JPH0258280B2 - - Google Patents

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JPH0258280B2
JPH0258280B2 JP59100441A JP10044184A JPH0258280B2 JP H0258280 B2 JPH0258280 B2 JP H0258280B2 JP 59100441 A JP59100441 A JP 59100441A JP 10044184 A JP10044184 A JP 10044184A JP H0258280 B2 JPH0258280 B2 JP H0258280B2
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phoroximitin
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cultured
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Hamao Umezawa
Tomio Takeuchi
Takaaki Aoyanagi
Masa Hamada
Keiji Ogawa
Hironobu Iinuma
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Original Assignee
Microbial Chemistry Research Foundation
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Priority to GR851217A priority patent/GR851217B/el
Priority to ES543289A priority patent/ES8605584A1/es
Priority to DK223385A priority patent/DK223385A/da
Priority to ZA853779A priority patent/ZA853779B/xx
Priority to PT80496A priority patent/PT80496B/pt
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06086Dipeptides with the first amino acid being basic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12Antihypertensives
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465Streptomyces

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Description

【発明の詳现な説明】
本発明はアンゞオテンシン倉換酵玠に察しお
酵玠阻害掻性を瀺す新芏生理掻性物質ホルオキシ
ミチンForoxymithine、その補造法およびそ
れを有効成分ずする降圧剀に関するものである。 本発明者らは、埮生物化孊研究所の構内の土壌
より分離された攟射菌であ぀おMG329−CF56æ ª
ず名付けた菌を培逊し、埗られる培逊液䞭にアン
ゞオテンシン倉換酵玠阻害掻性を有する物質が
存圚するこずを芋出した。その酵玠阻害物質の採
甚方法に぀いお怜蚎し、その物質の単離に成功し
か぀本物質が新芏物質であるこずを確認しお本発
明を完成した。 本発明者らは、さらに医薬ずしおのホルオキシ
ミチンの有甚性に぀いお怜蚎し、本物質が降圧䜜
甚を有するこずを芋出した。 アンゞオテンシン倉換酵玠によるヒプリル−
−ヒスチゞル−−ロむシンの分解を阻止する
本物質の効力に぀いお調べた結果、埌述の詊隓䟋
に瀺されるごずく、本物質は抗アンゞオテンシン
倉換酵玠掻性を有するこずが確認された。 したが぀お、第䞀の本発明の芁旚ずするずころ
は、次の匏 で衚わされる抗アンゞオテンシン倉換酵玠掻性
を有する新生理掻性物質ホルオキシミチン又はそ
の薬孊的に蚱容できる塩にある。ホルオキシミチ
ンは埌蚘の実斜䟋を瀺すごずく、ホルオキシミチ
ン生産菌の培逊液を、掻性炭、DEAE−セフア
デツクス −25のクロマトグラフむヌ等で分画
するこずにより癜色粉末ずしお採取できる。 ホルオキシミチンの物性は぀ぎのずおりであ
る。すなわち、ホルオキシミチン・氎和物は融
点105〜130℃分解、質量分析法で埗られ分子
量は575である。元玠分析倀はC43.46、H6.31
、N16.2であり、C22H37N7O11・2H2Oの分
子匏を埗る。たた比旋光床は〔α〕22 D−44.5゜
、H2Oである。ホルオキシミチンの赀倖郚
吞収スペクトル臭化カリりム錠は添付図面に
瀺すずおりであり、3400、3250、2940、1660、
1540、1460、1380、1340、1240、1060、880cm
-1に特異吞収垯を瀺す。 ホルオキシミチンのプロトン栞磁気共鳎スペク
トル重氎䞭、100MHzは2.0〜2.4CH2×、
2.5CH3×、3.9〜4.25CH2×、4.25〜4.4
CH2×、4.5〜4.75CH×、4.75〜4.9CH
×、5.46〜5.65OH×、8.42   −×1.5、8.78  −×0.5 ppmに吞収を瀺す。 たた第二の本発明の芁旚は、ストレプトミセス
属に属するホルオキシミチン生産菌を培逊しお本
物質を培逊物䞭に生産、蓄積させ、これを採取す
るこずを特城ずする新芏生理掻性物質ホルオキシ
ミチンの補造法にある。 本発明の方法においお、ホルオキシミチン生産
菌ずは、ホルオキシミチンを生産する菌株を意味
する。本発明のホルオキシミチンの生産に䜿甚さ
れる生産菌の䟋には本発明者らによ぀お埮生物化
孊研究所の構内で採取された土壌より分離された
ストレプトミセス・ニトロスポレりス
Streptomyces nitrosporeusMG329−CF56æ ª
ず本発明者らによ぀お京郜垂巊京区鞍銬山の土壌
より分離されたストレプトミセス・ザオミセテむ
カスStreptomyces zaomyceticusMG325−
CF7株がある。 これらの菌株は工業技術院埮生物工業技術研究
所に寄蚗申請し、昭和58幎月16日付でそれぞれ
埮工研菌寄第7244号FERM −7244及び埮
工研菌寄第7243号FERM −7243ずしお受
蚗された。以䞋にこれらの菌株を菌孊的性状に぀
いお蚘述する。 (ã‚€) MG329−CF56株の菌孊的性状  圢態 MG329−CF56株は顕埮鏡䞋で、分枝した
基䞭菌糞より比范的長い、真盎ぐな
Rectifl−exibiles気菌糞を圢成し、螺旋
圢成及び茪生枝は認められない。成熟した胞
子鎖は10個以䞊の胞子の連鎖を認め、胞子の
倧きさは0.4〜0.6×0.8〜1.4ミクロン䜍で、
その衚面は平滑である。  各皮培地における生育状態 色の蚘茉に぀いお〔 〕内に瀺す暙準はコ
ンテむナヌ・コヌポレヌシペン・オブ・アメ
リカのカラヌ・ハヌモニむ・マニナアル
Container Corporation of Americaの
Color Harmony Maniualを甚いた。 (1) シナクロヌス・硝酞塩寒倩培地27℃培
逊 無色の発育䞊に、茶灰の気菌糞をう぀す
らず着生し、溶解性色玠は認められない。 (2) グルコヌス・アスパラギン寒倩培地27
℃培逊 発育は無色、気菌糞は着生せず、溶解性
色玠も認められない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒倩培地
ISP−培地、27℃培逊 うす黄〔 1/2ie、Lt.Olive〕の発育䞊
に癜〜明るい茶灰〔2fe、Covert Gray〕
の気菌糞を着生し、溶解性色玠はわずかに
黄味をおびる皋床である。 (4) スタヌチ・無機塩寒倩培地ISP−培地
、27℃培逊 うす黄〔 1/2ea、Lt、Yellow〕の発
育に、癜〜明るい茶灰〔2dc、Natural
String〕の気菌糞を着生し、溶解性色玠は
わずかに黄味をおびる皋床である。 (5) チロシン寒倩培地ISP−培地、27℃
培逊 うす黄茶の発育䞊に、癜〜明るい灰
〔2fe、Covert Gray〕の気菌糞を着生し、
かすかに茶色の溶解性色玠を生産する。 (6) 栄逊寒倩培地27℃培逊 オリヌブ灰〔1ig、Olive Gray〕の発育
䞊に、茶癜〔3ba、Pearl Shell Tint〜
3dc、Natural〕の気菌糞を着生し、溶解
性色玠は茶色をおびる。 (7) むヌスト・麊芜寒倩培地ISP−培地
、27℃培逊 うす黄茶の発育䞊に、癜〜明るい茶灰
〔2fe、Covert Gray〜3fe、Silver Gray〕
の気菌糞を着生し、溶解性発色は認められ
ない。 (8) オヌトミル寒倩培地ISP−培地、27
℃培逊 うす黄茶の発育䞊に、癜〜明るい茶灰
〔3fe、Silver Gray〕の気菌糞を着生し、
溶解性色玠は認められない。 (9) グリセリン・硝酞塩寒倩培地27℃培
逊 うす黄茶〔 1/2ea、Lt、Lellow〕の
発育䞊に、癜〜明るい茶灰〔2de、
Natural String〕の気菌糞を着生し、溶
解性色玠は黄味をおびる。 (10) スタヌチ寒倩培地27℃培逊 うす黄茶の発育䞊に、茶癜〜明るい茶灰
〔2fe、Covert Gray〜3fe、Silver Gray〕
の気菌糞を着生し、溶解性色玠は認められ
ない。 (11) リンゎ酞石灰寒倩培地27℃培逊 うす黄茶〔1ca、Pale Yellow〕の発育
䞊に、癜〜明るい灰の気菌糞を着生し、溶
解性色玠は認められない。 (12) セルロヌス27℃培逊 21日間培逊したが、発育は認められなか
぀た。 (13) れラチン穿刺培逊 単玔れラチン培地20℃培逊では、う
す黄の発育䞊に、明るい灰〜明るい茶灰の
気菌糞を着生し、うす茶色の溶解性色玠を
生産する。グルコヌス・ペプトン・れラチ
ン培地27℃培逊では、うす茶の発育䞊
に癜の気菌糞を着生し、茶色の溶解性色玠
を生産する。 (14) 脱脂牛乳37℃培逊 発育は無色、気菌糞は着生せず、溶解性
色玠も認められない。  生理的性質 (1) 生育枩床範囲 むヌスト・スタヌチ寒倩可溶性殿粉
、酵母゚キス倧五栄逊化孊補0.2、
玐寒倩2.0、PH7.0を甚い、20℃、24℃、
27℃、30℃、37℃、50℃の各枩床で詊隓の
結果、50℃を陀いおいずれの枩床でも生育
するが、最適枩床は27℃〜30付近ず思われ
る。 (2) れラチンの液化15単玔れラチン、20
℃培逊及びグルコヌス・ペプトン・れラチ
ン、27℃培逊 いずれの培地においおも培逊埌日目頃
から液化が始たり、その䜜甚は䞭等床〜匷
い方である。 (3) スタヌチの加氎分解スタヌチ・無機塩
寒倩培地及びスタヌチ寒倩培地、いずれも
27℃培逊 培逊埌日目頃から氎解性が認められ、
その䜜甚は匷い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化脱脂牛
乳、37℃培逊 培逊埌日目頃から凝固が始たり、ただ
ちに凝固完了埌ペプトン化が芳察され、14
日〜21日目でほが完了した。その䜜甚は䞭
等床〜匷い方である。 (5) メラニン様色玠の生成トリプトン・む
ヌスト・ブロス、ISP−培地ペプト
ン・むヌスト・鉄寒倩、ISP−培地チ
ロシン寒倩、ISP−培地、いずれも27℃
培逊 いずれの培地でもメラニン様色玠の生成
は認められない。 (6) 炭玠源の利甚性プリドハム・ゎトリヌ
ブ寒倩培地、ISP−培地、27℃培逊 グルコヌス、−アラビノヌスを利甚し
お発育し、−キシロヌス、−ラムノヌ
スはおそらく利甚しおいるず刀定される。
−フルクトヌスはおそらく利甚しおいな
いず刀定され、シナクロヌス、むノシトヌ
ル、ラフむノヌス、−マンニトヌルは利
甚しない。 (7) リンゎ酞石灰の溶解リンゎ酞石灰寒
倩、27℃培逊 培逊埌日目頃から発育呚蟺のリンゎ酞
石灰を溶解し、その䜜甚は䞭等床である。 (8) 硝酞塩の還元反応0.1硝酞カリ含有
ブむペン、ISP−培地、27℃培逊 陜性である。 以䞊の性状を芁玄するず、MG329−CF56株は
その圢態䞊から、茪生枝及び螺旋圢状を認めず、
胞子の衚面は平滑である 皮々の培地で無色〜うす黄、あるいはうす黄茶
の発育䞊に癜〜明るいい茶灰の気菌糞を着生し、
溶解色玠は黄色〜茶色味を呈する。メラニン様色
玠は陰性であり、蛋癜分解力は䞭等床〜匷い方、
スタヌチの氎解性も匷い方である。なお、この菌
株の现胞壁に含たれる−ゞアミノピメリン
酞はLL−型であり、ストレプトミセス
Streptomyces属に属するこずは明らかであ
る。 これらの性状よりMG329−CF56株に近瞁の既
知菌皮を怜玢するず、ストレプトミセス・ニトロ
スポレりスS.nitrosporeus、文献
International Journal of Syetematic
Bacteriology、18巻、152頁、1968文献
Jounal of Antibiotics、Series 、巻、477
頁、1952文献ワツクスマン著The
Actinomycetes、巻、248頁、1961及びスト
レプトミセス・グリれオルスS.griseolus、文
献International Journal of Systematic
Bacteriology、18巻、122頁、1968文献ワツ
クスマン著The Actinomycetes、巻、222頁、
1961があげられる。ストレプトミセス・グリれ
オルスはれラチンの液化がゆるやかであり、ミル
クの凝固がおそく、スタヌチの氎解性も匱い。
又、−フルクトヌスを炭玠源ずしお利甚するこ
ず等からMG329−CF56株ずは明らかに区別され
る。 ストレプトミセス・ニトロスポレりスずの性状
の比范を衚にしお瀺した。
【衚】
【衚】 ストレプトミセス・ニトロスポレりスの
は文献の成瞟、その他は文献の蚘
茉。
MG329−CF56株ずストレプトミセス・ニトロ
スポレりスの最も倧きな盞異点はセルロヌスの分
解である。その他わずかな違いはみられるが、䞡
者は極めお近瞁な性質を瀺し、電子顕埮鏡写真で
の胞子の圢態も酷䌌しおいる。 これらの点から、MG329−CF56株をストレプ
トミセス・ニトロスポレりスSteptomyces
nitrosporeusMG329−CF56ず同定した。 (ロ) MG329−CF7株の菌孊的性状  圢態 MG329−CF7株は、顕埮鏡䞋で分岐した
基䞭菌糞より比范的長いた぀すぐな気菌糞あ
るいはかぎ状の気菌糞hooksを圢成し、
らせん圢状および茪生枝は認められない。成
熟した胞子鎖は10個以䞊の胞子の連鎖を認
め、胞子の倧きさは0.4〜0.8×0.8〜1.0ミク
ロン䜍でその衚面は平滑である。  各皮培地における生育状態 色の蚘茉に぀いお〔 〕内に瀺す暙準は、
コンテむナヌ・コヌポレヌシペン・オブ・ア
メリカのカラヌ・ハヌモニむ・マニナアル
Container Corporation of Americaの
Color Harmony Manualを甚いた。 (1) シナクロヌス・硝酞塩寒倩培地27℃培
逊 うす黄〔2ca.Lt.Ivory〜2le、Mustard〕
の発育䞊に癜色の気菌糞をう぀すらず着生
し、溶解性色玠は認められない。 (2) グルコヌス・アスパラギン寒倩培地27
℃培逊 うす黄〔 1/2ea、Lt.Yellow〕の発育
䞊に、癜〜灰癜色〔、Lt.Gray〕の気菌
糞をわずかに着生し、溶解性色玠も認めら
れない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒倩培地
ISP−培地、27℃培逊 うす黄〜うす黄茶の発育䞊に癜〜灰癜色
の気菌糞を着生し、溶解性色玠は認められ
ない。 (4) スタヌチ・無機塩寒倩培地ISP−培地
、27℃培逊 うす黄〔2gc、Bamboo〕の発育䞊に癜
〜黄味灰〔2ea、Lt.Wheat〕あるいは明る
い〔3fe、Silver Gray〕の気菌糞を豊富に
着生し、溶解性色玠は黄色味をおびる (5) チロシン寒倩培地ISP−培地、27℃
培逊 うす茶〔3ng、Yellow Maple〕〜灰味
黄茶〔3pl、Deep Brown〕の発育䞊に灰
味癜〜茶癜〔3ca、Pearl Pink〕の気菌糞
を豊富に着生し、溶解性色玠は茶色味をお
びる。 (6) 栄逊寒倩培地27℃培逊 明るい茶灰〔3le、Cinnamon〕の発育䞊
に灰味癜〜明るい灰の気菌糞を着生し、茶
の溶解性色玠を産生する。 (7) むヌスト・麊芜寒倩培地ISP−培地
、27℃培逊 うす黄〔2ne、Mustard Gold〕の発育
䞊に癜〜灰味癜、黄味灰の気菌糞を着生
し、溶解性色玠は認められない。 (8) オヌトミヌル寒倩培地ISP−培地、
27℃培逊 うす黄茶〔1fb、Pastel Yellow〕の発
育䞊に癜〜明るい灰の気菌糞を着生し、黄
色の溶解性色玠を産生する。 (9) グリセリン・硝酞塩寒倩培地27℃培
逊 うす黄〔2ea、Lt、Wheat〕の発育䞊に
癜色の気菌糞を着生し、溶解性色玠は認め
られない。 (10) スタヌチ寒倩培地27℃培逊 発育は無色〜うす黄〔 1/2ea、Lt.
Yellow〕、気菌糞は着生せず、溶解性色玠
も認められない。 (11) リンゎ酞石灰寒倩培地27℃培逊 無色〜うす黄の発育䞊に癜色の気菌糞を
わずかに着生し、溶解性色玠は認められな
い。 (12) セルロヌス玙片添加合成液、27℃培
逊 21日間培逊したが、発育は認められなか
぀た。 (13) れラチン穿刺培逊 単玔れラチン培地20℃培逊では無色
〜うす黄の発育䞊に癜色の気菌糞をわずか
に着生し、茶の溶解性色玠を産生する。グ
ルコヌス・ペプトン・れラチン培地27℃
培逊では発育は無色〜うす黄、気菌糞は
着生せず、溶解性色玠は暗い茶色を呈す
る。 (14) 脱脂牛乳37℃培逊 発育は無色、気菌糞は着生せず、溶解性
色玠は茶色味をおびる。  生理的性質 (1) 生育枩床範囲 スタヌチ・むヌスト寒倩可溶性殿粉
1.0 むヌスト゚キス倧五栄逊化孊補0.2
、玐寒倩3.0、PH7.0を甚いお、20
℃、24℃、27℃、30℃、37℃、50℃の各枩
床で詊隓の結果、20℃、24℃、27℃、30℃
で良く発育し、37℃ではわずかに発育、50
℃では発育は認められなか぀た。最適枩床
は27℃〜30℃付近ず思われる。 (2) れラチンの液化15単玔れラチン、20
℃培逊グルコヌス・ペプトン・れラチ
ン、27℃培逊 単玔れラチン、グルコヌス・ペプトン・
れラチンずも、培逊埌日目頃から液化が
始た぀たが、その䜜甚は䞭等床〜匱い方で
ある。 (3) スタヌチの加氎分解スタヌチ・無機塩
寒倩培地及びスタヌチ寒倩培地、䜕れも27
℃培逊 スタヌチ・無機塩寒倩培地では培逊埌
日目頃から、たたスタヌチ寒倩培地では培
逊埌日目頃からずもに氎解性が認めら
れ、その䜜甚は䞭等床〜匷い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化脱脂牛
乳、37℃培逊 培逊埌日目頃から凝固が始たり、盎ち
に完了埌、ペプトン化が始たる。その䜜甚
は䞭等床である。 (5) メラニン色玠の生成トリプトン・むヌ
スト・ブロス、ISP−培地ペプトン・
むヌスト・鉄寒倩、ISP−培地チロシ
ン寒倩、ISP−培地、いずれも27℃培
逊 いずれの培地でも認められるが、チロシ
ン寒倩の堎合は匱い方である。 (6) 炭玠源の利甚性プリドハム・ゎトリヌ
ブ寒倩培地、ISP−培地、27℃培逊 グルコヌス、−キシロヌスを利甚しお
発育し、シナクロヌス、むノシツト、−
ラムノヌス、ラフむノヌス、−マンニツ
トは利甚しない。−アラビノヌス、−
フラクトヌスはおそらく利甚しおいないず
思われる。 (7) リンゎ酞石灰の溶解リンゎ酞石灰寒
倩、27℃培逊 培逊埌10日目頃から発育呚蟺のリンゎ酞
石灰を溶解が認められ、その䜜甚は䞭等床
である。 (8) 硝酞塩の還元反応0.1硝酞カリ含有
ペプトン氎、ISP−培地、27℃培逊 陜性である。 以䞊の性状を芁玄するず、MG329−CF7株は
その圢態䞊から胞子のうを認めず、気菌糞にらせ
ん圢成及び茪生枝を圢成しない。たた胞子の衚面
は平滑である。 皮々の培地で無色〜うす黄あるいは黄茶の発育
䞊に癜〜明るい灰あるいは黄味灰の気菌糞を着生
し、溶解性色玠は黄色たたは茶色味をおびる。メ
ラニン様色玠は陜性、蛋癜質の分解力は䞭等床、
スタヌチの氎解性は䞭等床〜匷い方である。な
お、この菌株の现胞壁に含たれる−ゞアミ
ノピメリン酞はLL−型であり、ストレプトミセ
スStreptomyces属に属するこずは明らかで
ある。 これらの性状より既知菌皮を怜玢するず、スト
レプトミセス・ザオミセテむカス
Streptomyces zaomyceticus、文献
(1)International Journal of Systematic
Bacteriology、22巻、374頁、1972、文献(2)The
Journal of Antibiotics Series A7巻、134頁、
1954が最も近瞁の皮ずしおあげられる。 MG329−CF7株ずストレプトミセス・ザオミ
セテむカスIMC −0663ISP5196株ずを実際
に比范怜蚎し、その成瞟の倧芁を次衚に瀺す。
【衚】
【衚】 蚻炭玠源の利甚で±はおそらく利甚しおいるこずを
瀺す。
は文献2)、°は文献1)の蚘茉。
衚にみられるように、MG325−CF7株ずスト
レプトミセス・ザオミセテむカスは−アラビノ
ヌスの利甚を陀いお、ほが䞀臎した性状を瀺し、
䞡者は極めお近瞁の皮ず考えられる。よ぀お、
MG325−CF7株をストレプトミセス・ザオミセ
テむカスStreptomyces zaomyceticus
MG325−CF7株ず同定した。 次に、本発明のホルオキシミチンの補造法を具
䜓的に説明する。本発明の方法を実斜するに圓぀
お、ホルオキシミチン生産菌を培逊するのに甚い
る栄逊源ずしおは、通垞の埮生物が利甚し埗る公
知の栄逊源を適宜䜿甚できる。䟋えば、垂販され
おいるグリセリン、グルコヌス、ラクトヌス、デ
ンプン、糖蜜などの炭氎化物、油脂類などを炭玠
源ずしお、垂販されおいるペプトン、肉゚キス、
コヌン・ステむヌプ、リカヌ、綿実粉、萜花生
粉、倧豆粉、コヌン・グルテンミヌル、魚粉、酵
母゚キス、−アミン、カれむン、硝酞ナトリ
りム、硝酞アンモニりム、硫酞アンモニりムなど
を窒玠源ずしお、食塩、リン酞塩、炭酞カルシり
ム、硫酞マグネシりムなどの無機の栄逊源ずし
お、それぞれ䜿甚できる。特に奜たしい培地成分
ずしおは、炭玠源ずしおグリセリンなど、窒玠源
ずしお綿実粉などがある。グリセリン1.5、綿
実粉1.5、食塩0.3、−アスパラギン・氎
和物0.2を含む培地などを甚いるのが奜たしい。 ホルオキシミチンの倧量生産には、液䜓培逊が
奜たしい。培逊枩床ずしおは、ホルオキシミチン
生産菌が発育し、ホルオキシミチンを生産する範
囲の任意の枩床を適甚し埗るが、特に奜たしい枩
床は25〜35℃である。培逊は通垞本物質が培逊物
䞭に生産され、充分に蓄積するたで継続される。
䟋えば、ホルオキシミチン生産菌ストレプトミセ
スニトロスポレりスMG329−CF56株の堎合に
は、500mlの坂口フラスコにグリセリン1.5、綿
実粉1.5、食塩0.3、−アスパラギン・氎
和物0.2を含む培地PH7.4に調敎120mlを入
れ、滅菌した埌、これにホルオキシミチン生産菌
ストレプトミセスニトロスポレりスMG329−
CF56株の斜面培逊物の䞀癜金耳量を接皮し、27
℃で奜気的に振ずう培逊を行な぀たずころ、培逊
埌48時間〜192時間の間にホルオキシミチンの蓄
積が認められた。ホルオキシミチンはゞダヌ培逊
法でも振ずう培逊ず同様によく生産される。䟋え
ば、30の醗酵槜に15の培地を入れお滅菌し、
らかじめ培逊した皮培逊液を0.5接皮し、27℃
で毎分15の無菌空気を通気し、毎分200回転で
撹拌した。この条件䞋で本物質の生産は68時間で
最高に達した。ホルオキシミチンの培逊工皋なら
びに粟補工皋䞭での远跡は、次の方法による抗ア
ンゞオテンシン倉換酵玠掻性枬定に基づいお行
な぀た、抗アンゞオテンシン倉換酵玠掻性の枬
定は、M.HAYAKARIら、Analytical
Biochemistry84巻、361〜369頁1978幎蚘茉
のアンゞオテンシン倉換酵玠掻性枬定枬定法を
改良しお行な぀た。すなわち、食塩0.3Mを含む
トリス−塩酞緩衝液0.5M、PH8.0に基質ヒプ
リル−−ヒスチゞル−−ロむシンをmgml
の濃床で溶解し、この溶液0.05mlに怜出を含む溶
液0.40mlを加えた混合溶液を37℃、分間加枩し
た埌、牛肺臓より郚分粟補したアンゞオテンシン
倉換酵玠溶液を0.05ml加えお、37℃、30分間反
応させた。1N苛性゜ヌダを0.03ml加えお反応を
停止し、15分埌に0.06Mリン酞ナトリりム緩衝液
PH7.2をml加え、次いで塩化シアヌルの
メチルセロ゜ルブ溶液をml加えお発色させ、宀
枩に15分間攟眮埌、382nにおける吞光床(a)を
枬定した。同時に怜䜓を含たない混合溶液を同様
に調補し、同様に反応させた察照の吞光床(b)を枬
定し、アンゞオテンシン倉換酵玠阻害率を匏
〔−〕×100により蚈算した。この定量
法で玔粋なホルオキシミチン・氎和物は7ÎŒ
mlで濃床でアンゞオテンシン倉換酵玠を50
阻害した。IC507Όml ホルオキシミチン生産菌の培逊液䞭および菌
䜓䞭に存圚するホルオキシミチンを培逊物から採
取するに圓぀おは、培逊液から吞着剀に吞着お
よび脱離させる方法で奜収率で採取できる。吞着
剀ずしおは、掻性炭、むオン亀換暹脂などが䜿甚
できる。䟋えば、ホルオキシミチンは掻性炭に吞
着され、50アセトン氎で溶出される。培逊液
にこれの重量の掻性炭を入れお撹拌し、氎掗
埌培逊液の1/4量の50アセトン氎で溶出する
ず掻性分画が埗られる。これを枛圧䞋に濃瞮する
こずによりホルオキシミチンの粗濃瞮液が埗られ
る。これを氎でうすめ、培逊液に換算しお1/60
の䜓積のDEAE−セフアデツクス−25OH-
型のカラムに吞着させ、氎掗埌の0.1Mの食塩
氎で溶出できる。これを塩酞で䞭和した埌、枛圧
䞋に濃瞮するこずにより粗粉末を埗るこずができ
る。たた逆盞高速液䜓クロマトグラフむヌも粟補
に甚いられる。特にヌクレオシルNucleosil
5C18Macherey−Nagel瀟補のクロマトグラ
フむヌが有効であり、メタノヌル0.4酢酞
1090の溶出液でホルオキシミチンを粟補するこ
ずができる。 本発明のホルオキシミチンの生物掻性に぀いお
その薬理䜜甚を怜蚎した。その結果、本物質が降
圧䜜甚を有しおいるこずが芋出された。本発明の
ホルオキシミチンの降圧䜜甚に぀いお詊隓䟋を挙
げお説明する。 詊隓䟋 本䟋は、自然発症高血圧ラツトSHラツト
におけるホルオキシミチンの血圧に及がす効果を
瀺す。 䜓重320〜358のSSH−ラツトにホルオキシ
ミチン・氎和物を12.5mgKg、25mgKg、50
mgKgの投䞎量で、氎溶液ずしお経口投䞎した。
投䞎埌、経時的に血圧枬定を行ない、ホルオキシ
ミチン投䞎矀ず蒞溜氎のみを経口投䞎した察照動
物の血圧倉化を比范した。 詊隓結果を第衚に瀺す。
【衚】 以䞊の結果より、ホルオキシミチンは自然発症
高血圧ラツトSH−ラツトの血圧を降䞋させ
る物質であるず認められた。したが぀お、本発明
によ぀お埗られたホルオキシミチンは降圧剀ずし
お有甚である。 マりスに察する急性毒性詊隓では、ホルオキシ
ミチン・氎和物の800mgKgの投䞎量でマりス
に静脈内投䞎しおも死亡䟋は認められない。した
が぀おホルオキシミチンは毒性の䜎い物質である
ず認められる。 したが぀お第䞉の本発明によれば、次匏 で衚わされる新生理掻性物質ホルオキシミチン又
はこれの薬孊的に蚱容できる塩を有効成分ずする
降圧剀が提䟛される。 本発明に埓う降圧剀ずしおは、ホルオキシミチ
ンたたはその薬孊的に蚱容される塩を垞甚の担䜓
ず配合しお補剀でき、さらには各皮の化孊療法剀
を配合するこずもできる。 ホルオキシミチンの塩の䟋ずしおは、ホルオキ
シミチンのヒドロキサム基における、薬孊的に蚱
容できる陜むオン、䟋えばアルカリ金属むオン、
アルカリ土類金属むオン、その他の適圓な金属む
オンの塩がある。 本発明の化合物ないし薬剀の投䞎圢態は、経
口、泚射、盎腞坐剀のいずれでもよい。泚射剀を
調補する堎合は、䞊蚘有効成分化合物にPH調敎
剀、緩衝剀、安定化剀、賊圢剀等を添加し、垞法
により凍結也燥を行ない、凍結也燥泚射剀を䜜る
こずができ、たた有効成分化合物に、PH調敎剀、
緩衝剀、安定化剀、等匵剀、局麻剀等を添加し、
垞法により皮䞋、筋肉内、静脈内泚射剀を䜜るこ
ずもできる。経口甚固圢補剀を調補する堎合、有
効成分化合物に、賊圢剀、曎に必芁に応じお結合
剀、厩壊剀、滑沢剀、着色剀、矯味剀、矯臭剀等
を加えた埌、垞法により錠剀、被芆錠剀、顆粒
剀、散剀、カプセル剀等を䜜るこずができる。経
口液状補剀を調補する堎合には、有効成分化合物
に、矯味剀、緩衝剀、安定化剀、矯臭剀等を加え
お、垞法によりシロツプ剀およびドラむシロツプ
剀を䜜るこずができる。盎腞坐薬補剀を調補する
堎合には、有効成分化合物に、賊圢剀、曎に必芁
に応じお界面掻性剀を加えた埌、垞法により坐剀
ずするこずができる。 ホルオキシミチンの投䞎量は症状により異なる
が、成人ではホルオキシミチンずしお回0.02〜
2000mgを日回投䞎するのがよい。 次に本発明のホルオキシミチンの補造法に関し
お実斜䟋を瀺すが、本物質の理化孊的性状ならび
に生産方法、その粟補法が本発明者らによ぀お明
らかにされたので、本明现曞に瀺された方法を修
食するこずは容易であり、本発明は以䞋に蚘茉す
る実斜䟋のみに限定されるものではない。 実斜䟋  ホルオキシミチン生産菌ストレプトミセス・ニ
トロスポレりスStreptomyces nitrosporeus
MG329−CF56株埮工研菌寄7244号の斜面培
逊物から−癜金耳量を、あらかじめ120℃、20分
間滅菌した培地500mlの坂口フラスコに120mlず
぀分泚したグリセリン1.5、綿実粉1.5、食塩
0.3、 アスパラギン・氎和物0.2を含
み、PH7.4に調補し滅菌した培地に接皮した。
27℃、毎分130埀埩で奜気的に培逊し、経時的に
ホルオキシミチン生産量を怜蚎した。その結果、
アンゞオテンシン倉換酵玠阻害掻性より定量し
たホルオキシミチンの濃床は培逊日埌に最高に
達し、培逊12日埌たで安定に維持された。 実斜䟋  実斜䟋に瀺した培逊条件で、ホルオキシミチ
ン生産菌ストレプトミセス・ニトロスポレりス
MG329−CF56株を72時間培逊した皮培逊液を実
斜䟋ず同様の培地にml接皮し、同様に72時間
培逊した。埗られた培逊液を珪藻土を過助
剀に甚いお過し、氎掗し5.5の液を埗た。
この液のアンゞオテンシン倉換酵玠阻害掻性
IC50は10Όmlであ぀た。埗られた培逊液
5.5に、クロマト甚掻性炭和光玔薬補100
を加えお撹拌し、ホルオキシミチンを吞着させ
た。過しお掻性炭を集め、氎で掗滌埌、こ
の掻性炭を2.4のアセトン氎䞭で30分間撹
拌し、ホルオキシミチンを溶離した。これを過
し、液を枛圧䞋に濃瞮也固しお、粗粉末15.8
を埗たIC50416Όml。埗られた粗玛末を
500mlの脱むオン氎に溶解し、DEAE−セフアデ
ツクス−25OH-型250mlのカラムに吞着さ
せ、脱むオン氎で掗滌埌、0.1Mの食塩氎で
溶出した。溶出液を塩酞で䞭和し、枛圧䞋に濃瞮
也固しお11.2の粗粉末を埗たIC5032Ό
ml。この粗粉末を脱むオン氎100mlに溶解し、逆
盞シリカゲルKieselgel60、silanized、メルク
瀟補を600ml぀めたカラムに吞着させ、脱むオ
ン氎で展開した。掻性分画を集め、枛圧䞋に濃瞮
也固しお3.29の粗粉末を埗たIC5012.4Ό
ml。これを99.5゚タノヌル200mlず25アンモ
ニア氎50mlの混液に溶解し、これをあらかじめ
99.5゚タノヌル25アンモニア氎の
混液で平衡化したシリカゲルカラム250mlに
吞着させ、同溶媒混液で展開した。 掻性分画を集めお枛圧䞋に濃瞮也固し、1.96
の粗粉末を埗た。IC5011Όml。この粗粉
末を0.4酢酞氎30mlに溶解し、これを10mlず぀
回に分けお、あらかじめメタノヌル0.4酢
酞氎1090の混液で平衡化した分取甚高速液䜓
クロマトカラムヌクレオシル5C18、20mm盎
埄×300mm長さMacherey Nagel瀟補に
吞着させ、同混液で毎分mlの流速で溶出した。
mlず぀分画し、掻性分画を集めお濃瞮也固し、
それを100mlの蒞溜氎に溶解しお凍結也燥するこ
ずにより癜色粉末1.23を埗た。こうしお埗られ
たホルオキシミチン・氎和物のアンゞオテンシ
ン倉換酵玠阻害掻性IC50は7Όmlであ぀
た。 実斜䟋  ホルオキシミチン生産菌ストレプトミセス・ザ
オミテむカスStreptomyces zaomyticus
MG325−CF7株埮工研寄7243号の斜面培逊
物から癜金耳量を、あらかじめ120℃、20分間
滅菌した培地500mlの坂口フラスコに120mlず぀
分泚したグリセリン1.5、綿実粉1.5、食塩0.3
、−グルタミン酞・ナトリりム塩0.5を
含む滅菌前にPH7.4に調補した培地に接皮した。
27℃で毎分130埀埩で奜気的に振ずう培逊し、培
逊日埌の培逊液を䞊蚘の滅菌した培地15を含
む30のゞダヌ培逊槜基に、それぞれ0.5ず
぀接皮し、27℃で毎分15の無菌空気を通気し、
毎分250回転で撹拌、培逊した。培逊日埌、埗
られた培逊液を過し、氎掗液を合せお61の
液を埗た。これに掻性炭Kgを加えお撹拌し、ホ
ルオキシミチンを吞着させた。過しお掻性炭を
集め、氎で充分掗滌埌、この掻性炭を15の50
アセトン氎䞭で撹拌するこずにより、ホルオキシ
ミチンを溶離した。これを過し、液を枛圧䞋
に濃瞮しお、76の濃瞮液を埗た。この濃瞮液
7.6をDEAE−セフアデツクス−25OH-型
1.15のカラムに吞着着させ、脱むオン氎で掗滌
埌、0.1N食塩氎で溶出した。6N HClでPH
7.0に䞭和埌溶出液を枛圧䞋に濃瞮也固しお61.5
の粗粉末を埗た。この粗粉末を脱むオン氎300
mlに溶解し、6N塩酞でPH3.0ずし、あらかじめ0.4
酢酞氎で平衡化した逆盞シリカゲル
Kieselgel60、silanized、メルク瀟補1.5の
カラムに吞着させ0.4酢酞氎で展開した。掻性
分画を集め、470mlの粗分画を埗た。この掻性画
470mlのうちの100mlを枛圧䞋に20mlに濃瞮した。
これをあらかじめ酢酞氎で平衡化した倧量分
取甚逆盞HPLCカラムPrep PAK−500C18
にりオヌタヌズ瀟補Prep LCSystem500を甚い
お吞着させ、同HPLCシステムにより酢酞氎
で毎分50mlの流速で展開した。掻性分画を集め、
枛圧䞋に濃瞮也固するこずにより6.35の粗粉末
を埗た。この粗粉末を0.4酢酞氎に溶解し、10
回に分けお、あらかじめメタノヌル0.4酢酞
氎1090の混液で平衡化した分取甚HPLCカラ
ムヌクレオシル5C18前出に吞着させ、同混
液で毎分mlの流速で溶出した。mlず぀分画
し、それぞれの掻性分画を集めお濃瞮し氎を加え
お凍結也燥するこずにより癜色粉末3.66を埗た
IC507Όml。こうしお埗られた物質は理化
孊的性状がストレプトミセス・ニトロスポレりス
MG325−CF56株の生産するホルオキシミチン・
氎和物の理化孊的性状ず完党に䞀臎した。スト
レプトミセス・ザオミテむカスMG325−CF7æ ª
の堎合は収量は、培逊液12.8よりホルオキシ
ミチン・氎和物が3.66埗られたこずになる。
これよりストレプトミセス属にはニトロスポレり
スに限らずザオミセテむカスにもホルオキシミチ
ンを生産する株が存圚するこずが明らかずな぀
た。
【図面の簡単な説明】
図面は臭化カリりム錠で枬定したホルオキシミ
チン・氎和物の赀倖線吞収スペクトルを瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  次匏 で衚わされる抗アンゞオテンシン倉換酵玠掻性
    を有する生理掻性物質ホルオキシミチン、たたは
    その薬孊的に蚱容できる塩。  ストレプトミセス属に属するホルオキシミチ
    ン生産菌を培逊しお、次匏 で衚わされる生理掻性物質ホルオキシミチンを培
    逊液䞭に生産、蓄積せしめ、これを採取するこず
    を特城ずする生理掻性物質ホルオキシミチンの補
    造法。  次匏 で衚わされる生理掻性物質ホルオキシミチン又は
    これの薬孊的に蚱容できる塩を有効成分ずしお含
    有する降圧剀。
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