JPH0429356B2

JPH0429356B2 -

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Publication number: JPH0429356B2
Application number: JP59006580A
Authority: JP
Priority date: 1984-01-18
Filing date: 1984-01-18
Publication date: 1992-05-18
Also published as: JPS60149394A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はストレプトマイセス属微生物の生産す
る新規な3′，5′―サイクリツクアデノシンモノホ
スフエートホスホジエステラーゼ（cAMPPDE）
阻害物質の製法に関する。 3′，5′―サイクリツクアデノシンモノホスフエ
ート（cAMP）はcAMP合成要素（アデニル酸サ
イクラーゼ）とcAMP分解酵素〔ホスホジエステ
ラーゼ（PDE）〕のバランスの上に、動物組織
（臓器）に広く分布し各種ホルモン作用のセカン
ド―メツセンジヤーとして作用し、生理、生化学
的に重要な役割を演じている。更に細胞の分裂、
増殖、分化、心臓収縮、造血、中枢神経系への作
用、免疫反応、インスリン、ヒスタミンの放出な
どに関与していることが知られている。cAMPは
このように多岐にわたる生理作用を有するもので
あるが、このcAMPを分解する酵素（cAMP
PDE）の阻害物質は細胞内のcAMPのレベルを
上昇させるので心血管用剤、抗喘息剤、平滑筋弛
緩剤、精神神経用剤、抗炎症剤、癌治療剤、抗糖
尿病剤などになりうると期待される。本発明者らは、放線菌ストレプトマイセス・グ
リゼオオーランテイアカスNo.43894
〔Streptomyces griseoaurantiacus No.43894（＝
SANK63479）〕株を水溶性培地に培養すると培
養液中にグリゼオール酸（特開昭56−68695号参
照）と共に他のcAMP PED阻害物質が生成蓄積
されてくることを見出した。この阻害物質が従来
知られているcAMP PED阻害物質と異なつた新
規な阻害物質であることを認め、この物質を7′―
デスオキシグリゼオール酸（7′―Desoxy
griseolic acid）と命名した。 7′―デスオキシグリゼオール酸は下式を有す
る。 7′―デスオキシグリゼオール酸の生産菌である
放線菌ストレプトマイセス・グリゼオオーランテ
イアカスNo.43894株についての菌学的性質は既に
特開昭56−68695号に記載されている。そして、本菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託番号第5223号として寄託されて
いる。以上、7′―デスオキシグリゼオール酸の生産菌
について説明したが、放線菌の諸性質は一定した
ものではなく、自然的、人工的に容易に変化する
ことは周知の通りであり、本発明で使用し得る菌
株はストレプトマイセス属に属する、7′―デスオ
キシグリゼオール酸を生産する菌株すべてを包含
するものである。次に、7′―デスオキシグリゼオール酸の製法に
ついて詳述する。１ No.43894株の培養本菌の培養においては、通常の放線菌の培養法
が一般に用いられる。培養のための栄養源として
は、各種のものが用いられるが、炭素源として
は、液糖、澱粉、グルコース、マニトール、フラ
クトース、ガラクトース、ラムノースなどが単独
または組合せて用いられる。窒素源としては無機
及び有機のものが用いられるが、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウ
ム、硝酸ソーダなど、また天然窒素源のペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、生酵母、
コーンステイープリカー、大豆粉、きな粉、カザ
ミノ酸、ソリユブル・ベジタブル・プロテイン等
が単独または組合せで使用することも出来る。そ
の他食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、塩化マグ
ネシウム、燐酸塩など無機塩類を加える他、本菌
の生育や7′―デスオキシグリゼオール酸の生産を
促進する有機物または無機物を添加することをさ
またげない。特に、7′―デスオキシグリゼオール酸はカルボ
キシル基を２個、アミノ基を１個分子内に有する
ので塩を形成する。従つて、例えば産生培地に食
塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、塩化マグネシウ
ムなどの無機塩類を添加することにより、ナトリ
ウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金
属塩として得られる。または、得られた7′―デス
オキシグリゼオール酸を常法により化学的に処理
することによつても塩として得られる。培養法としては、往復振盪、回転振盪液体培養
法、固体培養法、特に深部撹拌培養法が最も適し
ている。培養温度は20〜35℃、PHは中性付近で培
養するのが望ましい。液体培養で通常48時間乃至
120時間培養を行うと7′―デスオキシグリゼオー
ル酸もしくはその塩が培養液中に生成蓄積され
る。培養の進行に従つて培養液中に生産される
7′―デスオキシグリゼオール酸もしくはその塩は
下記の試験例記載の方法により測定する。深部液
体培養終了時の培養液の示す阻害活性は70〜85％
を示す。２ 7′―デスオキシグリゼオール酸およびその塩
の単離・精製 7′―デスオキシグリゼオール酸は酸性、水溶性
物質である。従つて培養液からの本物質の単
離・精製には水溶性の微生物代謝生産物をその培
養液から単離するために一般に用いられる分離・
精製の方法が利用可能である。深部培養法の場合
には、次のように行うのが好ましい。すなわち、
その菌糸体を過または遠心分離し、そのフイル
ターケーキを水で十分洗い、その洗液と液を合
わせる。この合併液を活性炭または他の吸着剤、
イオン交換樹脂で処理することによつて7′―デス
オキシグリゼオール酸およびその塩を吸着させ
る。この吸着は、バツチ方式によつて行うことが
できるし、または、吸着塔に連続的に貫流するこ
とによつても行うことができる。バツチ方式にお
いては、その液に活性炭吸着剤0.1〜0.6重量／
容量％、好ましくは0.35〜0.40重量／容量％を加
え、こうして得られた混合物を30〜60分撹拌す
る。その活性炭吸着剤を含水アセトンまたは含水低
級アルカノールで溶離し、この溶離液を減圧下で
濃縮することにより濃縮物を得る。更にイオン交
換樹脂カラム、活性炭カラム、ダイヤイオンカラ
ム、セフアデツクスカラムで精製を行い、純粋な
7′―デスオキシグリゼオール酸およびその塩を得
ることが出来る。３ 7′―デスオキシグリゼオール酸の塩類の別製
法以上の如くして得られた7′―デスオキシグリゼ
オール酸は、化学的常法により塩に変換すること
ができる。例えば7′―デスオキシグリゼオール酸
を少量の水または水と酢酸エチルのような含水有
機溶剤に懸濁し、次いでナトリウム、カリウムな
どのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムな
どのアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭
酸塩などと室温付近で接触させてPH７〜10に調整
する。次いで析出した沈澱をろ取することによつ
て得られる。得られた粗塩類は例えばカラムクロ
マトグラフイーなどに付して精製することにより
純品として得れらる。次に本発明をあげて本発明を説明するが培養
法、分離・精製法はこれに限定されるものではな
い。実施例１ 7′―デスオキシグリゼオール酸グルコース５％、大豆粉１％、イーストエキス
0.1％、ポリペブトン0.4％、ミートエキス0.4％、
食塩0.25％、炭酸カルシウム0.5％（PH7.0）の組
成をもつ培地30を作り、30ジヤー２基に15
づつ分注、121℃、30分加圧殺菌した。冷却後同
一培地で28℃、72時間、回転振盪培養機にて前培
養したNo.43894菌培溶液150mlづつ〔１％、フラス
コ２本）を接種し、28℃、72時間、通気量１：
１、回転数200rpmで培養を行つた。２基分の
液28（PH6.5）はダイヤイオンHP20（三菱化成
工業(株)社製）を通過させカーボン吸着、水洗後60
％アセトンで溶出した。アセトンを留去、水層は
濃縮後、更に凍結乾燥して粗粉末120mgが得られ
た。次いで小量の蒸溜水に溶かし、ダウエツクス
１×４（ダウケミカル社製、Cl^-型）へ吸着、食塩
濃度をかえてグリゼオール酸と7′―デスオキシグ
リゼオール酸の混合物を溶出した後、セフアデツ
クスLH―20（フアルマシア社製）によるカラム
クロマトグラフイーを行い7′―デスオキシグリゼ
オール酸を水を用いて溶出した。グリゼオール酸
を含む分画が先に溶出した。次いで得られた目的
物質を含む分画をPH2.5に1NHClで調整し、ダイ
ヤイオンHP20に吸着、水洗後、60％アセトンで
溶出した。アセトンを留去後、水層を凍結乾燥し
て7′―デスオキシグリゼオール酸がシリカゲル薄
層クロマトグラフイー（メルク社製、Art.5715）
上、単一のスポツト標品（遊離型）で2.7mg得ら
れた。 7′―デスオキシグリゼオール酸の物理恒数は次
の通りである。１）外観；白色粉末２）融点；160℃（褐変分解）３）分子量；363（ハイ・マススペクトルによ
る）４）分子式；C₁₄H₁₃N₅O₇ ５）旋光度；〔α〕²⁰ _D＝＋13.2゜（Ｃ＝1.1，ジメチ
ルスルホキシド）６）紫外部吸収スペクトル；λ_naxnm（E¹%₁cm） 0.01N塩酸水溶液および0.01N水酸化ナ
トリウム水溶液中で測定した紫外部吸収ス
ペクトルを第１図に示す。７）赤外部吸収スペクトル；ν^KBr _naxcm^-1 KBrペレツト中で測定した赤外部吸収
スペクトルを第２図に示す。８） ¹H核磁気共鳴スペクトル；δ：ppm d₆―ジメチルスルホキシド中、90MHzで
測定した核磁気共鳴スペクトルを第３図に
示す。実施例２ 7′―デスオキシグリゼオール酸ナトリウム塩グルコース５％、大豆粉１％、イーストエキス
0.1％、ポリペプトン0.4％、ミートエキス0.4％、
食塩0.25％（PH7.0）の組成をもつ培地を作り、
30ジヤー２基に15づつ分注、実施例１に記載
したと同じ条件で培養を行なつた。２基分の培養
液27.5はダイヤイオンHP20を通過させた後、
カーボンカラムに吸着、水洗後60％アセトンで溶
出した。アセトンを留去し水層を濃縮後、さらに
凍結乾燥して粗粉末130mgが得られた。ついでセ
フアデツクスLH―20（フアルマシア社製）によ
るカラムクロマトグラフイーを行い目的物を水に
用いて溶出した。グリゼオール酸を含む分画が先
に溶出した。グリゼオール酸の含まれていない溶
出液を濃縮後４℃にて一週間静置して生じた沈澱
物を遠心して集め凍結乾燥して、7′―デスオキシ
グリゼオール酸ナトリウム塩が3.1mg得られた。 7′―デスオキシグリゼオール酸ナトリウム塩の
物理恒数は次の通りである。１）外観；白色粉末２）融点；190℃（褐変分解）３）分子式；C₁₄H₁₁N₅O₇Na₂ ４）元素分析値（％、２水塩として）；計数値Ｃ，37.92 Ｈ，3.39 Ｎ，
15.80 測定値Ｃ，37.00 Ｈ，3.49 Ｎ，
15.33 ５）赤外部吸収スペクトル；ν^KBr _naxcm^-1 KBrペレツト中で測定した赤外部吸収スペクト
ルを第４図に示す。６） ¹H核磁気共鳴スペクトル；δ：ppm 重水中、90MHzで測定した核磁気共鳴ス
ペクトルを第５図に示す。実施例３ 7′―デスオキシグリゼオール酸実施例１に記載したと同じ培地で600タンク
（内容300）を用いて行つた以外は実施例１と全
く同様に行つた。培養48時間目の培養液5μ
の示す阻害活性は76％であつた。培養液280
から実施例１と同様の方法で目的物の分離・精製
を行ないシリカゲル薄層クロマトグラフイー上、
単一の7′―デスオキシグリゼオール酸（遊離型）
41mgが得られた。得られた7′―デスオキシグリゼオール酸の物理
恒数は実施例１で得たものと同じであつた。実施例４ 7′―デスオキシグリゼオール酸ナトリウム塩実施例３に記載したと同じ方法で培養、分離・
精製を行ない、得られた7′―デスオキシグリゼオ
ール酸40mgを小量の水に懸濁した。1NNaOHを
用いてPH10に調整し、ついでセフアデツクスLH
―20カラムクロマトグラフイーを行い凍結乾燥す
ると7′―デスオキシグリゼオール酸ナトリウム塩
38mgが得られた。得られた7′―デスオキシグリゼオール酸ナトリ
ウム塩の物理恒数は実施例２で得たものと同じで
あつた。試験例酵素阻害活性１酵素阻害活性測定法 cAMP PDEはラツト脳由来の粗酵素液を用
い、阻害活性測定法はアンネ・リース・ピチヤー
ド、ワイ・ユー・チユン著「ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー」251巻5726〜
5737頁（1976年）に記載の方法を１部改変して実
施した。即ち¹⁴CでラベルしたcAMPを基質とし、
微生物培養液２〜5μ、蛇毒液20μ、粗酵素
液40μを0.2Mトリスー塩酸緩衝液（PH8.0）中
で混合し、30℃、20分間反応させる。反応終了
後、反応液を樹脂アンバーライトIRP―58で処理
し、残存するアデノシンの放射活性量からcAMP
PDE 阻害活性を100分率で算出した。２ 7′―デスオキシグリゼオール酸のcAMP PDEに対する阻害活性を50％阻害値（I₅₀）で
示すと第１表の通りである。

【表】第１表に示した如く、7′―デスオキシグリゼオ
ール酸はラツト脳由来のcAMP PDEに対して阻
害活性をもつていることがわかる。公知の本酵素
の阻害物質であるパパベリンはラツト脳由来の
cAMP PDEに対してI₅₀値が3.5μMであるのと比
較して本物質は約20倍強い阻害活性を示してい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は7′―デスオキシグリゼオール酸の紫外
部吸収スペクトル、第２図は同物質の赤外部吸収
スペクトル、第３図は同物質の核磁気共鳴スペク
トルを示す。第４図は7′―デスオキシグリゼオー
ル酸ナトリウム塩の赤外部吸収スペクトル、第５
図は同物質の核磁気共鳴スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ストレプトマイセス属に属する7′―デスオキ
シグリゼオール酸もしくはその塩の生産菌を培養
して、その培養物より7′―デスオキシグリゼオー
ル酸もしくはその塩を単離することを特徴とする
7′―デスオキシグリゼオール酸もしくはその塩の
製法。２ 7′―デスオキシグリゼオール酸もしくはその
塩の生産菌がストレプトマイセス・グリゼオオー
ランテイアカスNo.43894（Streptomyces
griseoaurantiacus No.43894）である特許請求の
範囲第１項記載の製法。３ストレプトマイセス属に属する7′―デスオキ
シグリゼオール酸生産菌を培養して、その培養物
より7′―デスオキシグリゼオール酸を単離し、次
いで塩形成物質と接触させてPH７〜10に調整する
ことを特徴とする7′―デスオキシグリゼオール酸
の塩類の製法。