세스(Streptomyces)속에 속하는 균주의 배약액내에 아미노펩티다제 M에 강한 저해활성을 보이는 2종류의 물질이 존재함을 발견하고 이를 단리 정제하는데 성공하여 본발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 하기 일반식을 갖는 화합물 또는 이들의 염을 제공하는 것이다:
상기식에서, R은 하이드록시프롤린 또는 프롤린이다.
구체적으로, 본 발명은 하기 구조식을 갖는 MR-387A 또는 이의 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 구조식을 갖는 MR-387B 또는 이의 염을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 스트렙토미세스속에 속하는 MR-387A와 MR-387B의 생산균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 MR-387A와 MR-387B를 각각 단리하는 것을 특징으로 하는 아미노펩티다제 M저해물질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 MR-387A와 MR-387B를 생산하는 한국 토양으로부터 새로 분리한 SL-387 균주를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다
1. 본 발명의 아미노펩티다제 M 저해물질 MR-387A와 MR-387B 및 이들의 염
본 발명의 MR-387A 및 MR-387B는 각각 하기 구조식을 갖는다.
MR-387A와 MR-387B의 이화학적 성질은 다음과 같다:
(A) MR-387A의 이화학적 특징
(1) 색 및 형상 : 백색 분말
(2) 분자식 : C25H36N4O7
(3) 분자량 : 504, SI-MS, m/z
(4) 자외선 흡수 스펙트럼 : 1mg/ml 메탄올 용액중에서 210nm-360nm에 특이적 흡수를 보이지 않았다.
(5) 적외선 흡수 스펙트럼 : 첨부한 도면 제1도에 나타낸 바와 같다.
(6) 수소 핵자기공명 스펙트럼 : 첨부한 도면 제2도에 나타낸 바와 같다.
(7) 아미노산 분석 : 첨부한 도면 제5도에 나타낸 바와 같다.
(8) 정색 반응 : 실리카겔 박충상에서 니하이드린 시약에 양성
(9) 용해성 : 물, 메탄올, 디메틸 설폭시드에 용해되고, 아세론, 초산에틸, 클로로포름, 헥산에 불용.
(10) 박충 크로마토그래피의 Rf치 : 실리카[머크사제 박충실리카겔 Art, 5715, 전개용매 : n-부탄올-초산-물(4 : 1 : 1)] Rf=0.35
(B) MR-387B의 이화학적 특징
(1) 색 및 형상 : 백색 분말.
(2) 분자식 : C25H36N₄O6
(3) 분자량 : 488, SI-MS, m/z
(4) 자외선 흡수 스펙트럼 : 1mg/ml 메탄을 용액중에서 210nm-360nm에 특이적 흡수를 보이지 않았다.
(5) 적외선 흡수 스펙트럼 : 첨부한 도면 제3도에 나타낸 바와 같다.
(6) 수소 핵자기공명 스펙트럼 : 첨부한 도면 제4도에 나타낸 바와 같다.
(7) 아미노산 분석 : 첨부한 도면 제5도에 나타낸 바와 같다.
(8) 정색 반응 : 실리카겔 박충상에서 니하이드린 시약에 양성.
(9) 용해성 : 물, 메탄올, 디메틸 설폭시드에 용해되고, 아세톤, 초산에틸, 클로로포름, 헥산에 불용.
(10) 박충 크로마토그래피의 Rf치 : 실리카[머크사제 박충실리카겔 Art, 5715, 전개용매 : n-부탄올-초산-물(4 : 1 : 1)] Rf=0.42
상기 MR-387A 및 MR-387B는 첨부한 도면 제6도에 나타낸 바와 같이 기존의 아미노펩티다제 M저해물질인 액티노닌보다 강한 저해 활성을 보임을 알 수 있다.
2. MR-387A와 MR-387B의 제조
상기 본 발명의 저해물질은 스트렙토미세스 속에 속하는 한국 토양으로부터 새로이 분리한, 하기 상세히 설명한 바와 같은 SL-387균주를 적당한 배지에서 배양하고, 그 배양액으로부터 단리하므로써 제조하며, 아울러 이들은 기존의 올리고펩티드 합성 방법에 의해서도 합성 가능한다.
3. SL-387 균주
본 발명의 방법에 사용한 MR-387A와 R-387B의 생산균주는 한국 토양으로부터 새로이 분리하여 스트렙토미세스(Streptomyces)sp. LS-387로 명명되었으며, 1994년 3월 10일자로 한국과학기술연구원 유전공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0102BP로 기탁되었다. 이의 균학적 성상은 다음과 같다.
1) 형 태
SL-387 균주는 현미경하에서 관찰한 결과 가지난 기저균사에서 나선상의 기균사를 형성한다. 전자 현미경하에서 관찰한 결과 성숙한 포자사슬은 10 내지 50개의 다양한 갯수의 포자가 연결되어 있으며, 0.7 내지 0.8×1.1 내지 1.2 마이크로미터(㎛)정도이고 포자의 표면은 매끄러운 형이었다.
2) 각종 배지에서의 생육 상태
(1) 트립톤-효모 엑기스 한천배지(ISP-1 배지, 28℃ 배양)
옅은 회갈색의 적당한 발육을 나타내었고, 기균사의 색깔은 백색이었으며, 용해성 색소는 생성하지 않았다.
(2) 효모 엑기스-맥아 엑기스 한천배지(SIP-2 배지, 28℃ 배양)
황갈색 내지 검은색에 가까운 황갈색의 양호한 발육을 나타내었고, 기균사는 회색으로 벨벳모양의 왕성한 발육을 나타내었으며, 옅은 오렌지색의 용해성 색소를 형성하였다.
(3) 오트밀 한천배지(ISP-3 배지, 28℃ 배양)
옅은 회갈색의 적당한 발육을 나타내었고, 분말모양의 붉은색 기균사를 형성하였다. 용해성 색소는 형성하지 않았다.
(4) 전분-무기염 한천배지(ISP-4 배지, 28℃ 배양)
회갈색 내지 적회색의 적당한 발육을 나타내었고, 벨벳모양의 적회색 기균사를 왕성하게 형성하였다. 핑크색의 비확산성 색소와 황색의 확산성 색소를 배지상에 분비하였다.
(5) 글리세롤-아스파라긴 한천배지(ISP-5 배지, 28℃ 배양)
옅은 회갈색의 적당한 발육을 나타내었고, 분말상의 불량한 회색의 기균사를 형성하였다. 배지상에 비확산성 옅은 오렌지색 색소를 분비하였다.
(6) 티로신 한천배지(ISP-7 배지, 28℃ 배양)
옅은 적회색의 적당한 발육을 보였으며 기균사는 형성하지 않았다. 배지상에는 확산이 되지 않는 옅은 적회색 색소를 분비하였다.
3) 생리적 특징
(1) 생육 온도 범위
벤넷배지(Bennett, 글루코스 1%, 효모 엑기스 0.1%, 박토펩톤 0.2%, 우육 엑기스 0.1%, 한천 1.5 내지 2.0%)를 사용하여 10℃, 20℃, 24℃, 27℃, 30℃, 37℃, 45℃의 각 온도에서 시험한 결과 45℃와 10℃를 제외한 모든 온도에서 생육하였지만, 최적 생육온도는 24℃ 내지 30℃ 부근인 것으로 생각된다.
(2) 젤라틴 액화 : 양성
(3) 가용성 전분 액화 : 양성
(4) 탈지우유 펩톤화 : 양성
(5) 멜라닌 색소 생성 : 트립톤-호모엑기스 액체배지(1SP-1배지), 펩톤-효모엑기스-철 한천배지(1SP-6배지) 및 티로신 한천배지(1SP-7배지)에서 공히 갈색의 색소를 생성하였다.
(6) 탄소원 이용성 : D-글루코스, L-아라비노스, D-크실로스, D-프럭토스, D-만니톨, 이노시톨, L-람노스, 라피노스 등을 이용하여 생육하였고, 슈크로스는 이용하지 못했다.
(7) 질산염 환원반응 : 음성
(8) 황화수소 생성 : 양성
이상의 특성을 요약하면 하기 표와 같고, 배양학적, 생리학적 특징과 세포벽 성분인 2.6-디아미노피멜린산의 형태 분석에서 L, L-형인 것으로부터 SL-387 균주는 스트렙토미세스 속에 속하는 것으로 판단되었다. 이 균주는 포자낭이 보이지 않고 기균사는 나선형이며 포자의 표면은 매끄럽고, 각종 배지에서 적색 내지 회색의 기균사를 형성하였다. 한편 용해성 색소는 옅은 오렌지색 내지 황색을 분비하였고, 멜라닌 색소의 생성은 양성이었으며, 단백질 및 전분 분해력이 강한편이었다. 이러한 특성으로부터 SL-387 균주를 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4]에 의하여 조사한 결과를 하기 표에 나타내었다. 본 발명에 사용한 SL-387 균주는 스트렙토미세스 그리세오루버(Streptomyces griseoruber)와 SSM(공유도계수) 82.4%로 유사하였다. 그러나, SL-387 균주는 펙틴 분해능이 없고, D-만니톨과 라피노스를 이용하는 점에서 스트렙토미세스 그리세오루버와 달랐다.
본 발명의 SL-387 균주는 통상 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로서 탄소원은 글로코스, 물엿, 텍스트린, 슈크로스, 전분, 당밀, 동 식물류 등을 사용한다. 또한 질소원으로서는 탈지대두분, 탈지땅콩분, 어분, 육엑기스, 펩톤, 효모엑기스 등을 사용한다. 기타 필요에 따라서 나트륨, 마그네슘, 염소, 인산, 황산, 아연 및 기타 이온을 생성하는 무기염류를 첨가할 수 있다.
배양 방법으로는 호기적 조건에서으리 배양법, 특히 액침배양법이 적당하다. 배양에 적당한 온도는 15 내지 37℃이지만, 많은 경우 26 내지 30℃ 부근에서 배양한다. 생리활성물질 MR-387A와 MR-387B의 생산은 배양 조건에 따라 다르지만 진탕배양 및 탱크배양에서 1 내지 8일 사이에 축적이 최고에 도달한다. 배양물 중에 MR-387A와 MR-387B 물질의 축적이 최고에 도달하였을 때 배양을 중지하고 배양물로부터 목적 물질을 단리하여 정제한다.
본 발명의 MR-387A와 MR-387B를 배양액으로부터 채취하는 과정은 그 물질의 성상을 이용한 통상의 분리 수단을 적절히 조합하여 추출 정제할 수 있다. 즉 배양 여액을 흡착수지 암버라이트 XAD-2(시그마제)의 칼럼에 통과시켜 물로 세척하고 메탄올 등의 용매로 탁착시킨다. 탈착액에서 유기용매를 제거한 후 pH2에서 부탄올과 같은 물과 혼합되지 않는 유기용매를 사용하여 유효성분을 추출한다. 추출액을 감압하에서 농축건조시켜 조분말을 얻을 수 있다. 위의 방법에 더하여 흡착크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 등을 적절히 조합하거나 반복하여 MR-387A와 MR-387B를 각각 단리한다.
MR-387A와 MR-387B의 배양 공정중이나 정제 과정 중의 추적은 항아미노펩티다제 M 활성의 측정에 기준을 두어 다음과 같이 수행하였다. 먼저 배양액 또는 물에 녹인 검체 20㎕를 96웰마이크로플레이트(microplate)에 넣고, L-로이신-p-니트로아닐라이드 저장액(12.5mg/디메틸설폭시드 1㎖) 100㎕를 0.1M 트리스-염산 완충용액(pH 7.0) 10㎖에 사용 직전 희석하여 이 용액 160㎕를 넣은 후, 효소용액(아미노펩티다제 M, 시그마제, 1mU) 20㎕를 첨가하여 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, 바이오라드제)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 플레이트를 37℃에서 30분간 반응시킨 후 다시 405nm에서 흡광도를 측정한 후 다음식에 의하여 아미노펩티다제 M 저해율(%)을 계산하였다.
A : 저해제를 넣은 것의 반응전 흡광도
B : 저해제를 넣은 것의 반응후 흡광도
C : 저해제를 넣지 않은 것의 반응전 흡광도
D : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도
아래 실시예에서는 본 발명의 MR-387A와 MR-387B의 제조법을 나타내었다. 하기 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 어느 면으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
MR-387A와 MR-387B의 발효 생산
가용선 전분 1%, 대두박 2.5%, 글루코스 2%, 효모엑기스 0.4%, 육엑기스 0.1%, 염화나트륨 0.2%, 황산구리 5 수화물 0.0005%, 염화망간 4 수화물 0.005%, 염화아연 7수화물 0.005%를 함유한 배지를 종배지 및 생산배지로서 사용하였다. 살균전의 pH는 모든 6.8로 조절하여 사용하였다.
500㎖의 삼각 플라스크에 100㎖씩 분주한 종배지를 120℃에서 20분간 살균하고 이것에 사면배양한 스트렙토미세스 속 SL-387균주를 1 내지 2 백금이 접종하고 28℃에서 2일간 진탕배양하여 배양기의 종배양으로 하였다. 120℃에서 30분간 살균한 3ℓ의 생산배지를 함유한 5ℓ자형 발효기(Jer fermentor)에서 상기 종배양액 100㎖을 접종하여 28℃에서 4일간 통기(3ℓ/분)하여 180rpm 교반속도로 배양하였다. 배양 종료 후 여과 보조제로 규조토를 가해 여과하여 균체를 포함한 고형물을 제거한 후 배양여액을 얻었다.
[실시예 2]
MR-387A와 MR-387B의 분리 정제
실시예 1에서 얻은 배양여액 10ℓ를 흡착수지 암버라이트 XAD-2에 흡착시켜 물로 세척하고 물-메탄올(1 : 1) 용매로 탁착시킨 후 500㎖의 수용액으로 감압 농축시켰다. 이 수용액에 염산용액을 가하여 pH2.0으로 조정하고 동량의 n-부탄올로 3회 반복 추출한 후 부탄올층을 재농축하였다. 이 농축물을 소량의 부틸아세테이트-부탄올-초산-물(2 : 4 : 1 : 1)에 녹여 동일 용매로 충진된 실리카겔 칼럼에 통과시켰다. 통과된 활성 분획을 감압 농축하여 다이아이온(Diaion) HP-20 칼럼에서 1-100% 메탄올 농도 구배로 용출시켰다. 이 용출액중 활성분획을 역상 실리카겔 칼럼에서 0-70% 메탄올 용매 농도구배로 재용출시켜 활성 분획을 모았다. 활성 분획을 소량의 메탄올에 녹여 세파덱스(Sephadex) LH-20에서 겔 크로마토그라피를 행하여 활성부분을 모았다. 이 물질을 감압 농축하여 저압 액체크로마토그래피(머크사, Lobar RP-18)에서 22% 아세토니트릴-0.1% 트리플루오로아세트산 용매계를 이용하여 두 물질 MR-378A와 MR-378B로 분리하였다. 이 두 물질을 더 정제하기 위하여 고압 액체 크로마토그래피(칼럼 : Phenomenex Bondclone 10C18, φ7.6×300mm, 유속 : 1.5㎖/분, 210nm 검출, 용매 : 30% 메탄올)를 행하여 14분 근처에서 MR-378A를, 17분 근처에서 MR-378B를 순수하게 분리하고, 용매를 감압 건조기로 제거한 후 냉동 건조하여 백색의 분말을 얻었다.
MR-387A와 MR-387B를 각각 2.0mg과 1.4mg정도 얻었으며, 연구실 조건에서 아미노펩티다제 M 저해활성을 조사한 결과 MR-387A는 0.10㎍/㎖의 IC50값을, MR-387B의 경우는 0.08㎍/㎖의 IC50값을 나타냈다.

Claims (2)

  1. 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 SL-387균주(기탁번호 : KCTC 0102BP
    )를 적당한 배지에서 배양하여 그 배양액으로부터 하기 일반식의 화합물 및 이의 염을 단리하는 것을 특징으로 하는 아미노펩티다제 M 저해물질인 하기 일반식의 화합물 및 이의 염의 제조방법.
    상기식에서, R은 하이드록시프롤린 또는 프롤린이다.
  2. 아미노펩티다제 M 저해물질인 하기 일반식의 화합물 및 이의 염을 생산하는 스트렙토미세스(Streptomyces) 속 SL-387 균주(기탁번호 : KCTC 0102BP).
    상기식에서, R은 하이드록시프롤린 또는 프롤린이다.
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