JPH0358342B2 - - Google Patents
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- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Description
本発明は、カルボキシペプチダーゼB及びエン
ケフアリナーゼBに対して酵素阻害活性を示す新
規生理活性物質ヒスタジン(Histargin)、その製
造法、およびそれを有効成分とする鎮痛剤又は鎮
痛増強剤に関するものである。 本発明者らは、兵庫県伊丹市の土壤より分離さ
れた放射菌であつてMF118−A5株と名付けた菌
を培養し、得られる培養物中にカルボキシペプチ
ダーゼB阻害活性を有する物質が存在することを
見出した。その酵素阻害物質の採取方法について
検討し、その物質の単離に成功し、また本物質が
新規物質であることを確認し、本発明を完成し
た。 本発明者らは、さらに医薬としてのヒスタジン
の有用性について検討し、本物質が細胞性免疫に
対して増強作用を有すること、また鎮痛剤増強作
用乃至鎮痛作用を有することを見出した。 カルボキシペプチダーゼBによるヒプリル−L
−リジンの分解を阻止する本物質の効力について
調べた結果、後述の試験例に示されるごとく、抗
カルボキシペプチダーゼB活性を有することが確
認された。また、エンケフアリナーゼB阻害活性
をもつことも確認された。 従つて、第一の本発明の要旨とするところは、
次式: で表わされる抗カルボキシペプチダーゼB活性を
有する新生理活性物質ヒスタジン又はその塩又は
又は水和物にある。 ヒスタジンは後記の実施例に示すごとく、ヒス
タジン生産菌の培養液をアンバーライトIRC50
の如きイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフイ
ー等で分画することにより白色粉末として採取で
きる。 ヒスタジンの1水和物の物性は次の通りであ
る。即ち、ヒスタジン・1水和物は融点161〜165
℃(分解)、質量分析法で得られる分子量が355で
ある。元素分析値は、C45.53%、H7.53%、
N26.28%、O20.80%であり、C14H25N7O4・H2O
の分子式に一致する。また比施光度は、〔α〕25 D=
36.3°(c=1、定沸点塩酸)である。ヒスタジ
ン・1水和物の赤外部吸収スペクトル(臭化カリ
ルム錠)は、添付図面に示すとうりであり、
3375,1670,1630,1580,1450,1400,1320,
1180,1100,980,940,760(cm-1)に特異吸収帯
を示す。 ヒスタジン・1水和物のプロトン核磁気共鳴ス
ペクトル(重水溶液,100MHz)では1.8〜2.3
(CH2×2)、3.2〜3.5(CH2×3)、3.5〜3.65
(CH2)、3.65〜3.83(CH)、3.85〜4.05(CH)、7.3
〜7.4(−CH=)、8.05〜8.15(−CH=)ppmに吸
収を示す。 また第二の本発明の要旨は、ストレプトミセス
属に属するヒスタジン生産菌を培養して本物質を
培養物中に生産、蓄積させ、さらにこれを採取す
ることを特徴とする新規生理活性物質ヒスタジン
の製造法にある。 本発明の方法において、本発明のヒスタジンの
生産に使用される生産菌の一例には、本発明者ら
によつて兵庫県伊丹市で採取された土壤より分離
されたストレプトマイセス・ロゼオビリデイス
(Streptomyces roseoviridis)MF118−A5株が
ある。本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、昭和58年4月18日保管委託し、微工研菌寄
第7043号(FERMP−7043)の受託番号が付せら
れて保管されている。以下のこの菌株の菌学的性
状について記述する。 MF118−A5株の菌学的性状は次の通りである。 1 形態 MF118−A5株は、顕微鏡下で分枝した基中菌
糸よりまつすぐな気菌糸を形成し、輪生枝はみと
められない。成熟した胞子鎖は10個以上の胞子の
連鎖をみとめ、胞子の大きさは0.4〜0.6×1.6〜
1.8ミクロン位で、胞子の表面は平滑である。 2 各種培地における生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準は、コン
テイナー・コーポレーシヨン・オブ・アメリカの
カラー・ハーモニイ・マニユアル(Container
Corporation of AmericaのColor Harmory
Manual)を用いた。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地(27℃培養) 無色の発育上に白の気菌糸をうつすらと着生
し、溶解性色素はみとめられない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地(27℃培
養) うす黄の発育上にうすピンク〔5ca,Flesh
Pink〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
められない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP−
培地5、27℃培養) うす茶〔3gc,Lt Tan〕の発育上に白〜う
すピンク〔6ca,Flesh Pink〕の気菌糸を着生
し、溶解性色素はわずかに茶色味をおびる程度
である。 (4) スターチ・無機塩寒天培地(ISP−培地4、
27℃培養) うす黄茶の発育上にうす茶〔4ec,Bisque〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに茶色
味をおびる程度である。 (5) チロシン寒天培地(ISP−培地7,27℃培
養) うす黄茶の発育上に、茶白〔3ba,Pearl〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味をおび
る程度である。 (6) 栄養寒天培地(27℃培養) 発育はうす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性
色素もみとめられない。 (7) イースト・麦芽寒天培地(ISP−培地2,27
℃培養) 無色〜うす黄茶〔3ie,Camel〕の発育上に
白〜うす茶〔4ec,Bisque〜5ec,Dusty
peach〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はわず
かに茶色味をおびる程度である。 (8) オートミール寒天培地(ISP−培地3,27℃
培養) うす黄〜うす黄茶の発育上の白〜うすピンク
〔4ca,Flesh Pink〕の気菌糸を着生し、溶解
性色素はみとめられない。 (9) グリセリン・硝酸塩寒天培地(27℃培養) うす黄茶〔2gc,Bamboo〕の発育上にうつ
すらと白の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
めらるない。 (10) スターチ寒天培地(27℃培養) うす黄の発育上に白〜うすピンク〔5ca,
Flesh pink,〜4ca,Flesh pink〕の気菌糸を
着生し、溶解性色素はみとめられない。 (11) リンゴ酸石灰寒天培地(27℃培養) 無色の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。 (12) セルロース(紙片添加合成液、27℃培養) 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素
もみとめられない。 (13) ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地(20℃培養)では、発育は
うす茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は茶色
となる。 グルコース・ペプトン・ゼラチン培地(27℃
培養)では、発育はうす茶、気菌糸は着生せ
ず、溶解性色素は暗い茶色を呈する。 (14) 脱脂牛乳(37℃培養) 発育はうす茶、気菌糸は着生せず、溶解性色
素は茶色味をおびる程度である。 3 生理的性質 (1) 生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天を用い、20
℃,24℃,27℃,30℃,37℃,50℃の各温度で
培養試験の結果、50℃を除いてそのいずれの温
度でも発育したが、最適温度は24℃〜30℃付近
と思われる。 (2) ゼラチンの液化(15%単純ゼラチン、20℃培
養;グルコース・ペプトン・ゼラチン、27℃培
養) 単純ゼラチン培地、グリコース・ペプトン・
ゼラチン培地とともに培養後10日目頃から液化
が始まる。その作用はともに中等度である。 (3) スターチの加水分解(スターチ・無機塩寒天
培地及びスターチ寒天培地、いずれも27℃培
養) スターチ・無機塩寒天培地の場合は、培養後
3日目頃から、またスターチ寒天培地では培養
後5日目頃から、ともに加水分解性がみとめら
れ、その作用は中等度〜強い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化(脱脂牛乳、37
℃培養) 培養後10日目頃より凝固がはじまり、直ちに
完了後ペプトン化が始まる。ペプトン化は培養
後21日目頃に完了する。その作用はともに中等
度〜強い方である。 (5) メラニン様色素の生成(トリプトン・イース
ト・ブロス、ISP−培地1;ペプトン・イース
ト・鉄寒天、ISP−培地6;チロシン寒天、
ISP−培地7、いずれも27℃培養) トリプトン・イースト・ブロス培地およびペ
プトン・イースト・鉄寒天培地でメラニン様色
素をみとめるが、チロシン寒天でははつきりし
たメラニン様色素を観察できなかつた。 (6) 炭素源の利用(プリドハム・ゴトリーブ寒天
培地、ISP−培地9、27℃培養) D−グルコース、L−アラビノース、D−キ
シロースを利用して発育し、D−フラクトー
ス、シユクトース、イノシトール、L−ラムノ
ース、ラフイノース、D−マンニトールを利用
しない。 (7) リンゴ酸石灰の溶解(リンゴ酸石灰寒天、27
℃培養) 培養後7日目頃から発育周辺のリンゴ酸石灰
を溶解し、その作用は中等度〜強い方である。 (8) 硝酸塩の還元反応(1.0%硝酸カリ含有ペプ
トン水、ISP−培地8、27℃培養)陽性であ
る。 以上の性状を要約すると、MF118−A5株は、
ストレプトミセス(Streptomyces)属に属し、
細胞壁に含まれる2,6−ジアミノピメリン酸は
LL−型である。また、胞子のうをみとめず、気
菌糸はまつすぐで輪生枝はみとめられない。胞子
の表面は平滑である。種々の培地で、無色〜うす
黄茶の発育上に、白〜うすピンクあるいはうす茶
の気菌糸を着生し、溶解性色素はほとんどみとめ
られない。メラニン様色素は陽性、蛋白分解力は
中等度、スターチの水解性は中等度〜強い方であ
る。 これらの性状より、MF−118−A5株に近縁の
既知菌種を検索すると、次の2種があげられる。
すなわち、アクチノミセス・ロゼオビリデイス
(Actinomyces roseoviridis;文献(1)
International Journal of Systematic
Bacteriology,18巻,372頁、1968:;文献(2)
Gause,G.F.et al,Zur Klassifizierung der
Actinomyceten,43頁,Veb Gustav Fischer
Verlag,Jena,1958)およびストレプトミセ
ス・ラベンドレー(Streptomyces lavendulae;
文献(3)International Journal of Systematic
Bacteriology,18巻,138頁,1968)である。こ
れら2種のISP菌株(本出願人の研究所保管)と
MF118−A5株とを比較、試験した成績の大要を
示すと次表のようになる。
ケフアリナーゼBに対して酵素阻害活性を示す新
規生理活性物質ヒスタジン(Histargin)、その製
造法、およびそれを有効成分とする鎮痛剤又は鎮
痛増強剤に関するものである。 本発明者らは、兵庫県伊丹市の土壤より分離さ
れた放射菌であつてMF118−A5株と名付けた菌
を培養し、得られる培養物中にカルボキシペプチ
ダーゼB阻害活性を有する物質が存在することを
見出した。その酵素阻害物質の採取方法について
検討し、その物質の単離に成功し、また本物質が
新規物質であることを確認し、本発明を完成し
た。 本発明者らは、さらに医薬としてのヒスタジン
の有用性について検討し、本物質が細胞性免疫に
対して増強作用を有すること、また鎮痛剤増強作
用乃至鎮痛作用を有することを見出した。 カルボキシペプチダーゼBによるヒプリル−L
−リジンの分解を阻止する本物質の効力について
調べた結果、後述の試験例に示されるごとく、抗
カルボキシペプチダーゼB活性を有することが確
認された。また、エンケフアリナーゼB阻害活性
をもつことも確認された。 従つて、第一の本発明の要旨とするところは、
次式: で表わされる抗カルボキシペプチダーゼB活性を
有する新生理活性物質ヒスタジン又はその塩又は
又は水和物にある。 ヒスタジンは後記の実施例に示すごとく、ヒス
タジン生産菌の培養液をアンバーライトIRC50
の如きイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフイ
ー等で分画することにより白色粉末として採取で
きる。 ヒスタジンの1水和物の物性は次の通りであ
る。即ち、ヒスタジン・1水和物は融点161〜165
℃(分解)、質量分析法で得られる分子量が355で
ある。元素分析値は、C45.53%、H7.53%、
N26.28%、O20.80%であり、C14H25N7O4・H2O
の分子式に一致する。また比施光度は、〔α〕25 D=
36.3°(c=1、定沸点塩酸)である。ヒスタジ
ン・1水和物の赤外部吸収スペクトル(臭化カリ
ルム錠)は、添付図面に示すとうりであり、
3375,1670,1630,1580,1450,1400,1320,
1180,1100,980,940,760(cm-1)に特異吸収帯
を示す。 ヒスタジン・1水和物のプロトン核磁気共鳴ス
ペクトル(重水溶液,100MHz)では1.8〜2.3
(CH2×2)、3.2〜3.5(CH2×3)、3.5〜3.65
(CH2)、3.65〜3.83(CH)、3.85〜4.05(CH)、7.3
〜7.4(−CH=)、8.05〜8.15(−CH=)ppmに吸
収を示す。 また第二の本発明の要旨は、ストレプトミセス
属に属するヒスタジン生産菌を培養して本物質を
培養物中に生産、蓄積させ、さらにこれを採取す
ることを特徴とする新規生理活性物質ヒスタジン
の製造法にある。 本発明の方法において、本発明のヒスタジンの
生産に使用される生産菌の一例には、本発明者ら
によつて兵庫県伊丹市で採取された土壤より分離
されたストレプトマイセス・ロゼオビリデイス
(Streptomyces roseoviridis)MF118−A5株が
ある。本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、昭和58年4月18日保管委託し、微工研菌寄
第7043号(FERMP−7043)の受託番号が付せら
れて保管されている。以下のこの菌株の菌学的性
状について記述する。 MF118−A5株の菌学的性状は次の通りである。 1 形態 MF118−A5株は、顕微鏡下で分枝した基中菌
糸よりまつすぐな気菌糸を形成し、輪生枝はみと
められない。成熟した胞子鎖は10個以上の胞子の
連鎖をみとめ、胞子の大きさは0.4〜0.6×1.6〜
1.8ミクロン位で、胞子の表面は平滑である。 2 各種培地における生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準は、コン
テイナー・コーポレーシヨン・オブ・アメリカの
カラー・ハーモニイ・マニユアル(Container
Corporation of AmericaのColor Harmory
Manual)を用いた。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地(27℃培養) 無色の発育上に白の気菌糸をうつすらと着生
し、溶解性色素はみとめられない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地(27℃培
養) うす黄の発育上にうすピンク〔5ca,Flesh
Pink〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
められない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP−
培地5、27℃培養) うす茶〔3gc,Lt Tan〕の発育上に白〜う
すピンク〔6ca,Flesh Pink〕の気菌糸を着生
し、溶解性色素はわずかに茶色味をおびる程度
である。 (4) スターチ・無機塩寒天培地(ISP−培地4、
27℃培養) うす黄茶の発育上にうす茶〔4ec,Bisque〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに茶色
味をおびる程度である。 (5) チロシン寒天培地(ISP−培地7,27℃培
養) うす黄茶の発育上に、茶白〔3ba,Pearl〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味をおび
る程度である。 (6) 栄養寒天培地(27℃培養) 発育はうす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性
色素もみとめられない。 (7) イースト・麦芽寒天培地(ISP−培地2,27
℃培養) 無色〜うす黄茶〔3ie,Camel〕の発育上に
白〜うす茶〔4ec,Bisque〜5ec,Dusty
peach〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はわず
かに茶色味をおびる程度である。 (8) オートミール寒天培地(ISP−培地3,27℃
培養) うす黄〜うす黄茶の発育上の白〜うすピンク
〔4ca,Flesh Pink〕の気菌糸を着生し、溶解
性色素はみとめられない。 (9) グリセリン・硝酸塩寒天培地(27℃培養) うす黄茶〔2gc,Bamboo〕の発育上にうつ
すらと白の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
めらるない。 (10) スターチ寒天培地(27℃培養) うす黄の発育上に白〜うすピンク〔5ca,
Flesh pink,〜4ca,Flesh pink〕の気菌糸を
着生し、溶解性色素はみとめられない。 (11) リンゴ酸石灰寒天培地(27℃培養) 無色の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。 (12) セルロース(紙片添加合成液、27℃培養) 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素
もみとめられない。 (13) ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地(20℃培養)では、発育は
うす茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は茶色
となる。 グルコース・ペプトン・ゼラチン培地(27℃
培養)では、発育はうす茶、気菌糸は着生せ
ず、溶解性色素は暗い茶色を呈する。 (14) 脱脂牛乳(37℃培養) 発育はうす茶、気菌糸は着生せず、溶解性色
素は茶色味をおびる程度である。 3 生理的性質 (1) 生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天を用い、20
℃,24℃,27℃,30℃,37℃,50℃の各温度で
培養試験の結果、50℃を除いてそのいずれの温
度でも発育したが、最適温度は24℃〜30℃付近
と思われる。 (2) ゼラチンの液化(15%単純ゼラチン、20℃培
養;グルコース・ペプトン・ゼラチン、27℃培
養) 単純ゼラチン培地、グリコース・ペプトン・
ゼラチン培地とともに培養後10日目頃から液化
が始まる。その作用はともに中等度である。 (3) スターチの加水分解(スターチ・無機塩寒天
培地及びスターチ寒天培地、いずれも27℃培
養) スターチ・無機塩寒天培地の場合は、培養後
3日目頃から、またスターチ寒天培地では培養
後5日目頃から、ともに加水分解性がみとめら
れ、その作用は中等度〜強い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化(脱脂牛乳、37
℃培養) 培養後10日目頃より凝固がはじまり、直ちに
完了後ペプトン化が始まる。ペプトン化は培養
後21日目頃に完了する。その作用はともに中等
度〜強い方である。 (5) メラニン様色素の生成(トリプトン・イース
ト・ブロス、ISP−培地1;ペプトン・イース
ト・鉄寒天、ISP−培地6;チロシン寒天、
ISP−培地7、いずれも27℃培養) トリプトン・イースト・ブロス培地およびペ
プトン・イースト・鉄寒天培地でメラニン様色
素をみとめるが、チロシン寒天でははつきりし
たメラニン様色素を観察できなかつた。 (6) 炭素源の利用(プリドハム・ゴトリーブ寒天
培地、ISP−培地9、27℃培養) D−グルコース、L−アラビノース、D−キ
シロースを利用して発育し、D−フラクトー
ス、シユクトース、イノシトール、L−ラムノ
ース、ラフイノース、D−マンニトールを利用
しない。 (7) リンゴ酸石灰の溶解(リンゴ酸石灰寒天、27
℃培養) 培養後7日目頃から発育周辺のリンゴ酸石灰
を溶解し、その作用は中等度〜強い方である。 (8) 硝酸塩の還元反応(1.0%硝酸カリ含有ペプ
トン水、ISP−培地8、27℃培養)陽性であ
る。 以上の性状を要約すると、MF118−A5株は、
ストレプトミセス(Streptomyces)属に属し、
細胞壁に含まれる2,6−ジアミノピメリン酸は
LL−型である。また、胞子のうをみとめず、気
菌糸はまつすぐで輪生枝はみとめられない。胞子
の表面は平滑である。種々の培地で、無色〜うす
黄茶の発育上に、白〜うすピンクあるいはうす茶
の気菌糸を着生し、溶解性色素はほとんどみとめ
られない。メラニン様色素は陽性、蛋白分解力は
中等度、スターチの水解性は中等度〜強い方であ
る。 これらの性状より、MF−118−A5株に近縁の
既知菌種を検索すると、次の2種があげられる。
すなわち、アクチノミセス・ロゼオビリデイス
(Actinomyces roseoviridis;文献(1)
International Journal of Systematic
Bacteriology,18巻,372頁、1968:;文献(2)
Gause,G.F.et al,Zur Klassifizierung der
Actinomyceten,43頁,Veb Gustav Fischer
Verlag,Jena,1958)およびストレプトミセ
ス・ラベンドレー(Streptomyces lavendulae;
文献(3)International Journal of Systematic
Bacteriology,18巻,138頁,1968)である。こ
れら2種のISP菌株(本出願人の研究所保管)と
MF118−A5株とを比較、試験した成績の大要を
示すと次表のようになる。
【表】
【表】
±:おそらく利用している。
−
+:生育しないか、わずかに利用して生育する。
この表から明らかなように、MF−118−A5株
とストレプトミセス・ラベンドレーIMCS−0169
(ISP5069)株とは、気菌糸の形態、色、炭素源
の利用性などに相違点がみられる。他方、アクチ
ノミセス・ロゼオビリデイスIMCS−0149
(ISP5175株)は、文献(2)でスターチの加水分解、
牛乳の凝固、ペプトン化が陰性と記載されている
が、比較実験ではMF118−A5株と同様に陽性と
なり両者はよく一致している。 これらの点より、MF118−A5株をストレプト
ミセス・ロゼオビリデイス(Streptomyces
roseoviridis)、MF118−A5と同定した。 また、第三の本発明の要旨とするところは、次
式 で表わされる新生理活性物質ヒスタジンを有効成
分として含む鎮痛剤又は鎮痛増強剤にある。 次に、本発明の方法を具体的に説明する。本発
明の方法を実施するに当つて、ヒスタジン生産菌
を培養するのに用いる栄養源としては、通常の微
生物が利用し得る公知の栄養源を適宜使用でき
る。例えば、市販されているグリセリン、グルコ
ース、ラクトース、デンプン、糖蜜などの炭水化
物、油脂類などを炭素源として、市販されている
ペプトン、肉エキス、コーンステイープ・リカ
ー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、コーン・グルテ
ンミール、魚粉、酵母エキス、N−Zアミン、カ
ゼイン、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウムなどを窒素源として、食塩、リン
酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどを
無機の栄養源として、それぞれ使用できる。特に
好ましい培地成分としては、炭素源として、グリ
セリン、デキストリンなど、窒素源として、大豆
ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウムなどが
ある。グリセリン2.0%、デキストリン2.0%、大
豆ペプトン1.0%、酵母エキス0.3%、硫酸アンモ
ニウム0.2%、炭酸カルシウム0.2%、消泡剤
KM70(信越化学工業社商標)0.01%を含む培地
などを用いるのが好ましい。 ヒスタジンの大量生産には、液体培養が好まし
い。培養温度としては、ヒスタジン生産菌が発育
し、ヒスタジンを生産する範囲の温度が適用し得
るが、特に好ましい温度範囲は、25〜35℃であ
る。培養は、普通は、本物質が培養物中に生産さ
れ、充分に蓄積するまで継続される。例えば、
500mlの坂口フラスコにグリセリン2.0%、デキス
トリン2.0%、大豆ペプトン1.0%、酵母エキス0.3
%、硫酸アンモニウム0.2%、炭酸カルシウム0.2
%、消泡剤KM70 0.01%を含む培地(PH7.4に調
製)120mlを入れ、滅菌した後、これにヒスタジ
ン生産菌の斜面培養物の一白金耳量を接種し、27
℃で好気的に振とう培養を行なつたところ、培養
45時間から150時間の間に、ヒスタジンの蓄積が
認められた。ヒスタジンは、タンク培養法でも振
とう培養法と同様によく生産される。例えば、
200の醗酵槽に120の培地を入れて滅菌し、あ
らかじめ培養した種培養液を5接種し、毎分90
の無菌空気を通気し、毎分250回転で撹拌した。
この条件で本物質の生産は68時間で最高に達し
た。 ヒスタジンの培養工程ならびに精製工程中での
追跡は、次の方法による抗カルボキシペプチダー
ゼB活性の測定に基づいて行なつた。ヒスタジン
の抗カルボキシペプチダーゼB活性の測定は、
M.HAYAKARI etal「Analytical
Biochemistry」84,361〜369(1978)記載のアン
ジオテンシンI変換酵素活性測定法を改良して行
なつた。 即ち、0.05Mのヒプリル−L−リジン(蛋白質
研究奨励会製)0.05mlに0.05Mトリス−塩酸緩衝
液(PH8.0)の0.25ml、ヒスタジン検体を含む溶
液の0.15mlを加えた混合溶液を37℃、3分間加温
した後、豚膵臓より精製したカルボキシペプチダ
ーゼB(ベーリンガー・マンハイム社製)の1μ
g/ml水溶液を0.05ml加えて、37℃、30分間反応
した。1N苛性ソーダの0.03mlを加え反応を停止
し、15分後に0.06Mリン酸ナトリウム緩衝液(PH
7.2)の2mlを加え、1%塩化シアヌルのメチル
セロソルブ溶液の2mlを加え発色し、室温に15分
間放置後382nmにおける吸光度(a)を測定した。同
時に検体だけを除いて同様に反応した時の対照の
反応液の吸光度(b)を測定し、ヒスタジンによるカ
ルボキシペプチダーゼB阻害率を式、〔(b−
a)/b〕×100により計算した。このようなヒス
タジンの抗カルボキシペプチダーゼB活性測定法
によると、純粋なヒスタジン・1水和物は12μ
g/mlの濃度でカルボキシペプチターゼBを50%
阻害(IC50)した。 さらに、ヒスタジンは、後記の試験例に示す如
く、動物の脳内に存在して痛みの感覚の生理機構
に関与するエンケフアリナーゼBに対して阻害活
性を示すことが認められた。 ヒスタジン生産菌の培養液中及び菌体中に存
在するヒスタジンを培養物から採取するに当つて
は、培養液から吸着剤に吸着および脱離させる
方法で好収率で採取できる。吸着剤としては、活
性炭、イオン交換樹脂及び非イオン系吸着樹脂な
どが使用できる。例えば、ヒスタジンはアンバー
ライトIRC50(H+型)に吸着され、50%アセトン
を含む0.5N塩酸で溶出される。培養液の8%
の体積のアンバーライトIRC50(H+型)をカラム
につめ、これに培養液を吸着し、水洗後、50%
アセトン水で洗い、次に50%アセトンを含む
0.5N塩酸で溶出すると活性分画が得られる。こ
れを苛性ソーダで中和し、減圧下に濃縮すること
によりヒスタジンの粗濃縮液が得られる。次に、
これを水でうすめ、培養液に換算して0.18%量
の活性炭を加えて撹拌することにより、ヒスタジ
ンを活性炭に吸着し、過後、活性炭を水洗し、
90%メタノール水(塩酸酸性PH2)でヒスタジン
を溶出できる。これを減圧下に濃縮することによ
り粗粉末を得ることができる。またイオン交換樹
脂のクロマトグラフイーも精製に用いられる。特
にダウエツクス50Wのクロマトグラフイーが有効
であり、ピリジン−酢酸緩衝液でヒスタジンを精
製することができる。 本発明のヒスタジンの生物活性について、その
薬理作用を検討した。その結果、本物質が鎮痛作
用と、細胞性免疫に対する増強作用を有している
ことが見出された。本発明のヒスタジンの生物活
性について試験例を挙げて説明する。 試験例 1 本例は正常マウスにおけるヒスタジンの細胞性
免疫に及ぼす効果の示す。細胞性免疫に及ぼす、
ヒスタジンの作用を羊赤血球(SRBCと略記)を
抗原として静脈内に接種して得られる遅延型過敏
症(D.T.H.と略記)を指標(参考文献J.Exp.
Med.139、1529〜1539、1974)として検討した。 即ち、SRBC105個をとり、0.05mlの生理食塩水
に浮遊させた懸濁液をSlc−CDF1(雌性、9週令)
マウスの静脈内に接種し、これと同時にヒスタジ
ン・1水和物を5mg/Kg,0.5mg/Kg,0.05mg/
Kg,0.005mg/Kgの投与量でヒスタジン生理食塩
水溶液として1回腹腔内投与した。投与4日後、
足蹠にSRBC108個を0.05mlの生理食塩水に浮遊さ
せた懸濁液を皮下注射して二次感作させた。その
24時間後、その足蹠にみられる腫脹度(足蹠の厚
さの増加)をキヤリパスで測定した。供試化合物
を投与しないで、SRBCと生理食塩水の注射を受
けた対照動物の足蹠肥厚度(c)を100%と評価し、
これと処理した供試動物の足蹠肥厚度(T)を比較し
てT/C値(%)を算出することにより、供試化
合物の細胞性免疫増強効果を判定した。試験結果
を第一表に示す。
−
+:生育しないか、わずかに利用して生育する。
この表から明らかなように、MF−118−A5株
とストレプトミセス・ラベンドレーIMCS−0169
(ISP5069)株とは、気菌糸の形態、色、炭素源
の利用性などに相違点がみられる。他方、アクチ
ノミセス・ロゼオビリデイスIMCS−0149
(ISP5175株)は、文献(2)でスターチの加水分解、
牛乳の凝固、ペプトン化が陰性と記載されている
が、比較実験ではMF118−A5株と同様に陽性と
なり両者はよく一致している。 これらの点より、MF118−A5株をストレプト
ミセス・ロゼオビリデイス(Streptomyces
roseoviridis)、MF118−A5と同定した。 また、第三の本発明の要旨とするところは、次
式 で表わされる新生理活性物質ヒスタジンを有効成
分として含む鎮痛剤又は鎮痛増強剤にある。 次に、本発明の方法を具体的に説明する。本発
明の方法を実施するに当つて、ヒスタジン生産菌
を培養するのに用いる栄養源としては、通常の微
生物が利用し得る公知の栄養源を適宜使用でき
る。例えば、市販されているグリセリン、グルコ
ース、ラクトース、デンプン、糖蜜などの炭水化
物、油脂類などを炭素源として、市販されている
ペプトン、肉エキス、コーンステイープ・リカ
ー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、コーン・グルテ
ンミール、魚粉、酵母エキス、N−Zアミン、カ
ゼイン、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウムなどを窒素源として、食塩、リン
酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどを
無機の栄養源として、それぞれ使用できる。特に
好ましい培地成分としては、炭素源として、グリ
セリン、デキストリンなど、窒素源として、大豆
ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウムなどが
ある。グリセリン2.0%、デキストリン2.0%、大
豆ペプトン1.0%、酵母エキス0.3%、硫酸アンモ
ニウム0.2%、炭酸カルシウム0.2%、消泡剤
KM70(信越化学工業社商標)0.01%を含む培地
などを用いるのが好ましい。 ヒスタジンの大量生産には、液体培養が好まし
い。培養温度としては、ヒスタジン生産菌が発育
し、ヒスタジンを生産する範囲の温度が適用し得
るが、特に好ましい温度範囲は、25〜35℃であ
る。培養は、普通は、本物質が培養物中に生産さ
れ、充分に蓄積するまで継続される。例えば、
500mlの坂口フラスコにグリセリン2.0%、デキス
トリン2.0%、大豆ペプトン1.0%、酵母エキス0.3
%、硫酸アンモニウム0.2%、炭酸カルシウム0.2
%、消泡剤KM70 0.01%を含む培地(PH7.4に調
製)120mlを入れ、滅菌した後、これにヒスタジ
ン生産菌の斜面培養物の一白金耳量を接種し、27
℃で好気的に振とう培養を行なつたところ、培養
45時間から150時間の間に、ヒスタジンの蓄積が
認められた。ヒスタジンは、タンク培養法でも振
とう培養法と同様によく生産される。例えば、
200の醗酵槽に120の培地を入れて滅菌し、あ
らかじめ培養した種培養液を5接種し、毎分90
の無菌空気を通気し、毎分250回転で撹拌した。
この条件で本物質の生産は68時間で最高に達し
た。 ヒスタジンの培養工程ならびに精製工程中での
追跡は、次の方法による抗カルボキシペプチダー
ゼB活性の測定に基づいて行なつた。ヒスタジン
の抗カルボキシペプチダーゼB活性の測定は、
M.HAYAKARI etal「Analytical
Biochemistry」84,361〜369(1978)記載のアン
ジオテンシンI変換酵素活性測定法を改良して行
なつた。 即ち、0.05Mのヒプリル−L−リジン(蛋白質
研究奨励会製)0.05mlに0.05Mトリス−塩酸緩衝
液(PH8.0)の0.25ml、ヒスタジン検体を含む溶
液の0.15mlを加えた混合溶液を37℃、3分間加温
した後、豚膵臓より精製したカルボキシペプチダ
ーゼB(ベーリンガー・マンハイム社製)の1μ
g/ml水溶液を0.05ml加えて、37℃、30分間反応
した。1N苛性ソーダの0.03mlを加え反応を停止
し、15分後に0.06Mリン酸ナトリウム緩衝液(PH
7.2)の2mlを加え、1%塩化シアヌルのメチル
セロソルブ溶液の2mlを加え発色し、室温に15分
間放置後382nmにおける吸光度(a)を測定した。同
時に検体だけを除いて同様に反応した時の対照の
反応液の吸光度(b)を測定し、ヒスタジンによるカ
ルボキシペプチダーゼB阻害率を式、〔(b−
a)/b〕×100により計算した。このようなヒス
タジンの抗カルボキシペプチダーゼB活性測定法
によると、純粋なヒスタジン・1水和物は12μ
g/mlの濃度でカルボキシペプチターゼBを50%
阻害(IC50)した。 さらに、ヒスタジンは、後記の試験例に示す如
く、動物の脳内に存在して痛みの感覚の生理機構
に関与するエンケフアリナーゼBに対して阻害活
性を示すことが認められた。 ヒスタジン生産菌の培養液中及び菌体中に存
在するヒスタジンを培養物から採取するに当つて
は、培養液から吸着剤に吸着および脱離させる
方法で好収率で採取できる。吸着剤としては、活
性炭、イオン交換樹脂及び非イオン系吸着樹脂な
どが使用できる。例えば、ヒスタジンはアンバー
ライトIRC50(H+型)に吸着され、50%アセトン
を含む0.5N塩酸で溶出される。培養液の8%
の体積のアンバーライトIRC50(H+型)をカラム
につめ、これに培養液を吸着し、水洗後、50%
アセトン水で洗い、次に50%アセトンを含む
0.5N塩酸で溶出すると活性分画が得られる。こ
れを苛性ソーダで中和し、減圧下に濃縮すること
によりヒスタジンの粗濃縮液が得られる。次に、
これを水でうすめ、培養液に換算して0.18%量
の活性炭を加えて撹拌することにより、ヒスタジ
ンを活性炭に吸着し、過後、活性炭を水洗し、
90%メタノール水(塩酸酸性PH2)でヒスタジン
を溶出できる。これを減圧下に濃縮することによ
り粗粉末を得ることができる。またイオン交換樹
脂のクロマトグラフイーも精製に用いられる。特
にダウエツクス50Wのクロマトグラフイーが有効
であり、ピリジン−酢酸緩衝液でヒスタジンを精
製することができる。 本発明のヒスタジンの生物活性について、その
薬理作用を検討した。その結果、本物質が鎮痛作
用と、細胞性免疫に対する増強作用を有している
ことが見出された。本発明のヒスタジンの生物活
性について試験例を挙げて説明する。 試験例 1 本例は正常マウスにおけるヒスタジンの細胞性
免疫に及ぼす効果の示す。細胞性免疫に及ぼす、
ヒスタジンの作用を羊赤血球(SRBCと略記)を
抗原として静脈内に接種して得られる遅延型過敏
症(D.T.H.と略記)を指標(参考文献J.Exp.
Med.139、1529〜1539、1974)として検討した。 即ち、SRBC105個をとり、0.05mlの生理食塩水
に浮遊させた懸濁液をSlc−CDF1(雌性、9週令)
マウスの静脈内に接種し、これと同時にヒスタジ
ン・1水和物を5mg/Kg,0.5mg/Kg,0.05mg/
Kg,0.005mg/Kgの投与量でヒスタジン生理食塩
水溶液として1回腹腔内投与した。投与4日後、
足蹠にSRBC108個を0.05mlの生理食塩水に浮遊さ
せた懸濁液を皮下注射して二次感作させた。その
24時間後、その足蹠にみられる腫脹度(足蹠の厚
さの増加)をキヤリパスで測定した。供試化合物
を投与しないで、SRBCと生理食塩水の注射を受
けた対照動物の足蹠肥厚度(c)を100%と評価し、
これと処理した供試動物の足蹠肥厚度(T)を比較し
てT/C値(%)を算出することにより、供試化
合物の細胞性免疫増強効果を判定した。試験結果
を第一表に示す。
【表】
以上の結果より、ヒスタジンは正常動物の細胞性
免疫能を増強する物質であると認められた。従つ
て本発明によつて得られたヒスタジンは、免疫増
強剤として有用である。また、抗腫瘍免疫賦活剤
として、各種癌化学療法剤の補助薬としての有用
性をもつ。 試験例 2 本例はラツトにおけるヒスタジンのモルヒネ鎮
痛増強作用を示す。 あらかじめウイスターラツトに0.5mg/Kgのモ
ルヒネを腹腔内投与し、モルヒネ鎮痛有効ラツト
と無効ラツトに分類し、モルヒネ鎮痛増強作用に
対しては、モルヒネ鎮痛無効ラツトを用いた。こ
の分類試験の方法は、昭和医学雑誌第39号、第
573〜582頁(1979)に準じた。 この分類試験の約1週間以上経過した後、生理
食塩水に溶解した本発明のヒスタジン・1水和物
の100mg/Kgを腹腔内投与し、次いでモルヒネの
0.5mg/Kgを投与し、鎮痛効果をtail−flick法によ
り検定した。tail−flick法による痛覚閾値の測定
は次のようである。尾の先端より1cm位のところ
を黒く塗り、これに放射熱を適用して、尾の逃避
反射の潜伏時間を測定した。コントロールの尾の
逃避反射の潜伏時間は平均約2.0秒となるように
熱量を調節し、最高7.0秒まで測定した。それ以
上時間がかかる場合は尾の皮膚の損傷を防ぐため
測定しなかつた。各点における尾逃避反射の潜伏
時間は5回の平均値をとり、15分間隔で測定し
た。 なお各動物における尾逃避反射の潜伏時間の変
化は対照群(0.5mg/Kgモルヒネ単独処置)とヒ
スタジン検体100mg/Kg+モルヒネ0.5mg/Kg投与
の処理群との鎮痛効果を比較した。その結果を第
二表に示す。
免疫能を増強する物質であると認められた。従つ
て本発明によつて得られたヒスタジンは、免疫増
強剤として有用である。また、抗腫瘍免疫賦活剤
として、各種癌化学療法剤の補助薬としての有用
性をもつ。 試験例 2 本例はラツトにおけるヒスタジンのモルヒネ鎮
痛増強作用を示す。 あらかじめウイスターラツトに0.5mg/Kgのモ
ルヒネを腹腔内投与し、モルヒネ鎮痛有効ラツト
と無効ラツトに分類し、モルヒネ鎮痛増強作用に
対しては、モルヒネ鎮痛無効ラツトを用いた。こ
の分類試験の方法は、昭和医学雑誌第39号、第
573〜582頁(1979)に準じた。 この分類試験の約1週間以上経過した後、生理
食塩水に溶解した本発明のヒスタジン・1水和物
の100mg/Kgを腹腔内投与し、次いでモルヒネの
0.5mg/Kgを投与し、鎮痛効果をtail−flick法によ
り検定した。tail−flick法による痛覚閾値の測定
は次のようである。尾の先端より1cm位のところ
を黒く塗り、これに放射熱を適用して、尾の逃避
反射の潜伏時間を測定した。コントロールの尾の
逃避反射の潜伏時間は平均約2.0秒となるように
熱量を調節し、最高7.0秒まで測定した。それ以
上時間がかかる場合は尾の皮膚の損傷を防ぐため
測定しなかつた。各点における尾逃避反射の潜伏
時間は5回の平均値をとり、15分間隔で測定し
た。 なお各動物における尾逃避反射の潜伏時間の変
化は対照群(0.5mg/Kgモルヒネ単独処置)とヒ
スタジン検体100mg/Kg+モルヒネ0.5mg/Kg投与
の処理群との鎮痛効果を比較した。その結果を第
二表に示す。
【表】
以上の結果より、ヒスタジンは、正常動物に対し
て、モルヒネ鎮痛作用を増強する物質であると認
められた。 試験例 3 本例は、エンケフアリナーゼBに対するヒスタ
ジンの阻害作用を示す。 エンケフアリナーゼBはカニクイザルの脳をホ
モゲナイズしてその可溶性分画を、羽里らの方法
(Biochemical and Biophysical Research
Communications第105巻、第2号、第470〜475
頁、1982年)に準じて単一に精製した。エンケフ
アリナーゼB阻害活性の測定も羽里らの上記の文
献の方法により測定した。 すなわち、アミノ末端のチロシンが一部トリチ
ウム化されたメチオニンエンケフアリン(Tyr−
Gly−Gly−Phe−Met)10マイクロモルを基質に
用い、25mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.0)100μ
中でエンケフアリナーゼBにより加水分解し
た。加水分解により生じたTyr−GlyをPorapak
Q(ワツトマン社製)のカラムで分離し、放射活
性に基づいて定量した。上記の反応液にヒスタジ
ンを入れた場合と、入れない場合とを比較して、
エンケフアリナーゼBに対するヒスタジンの阻害
活性を調べた。その結果、ヒスタジン・1水和物
は100μg/mlの濃度で、上記のエンケフアリナ
ーゼBを92%阻害することが認められた。 これより、ヒスタジンは単独でも鎮痛作用を有
することが強く期待される。 マウスに対する急性毒性試験では、ヒスタジ
ン・1水和物の1g/Kgをマウスに静脈内投与し
ても死亡例は認められない。従つて、ヒスタジン
は毒性の低い物質であると認められる。 ヒスタジンを有効成分とする鎮痛剤又は鎮痛増
強剤としては、ヒスタジン、またはその薬学的に
許容される塩又は水和物のいづれかを常用の担体
と配合して製剤でき、更には各種の化学療法剤と
混合してもよい。ヒスタジンの塩の例としては、
ヒスタジンのカルボキシル基における薬学的に許
容できる陽イオン、例えばナトリウム、カリウム
のごときアルカリ金属、カルシウム、マグネシウ
ムの如きアルカリ土類金属の陽イオンがある。ヒ
スタジンのイミノ基又はグアニジノ基又はその両
方の基における薬学的に許容できる無機塩例えば
塩酸塩など又は有機酸、例えば酢酸などとの酸付
加塩も包含される。 本発明の化合物ないし薬剤の投与形態は、経
口、注射、直腸坐剤のいずれでもよい。注射剤を
調製する場合は、上記有効成分化合物にPH調整
剤、緩衝剤、安定化剤、賦形剤を添加し常法によ
り、凍結乾燥を行ない、凍結乾燥注射剤を作るこ
とができ、また有効成分化合物に、PH調整剤、緩
衝剤、安定化剤、等張剤、局麻剤等を添加し、常
法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤を作ること
もできる。経口用固形製剤を調製する場合は、有
効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応じて結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤を
加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、
散剤、カプセル剤等を作ることができる。経口液
状製剤を調製する場合には、有効成分化合物に、
矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、
常法によりシロツプ剤およびドライシロツプ剤を
作ることができる。直腸坐薬製剤を調製する場合
には、有効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応
じて、界面活性剤を加えた後、常法により坐剤と
することができる。 ヒスタジンの投与量は症状及び治療目的により
異なるが、成人では1回ヒスタジンとして0.02−
2000mgを1日3回投与できる。 次に本発明のヒスタジンの製造に関して実施例
を示すが、本物質の理化学的症状ならびに生産方
法、その製製法が本発明者らによつて明らかにさ
れたので、本明細書に示された方法を修飾するこ
とは容易であり、本発明は以下に記載する実施例
のみに限定されるものではない。 実施例 1 ヒスタジン生産菌ストレプトミセス・ロゼオビ
リデイス(Streptomyces roseoviridis)MF118
−A5株(FERM P−7043)の斜面培養物から一
白金耳量をあらかじめ120℃、20分間滅菌した培
地(500mlの坂口フラスコに120mlづつ分注したグ
リセリン2.0%、デキストリン2.0%、大豆ペプト
ン1.0%、酵母エキス0.3%、硫酸アンモニウム0.2
%、炭酸カルシウム0.2%、消泡剤KM70 0.01%
を含むPH7.4の培地)に接種した。27℃毎分130往
復で好気的に振とう培養した。経時的に、ヒスタ
ジン産生量を、培養液の抗カルボキシペプチダー
ゼB活性の測定により検討した。その結果、カル
ボキシペプチダーゼBの阻害活性により定量した
ヒスタジンの培養液濃度は、培養4日後に最高に
達し、以下6日後まで安定に維持されたが、その
後は徐々に低下した。 実施例 2 実施例1で示した培養条件で28時間培養した種
培養液を実施例1と同様の培地に5ml接種し、同
様に96時間培養して得られた培養液60を硅そう
土を過助剤に用い過し56の培養液を得
た。この液のカルボキシペプチダーゼB阻害活
性(IC50)は、90μ/mlであつた。 得られた培養液56をあらかじめカラムにつ
めたイオン交換樹脂アンバーライトIRC50(H+
型)4.5に吸着した。次に水15、次いで50%
アセトン水15で樹脂を洗滌した後、50%アセト
ンを含む0.5N塩酸で溶出し、溶出液を250mlづつ
分画した。活性分画を集めて、2N苛性ソーダで
中和し、減圧下に濃縮し、400mlとした。次にこ
れに水を加えて4とし、活性炭90gを入れ、60
分間撹拌し、ヒスタジンを吸着した。過して活
性炭を集め水5で洗滌後、この活性炭を2の
90%メタノール水(塩酸酸性PH2)中で30分間撹
拌しヒスタジンを溶離した。これを過し、液
を減圧下に濃縮乾固して、粗粉末5.3gを得た。
この粗粉末のカルボキシペプチダーゼB阻害活性
(IC50)は55.6μg/mlであつた。 得られた粗粉末を500mlのPH3.2の0.2Mピリジ
ン−酢酸緩衝液に溶解し、あらかじめ同緩衝液で
平衡化したイオン交換樹脂ダウエツクス50W(ピ
リジニウム型、×4、100〜200メツシユ)300mlの
カラムに吸着させ、この樹脂をPH4.6の0.5Mピリ
ジン−酢酸緩衝液で洗滌後、PH5.0の1Mピリジン
−酢酸緩衝液で溶出した。活性分画を集めて減圧
下に濃縮乾固して1.5gの粗粉末を得た。この粗
粉末のカルボキシペプチダーゼB阻害活性
(IC50)は、35.3μg/mlであつた。 この粗粉末を10%酢酸アンモニウム水溶液10ml
に溶解し、これをあらかじめ10%酢酸アンモニウ
ム水溶液で平衡化した分取用高速液体クロマト用
逆相カラム:Partisil−10−ODS−3/
Magnum20(ワツトマン社製)に吸着し、カラム
から10%酢酸アンモニウム水溶液で毎分8mlの流
速で溶出した。溶出液を8mlづつ分画し、活性分
画(第40〜53分画)を集めて水でうすめて500ml
とした。これをイオン交換樹脂ダウエツクス50W
(H+型、×4、100−200メツシユ)300mlをつめた
カラムに吸着し、このカラムを1の水で洗つた
後、1.5Nアンモニア水で溶出した。活性分画を
集めて減圧下に濃縮乾固し406mgの純粋なヒスタ
ジン・1水和物の白色粉末を得た。こうして得ら
れたヒスタジン・1水和物のカルボキシペプチダ
ーゼB阻害活性(IC50)は12μg/mlであつた。
て、モルヒネ鎮痛作用を増強する物質であると認
められた。 試験例 3 本例は、エンケフアリナーゼBに対するヒスタ
ジンの阻害作用を示す。 エンケフアリナーゼBはカニクイザルの脳をホ
モゲナイズしてその可溶性分画を、羽里らの方法
(Biochemical and Biophysical Research
Communications第105巻、第2号、第470〜475
頁、1982年)に準じて単一に精製した。エンケフ
アリナーゼB阻害活性の測定も羽里らの上記の文
献の方法により測定した。 すなわち、アミノ末端のチロシンが一部トリチ
ウム化されたメチオニンエンケフアリン(Tyr−
Gly−Gly−Phe−Met)10マイクロモルを基質に
用い、25mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.0)100μ
中でエンケフアリナーゼBにより加水分解し
た。加水分解により生じたTyr−GlyをPorapak
Q(ワツトマン社製)のカラムで分離し、放射活
性に基づいて定量した。上記の反応液にヒスタジ
ンを入れた場合と、入れない場合とを比較して、
エンケフアリナーゼBに対するヒスタジンの阻害
活性を調べた。その結果、ヒスタジン・1水和物
は100μg/mlの濃度で、上記のエンケフアリナ
ーゼBを92%阻害することが認められた。 これより、ヒスタジンは単独でも鎮痛作用を有
することが強く期待される。 マウスに対する急性毒性試験では、ヒスタジ
ン・1水和物の1g/Kgをマウスに静脈内投与し
ても死亡例は認められない。従つて、ヒスタジン
は毒性の低い物質であると認められる。 ヒスタジンを有効成分とする鎮痛剤又は鎮痛増
強剤としては、ヒスタジン、またはその薬学的に
許容される塩又は水和物のいづれかを常用の担体
と配合して製剤でき、更には各種の化学療法剤と
混合してもよい。ヒスタジンの塩の例としては、
ヒスタジンのカルボキシル基における薬学的に許
容できる陽イオン、例えばナトリウム、カリウム
のごときアルカリ金属、カルシウム、マグネシウ
ムの如きアルカリ土類金属の陽イオンがある。ヒ
スタジンのイミノ基又はグアニジノ基又はその両
方の基における薬学的に許容できる無機塩例えば
塩酸塩など又は有機酸、例えば酢酸などとの酸付
加塩も包含される。 本発明の化合物ないし薬剤の投与形態は、経
口、注射、直腸坐剤のいずれでもよい。注射剤を
調製する場合は、上記有効成分化合物にPH調整
剤、緩衝剤、安定化剤、賦形剤を添加し常法によ
り、凍結乾燥を行ない、凍結乾燥注射剤を作るこ
とができ、また有効成分化合物に、PH調整剤、緩
衝剤、安定化剤、等張剤、局麻剤等を添加し、常
法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤を作ること
もできる。経口用固形製剤を調製する場合は、有
効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応じて結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤を
加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、
散剤、カプセル剤等を作ることができる。経口液
状製剤を調製する場合には、有効成分化合物に、
矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、
常法によりシロツプ剤およびドライシロツプ剤を
作ることができる。直腸坐薬製剤を調製する場合
には、有効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応
じて、界面活性剤を加えた後、常法により坐剤と
することができる。 ヒスタジンの投与量は症状及び治療目的により
異なるが、成人では1回ヒスタジンとして0.02−
2000mgを1日3回投与できる。 次に本発明のヒスタジンの製造に関して実施例
を示すが、本物質の理化学的症状ならびに生産方
法、その製製法が本発明者らによつて明らかにさ
れたので、本明細書に示された方法を修飾するこ
とは容易であり、本発明は以下に記載する実施例
のみに限定されるものではない。 実施例 1 ヒスタジン生産菌ストレプトミセス・ロゼオビ
リデイス(Streptomyces roseoviridis)MF118
−A5株(FERM P−7043)の斜面培養物から一
白金耳量をあらかじめ120℃、20分間滅菌した培
地(500mlの坂口フラスコに120mlづつ分注したグ
リセリン2.0%、デキストリン2.0%、大豆ペプト
ン1.0%、酵母エキス0.3%、硫酸アンモニウム0.2
%、炭酸カルシウム0.2%、消泡剤KM70 0.01%
を含むPH7.4の培地)に接種した。27℃毎分130往
復で好気的に振とう培養した。経時的に、ヒスタ
ジン産生量を、培養液の抗カルボキシペプチダー
ゼB活性の測定により検討した。その結果、カル
ボキシペプチダーゼBの阻害活性により定量した
ヒスタジンの培養液濃度は、培養4日後に最高に
達し、以下6日後まで安定に維持されたが、その
後は徐々に低下した。 実施例 2 実施例1で示した培養条件で28時間培養した種
培養液を実施例1と同様の培地に5ml接種し、同
様に96時間培養して得られた培養液60を硅そう
土を過助剤に用い過し56の培養液を得
た。この液のカルボキシペプチダーゼB阻害活
性(IC50)は、90μ/mlであつた。 得られた培養液56をあらかじめカラムにつ
めたイオン交換樹脂アンバーライトIRC50(H+
型)4.5に吸着した。次に水15、次いで50%
アセトン水15で樹脂を洗滌した後、50%アセト
ンを含む0.5N塩酸で溶出し、溶出液を250mlづつ
分画した。活性分画を集めて、2N苛性ソーダで
中和し、減圧下に濃縮し、400mlとした。次にこ
れに水を加えて4とし、活性炭90gを入れ、60
分間撹拌し、ヒスタジンを吸着した。過して活
性炭を集め水5で洗滌後、この活性炭を2の
90%メタノール水(塩酸酸性PH2)中で30分間撹
拌しヒスタジンを溶離した。これを過し、液
を減圧下に濃縮乾固して、粗粉末5.3gを得た。
この粗粉末のカルボキシペプチダーゼB阻害活性
(IC50)は55.6μg/mlであつた。 得られた粗粉末を500mlのPH3.2の0.2Mピリジ
ン−酢酸緩衝液に溶解し、あらかじめ同緩衝液で
平衡化したイオン交換樹脂ダウエツクス50W(ピ
リジニウム型、×4、100〜200メツシユ)300mlの
カラムに吸着させ、この樹脂をPH4.6の0.5Mピリ
ジン−酢酸緩衝液で洗滌後、PH5.0の1Mピリジン
−酢酸緩衝液で溶出した。活性分画を集めて減圧
下に濃縮乾固して1.5gの粗粉末を得た。この粗
粉末のカルボキシペプチダーゼB阻害活性
(IC50)は、35.3μg/mlであつた。 この粗粉末を10%酢酸アンモニウム水溶液10ml
に溶解し、これをあらかじめ10%酢酸アンモニウ
ム水溶液で平衡化した分取用高速液体クロマト用
逆相カラム:Partisil−10−ODS−3/
Magnum20(ワツトマン社製)に吸着し、カラム
から10%酢酸アンモニウム水溶液で毎分8mlの流
速で溶出した。溶出液を8mlづつ分画し、活性分
画(第40〜53分画)を集めて水でうすめて500ml
とした。これをイオン交換樹脂ダウエツクス50W
(H+型、×4、100−200メツシユ)300mlをつめた
カラムに吸着し、このカラムを1の水で洗つた
後、1.5Nアンモニア水で溶出した。活性分画を
集めて減圧下に濃縮乾固し406mgの純粋なヒスタ
ジン・1水和物の白色粉末を得た。こうして得ら
れたヒスタジン・1水和物のカルボキシペプチダ
ーゼB阻害活性(IC50)は12μg/mlであつた。
図面は、本発明のヒスタジン・水和物の赤外部
吸収スペクトルを示す。
吸収スペクトルを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 式 で表わされる抗カルボキシペプチダーゼB活性を
有する新生理活性物質ヒスタジンまたはその塩又
は水和物。 2 ストレプトミセス属に属するヒスタジン生産
菌を培養して、次式 で表わされる新生理活性物質ヒスタジンを培養液
中に生産、蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする新生理活性物質ヒスタジンの製造法。 3 次式 で表わされる新生理活性物質ヒスタジンを有効成
分として含有する鎮痛剤又は鎮痛増強剤。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58089075A JPS59216597A (ja) | 1983-05-23 | 1983-05-23 | 新生理活性物質ヒスタジン |
EP84105601A EP0127076A3 (en) | 1983-05-23 | 1984-05-17 | Histargin, a microbiological process for its preparation, its use as a medicament, and the strain streptomyces roseoviridis having the ability to produce histargin |
GR74769A GR82026B (ja) | 1983-05-23 | 1984-05-21 | |
DK251384A DK251384A (da) | 1983-05-23 | 1984-05-22 | Histargin samt fremgangsmaade til fremstilling heraf ud fra en stamme af slaegten streptomyces |
ZA843846A ZA843846B (en) | 1983-05-23 | 1984-05-22 | Histargin,a microbiological process for its preparation,its use as a medicament,and the strain streptomyces roseoviridis having the ability to produce histargin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58089075A JPS59216597A (ja) | 1983-05-23 | 1983-05-23 | 新生理活性物質ヒスタジン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59216597A JPS59216597A (ja) | 1984-12-06 |
JPH0358342B2 true JPH0358342B2 (ja) | 1991-09-05 |
Family
ID=13960733
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58089075A Granted JPS59216597A (ja) | 1983-05-23 | 1983-05-23 | 新生理活性物質ヒスタジン |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0127076A3 (ja) |
JP (1) | JPS59216597A (ja) |
DK (1) | DK251384A (ja) |
GR (1) | GR82026B (ja) |
ZA (1) | ZA843846B (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6163661A (ja) * | 1984-09-05 | 1986-04-01 | Microbial Chem Res Found | ヒスタジン関連化合物 |
KR101378821B1 (ko) * | 2006-01-24 | 2014-03-28 | 니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤 | 신규 히스티딘 유도체 |
CA2692824A1 (en) | 2007-07-23 | 2009-01-29 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. | Novel histidine derivatives |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2367492A1 (fr) * | 1976-10-12 | 1978-05-12 | Stanley Drug Products Inc | Derives de l'histidine utilisables pour lutter contre les infections microbiennes. |
-
1983
- 1983-05-23 JP JP58089075A patent/JPS59216597A/ja active Granted
-
1984
- 1984-05-17 EP EP84105601A patent/EP0127076A3/en not_active Withdrawn
- 1984-05-21 GR GR74769A patent/GR82026B/el unknown
- 1984-05-22 DK DK251384A patent/DK251384A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-05-22 ZA ZA843846A patent/ZA843846B/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK251384A (da) | 1984-11-24 |
ZA843846B (en) | 1985-02-27 |
EP0127076A2 (en) | 1984-12-05 |
DK251384D0 (da) | 1984-05-22 |
JPS59216597A (ja) | 1984-12-06 |
EP0127076A3 (en) | 1987-04-29 |
GR82026B (ja) | 1984-12-12 |
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